Summary
Das vorliegende Protokoll beschreibt ein einfaches und effizientes Verfahren für den Langstreckentransport von Perfluoralkylsäuren in Weizen.
Abstract
Große Mengen an Perfluoralkylsäuren (PFAAs) wurden in den Boden eingebracht und von Pflanzen angesammelt, was potenzielle Risiken für die menschliche Gesundheit darstellt. Es ist unerlässlich, die Akkumulation und Translokation von PFAAs innerhalb von Pflanzen zu untersuchen. Der Langstreckentransport ist ein wichtiger Weg für PFAAs, die von den Pflanzenblättern durch das Phloem in das essbare Gewebe übertragen werden. Bisher war es jedoch schwierig, das Translokationspotenzial organischer Kontamination in einer kurzfristigen Expositionszeit abzuschätzen. Das Split-Root-Experiment bietet eine Lösung, um die Translokation von PFAAs über große Entfernungen mit einem hydroponischen Experiment effektiv aufzudecken, das in dieser Studie in zwei 50-ml-Zentrifugenröhrchen (A und B) durchgeführt wurde, von denen Zentrifugenröhrchen A 50 ml sterile Hoagland-Nährlösung mit einer Viertelstärke aufwiesen, während Zentrifugenröhrchen B die gleiche Menge an Nährstoffkonzentration aufwiesen. und die Ziel-PFAAs (Perfluoroctansulfonsäure, PFOS und Perfluoroctansäure, PFOA), die in einer bestimmten Konzentration hinzugefügt wurden. Eine ganze Weizenwurzel wurde manuell in zwei Teile getrennt und vorsichtig in die Röhrchen A und B eingeführt. Die Konzentration von PFAAs in den Wurzeln, Weizentrieben und Lösungen in den Röhrchen A und B wurde mit LC-MS/MS bewertet, nachdem sie 7 Tage lang in einem Inkubator kultiviert und geerntet wurden. Die Ergebnisse deuteten darauf hin, dass PFOA und PFOS einen ähnlichen Langstreckentransportprozess durch das Phloem vom Spross bis zur Wurzel erfahren und in die Umgebung freigesetzt werden könnten. So kann die Split-Root-Technik verwendet werden, um den Langstreckentransport verschiedener Chemikalien zu bewerten.
Introduction
Perfluoralkylsäuren (PFAAs) werden aufgrund ihrer hervorragenden physikalisch-chemischen Eigenschaften, einschließlich Oberflächenaktivität und thermischer und chemischerStabilität 1,2,3, in verschiedenen kommerziellen und industriellen Produkten häufig verwendet. Perfluoroctansulfonsäure (PFOS) und Perfluoroctansäure (PFOA) sind die beiden wichtigsten weltweit verwendeten PFAAs 4,5,6, obwohl diese Verbindungen 2009 bzw. 2019 in der internationalen Stockholmer Konvention 7,8 aufgeführt wurden. Aufgrund ihrer Persistenz und weit verbreiteten Verwendung wurden PFOS und PFOA in verschiedenen Umweltmatrices nachgewiesen. Die Konzentrationen von PFOA und PFOS im Oberflächenwasser verschiedener Flüsse und Seen weltweit betragen 0,15-52,8 ng/L bzw. 0,09-29,7 ng/L9. Aufgrund der Verwendung von Grundwasser oder aufbereitetem Wasser für die Bewässerung und auch der Verwendung von Biofeststoffen als Dünger sind PFOA und PFOS im Boden weit verbreitet und liegen zwischen 0,01-123 μg/kg bzw. 0,003-162 μg/kg bzw.10, was eine große Menge an PFAAs in Pflanzen einbringen und potenzielle Risiken für die menschliche Gesundheit darstellen könnte. Die PFAA-Konzentrationen (C4-C8) in landwirtschaftlichen Böden und Getreide (Weizen und Mais) zeigen eine positive lineare Korrelation11. Daher ist es unerlässlich, die Akkumulation und Translokation von PFAAs innerhalb von Pflanzen zu untersuchen.
