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Genetics

オレオクロミス属由来の病原性大腸菌株のキャラクタリゼーション 全ゲノムシーケンシングを使用する農場

Published: December 23, 2022 doi: 10.3791/64404
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1Unidad de Investigaciones en Salud Pública “Dra. Kaethe Willms”, Facultad de Ciencias Químico Biológicas, Universidad Autónoma de Sinaloa, 2Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A. C. (CIAD), Unidad Mazatlán en Acuicultura y Manejo Ambiental

ERRATUM NOTICE

Summary

ベンチトップ機器を使用した全ゲノムシーケンス(WGS)戦略の実現可能性により、ラボ環境での公衆衛生に関連するすべての微生物のゲノム調査が簡素化されました。細菌WGSのワークフローの方法論的適応について説明し、分析のためのバイオインフォマティクスパイプラインも提示します。

Abstract

水産養殖は世界で最も急速に成長している食料生産部門の1つであり、ティラピア(オレオクロミス属)養殖は養殖される主要な淡水魚の品種を構成しています。水産養殖は人為的発生源に由来する微生物汚染の影響を受けやすいため、抗生物質の広範な使用が必要であり、養殖システムは、大腸菌(大腸菌)などの抗生物質耐性菌および病原性細菌の重要な発生源になります。ここでは、内陸養殖オレオクロミス属から回収された病原性大腸菌株の抗菌剤耐性、病原性、およびモビロームの特徴を、全ゲノムシーケンス(WGS)およびインシリコ分析によって解明しました。抗菌薬感受性試験(AST)およびWGSを実施した。さらに、系統発生グループ、血清型、多遺伝子座配列タイピング(MLST)、獲得された抗菌剤耐性、病原性、プラスミド、およびプロファージ含有量を、利用可能な多様なWebツールを使用して決定しました。大腸菌分離株はアンピシリンに対する中程度の感受性のみを示し、WGSベースのタイピングによってONT:H21-B1-ST40株として特徴付けられました。単一の抗菌薬耐性関連遺伝子のみが検出されたが[mdf(A)]、非定型腸病原性大腸菌(aEPEC)病型からのいくつかの病原性関連遺伝子(VAG)が同定された。さらに、大きなプラスミドグループと18のプロファージ関連領域からのプラスミドレプリコンの貨物が検出されました。結論として、メキシコのシナロア州の養魚場から回収されたaEPEC分離株のWGS特性評価は、その病原性の可能性と生の水産養殖製品を消費することによる人間の健康リスクの可能性についての洞察を可能にします。環境微生物を研究するための次世代シーケンシング(NGS)技術を活用し、健康問題がどのように発生するかを知るためにワンヘルスフレームワークを採用する必要があります。

Introduction

水産養殖は、世界で最も急速に成長している食料生産部門の1つであり、その生産慣行は、人間の消費に対する増大する食料需要を満たすことを目的としています。世界の養殖生産量は、1997年の3,400万トン(Mt)から2017年には112Mtに3倍になりました1。生産の75%近くに貢献している主な種グループは、海藻、コイ、二枚貝、ナマズ、ティラピア(オレオクロミス 属)でした。1. しかし、微生物主体による病気の出現は、集中的な養殖のために避けられず、潜在的な経済的損失につながる2.

魚の養殖慣行における抗生物質の使用は、生産性の主な制限要因である細菌感染の予防と治療でよく知られています3,4。それにもかかわらず、残留抗生物質は水産養殖の堆積物と水に蓄積し、選択圧を発揮し、魚に関連する細菌群集と存在する細菌群集を改変します5,6,7,8。その結果、水産養殖環境は抗菌薬耐性遺伝子(ARG)の貯蔵庫として機能し、周囲の環境で抗生物質耐性菌(ARB)がさらに出現および拡散します9。魚の養殖慣行に影響を与える一般的に観察される細菌性病原体に加えて、エンテロバクター属、大腸菌、クレブシエラ属、サルモネラ属菌のヒト病原体株を含む腸内細菌科のメンバーにしばしば遭遇します10。大腸菌は、魚の養殖において魚粉と水から分離された最も一般的な微生物です11、12、13、14、15。

