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JoVE Journal Genetics
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Genetics

Charakterisierung eines pathogenen Escherichia coli-Stammes aus Oreochromis spp. Farmen mit Ganzgenomsequenzierung

Published: December 23, 2022 doi: 10.3791/64404
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1Unidad de Investigaciones en Salud Pública “Dra. Kaethe Willms”, Facultad de Ciencias Químico Biológicas, Universidad Autónoma de Sinaloa, 2Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A. C. (CIAD), Unidad Mazatlán en Acuicultura y Manejo Ambiental

ERRATUM NOTICE

Summary

Die Machbarkeit von Gesamtgenomsequenzierungsstrategien (WGS) mit Tischgeräten hat die Genomabfrage jeder Mikrobe von Relevanz für die öffentliche Gesundheit in einer Laborumgebung vereinfacht. Eine methodische Anpassung des Workflows für bakterielle WGS wird beschrieben und eine bioinformatische Pipeline zur Analyse vorgestellt.

Abstract

Die Aquakultur ist einer der am schnellsten wachsenden lebensmittelproduzierenden Sektoren weltweit, und die Tilapia-Landwirtschaft (Oreochromis spp.) ist die wichtigste Süßwasserfischsorte, die kultiviert wird. Da Aquakulturpraktiken anfällig für mikrobielle Kontamination aus anthropogenen Quellen sind, ist ein umfassender Einsatz von Antibiotika erforderlich, was dazu führt, dass Aquakultursysteme zu einer wichtigen Quelle für antibiotikaresistente und pathogene Bakterien von klinischer Relevanz wie Escherichia coli (E. coli) werden. Hier wurden die antimikrobiellen Resistenz-, Virulenz- und Mobilommerkmale eines pathogenen E. coli-Stammes, der aus Oreochromis spp. aus Inlandzucht gewonnen wurde, durch Whole-Genom-Sequenzierung (WGS) und In-silico-Analyse aufgeklärt. Antimikrobielle Suszeptibilitätstests (AST) und WGS wurden durchgeführt. Darüber hinaus wurden phylogenetische Gruppe, Serotyp, Multilocus-Sequenz-Typisierung (MLST), erworbene antimikrobielle Resistenz, Virulenz, Plasmid und Prophagengehalt mit verschiedenen verfügbaren Web-Tools bestimmt. Das E. coli-Isolat zeigte nur eine intermediäre Empfindlichkeit gegenüber Ampicillin und wurde durch WGS-basierte Typisierung als ONT:H21-B1-ST40-Stamm charakterisiert. Obwohl nur ein einziges antimikrobielles Resistenz-assoziiertes Gen nachgewiesen wurde [mdf(A)], wurden mehrere Virulenz-assoziierte Gene (VAGs) aus dem atypischen enteropathogenen E. coli (aEPEC)-Pathotyp identifiziert. Zusätzlich wurde die Ladung von Plasmid-Replicons aus großen Plasmidgruppen und 18 Prophagen-assoziierten Regionen nachgewiesen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die WGS-Charakterisierung eines aEPEC-Isolats, das aus einer Fischfarm in Sinaloa, Mexiko, gewonnen wurde, Einblicke in sein pathogenes Potenzial und das mögliche Risiko des Verzehrs roher Aquakulturprodukte für die menschliche Gesundheit ermöglicht. Es ist notwendig, Next-Generation-Sequencing-Techniken (NGS) zur Untersuchung von Umweltmikroorganismen zu nutzen und einen One-Health-Rahmen zu verabschieden, um zu erfahren, wie Gesundheitsprobleme entstehen.

Introduction

Die Aquakultur ist einer der am schnellsten wachsenden lebensmittelproduzierenden Sektoren weltweit, und ihre Produktionspraktiken sollen die steigende Nachfrage nach Nahrungsmitteln für den menschlichen Verzehr befriedigen. Die weltweite Aquakulturproduktion hat sich von 34 Millionen Tonnen (Mt) im Jahr 1997 auf 112 Mt im Jahr 2017 verdreifacht1. Die wichtigsten Artengruppen, die fast 75% der Produktion ausmachten, waren Algen, Karpfen, Muscheln, Wels und Tilapia (Oreochromis spp.) 1. Das Auftreten von Krankheiten, die durch mikrobielle Einheiten verursacht werden, ist jedoch aufgrund der intensiven Fischzucht unvermeidlich, was zu potenziellen wirtschaftlichen Verlusten führt2.