Die Translokation von PFAAs in Pflanzen erfolgt zunächst von den Wurzeln zu den oberirdischen Geweben, und die Translokation von PFAAs von den Wurzeln zu den essbaren Geweben wird als Ferntransport angesehen12,13. Frühere Studien haben Bisphenol A, Nonylphenol und natürliche Östrogene in Gemüse und Obst nachgewiesen14, was bedeutet, dass diese Chemikalien über das Phloem wandern könnten. Daher ist es wichtig, die Translokation von PFAAs in Pflanzen aufzudecken, um ihr potenzielles Risiko abzuschätzen. Die Akkumulation und Translokation von PFAAs wird jedoch durch ihre Bioverfügbarkeit im Boden beeinflusst, so dass es nicht einfach ist, die Translokationsfähigkeit von Ziel-PFAAs in Pflanzen zu bewerten. Darüber hinaus sind hydroponische Experimente im Allgemeinen durch mehrere Faktoren begrenzt, was es schwieriger macht, das essbare Gewebe von Pflanzen zu erwerben. Typischerweise wurde das Phloem direkt von Pflanzen gesammelt, um die Translokation organischer Verbindungen über große Entfernungen in Pflanzen zu beobachten, während es schwierig ist, Phloems aus Pflanzensämlingen zu gewinnen15. Daher wurde eine einfache und effektive Methode, die Split-Root-Technik, eingeführt, um die Translokation von PFAAs in Pflanzen während einer relativ kurzfristigen Exposition zu untersuchen. Was die Split-Root-Untersuchung betrifft, so werden die Wurzeln in einem Pflanzensämling in zwei Teile getrennt; Ein Teil wird in die Nährlösung gegeben, die Ziel-PFAAs enthält (Röhrchen A), und der andere Teil wird in Abwesenheit von PFAAs in die Nährlösung gegeben (Röhrchen B). Nach mehrtägiger Exposition werden die PFAAs in Röhre B mittels LC-MS/MS gemessen. Die Konzentration von PFAAs in Röhre B offenbart das Translokationspotential von PFAAs durch das Phloem innerhalb der Pflanzen16,17,18.
Das Split-Root-Experiment wurde für die Untersuchung der Ferntranslokation vieler Verbindungen in Pflanzen berichtet, wie CuO-Nanopartikel17, Steroidöstrogene 18 und Organophosphatester16. Diese Studien lieferten den Nachweis, dass diese Verbindungen über das Phloem auf die essbaren Teile von Pflanzen übertragen werden können. Ob PFAAs jedoch bei der Translokation in Pflanzen helfen könnten, und die Auswirkungen von Verbindungseigenschaften müssen weiter untersucht werden. Basierend auf diesen Berichten wurde das Split-Root-Experiment in der vorliegenden Studie durchgeführt, um den Langstreckentransport von PFAAs in Weizen aufzudecken.
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Protocol
Weizensamen, Triticum aestivum L., wurden beschafft (siehe Materialtabelle) und für die vorliegende Studie verwendet.
1. Keimung von Weizenkeimlingen und Hydrokultur
- Wählen Sie Weizensamen ähnlicher Größe und desinfizieren Sie sie für 15 min mit 8% (w/w) Wasserstoffperoxidlösung.
- Spülen Sie die desinfizierten Samen gründlich mit entionisiertem Wasser ab und legen Sie sie dann im Dunkeln bei Raumtemperatur auf feuchtes Filterpapier, um 5 Tage lang zu keimen.
- Wählen Sie ungefähr neun gekeimte Sämlinge einheitlicher Größe aus und geben Sie sie in Kunststoffbecher mit 250 ml Nährlösung (1/4 Stärke der Hoagland-Lösung; ihre chemische Zusammensetzung ist in Tabelle 1 dargestellt).