大腸菌は、哺乳類や鳥類の腸内細菌叢の共生メンバーとして胃腸管に生息する多用途のグラム陰性菌です。しかし、大腸菌は、土壌、堆積物、食物、水など、さまざまな環境ニッチにコロニーを形成し、存続する適応性の高い能力を持っています16。遺伝子水平伝播(HGT)現象による遺伝子の増減により、大腸菌は急速に適応した抗生物質耐性病原体に進化し、ヒトおよび動物に広範囲の疾患を引き起こす可能性があります17,18。単離起源に基づいて、病原性変異体は、腸病原性大腸菌(InPEC)または腸外病原性大腸菌(ExPEC)として定義される。さらに、InPECとExPECは、疾患の発現、遺伝的背景、表現型形質、および病原性因子(VF)に従って明確に定義された病理型に細分化されます16,17,19。

病原性大腸菌株の伝統的な培養と分子技術により、さまざまな病型の迅速な検出と同定が可能になりました。ただし、それらは時間と手間がかかり、多くの場合、高度な技術トレーニングが必要になる場合があります19。さらに、大腸菌のすべての病原性多様体は、その遺伝的背景が複雑なため、単一の方法を使用して確実に研究することはできません。現在、これらの欠点は、ハイスループットシーケンシング(HTS)技術の出現によって克服されています。全ゲノムシーケンシング(WGS)アプローチとバイオインフォマティクスツールは、微生物DNAの探索を手頃な価格で大規模に改善し、密接に関連する病原性多様体を含む微生物の詳細な特性評価を1回の実行で容易にしました20,21,22。生物学的な質問に応じて、いくつかのバイオインフォマティクスツール、アルゴリズム、およびデータベースを使用してデータ分析を実行できます。たとえば、主な目標がARG、VF、およびプラスミドの存在を評価することである場合、ResFinder、VirulenceFinder、PlasmidFinderなどのツールと、それらに関連するデータベースが適切な出発点になる可能性があります。Carriço et al.22は、生データの前処理から系統発生的推論まで、微生物WGS分析に適用されるさまざまなバイオインフォマティクスソフトウェアと関連データベースの詳細な概要を提供しました。

いくつかの研究は、抗菌薬耐性属性、病原性の可能性、および多様な起源に由来する大腸菌の臨床的に関連する変異体の出現と進化的関係の追跡に関するゲノム調査のためのWGSの幅広い有用性を実証しています23,24,25,26.WGSは、希少または複雑な耐性メカニズムを含む、抗菌剤に対する表現型耐性の根底にある分子メカニズムの同定を可能にしました。これは、獲得されたARG変異体、薬物標的遺伝子における新規変異、またはプロモーター領域27、28を検出することによるものである。さらに、WGSは、細菌株の耐性表現型に関する事前知識を必要とせずに抗菌剤耐性プロファイルを推測する可能性を提供する29。あるいは、WGSは、抗菌剤耐性と病原性の特徴の両方を持つ可動遺伝要素(MGE)の特性評価を可能にし、既存の病原体の細菌ゲノム進化を推進してきました。たとえば、2011年のドイツの大腸菌発生の調査中にWGSを適用した結果、明らかに新しい大腸菌の病理型のユニークなゲノム特徴が明らかになりました。興味深いことに、これらのアウトブレイク株は、腸管出血性大腸菌(EHEC)の病型30から志賀毒素をコードするプロファージを獲得した腸凝集性大腸菌(EAEC)グループに由来します。

この研究は、ベンチトップシーケンサーを使用した細菌WGSのワークフローの方法論的適応を示しています。さらに、Webベースのツールを使用してバイオインフォマティクスパイプラインが提供され、結果の配列を分析し、バイオインフォマティクスの専門知識が限られているかまったくない研究者をさらにサポートします。記載された方法により、2011年にメキシコのシナロア州で内陸養殖オレオクロミス属から単離された病原性大腸菌ACM5株の抗菌剤耐性、病原性、およびモビロームの特徴を解明することができました12。

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Protocol

注:大腸 菌 株ACM5は、糞便性大腸菌群(FC)測定のために魚サンプルを処理および培養することによって回収されました12。魚のサンプリング中、魚は病気、細菌、または真菌感染の臨床的兆候を示さず、平均温度は22.3°Cでした。単離後、 大腸菌 分離物を生化学的試験にかけ、凍結保護剤としてDMSO(8%v/v)を含む脳心臓注入(BHI)ブロスで凍結保存しました。

1. 凍結 大腸菌 ACM5ストック培養の再活性化

  1. 凍結細菌ストックからチューブを開き、滅菌ループ、ピペットチップ、またはつまようじを使用して、凍結細菌培養物の表面をこすり落とします。
  2. 細菌をルリア・ベルターニ(LB)寒天プレートにストリークし、37 ± 2°Cで24時間インキュベートします。