Der Einsatz von Antibiotika in der Fischzucht ist bekannt für die Vorbeugung und Behandlung bakterieller Infektionen, dem wichtigsten limitierenden Faktor für die Produktivität 3,4. Dennoch reichern sich Restantibiotika in Aquakultursedimenten und im Wasser an, üben Selektionsdruck aus und verändern die fischassoziierten und die ansässigen Bakteriengemeinschaften 5,6,7,8. Folglich dient die Aquakulturumgebung als Reservoir für antimikrobielle Resistenzgene (ARGs) und das weitere Auftreten und die Ausbreitung antibiotikaresistenter Bakterien (ARB) im umgebenden Milieu9. Zusätzlich zu den bakteriellen Krankheitserregern, die häufig die Fischzuchtpraktiken beeinflussen, werden häufig Mitglieder der Enterobacteriaceae-Familie angetroffen, darunter humanpathogene Stämme von Enterobacter spp., Escherichia coli, Klebsiella spp. und Salmonella spp.10. E. coli ist der häufigste Mikroorganismus, der aus Fischmehl und Wasser in der Fischzucht isoliert wird 11,12,13,14,15.

E. coli ist ein vielseitiges gramnegatives Bakterium, das den Magen-Darm-Trakt von Säugetieren und Vögeln als kommensales Mitglied ihrer Darmmikrobiota bewohnt. E. coli besitzt jedoch eine sehr anpassungsfähige Fähigkeit, sich in verschiedenen Umweltnischen wie Boden, Sedimenten, Nahrung und Wasser zu besiedeln und zu persistieren16. Aufgrund des Gengewinns und -verlusts durch das Phänomen des horizontalen Gentransfers (HGT) hat sich E. coli schnell zu einem gut angepassten antibiotikaresistenten Erreger entwickelt, der in der Lage ist, ein breites Spektrum von Krankheiten bei Mensch und Tier zu verursachen17,18. Basierend auf dem isolierten Ursprung werden pathogene Varianten als intestinale pathogene E. coli (InPEC) oder extraintestinale pathogene E. coli (ExPEC) definiert. Darüber hinaus werden InPEC und ExPEC in genau definierte Pathotypen nach Krankheitsmanifestation, genetischem Hintergrund, phänotypischen Merkmalen und Virulenzfaktoren (VFs) unterteilt16,17,19.

Traditionelle Kultur- und molekulare Techniken für pathogene E. coli-Stämme haben den schnellen Nachweis und die Identifizierung verschiedener Pathotypen ermöglicht. Sie können jedoch zeitaufwendig und mühsam sein und erfordern häufig eine hohe technische Schulung19. Darüber hinaus kann aufgrund der Komplexität ihres genetischen Hintergrunds keine einzige Methode verwendet werden, um alle pathogenen Varianten von E. coli zuverlässig zu untersuchen. Derzeit wurden diese Nachteile mit dem Aufkommen von Hochdurchsatzsequenzierungstechnologien (HTS) überwunden. Whole-Genome Sequencing (WGS) -Ansätze und bioinformatische Werkzeuge haben die Erforschung mikrobieller DNA kostengünstig und in großem Maßstab verbessert und die eingehende Charakterisierung von Mikroben in einem einzigen Durchgang erleichtert, einschließlich eng verwandter pathogener Varianten20,21,22. Abhängig von den biologischen Fragestellungen können mehrere bioinformatische Werkzeuge, Algorithmen und Datenbanken verwendet werden, um Datenanalysen durchzuführen. Wenn das Hauptziel beispielsweise darin besteht, das Vorhandensein von ARGs, VFs und Plasmiden zu bewerten, können Tools wie ResFinder, VirulenceFinder und PlasmidFinder zusammen mit den zugehörigen Datenbanken ein guter Ausgangspunkt sein. Carriço et al.22 gaben einen detaillierten Überblick über die verschiedenen Bioinformatik-Software und zugehörigen Datenbanken, die für die mikrobielle WGS-Analyse eingesetzt werden, von der Vorverarbeitung von Rohdaten bis zur phylogenetischen Inferenz.