HINWEIS: Von den neun Samen wurden jeweils drei für Blank, PFOA bzw. PFOS ausgewählt. - Die Sämlinge vor der Exposition 7 Tage lang in Wachstumskammern mit einem Zyklus von 14 h bei 22 °C und 10 h bei 27 °C kultivieren.
2. Das Wurzelspaltungsexperiment
- Führen Sie die Sämlingskultivierung in zwei 50-ml-Zentrifugenröhrchen (A und B) durch.
HINWEIS: In Zentrifugenröhrchen A waren 50 ml sterile 1/4 Hoagland-Lösung vorhanden, und die gleiche Menge an Nährlösung war in Zentrifugenröhrchen B vorhanden.- Das handelsübliche PFOA und PFOS (siehe Materialtabelle) wird in Methanol gelöst und mit der sterilen Nährlösung als Stammlösung verdünnt. Dann wird die Stammlösung in Röhrchen B mit einer PFOA/PFOS-Konzentration von 100 μg/L gegeben.
- Führen Sie die Behandlungen in dreifacher Ausführung mit einer Blankokontrolle durch, um die Hintergrundkontamination zu überwachen. Ein schematisches Diagramm der Split-Root-Expositionsexperimente ist in Abbildung 1 dargestellt.
- Trennen Sie die gesamten Wurzeln des Weizenkeimlings mit einer Pinzette in zwei gleiche Teile, so dass die Wurzeln immer noch am selben Trieb befestigt sind, und führen Sie sie vorsichtig in die Röhrchen A bzw. B ein.
- Verschließen Sie die beiden Röhrchen mit Aluminiumfolie und kultivieren Sie sie 7 Tage lang in einem Inkubator. Behalten Sie die gleichen Inkubationsbedingungen wie in Schritt 1.4 beschrieben bei.
- Sammeln Sie die Weizensämlinge nach 7 Tagen Kultur und trennen Sie den Weizen in drei Teile: Triebe und Wurzeln, die in der Stachellösung von PFAAs bzw. undotierter Lösung mit sterilisierter Schere kultiviert werden.
- Die Pflanzenproben werden in einem Gefriertrockner bei −55 °C für 48 h gefriergetrocknet.
- Homogenisieren und wiegen Sie die Wurzel- und Sprossenproben. Sammeln Sie die Proben der aufgespießten und nicht dotierten Lösung.
3. Extraktion von PFOA und PFOS aus Pflanzengeweben
- Fügen Sie 2 ml Natriumcarbonatpuffer (0,25 mol/L), 1 ml Tetrabutylammoniumhydrogensulfat (0,5 mol/L) und 5 ml Methyl-tert-Butylether (siehe Materialtabelle) zu einem 15-ml-Polypropylenrohr hinzu, einschließlich der homogenisierten Wurzel oder des homogenisierten Sprosses.
- Schütteln Sie das Röhrchen bei 250 U/min für 20 min und zentrifugieren Sie es bei 2.000 x g für 10 min bei Raumtemperatur, um die überstehende organische Phase zu erhalten. Führen Sie den Extraktionsvorgang zweimal durch.
- Mischen Sie die gesammelten Extrakte, verdampfen Sie sie in einem sanften Stickstoffstrom (N2) zur Trockne und rekonstituieren Sie sie dann mit 5 ml Methanol und wirbeln Sie sie, wobei die gleiche Geschwindigkeit für etwa 30 s beibehalten wird.
- Die Pesticarb-Kartusche (siehe Materialtabelle) wird mit 5 ml 0,1 % NH4OH in Methanol, 5 ml Wasser und 5 ml Methanol konditioniert.
- Fügen Sie die 5 ml extrahierende Methanollösung durch die Pesticarb-Patrone (500 mg / 6 ml) hinzu, um das Pigment zu entfernen, eluieren Sie die Patrone mit 5 ml Methanol und sammeln Sie in den gleichen Röhrchen.