2.抗菌感受性の決定

注:ここに記載されている抗菌剤感受性試験は、臨床検査基準研究所(CLSI)ガイドライン(M02 Ed13:2018)31に基づくディスク拡散法に対応しています。 大腸菌 ATCC 25922株は、品質管理のために必要です。

  1. コロニー懸濁法による接種材料調製
    1. ステップ1.2でインキュベートしたLBプレートから、1つまたは2つのコロニーをミューラーヒントン(MH)寒天プレートにストリークし、37 ± 2°Cで18〜24時間インキュベートします。
    2. 滅菌ループを使用して、MH寒天プレート上で新たに継代培養した大腸 菌 分離物から2つまたは3つのコロニーを選択し、3 mLの滅菌MHブロスまたは0.85%(w / v)生理食塩水に再懸濁し、ボルテックスによって完全に混合して均一な細菌懸濁液を得ます。
    3. UV可視分光光度計( 材料の表を参照)を使用して、細菌懸濁液を0.5マクファーランド標準(約1〜2 x 108 細胞/ mLに相当)に匹敵する濁度に調整します。細菌懸濁液が軽すぎたり重すぎたりする場合は、必要に応じて 大腸菌 コロニーまたはMHブロスを追加します。準備から15分以内に準備された接種材料を使用してください。
  2. 試験寒天プレートの接種
    1. 滅菌綿棒を調整した細菌懸濁液に浸します。綿棒を数回回転させ、チューブの内壁にしっかりと押し付けて、綿棒から余分な液体を取り除きます。
    2. 寒天表面全体に綿棒を3倍ストリーキングし、毎回プレートを60°回転させて、MH寒天プレートを接種します。寒天の縁も拭いて、接種材料の均一な分布を確保します。
    3. ペトリ皿の蓋を3〜5分間半開きにして、水分を蒸発させます。
  3. 接種寒天プレートへの抗菌ディスクの適用
    1. 均等に分配し、各抗菌ディスク( 材料の表を参照)を接種した寒天プレートの表面に押し下げて、完全に接触するようにします。ディスク塗布後15分以内にプレートを反転させ、35 ± 2°Cで16〜18時間インキュベートします。
      注意: 150mmと100mmのペトリ皿には、それぞれ最大12枚と6枚のディスクを使用する必要があります。
  4. インキュベーション後、ノギスを使用して阻害サイズのゾーンを測定し、CLSIブレークポイント基準(M100-表2A)に従って結果の直径を解釈します32。

3. ゲノムDNA(gDNA)の抽出と定量

  1. ゲノムDNA抽出
    1. 培養したばかりの 大腸菌 コロニーを5 mLのLBブロスに再懸濁し、37 ± 2°Cの振とうインキュベーター(180 rpm)で一晩インキュベートします。
    2. 細菌懸濁液を3,500 x g で5分間遠心分離し、上清を注意深く廃棄します。
    3. DNA抽出キットのガイドラインに従ってgDNAを抽出します(材料の表を参照)。
    4. 紫外可視分光光度計を用いて260/280 nm(比:>1.8)および260/230 nm(比:2.0-2.2)の光学密度を測定し、gDNAの純度を確認します。0.8%アガロースゲル電気泳動を行い、gDNAの完全性を検証します。
  2. ゲノムDNA定量
    注:蛍光アッセイキットの製造元によって承認された薄肉の透明な0.5 mL PCRチューブのみを使用してください(材料の表を参照)。
    1. サンプルとアッセイ標準に必要な数のチューブを設定します。メーカーのガイドラインに従って、キットに付属の成分Aと成分Bを混合して、実用的なアッセイ溶液を調製します。
    2. 190 μLの作業溶液と10 μLの各標準物質を適切なチューブに加えて、アッセイ標準を準備します(2つの標準物質が必要です)。
    3. 198 μLの作業溶液と2 μLのDNAサンプルを適切なチューブに加えます。すべてのチューブを5秒間ボルテックスして激しく混合します。泡を作らないように注意してください。
    4. すべてのチューブを室温で2分間インキュベートし、光から保護します。蛍光光度計を使用して、メーカーのガイドラインに基づいてすべてのチューブの蛍光を測定します(材料の表を参照)。
    5. シーケンシングを進めるために、gDNAサンプル濃度を適切に調整してください。