Mehrere Studien haben den breiten Nutzen von WGS für die Genomabfrage in Bezug auf antimikrobielle Resistenzattribute, pathogenes Potenzial und die Verfolgung der Entstehung und evolutionären Beziehungen klinisch relevanter Varianten von E. coli aus verschiedenen Ursprüngen gezeigt23,24,25,26 . WGS hat die Identifizierung molekularer Mechanismen ermöglicht, die der phänotypischen Resistenz gegen Antibiotika zugrunde liegen, einschließlich dieser seltenen oder komplexen Resistenzmechanismen. Dies geschieht durch den Nachweis erworbener ARG-Varianten, neuartiger Mutationen in Wirkstoffzielgenen oder Promotorregionen27,28. Darüber hinaus bietet WGS das Potenzial, antimikrobielle Resistenzprofile abzuleiten, ohne dass Vorkenntnisse über den Resistenzphänotyp eines Bakterienstamms erforderlichsind 29. Alternativ hat WGS die Charakterisierung der mobilen genetischen Elemente (MGEs) ermöglicht, die sowohl antimikrobielle Resistenz- als auch Virulenzmerkmale aufweisen, was die bakterielle Genomevolution bestehender Krankheitserreger vorangetrieben hat. Zum Beispiel führte die Anwendung von WGS während der Untersuchung des deutschen E. coli-Ausbruchs im Jahr 2011 zur Aufdeckung der einzigartigen genomischen Merkmale eines scheinbar neuartigen E. coli-Pathotyps; Interessanterweise stammten diese Ausbruchsstämme aus der enteroaggregativen E. coli (EAEC) -Gruppe, die den Prophagen, der das Shiga-Toxin kodiert, aus dem enterohämorrhagischen E. coli (EHEC) Pathotyp30 erwarb.

Diese Arbeit stellt eine methodische Anpassung des Workflows für bakterielle WGS mit einem Tischsequenzer vor. Darüber hinaus wird eine Bioinformatik-Pipeline mit webbasierten Werkzeugen bereitgestellt, um die resultierenden Sequenzen zu analysieren und Forscher mit begrenzter oder keiner bioinformatischen Expertise weiter zu unterstützen. Die beschriebenen Methoden ermöglichten die Aufklärung der antimikrobiellen Resistenz, Virulenz und Mobilommerkmale eines pathogenen E. coli-Stammes ACM5, der 2011 aus Oreochromis spp. aus Binnenzucht in Sinaloa, Mexikoisoliert wurde 12.

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Protocol

ANMERKUNG: Der E. coli-Stamm ACM5 wurde durch Verarbeitung und Kultivierung der Fischprobe für die Bestimmung der fäkalcoliformen (FC) gewonnen12. Während der Fischprobenahme zeigten die Fische keine klinischen Anzeichen von Krankheiten, Bakterien- oder Pilzinfektionen, und es herrschte eine Durchschnittstemperatur von 22,3 °C. Nach der Isolierung wurde das E. coli-Isolat biochemischen Tests unterzogen und kryokonserviert in Gehirnherzinfusionsbrühe (BHI) mit DMSO (8% v/v) als Kryoprotektivum.

1. Reaktivierung der gefrorenen E. coli ACM5-Stammkultur

  1. Öffnen Sie aus dem gefrorenen Bakterienfond das Röhrchen und verwenden Sie eine sterile Schlaufe, eine Pipettenspitze oder einen Zahnstocher, um die Oberfläche der gefrorenen Bakterienkultur abzukratzen.
  2. Die Bakterien auf eine Luria-Bertani (LB) Agarplatte streifen und bei 37 ± 2 °C 24 h inkubieren.

2. Bestimmung der antibakteriellen Empfindlichkeit

HINWEIS: Die hier beschriebene antimikrobielle Empfindlichkeitsprüfung entspricht der Scheibendiffusionsmethode auf der Grundlage der Richtlinien des Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) (M02 Ed13:2018)31. E. coli ATCC 25922 Stamm ist für Qualitätskontrollzwecke erforderlich.