- Die gesammelten 10 mL Methanollösung werden nahezu trocken eingedampft und mit 200 μL Methanol rekonstituiert, gefolgt von Wirbeln und Zentrifugieren bei 10.000 x g für 20 min bei Raumtemperatur.
4. Probenvorbereitung aus der Nährlösung
- Zustand mit 5 mL Methanol und 5 ml Wasser zur Aktivierung der PEP-Extraktionskartusche (60 mg/g, 3 ml) (siehe Materialtabelle).
- Geben Sie 1 ml der Stachellösung oder 50 ml der nicht dotierten Lösungsproben (Schritt 2.6) durch die Patrone.
- Eluieren Sie die Ziel-PFAAs mit 10 ml Methanol, verdampfen Sie den Extrakt mit sanftemN2 und rekonstituieren Sie dann mit 200 μL Methanol für die Analyse.
5. Instrumentelle Analyse
- Verwenden Sie eine Hochleistungsflüssigkeitschromatographie-UPLC in Verbindung mit Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) zur Quantifizierung der Ziel-PFAAs im Multireaktionsmodus (MRM) und negativer Elektrospray-Ionisation (ESI-) (siehe Materialtabelle).
- Injizieren Sie 10 μL Proben und trennen Sie die Ziel-PFAAs mit einer C18-Flüssigkeitschromatosäule (1,7 μm, 2,1 mm x 50 mm, siehe Materialtabelle) und verwenden Sie 2 mM Ammoniumacetat in Wasser (Phase A) und Methanol (Phase B) als mobile Phase für UPLC mit einer Durchflussrate von 0,3 ml / min. Halten Sie die Säulentemperatur bei 50 °C.
HINWEIS: Die Ionenübergänge von PFOA und PFOS betragen 413 bis 369 bzw. 499 bis 80. Das Gradientenelutionsprogramm und die instrumentellen Parameter LC-MS/MS zur Quantifizierung der Ziel-PFAAs sind in Tabelle 2 aufgeführt. - Verarbeiten Sie die Daten mit der Datenanalysesoftware (siehe Materialtabelle).
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Representative Results
Das Split-Root-Experiment untersuchte den Langstreckentransport von PFAAs in Weizen. Wie in Abbildung 2A,C gezeigt, konnten sowohl PFOA als auch PFOS von der Weizenwurzel aufgenommen und auf den Spross übertragen werden. PFOS und PFOA wurden in der Weizenwurzel und -lösung im Röhrchen A der Blindkontrolle nicht nachgewiesen. Es wurde festgestellt, dass PFOS und PFOA in den Weizenwurzeln nachgewiesen wurden, die in der undotierten Lösung kultiviert wurden, mit einer Konzentration von 0,26 ng/g ± 0,02 ng/g bzw. 0,64 ng/g ± 0,05 ng/g Trockengewicht (dw) (n = 3), was 1,5% bzw. 1,8% der Akkumulation in der Vollweizenpflanze ausmacht. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass PFOS und PFOA einen Langstreckentransport durch das Phloem vom Spross bis zur Wurzel erfahren könnten. Es war erwähnenswert, dass PFOS und PFOA auch in der nicht stacheligen Nährlösung mit einer Konzentration von 17,8 ng/L ± 0,28 ng/L bzw. 28,5 ng/L ± 5,9 ng/L (n = 3) gefunden wurden, was darauf hindeutet, dass PFOA und PFOS den Casparian-Wurzelstreifen19,20 passieren und in die Umgebung freisetzen könnten. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit liefern solide Beweise dafür, dass der Langstreckentransport auch ein wichtiger Weg für Weizen ist, um PFAA zu eliminieren.