4. DNAライブラリーの調製

注:DNAライブラリの調製とシーケンシングは、製造元のガイドラインとプロトコルに従って実行されました( 材料表を参照)。開始gDNA濃度は4.0 ngです。

  1. タグ付け、PCR増幅、インデックス作成
    1. 0.2 mL チューブに、2.5 μL のタグメンテーションバッファーと 2 μL のインプット gDNA (2.0 ng/μL) を加えます。ピペッティングで穏やかに混ぜます。
    2. 1 μLの増幅バッファーを加え、ピペッティングで穏やかに混合します。室温で280 x g で1分間スピンダウンします。
    3. サンプルをサーモサイクラー( 材料表を参照)に入れ、次のPCRプログラムを実行します:55°Cで5分間、次に10°Cで保持します。 サンプルが10°Cに達したら、直ちに反応を中和するために進行する。
    4. 1 μLの中和バッファーをサンプルチューブに加え、ピペッティングで穏やかに混合します。280 x g で1分間スピンダウンし、室温で5分間インキュベートします。
    5. 各インデックスアダプター(インデックスi7およびi5)1.7 μLとインデックスPCRマスターミックス3 μLを加えます。ピペッティングで穏やかに混ぜます。室温で280 x g で1分間スピンダウンします。
    6. サンプルをサーモサイクラーに入れ、72°Cで3分間、95°Cで30秒間、95°Cで10秒間、55°Cで30秒間、72°Cで30秒間、72°Cで5分間の18サイクルで2回目のPCR反応を行い、10°Cで保持します。
  2. 増幅されたライブラリのクリーンアップ
    1. 市販の磁気ビーズ溶液( 材料表を参照)をメーカーのガイドラインに基づいてボルテックスして混合します。
    2. タグ付き/インデックス付きgDNAサンプルを新しい1.5 mLチューブに移し、gDNAサンプルの最終容量(≈13 μL)のμLごとに0.6 μLの磁気ビーズを追加します。ピペッティングで穏やかに混合し、室温で5分間インキュベートします。
    3. 上清が透明になるまで、サンプルチューブを磁気ラック( 材料の表を参照)に2分間置きます。ビーズを乱さずに上清を慎重に取り除き、廃棄します。
    4. 新たに調製した80%エタノール200 μLを混合せずに添加します。溶出液が透明になるまで30秒間インキュベートし、ビーズを乱すことなく上清を注意深く除去して廃棄します。
    5. 2番目の洗浄ステップを実行します。200 μLの80%エタノールをビーズに加え、30秒間インキュベートします。溶出液が透明になったら、上清を取り出して廃棄し、ビーズを10分間風乾します。
    6. 15 μLの10 mMトリスバッファー(pH 8)をビーズに加え、ピペッティングで穏やかに混合します。室温で2分間インキュベートします。サンプルチューブを再び磁気ラックに2分間置き、上清を取り除きます。
    7. 14 μLの上清をサンプルチューブから新しい0.2 mLチューブに慎重に移します。これはクリーンアップされたライブラリです。
      注:この時点で、クリーンアップされたライブラリは-20°Cで最大7日間保存できます。
  3. ライブラリの正規化
    1. ステップ3.2.5を除き、ステップ3.2に記載されるように蛍光アッセイによってクリーンアップされたライブラリを定量することに進む。
    2. クリーンアップしたライブラリを1%アガロースゲル電気泳動で可視化し、平均フラグメントサイズを決定します。
    3. 次の式を使用してライブラリのモル濃度値を計算します。
      Equation 1
    4. モル濃度の値を使用して、再懸濁バッファー(RSB)とクリーンアップされたライブラリの適切な容量を計算し、個々のライブラリを開始濃度10 nMで希釈します。