  1. Inokulumpräparation mittels Koloniesuspensionsmethode
    1. Von der LB-Platte, die in Schritt 1.2 inkubiert wurde, streifen Sie eine oder zwei Kolonien auf eine Mueller-Hinton (MH) Agarplatte und inkubieren Sie bei 37 ± 2 °C für 18-24 h.
    2. Verwenden Sie eine sterile Schlaufe, um zwei oder drei Kolonien aus dem frisch subkultivierten E. coli-Isolat auf MH-Agarplatte zu entnehmen und sie in 3 ml steriler MH-Brühe oder 0,85% (w / v) Kochsalzlösung zu resuspendieren, wobei gründlich durch Wirbeln gemischt wird, um eine einheitliche Bakteriensuspension zu erhalten.
    3. Stellen Sie die Bakteriensuspension mit einem UV-sichtbaren Spektralphotometer (siehe Materialtabelle) auf eine Trübung ein, die mit einem 0,5-MacFarland-Standard vergleichbar ist (entspricht etwa 1-2 x 108 Zellen/ml). Wenn die Bakteriensuspension zu leicht oder zu schwer ist, fügen Sie je nach Bedarf weitere E. coli-Kolonien oder MH-Brühe hinzu . Verwenden Sie das vorbereitete Inokulum innerhalb von 15 Minuten nach der Zubereitung.
  2. Beimpfung der Testagarplatten
    1. Tauchen Sie ein steriles Wattestäbchen in die angepasste Bakteriensuspension. Drehen Sie den Tupfer mehrmals und drücken Sie ihn fest auf die Innenwand des Röhrchens, um überschüssige Flüssigkeit aus dem Tupfer zu entfernen.
    2. Beimpfen Sie eine MH-Agarplatte, indem Sie den Tupfer 3x über die gesamte Agaroberfläche streifen und die Platte jedes Mal um 60° drehen. Tupfen Sie auch den Rand des Agars ab, um eine gleichmäßige Verteilung des Inokulums zu gewährleisten.
    3. Lassen Sie den Petrischalendeckel 3-5 min stehen, damit die Feuchtigkeit verdunsten kann.
  3. Aufbringen der antimikrobiellen Scheibe auf beimpfte Agarplatten
    1. Verteilen Sie sie gleichmäßig und drücken Sie jede antimikrobielle Scheibe (siehe Materialtabelle) auf die Oberfläche der beimpften Agarplatten, um einen vollständigen Kontakt zu gewährleisten. Die Platten innerhalb von 15 min nach dem Auftragen der Scheibe umdrehen und bei 35 ± 2 °C für 16-18 h inkubieren.
      HINWEIS: In Petrischalen von 150 mm bzw. 100 mm dürfen maximal 12 bzw. sechs Scheiben verwendet werden.
  4. Messen Sie nach der Inkubation die Zone der Hemmungsgrößen mit einem Vernier-Messschieber und interpretieren Sie die resultierenden Durchmesser gemäß den CLSI-Breakpoint-Kriterien (M100 - Tabelle 2A)32.

3. Extraktion und Quantifizierung genomischer DNA (gDNA)

  1. Genomische DNA-Extraktion
    1. Resuspendieren Sie eine Schleife frisch kultivierter E . coli-Kolonien in 5 ml LB-Brühe und inkubieren Sie über Nacht in einem Schüttelinkubator (180 U/min) bei 37 ± 2 °C.
    2. Zentrifugieren Sie die Bakteriensuspension bei 3.500 x g für 5 min und entsorgen Sie den Überstand vorsichtig.
    3. Extrahieren Sie gDNA gemäß den Richtlinien für DNA-Extraktionskits (siehe Materialtabelle).
    4. Überprüfen Sie die Reinheit der gDNA, indem Sie die optische Dichte bei 260/280 nm (Verhältnis: >1,8) und 260/230 nm (Verhältnis: 2,0-2,2) mit einem UV-sichtbaren Spektralphotometer messen. Führen Sie eine 0,8% ige Agarose-Gelelektrophorese durch, um die gDNA-Integrität zu überprüfen.
  2. Genomische DNA-Quantifizierung
    HINWEIS: Verwenden Sie nur dünnwandige, klare 0,5-ml-PCR-Röhrchen, die vom Hersteller des Fluoreszenztest-Kits zugelassen sind (siehe Materialtabelle).
    1. Richten Sie die erforderliche Anzahl von Röhrchen für Proben und Assay-Standards ein. Bereiten Sie die funktionierende Assaylösung vor, indem Sie die im Kit enthaltenen Komponenten A und B gemäß den Anweisungen des Herstellers mischen.
    2. Bereiten Sie die Assay-Standards vor, indem Sie 190 μL der Arbeitslösung und 10 μL jedes Standards in das entsprechende Röhrchen geben (zwei Standards sind erforderlich).
    3. 198 μL der Arbeitslösung und 2 μL der DNA-Probe in das entsprechende Röhrchen geben. Kräftig mischen, indem Sie alle Röhren 5 s lang durchwirbeln. Achten Sie darauf, keine Blasen zu erzeugen.
    4. Alle Röhrchen 2 min bei Raumtemperatur lichtgeschützt inkubieren. Messen Sie die Fluoreszenz aller Röhrchen nach den Richtlinien des Herstellers mit dem Fluorometer (siehe Materialtabelle).
    5. Stellen Sie die Konzentration der gDNA-Probe für den Sequenzierungsvorgang richtig ein.

4. Vorbereitung der DNA-Bibliothek

HINWEIS: Die Vorbereitung und Sequenzierung der DNA-Bibliothek erfolgte gemäß den Richtlinien und Protokollen des Herstellers (siehe Materialtabelle). Die anfängliche gDNA-Konzentration beträgt 4,0 ng.