Abbildung 1: Schematische Darstellung der Split-Root-Experimente. Die gesamten Wurzeln des Weizenkeimlings wurden gleichmäßig in zwei Teile getrennt und vorsichtig in Röhrchen (A) und (B) eingeführt. Ein hydroponischer Kunststoff-Wurzelhalter mit einem passenden Schwamm wurde verwendet, um die beiden Rohre zu verbinden und den Sämling zu fixieren. Die leere Gruppe wird auf die Lösung in A festgelegt. B-Röhren sind alle undotiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Verteilung der PFOA- und PFOS-Konzentrationen im Split-Root-Experiment nach 7 Tagen Exposition. Die Stachellösung (Lösung, die Ziel-PFAAs enthält), die Stachelwurzel (Wurzel in PFAAs-Stachellösung) und der Spross von (A) PFOA und (C) PFOS. Ungestachelte Lösung (Lösung ohne PFAAs) und ungestachelte Wurzel (Wurzel in nicht stacheliger Lösung) von (B) PFOA (D) und PFOS. Die Fehlerbalken bezeichnen die Standardabweichungen (n = 3). Abkürzung: dw = Trockengewicht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| Bestandteil | Molekulargewicht | Konz. aus Stammlösung (g/L) | Volumen der Stammlösung pro Liter (ml) | Element | Endkontz. des Elements in Nährlösung (ppm) |
| Makronährstoffe | |||||
| KNO3 | 101.1 | 101.1 | 1.25 | K | 56 |
| Ca(NO3)2. 4H2O | 236.16 | 236.16 | 1 | N | 58.75 |
| NH 4 H2PO4 | 115.08 | 115.08 | 0.5 | Ca | 40 |
| MgSO4. 7Std. 2O | 246.48 | 246.48 | 0.25 | P | 15.5 |
| Mg | 6 | ||||
| S | 8 | ||||
| Eisen (EDTA-FeNa) | |||||
| EDTA-FeNa | 367.05 | 7.342 | 0.25 | Fe | 0.28 |
| Mikronährstoffe | |||||
| H 3BO3 | 61.83 | 2.86 | B | 0.125 | |
| MnCl2. 4H2O | 197.91 | 1.81 | Mn | 0.125 | |
| ZnSO4. 7Std. 2O | 287.56 | 0.22 | Zn | 0.0125 | |
| CuSO4 | 159.61 | 0.051 | Cu | 0.005 | |
| H2MoO4 (85% MoO3) | 161.97 | 0.017 | Moment | 0.0025 |
Tabelle 1: Chemische Zusammensetzungen der 1/4 starken Hoagland-Nährlösung. Diese Nährlösung stellt die undotierte Lösung im Spaltwurzelexperiment dar.
| Säulentemperatur | 50 °C | |||||
| Mobile Phase | 2 mM Ammoniumacetat in Wasser pH = 9 (A) und Methanol (B) | |||||
| Steigung | Zeit (min) | Durchfluss (ml/min) | A (%) | B (%) | ||
| Initial | 0.3 | 75 | 25 | |||
| 0.5 | 0.3 | 75 | 25 | |||
| 5 | 0.3 | 15 | 85 | |||
| 5.1 | 0.3 | 0 | 100 | |||
| 7 | 0.3 | 0 | 100 | |||
| 7.1 | 0.3 | 75 | 25 | |||
| 9 | 0.3 | 75 | 25 | |||
| Massenparameter | Kapillarspannung: -1,5 kV | |||||
| Auflösungstemperatur 500 °C | ||||||
| Desolvationsgasdurchfluss: 1000 L/h | ||||||
| Kegelgasdurchfluss: 150 L/h | ||||||
| Mehrfach | Komposita | Eltern-Ionen | Produktionen (m/z) | |||
| Reaktion | (m/z) | |||||
| Überwachung | ||||||
| (MRM) | PFOA | 413 | 369 | |||
| Übergänge | PFOS | 499 | 80 | |||
Tabelle 2: Instrumentelle LC-MS/MS-Parameter zur Quantifizierung der Ziel-PFAAs.