5. ライブラリのプーリング、非自然化、シーケンサーの開始

  1. 製造元の指示に従って試薬カートリッジを解凍します。フローセルを冷蔵庫(4°C)から取り出し、室温に戻してからシーケンシングします。
  2. 正規化された各ライブラリ(10 nM)の5 μLを低結合1.5 mLチューブにプールします。プールされたライブラリを適切な容量のRSBで4 nMで希釈します。
  3. プールされたライブラリ (4 nM) 5 μLと0.2 N NaOHの5 μLを新しい低結合1.5 mLチューブに加えます。ボルテックスで短時間混合し、280 x g で1分間スピンダウンし、室温で5分間インキュベートして、プールされたライブラリを一本鎖に変性させます。
  4. 10 μLの変性プールライブラリと990 μLのプレチルドハイブリダイゼーションバッファーをピペッティングで穏やかに混合し、シーケンサーローディングの最終希釈が行われるまで氷上に置きます。変性プールライブラリの濃度は20pMである。
  5. 2 μLのコントロールライブラリ(10 nM)と3 μLのヌクレアーゼフリー水を混合することにより、4 nMの濃度でコントロールライブラリ( 材料の表を参照)を解凍して調製します。
  6. 5 μLのコントロールライブラリ(4 nM)と5 μLの新たに調製した0.2 N NaOHを混合します。ボルテックスで短時間混合し、280 x g で1分間スピンダウンし、室温で5分間インキュベートして、コントロールライブラリを一本鎖に変性させます。
  7. 10 μLの変性コントロールライブラリと990 μLのプレチルドハイブリダイゼーションバッファーをピペッティングで穏やかに混合し、シーケンサーローディングの最終希釈が完了するまで氷上に置きます。変性コントロールライブラリの濃度は20pMである。
  8. 新しい低結合1.5 mLチューブで、20 pMで594 μLの変性プールライブラリと20 pMで6 μLの変性コントロールライブラリを組み合わせます。適切に混ぜます。
  9. プレチルドハイブリダイゼーションバッファーを使用して、最終ライブラリミックス(20 pM)を600 μLの容量で最終負荷濃度1.2 pMに希釈します。
  10. 最終的なライブラリミックスを試薬カートリッジにロードする前に、追加の熱前処理を実行して、フローセルへの効率的なロードを実現します。最終ライブラリーミックスを96°Cで2分間インキュベートします。 チューブを反転させて混合し、チューブを氷の上に5分間置きます。
  11. 500 μLの最終ライブラリミックスを試薬カートリッジの設計したリザーバーにロードします。ガイドラインに従ってシーケンスを開始します。フローセルと試薬カートリッジをロードし、シーケンシングランを設定します。

6. シーケンスデータ解析

注:一般的なWGSデータの前処理、ソフトウェア、パラメータ設定、および大腸菌ゲノムの配列解析の詳細については、補足ファイル1を確認してください。

  1. シーケンシングデータサーバーに接続し、FASTQファイルをダウンロードします。
  2. 生のシーケンスデータの初期品質をサードパーティ製ソフトウェアで評価します。生のシーケンシング・データから、レムナント・アダプター・シーケンス、低品質の塩基(補足ファイル1を参照)。
  3. サードパーティ製ソフトウェアを使用して、品質チェックされたシーケンスデータをコンティフォールドレベルまたはスキャフォールドレベルにアセンブルします( 補足ファイル1を参照)。
  4. 組み立てられたゲノムを含むFASTAファイルをRASTサーバーに送信することにより、ゲノムアノテーションを実行します(https://rast.nmpdr.org/)。
  5. FASTAファイルをゲノム疫学センター(CGE)(http://www.genomicepidemiology.org/services/)およびClermonTyping(http://clermontyping.iame-research.center/index.php)ウェブプラットフォームにアップロードして、疫学的特徴、ARG、VAG、およびプラスミドを特定します(補足ファイル1を参照)。
  6. FASTAファイルをPHASTERサーバーにアップロードして、プロファージ配列を特定します(https://phaster.ca/)。

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Representative Results

抗菌薬感受性はディスク拡散法によって決定され、6つの異なる抗菌クラス、すなわちアミノグリコシド、βラクタム、フルオロキノロン、ニトロフラン、フェニコール、および葉酸経路アンタゴニストにまたがる12の抗生物質のCLSIブレークポイント基準によって解釈されました。 大腸菌 ACM5は、1つのβラクタム薬を除くすべての抗生物質に対して感受性を示しました。4つのβラクタム薬がテストされました:アンピシリン、カルベニシリン、セファロチン、およびセフォタキシム。これらのうち、アンピシリンに対する14 mm阻害ハローを測定した。したがって、アンピシリンのCLSI解釈カテゴリー(感受性:≥17mm;中間:14-16mm;耐性:≤13mm) 32によれば、 大腸菌 ACM5はアンピシリンに対する中間感受性を示す。

大腸菌ACM5をベンチトップシーケンサーを用いてWGSに供した。したがって、DNAサンプルを調製し、マルチプレックス化し、記載されたプロトコルに従って配列決定した。全体として、中間出力構成で行われたシーケンス実行では、エラー率が0.73%で3.37 Gbのデータが得られ、89.71%のベースがQ3033を超える品質を獲得しました。特に、大腸菌ACM5の配列決定により、合計1,490,594のペアエンド(PE)リードが生成されました。この研究の生のシーケンスデータは、バイオプロジェクト番号PRJNA715781で国立バイオテクノロジー情報センター(NCBI)のシーケンスリードアーカイブ(SRA)データベースに寄託されました。