  1. Tagmentation, PCR-Amplifikation und Indexierung
    1. In einem 0,2-ml-Röhrchen werden 2,5 μL Tagmentationspuffer und 2 μL Eingangs-gDNA (2,0 ng/μL) hinzugefügt. Durch Pipettieren vorsichtig mischen.
    2. Fügen Sie 1 μL Amplifikationspuffer hinzu und mischen Sie vorsichtig durch Pipettieren. Bei 280 x g 1 min bei Raumtemperatur herunterdrehen.
    3. Legen Sie die Proben in einen Thermocycler (siehe Materialtabelle) und führen Sie das folgende PCR-Programm durch: 55 °C für 5 min, dann bei 10 °C halten. Wenn die Proben 10 °C erreichen, fahren Sie sofort fort, um die Reaktion zu neutralisieren.
    4. Geben Sie 1 μL neutralisierenden Puffer in die Probenröhrchen und mischen Sie vorsichtig durch Pipettieren. Bei 280 x g für 1 min herunterdrehen und 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
    5. Fügen Sie 1,7 μL jedes Indexadapters (d. h. Indizes i7 und i5) und 3 μL Indexing-PCR-Mastermix hinzu. Durch Pipettieren vorsichtig mischen. Bei 280 x g 1 min bei Raumtemperatur herunterdrehen.
    6. Legen Sie die Proben in den Thermocycler und führen Sie eine zweite PCR-Reaktion wie folgt durch: 72 °C für 3 min, 95 °C für 30 s, 18 Zyklen von 95 °C für 10 s, 55 °C für 30 s, 72 °C für 30 s, 72 °C für 5 min und bei 10 °C halten.
  2. Verstärkte Bibliotheksbereinigung
    1. Mischen Sie durch Vortexen der handelsüblichen magnetischen Perlenlösung (siehe Materialtabelle) gemäß den Richtlinien des Herstellers.
    2. Die markierte/indizierte gDNA-Probe wird in ein neues 1,5-ml-Röhrchen überführt und 0,6 μL magnetische Beads für jedes μL des endgültigen Volumens der gDNA-Probe (≈13 μL) hinzugefügt. Vorsichtig durch Pipettieren mischen und 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
    3. Legen Sie die Probenröhrchen für 2 min auf ein Magnetgestell (siehe Materialtabelle), bis der Überstand verschwunden ist. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand vorsichtig, ohne die Perlen zu stören.
    4. Fügen Sie 200 μL frisch zubereitetes 80% Ethanol ohne Mischen hinzu. Inkubieren Sie für 30 s, bis sich das Eluat klärt, und entfernen und verwerfen Sie vorsichtig den Überstand, ohne die Perlen zu stören.
    5. Führen Sie einen zweiten Waschschritt durch. 200 μL 80% Ethanol zu den Perlen geben und 30 s inkubieren. Nachdem der Eluat geklärt ist, entfernen und entsorgen Sie den Überstand und trocknen Sie die Perlen für 10 min an der Luft.
    6. 15 μL 10 mM Tris-Puffer (pH 8) zu den Beads geben und vorsichtig durch Pipettieren mischen. 2 min bei Raumtemperatur inkubieren. Legen Sie die Probenröhrchen für 2 min wieder auf das Magnetgestell, damit der Überstand klar werden kann.
    7. Übertragen Sie vorsichtig 14 μL des Überstands aus dem Probenröhrchen in ein neues 0,2-ml-Röhrchen. Dies ist die bereinigte Bibliothek.
      HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt kann die bereinigte Bibliothek bis zu 7 Tage bei -20 °C gelagert werden.
  3. Normalisierung der Bibliothek
    1. Fahren Sie mit der Quantifizierung der bereinigten Bibliotheken durch Fluoreszenztest fort, wie in Schritt 3.2 beschrieben, mit Ausnahme von Schritt 3.2.5.
    2. Visualisieren Sie die bereinigten Bibliotheken auf einer 1% igen Agarose-Gelelektrophorese, um die durchschnittlichen Fragmentgrößen zu bestimmen.
    3. Berechnen Sie den Molaritätswert der Bibliothek anhand der folgenden Gleichung:
      Equation 1
    4. Berechnen Sie anhand des Molaritätswerts die richtigen Volumina des Resuspensionspuffers (RSB) und der bereinigten Bibliotheken, um die einzelne Bibliothek bei einer Ausgangskonzentration von 10 nM zu verdünnen.