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Discussion
Um die Genauigkeit dieses Verfahrens zu gewährleisten, muss sorgfältig vorgegangen werden, um sicherzustellen, dass die Stachellösung in Röhrchen B die nicht versetzte Lösung in Röhrchen A nicht verunreinigt. Die gegebene Konzentration von Ziel-PFAAs in der vorliegenden Studie war relativ höher als ihre Konzentration in der realen Umgebung, was sicherstellt, dass Ziel-PFAAs in Weizen und ungespießten Lösungen mit LC-MS/MS überwacht werden konnten.
Es gibt Einschränkungen für diese Methode. Da in jeder Behandlungsgruppe nur ein Weizenkeimling verwendet wurde und die Wurzel in zwei Hälften geteilt wurde, kann bei relativ niedriger Anfangskonzentration der Stachellösung die geringere Biomasse aus der Endbehandlung dazu führen, dass die Konzentration von PFAA in den in der nicht versetzten Lösung kultivierten Wurzeln unter der Nachweisgrenze liegt. Darüber hinaus konnte aufgrund der kurzen Einwirkzeit der Transport von PFAA von den Wurzeln zu den essbaren Teilen des Weizens nicht bestimmt werden. Das Split-Root-Experiment konnte nur den Phloemtransport von PFAAs mit unterschiedlichen Eigenschaften innerhalb von Pflanzenanalysieren 16.
Diese Methode ist von großer Bedeutung für das Verständnis des Langstreckentransports12,13 von Schadstoffen in Pflanzengeweben. Den Ergebnissen zufolge können PFAAs von Wurzeln aufgenommen und hauptsächlich durch das Xylem zu den Trieben transportiert werden; Es ist jedoch zu beachten, dass sie von Blättern zu essbarem Gewebe sowie von Trieben zu Wurzeln durch das Phloem transloem transloziert werden könnten, was für die Beurteilung ihres potenziellen Translokationsrisikos bei Pflanzen wichtig ist. Darüber hinaus liefert die Translokation von PFAAs aus dem oberirdischen Gewebe zu den Wurzeln und die anschließende Freisetzung in die Umgebung solide Beweise für die Eliminationswege von PFAAs in Pflanzen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Acknowledgments
Wir danken der Natural Science Foundation of China (NSFC 21737003), dem Chinese Universities Scientific Fund (Nr. 2452021103) und der Chinese Postdoctoral Science Foundation (Nr. 2021M692651, 2021M702680).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ACQUITY UPLC BEH C18 column | Waters, Milford, MA | Liquid chromatographic column | |
| Cleanert PEP cartridge | Bonna- Angel Technologies, China | Solid phase extraction column | |
| Clearnert Pesticarb cartridge | Bonna- Angel Technologies, China | Solid phase extraction column | |
| LC-MS/MS(Waters Acquity UPLC i-Class Coupled to Xevo TQ-S) | Waters, Milford, MA | Liquid chromatography and mass spectrometry | |
| Lyophilizer | Boyikang Instrument Ltd., Beijing, China | FD-1A50 | Freeze-dried sample |
| Masslynx | Waters, Milford, MA | data analysis software | |
| Methyl tert-butyl ether | Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, US) | use for extracting target compounds from plant tissues | |
| MPFAC-MXA | Wellington Laboratories (Ontario, Canada) | PFACMXA0518 | the internal standards |
| PFAC-MXB | Wellington Laboratories (Ontario, Canada) | PFACMXB0219 | mixture of PFAA calibration standards |
| PFOA | Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, US) | 335-67-1 | a represent PFAAs |
| PFOS | Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, US) | 2795-39-3 | a represent PFAAs |
| Sodium carbonate buffer | Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, US) | use for extracting target compounds from plant tissues | |
| Tetrabutylammonium hydrogen sulfate | Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, US) | use for extracting target compounds from plant tissues | |
| Wheat seeds | Chinese Academy of Agricultural Sciences (Beijing,China) | Triticum aestivum L. |
References
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