最初の品質チェックとフィルタリングの後、リードの96.8%が生のシーケンスデータから保存され、38倍の深さのカバレッジを持つスキャフォールドに組み立てられました。スキャフォールドレベルのゲノムアセンブリは、83個のスキャフォールド(>300 bp)、長さ5,272,433 bp、GC含量50.61%を生成しました。ゲノムアノテーションにより、5,633個のコードされた特徴が明らかになり、そのうち5,524個がタンパク質コード遺伝子(CDS)、109個がRNA関連配列でした(図1)。さらに、ゲノムアノテーションは、CDSをサブシステムと呼ばれる機能的に関連するタンパク質のコレクション、特に炭水化物、タンパク質、アミノ酸および誘導体代謝、および膜輸送において機能的な役割を果たすタンパク質のコレクションにグループ化しました(図2)。

インシリコ タイピングでは、 大腸菌 ACM5がONT:H21血清型に割り当てられたO非型付け(ONT)株であると予測されました。さらに、系統群B1および配列タイプ(ST)40に属することを示した。広域スペクトルの多剤排出ポンプをコードする単一の獲得された抗菌剤耐性決定因子、すなわち mdf(A) 遺伝子が同定されました(図1)。

病原性形質に関しては、熱安定性エンテロトキシン(astA)、血清耐性タンパク質(iss)、III型分泌系(T3SS)をコードする遺伝子とその分泌エフェクタータンパク質など、研究中の大腸菌ゲノムにいくつかのVAGが含まれています(図1)。バンドル形成線毛(BFP)オペロンおよびperABC遺伝子クラスターは証明されなかった。その結果、予測された病原性プロファイルに従って、大腸菌ACM5がaEPEC病型に割り当てられました。

WGS分析はまた、 大腸菌 ゲノム中の異なる非適合性(Inc)グループ(すなわち、IncFおよびIncIプラスミドグループ)に属する2つの推定大型プラスミドを明らかにした。ただし、どちらもARGとVAGを欠いていました。さらに、18のプロファージ関連領域が同定された。しかし、プラスミドとは対照的に、プラスミドは ISS 遺伝子、鉄/マンガントランスポーターをコードする sitABCD オペロン、およびいくつかのT3SSエフェクタータンパク質を含むVAGを保持しています(図1)。

Figure 1
図1: 大腸菌 ACM5のドラフトゲノムの円形マップ。 最も外側の円から最も内側の円までのデータは、次のように宣言され、色分けされます。サークル1:塩基対のゲノムサイズスケール。円2と3:それぞれ順方向(青)と逆方向(赤)のDNA鎖に転写された注釈付きCDS。円4および5:それぞれリボソームRNA(黒)およびトランスファーRNA(緑)。円6:ドラフトゲノムの83個の足場(灰色)。サークル7:注釈付き特徴:抗菌薬耐性決定要因(赤)、病原性関連遺伝子(紫)、およびプロファージ領域(水)。円8:%GCコンテンツ(黒)。円9:GCスキュー。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図2:EPEC株ACM5のサブシステム分布。 分析は RAST SEED アノテーションに基づいています。円グラフは細胞プロセスごとにサブシステムを整理し、それぞれの細胞プロセスに関与するタンパク質コード遺伝子を括弧内に示しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

補足ファイル 1. WGSデータの前処理、ソフトウェア、パラメータ設定、および 大腸菌 ACM5ゲノムの配列解析の説明。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

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Discussion

この研究は、病原性 大腸菌 変異体のゲノム特性評価のためのベンチトップシーケンサーとパイプラインを使用した細菌WGSワークフローの適応を示しています。使用するシーケンシングプラットフォームに応じて、特に増殖の遅い細菌を研究する場合、ウェットラボ手順(細菌培養、gDNA抽出、ライブラリ調製、シーケンシング)およびシーケンス分析のターンアラウンドタイム(TAB)は異なる場合があります。上記のWGSのプロトコルに従って、TATは4日以内であり、これは文献が現在述べているもの(<5日) 34に匹敵する。