5. Bibliothekspooling, Denaturalisierung und Sequenzerinitiierung

  1. Tauen Sie die Reagenzienpatrone gemäß den Anweisungen des Herstellers auf. Entnehmen Sie die Durchflusszelle aus dem Kühlschrank (4 °C) und bringen Sie sie vor der Sequenzierung auf Raumtemperatur.
  2. Pool 5 μL jeder normalisierten Bibliothek (10 nM) in ein niedrig bindendes 1,5 ml Röhrchen. Verdünnen Sie die gepoolte Bibliothek bei 4 nM mit dem richtigen Volumen von RSB.
  3. Fügen Sie 5 μL der gepoolten Bibliothek (4 nM) und 5 μL 0,2 N NaOH in einem neuen 1,5-ml-Röhrchen mit niedriger Bindebindung hinzu. Kurz durch Wirbeln mischen, bei 280 x g für 1 min herunterdrehen und 5 min bei Raumtemperatur inkubieren, um die gepoolte Bibliothek in einzelne Stränge zu denaturieren.
  4. 10 μL denaturierte Poolbibliothek und 990 μL vorgekühlten Hybridisierungspuffer werden vorsichtig durch Pipettieren gemischt und auf Eis gelegt, bis die endgültige Verdünnung für die Sequenzerbeladung durchgeführt wurde. Die Konzentration der denaturierten Poolbibliothek beträgt 20 pM.
  5. Auftauen und Vorbereiten einer Kontrollbibliothek (siehe Materialtabelle) bei einer Konzentration von 4 nM durch Mischen von 2 μL Kontrollbibliothek (10 nM) und 3 μL nukleasefreiem Wasser.
  6. Mischen Sie 5 μL der Steuerungsbibliothek (4 nM) und 5 μL frisch zubereitetes 0,2 N NaOH. Kurz durch Wirbeln mischen, bei 280 x g für 1 min herunterdrehen und 5 min bei Raumtemperatur inkubieren, um die Steuerungsbibliothek in einzelne Stränge zu denaturieren.
  7. 10 μL denaturierte Kontrollbibliothek und 990 μL vorgekühlten Hybridisierungspuffer werden vorsichtig durch Pipettieren gemischt und auf Eis gelegt, bis die endgültige Verdünnung für die Sequenzerbeladung erfolgt ist. Die Konzentration der denaturierten Kontrollbibliothek beträgt 20 pM.
  8. In einem neuen Low-Bind-1,5-ml-Röhrchen werden 594 μL der denaturierten Poolbibliothek bei 20 pM und 6 μL der denaturierten Kontrollbibliothek bei 20 pM kombiniert. Richtig mischen.
  9. Die endgültige Bibliotheksmischung (20 pM) wird mit dem vorgekühlten Hybridisierungspuffer auf eine Endbelastungskonzentration von 1,2 pM in einem Volumen von 600 μL verdünnt.
  10. Bevor Sie die endgültige Bibliotheksmischung auf die Reagenzienpatrone laden, führen Sie eine zusätzliche thermische Vorbehandlung durch, um eine effiziente Beladung in die Durchflusszelle zu erreichen. Die endgültige Bibliotheksmischung für 2 min bei 96 °C inkubieren. Drehen Sie das Röhrchen um, um es zu mischen, und legen Sie das Röhrchen für 5 Minuten auf Eis.
  11. Laden Sie 500 μL der endgültigen Bibliotheksmischung in das vorgesehene Reservoir der Reagenzienpatrone. Initiieren Sie die Sequenzierung gemäß den Richtlinien. Laden Sie die Durchflusszelle und die Reagenzienkartusche und richten Sie den Sequenzierlauf ein.

6. Sequenzdatenanalyse

HINWEIS: In der Zusatzdatei 1 finden Sie eine weitere Beschreibung der allgemeinen WGS-Datenvorverarbeitung, Software, Parametereinstellungen und Sequenzanalyse des E. coli-Genoms.

  1. Stellen Sie eine Verbindung zum Sequenzdatenserver her und laden Sie die FASTQ-Dateien herunter.
  2. Bewerten Sie die anfängliche Qualität von Sequenzrohdaten mit Software von Drittanbietern. Entfernen Sie Restadaptersequenzen, Basen niedriger Qualität (Zusatzdatei 1).
  3. Stellen Sie die qualitätsgeprüften Sequenzierungsdaten mithilfe von Software von Drittanbietern auf Contig- oder Gerüstebene zusammen (siehe Zusatzdatei 1).
  4. Führen Sie eine Genomannotation durch, indem Sie die FASTA-Datei mit dem assemblierten Genom an den RAST-Server senden (https://rast.nmpdr.org/).
  5. Laden Sie die FASTA-Datei auf die Webplattformen Center for Genome Epidemiology (CGE) (http://www.genomicepidemiology.org/services/) und ClermonTyping (http://clermontyping.iame-research.center/index.php) hoch, um epidemiologische Merkmale, ARGs, VAGs und Plasmide zu identifizieren (siehe Zusatzdatei 1).
  6. Laden Sie die FASTA-Datei auf den PHASTER-Server hoch, um Prophagensequenzen (https://phaster.ca/) zu identifizieren.

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Representative Results

Die antimikrobielle Suszeptibilität wurde durch die Scheibendiffusionsmethode bestimmt und durch CLSI-Breakpoint-Kriterien für 12 Antibiotika interpretiert, die sechs verschiedene antimikrobielle Klassen umfassen, dh Aminoglykoside, β-Lactame, Fluorchinolone, Nitrofurane, Phenicole und Folatwegsantagonisten. Das E. coli ACM5 zeigte eine Empfindlichkeit gegenüber allen Antibiotika mit Ausnahme eines β-Lactam-Arzneimittels. Vier β-Lactam-Medikamente wurden getestet: Ampicillin, Carbenicillin, Cephalothin und Cefotaxim. Unter diesen wurde ein 14 mm Hemmungshalo für Ampicillin gemessen. Daher zeigt E. coli ACM5 gemäß den CLSI-Interpretationskategorien für Ampicillin (anfällig: ≥17 mm; intermediär: 14-16 mm; resistent: ≤13 mm) 32 eine intermediäre Anfälligkeit für Ampicillin.

Das E. coli ACM5 wurde mit dem Tischsequenzer einem WGS unterzogen. Daher wurde die DNA-Probe nach dem beschriebenen Protokoll präpariert, gemultiplext und sequenziert. Insgesamt ergab der Sequenzlauf mit Mid-Output-Konfiguration 3,37 GB Daten mit einer Fehlerrate von 0,73%, und 89,71% der Basen erzielten eine Qualität über Q3033. Insbesondere die Sequenzierung von E. coli ACM5 generierte insgesamt 1.490.594 gepaarte Endlesungen (PE). Die rohen Sequenzdaten aus dieser Studie wurden in der Datenbank des Sequence Read Archive (SRA) des National Center for Biotechnology Information (NCBI) unter der BioProject-Nummer PRJNA715781 hinterlegt.

Nach der ersten Qualitätsprüfung und Filterung wurden 96,8% der Lesevorgänge aus Rohsequenzierungsdaten konserviert und zu Gerüsten mit einer Abdeckungstiefe von 38x zusammengebaut. Die Genomassemblierung auf Gerüstebene erzeugte 83 Gerüste (>300 bp), 5.272.433 bp lang und mit 50,61% GC-Gehalt. Die Genomannotation ergab 5.633 kodierte Merkmale, von denen 5.524 proteinkodierende Gene (CDSs) und 109 RNA-verwandte Sequenzen sind (Abbildung 1). Darüber hinaus gruppierte die Genomannotation CDS in Sammlungen funktionell verwandter Proteine, die als Subsysteme bezeichnet werden, insbesondere solche, die funktionelle Rollen in Kohlenhydraten, Proteinen, Aminosäuren und abgeleiteten Stoffwechseln sowie im Membrantransport spielen (Abbildung 2).

Die In-silico-Typisierung sagte E. coli ACM5 als O-nichttypierbaren (ONT) Stamm voraus, der dem ONT:H21-Serotyp zugeordnet ist. Zusätzlich zeigte sich, dass es zur Stammgruppe B1 und zum Sequenztyp (ST) 40 gehört. Eine einzige erworbene antimikrobielle Resistenzdeterminante, die für eine Multidrug-Öfluxpumpe mit Breitbandspektrum kodiert, wurde identifiziert, nämlich das mdf(A)-Gen (Abbildung 1).

In Bezug auf Virulenzmerkmale wurden mehrere VAGs in dem untersuchten E. coli-Genom vorgestellt, darunter Gene, die für ein hitzestabiles Enterotoxin (astA), ein Serumresistenzprotein (iss) und das Typ-III-Sekretionssystem (T3SS) zusammen mit seinen sezernierten Effektorproteinen kodieren (Abbildung 1). Das bündelbildende Pili-Operon (BFP) und der perABC-Gencluster wurden nicht nachgewiesen. Folglich wurde E. coli ACM5 gemäß dem vorhergesagten Virulenzprofil dem aEPEC-Pathotyp zugeordnet.