大腸菌ACM5のゲノム配列決定の理論的カバレッジの深さは30倍と計算されました。それにもかかわらず、シーケンシングは38倍の深さでゲノムアセンブリの経験的データを生成しました。以前に推奨されたように35、これは全ゲノム表現を取得し、大腸菌ACM5の抗菌剤耐性、病原性、およびモビロームの特徴に関する下流のデータ分析を追跡するのに十分でした。抗菌剤耐性に関して、獲得された決定要因のみが調査された。大腸菌ACM5はアンピシリン耐性分離株であるが、MdfA多剤排出ポンプをコードする遺伝子のみが観察された。しかしながら、これはβ-ラクタム36に対する耐性を付与するものではなく、β-ラクタム耐性に関与する他の獲得決定基は同定されなかった。したがって、細胞膜透過性の低下や明確な排出ポンプシステムの発現の増加など、他の分子メカニズムの組み合わせが、観察されたアンピシリン耐性の根底にある可能性があります37。

病原性形質に関しては、インチミンコード遺伝子(eae)の唯一の存在がaEPEC株の特徴的な遺伝子マーカーです。aEPEC病型は、腸細胞消失(LEE)病原性アイランドの遺伝子座を保有する腸病原性大腸菌株のサブセットであり、Cif、EspA/B/D、EspF、intimin、および転座した内膜受容体(Tir)を含むT3SSおよび関連するエフェクター/トランスロケータータンパク質がコードされています。T3SSとそのエフェクターとの相互作用は、典型的な腸内病原性大腸菌(EPEC)およびEHECによる腸上皮細胞への付着および消失(A / E)病変を促進する能力に直接関与しており、どちらもヒトの食中毒原因物質として知られる病型です17,19。astA遺伝子はEAST1という名前の耐熱性エンテロトキシンをコードしており、最初に認識されEAEC株と関連していましたが、EAST1毒素は大腸菌の病型に広く分布しています38。ここで、WGSは、大腸菌ACM5がastA遺伝子を持っていることを示し、EAST1産生大腸菌分離株がヒトおよび動物の下痢性疾患に関連しているという事実にもかかわらず、下痢を誘発するその病原性の役割は議論の余地があります39。

この方法論的アプローチの主な限界は認識されるべきです。最初のコンティグレベルのアセンブリは、断片化されたドラフトゲノムをもたらし、したがって、より近い参照ゲノムに対してさらに足場にかけられた。実装されたシーケンシングリード長構成(2 x 150 bp)と大腸 菌 のゲノム全体に広大で反復的な要素が存在することは、断片化されたコンティグレベルのアセンブリの最も推定可能な説明です。ショートリードデータセットは正しく解決できないため、大きな反復要素を再構築し、アセンブリプロセス中に潜在的なミスアセンブリといくつかのブレークポイントを引き起こします。したがって、ロングリードシーケンシング技術の実装は、これらの制限を克服し、クローズドゲノムを取得するのに役立ちます40。

WGSプロトコル全体でいくつかの重要なステップを考慮する必要があります。高品質のgDNAは、高品質のシーケンシングデータを確保するために必要な最初のチェックポイントです。第二に、ライブラリ調製では、タグメンテーションプロセス中、特に複数のサンプルの取り扱いとインデックスプライマーの追加において、交差汚染を回避し、インキュベーション時間を制御してDNAサンプルを適切に断片化するために特別な注意を払う必要があります。さらに、プールされたライブラリの等モル比が正しくないと、サンプルあたりのリード数の分布が大幅に不均等になる可能性があるため、DNAライブラリが最終的なシーケンシングデータに導入する可能性のあるバイアスを排除するには、定量化および正規化のステップが不可欠です。ここで紹介する方法は簡単で、主にDNAライブラリ調製キットに含まれる試薬を最適に使用するための費用対効果の高い代替手段です。上記のWGSのプロトコルは、 大腸菌 ゲノムシーケンシングだけでなく、 腸炎ビブリオ41などの他の無関係な細菌種にも適用されています。国連食糧農業機関(FAO)と世界保健機関(WHO)によると、NGS方法論は、以前は不可能だった精度で微生物と抗菌薬耐性(AMR)の迅速な識別と特性評価を提供することにより、食品の安全性を決定する役割を果たすことができます42。したがって、これらの方法論は、臨床的状況だけでなく、食品媒介病原体のリスク評価においても、病原体の監視と発生源追跡のためのツールを構成し、これらの微生物の生態学的および生理学的特性への洞察を明らかにします43。

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Disclosures

著者は開示するものは何もありません。

Acknowledgments

ホセアントニオマガーニャリサラガ[No.481143]に授与された博士奨学金のために、メキシコ国立科学技術評議会(スペイン語の頭字語でCONACyT)に。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Accublock Mini digital dry bath Labnet D0100 Dry bath for incubation of tubes
Agencourt AMPure XP Beckman Coulter A63881 Magnetic beads in solution for DNA library purification
DeNovix DS-11 DeNovix Inc. UV-Vis spectophotometer to check the quality of the gDNA extracted
DNA LoBind Tubes Eppendorf 0030108418 1.5 mL PCR tubes for DNA library pooling
DynaMag-2 Magnet Invitrogen, Thermo Fisher Scientific 12321D Magnetic microtube rack used during magnetic beads-based DNA purification
Gram-negative Multibac I.D. Diagnostic reseach (Mexico) PT-35 Commercial standard antibiotic disks for antimicrobial susceptibility testing
MiniSeq Mid Output Kit (300-cycles) Illumina FC-420-1004 Reagent cartdrige for paired-end sequencing (2x150)
MiniSeq System Instrument Illumina SY-420-1001 Benchtop sequencer used for Next-generation sequencing
MiniSpin centrifuge Eppendorf 5452000816 Standard centrifuge for tubes
Nextera XT DNA Library Preparation Kit Illumina FC-131-1024 Reagents to perform DNA libraries for sequencing. Includes Box 1 and Box 2 reagents for 24 samples
Nextera XT Index Kit v2 Illumina FC-131-2001, FC-131-2002, FC-131-2003, FC-131-2004 Index set A, B, C, D
PhiX Control v3 Illumina FC-110-3001 DNA library control for sequencing
Precision waterbath LabCare America 51221081 Water bath shaker used for bacterial culture
Qubit 1X dsDNA HS Assay Kit Invitrogen, Thermo Fisher Scientific Q33231 Reagents for fluorescence-based DNA quantification assay
Qubit 2.0 Fluorometer Invitrogen, Thermo Fisher Scientific Q32866 Fluorometer used for fluorescence assay 
Qubit Assay tubes Invitrogen, Thermo Fisher Scientific Q32856 0.5 mL PCR tubes for fluorescence-based DNA quantification assay 
SimpliAmp Thermal Cycler Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific A24811 Thermocycler used for DNA library amplification
Spectronic GENESYS 10 Vis Thermo 335900 Spectophotometer used for bacterial suspension in antimicrobial susceptibility testing
ZymoBIOMICS DNA Miniprep Kit Zymo Research Inc. D4300 Kit for genomic DNA extraction (50 preps)

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Tags

遺伝学、第190号、全ゲノムシーケンス、 大腸菌、aEPEC、抗菌剤耐性、水産養殖、 オレオクロミス 属。

Erratum

Formal Correction: Erratum: Characterization of a Pathogenic Escherichia coli Strain Derived from Oreochromis spp. Farms Using Whole-Genome Sequencing
Posted by JoVE Editors on 02/02/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Characterization of a Pathogenic Escherichia coli Strain Derived from Oreochromis spp. Farms Using Whole-Genome Sequencing. The Authors section was updated from:

José Antonio Magaña-Lizárraga1,
Bruno Gómez-Gil2,
Julissa Enciso-Ibarra2,
María Elena Báez-Flores1
1Unidad de Investigaciones en Salud Pública “Dra. Kaethe Willms”, Facultad de Ciencias Químico Biológicas, Universidad Autónoma de Sinaloa, Ciudad Universitaria
2Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A. C. (CIAD), Unidad Mazatlán en Acuicultura y Manejo Ambiental

to:

José Antonio Magaña-Lizárraga1,
Bruno Gómez-Gil2,
Julissa Enciso-Ibarra2,
María Elena Báez-Flores1
1Unidad de Investigaciones en Salud Pública “Dra. Kaethe Willms”, Facultad de Ciencias Químico Biológicas, Universidad Autónoma de Sinaloa
2Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A. C. (CIAD), Unidad Mazatlán en Acuicultura y Manejo Ambiental

<em>オレオクロミス</em>属由来の病原性<em>大腸菌</em>株のキャラクタリゼーション 全ゲノムシーケンシングを使用する農場
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Magaña-Lizárraga, J. A.,… More

Magaña-Lizárraga, J. A., Gómez-Gil, B., Enciso-Ibarra, J., Báez-Flores, M. E. Characterization of a Pathogenic Escherichia coli Strain Derived from Oreochromis spp. Farms Using Whole-Genome Sequencing. J. Vis. Exp. (190), e64404, doi:10.3791/64404 (2022).

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