Die WGS-Analyse ergab auch zwei mutmaßliche große Plasmide, die zu verschiedenen Inkompatibilitätsgruppen (Inc) im E. coli-Genom gehören (d.h. die IncF- und IncI-Plasmidgruppen). Beiden fehlten jedoch ARGs und VAGs. Darüber hinaus wurden 18 Prophagen-assoziierte Regionen identifiziert; Im Gegensatz zu Plasmiden beherbergen diese jedoch VAGs, darunter das iss-Gen, das sitABCD-Operon, das für einen Eisen/Mangan-Transporter kodiert, und einige T3SS-Effektorproteine (Abbildung 1).

Figure 1
Abbildung 1: Kreiskarte des Entwurfsgenoms von E. coli ACM5. Daten vom äußersten bis zum innersten Kreis werden wie folgt deklariert und eingefärbt. Kreis 1: Genomgrößenskala in Basenpaaren. Kreise 2 und 3: Annotierte CDSs, die auf dem vorderen (blauen) bzw. umgekehrten (roten) DNA-Strang transkribiert werden. Kreise 4 und 5: Ribosomale RNAs (schwarz) bzw. Transfer-RNAs (grün). Kreis 6: 83 Gerüste des Entwurfsgenoms (grau). Kreis 7: Kommentierte Merkmale: Antimikrobielle Resistenzdeterminanten (rot), Virulenz-assoziierte Gene (violett) und Prophagenregionen (aqua). Kreis 8: %GC-Gehalt (schwarz). Kreis 9: GC-Schiefe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: Subsystemverteilung des aEPEC-Stamms ACM5. Die Analyse basiert auf der RAST SEED-Annotation. Das Kreisdiagramm organisiert die Subsysteme nach zellulären Prozessen, und die proteinkodierenden Gene, die am jeweiligen zellulären Prozess beteiligt sind, sind in Klammern angegeben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Ergänzendes Dossier 1. Beschreibung der WGS-Datenvorverarbeitung, Software, Parametereinstellungen und Sequenzanalyse des E. coli ACM5-Genoms. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

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Discussion

Diese Studie stellt eine Anpassung des bakteriellen WGS-Workflows unter Verwendung eines Tischsequenzierers und einer Pipeline zur genomischen Charakterisierung einer pathogenen E. coli-Variante dar. Abhängig von der verwendeten Sequenzierungsplattform können die Durchlaufzeiten (TATs) für nasse Laborverfahren (Bakterienkultur, gDNA-Extraktion, Bibliotheksvorbereitung und Sequenzierung) und die Sequenzanalyse variieren, insbesondere wenn langsam wachsende Bakterien untersucht werden. Nach dem oben beschriebenen Protokoll für WGS lag die TAT innerhalb von 4 Tagen, was vergleichbar ist mit dem, was die Literatur derzeit angibt (<5 Tage) 34.

Die theoretische Abdeckungstiefe für die Genomsequenzierung von E. coli ACM5 wurde mit 30x berechnet. Nichtsdestotrotz generierte die Sequenzierung empirische Daten für die Genomassemblierung in 38-facher Tiefe. Wie zuvor empfohlen35, war dies ausreichend, um eine vollständige Genomdarstellung zu erhalten und nachgelagerte Datenanalysen hinsichtlich der antimikrobiellen Resistenz, Virulenz und Mobilommerkmale von E. coli ACM5 zu verfolgen. Unter Berücksichtigung der antimikrobiellen Resistenz wurden nur die erworbenen Determinanten untersucht. E. coli ACM5 ist ein Ampicillin-resistentes Isolat, aber nur das MdfA-Multidrug-Effluxpumpen-kodierende Gen wurde beobachtet. Dies verleiht jedoch keine Resistenz gegen β-Lactame36, und es wurde keine andere erworbene Determinante identifiziert, die an der β-Lactam-Resistenz beteiligt ist. Daher ist es wahrscheinlich, dass eine Kombination anderer molekularer Mechanismen, wie eine verminderte Zellmembranpermeabilität und eine erhöhte Expression verschiedener Ablaufpumpensysteme, der beobachteten Ampicillinresistenzzugrunde liegt 37.

In Bezug auf Virulenzmerkmale ist das alleinige Vorhandensein des intimin-kodierenden Gens (eae) der charakteristische genetische Marker von aEPEC-Stämmen. Der aEPEC-Pathotyp ist eine Untergruppe des intestinalen pathogenen E. coli-Stammes, der den Locus der Enterozyteneffacement (LEE) -Pathogenitätsinsel trägt, auf der ein T3SS und assoziierte Effektor- / Translokatorproteine kodiert sind, einschließlich Cif, EspA/B/D, EspF, Intimin und der translozierte Intiminrezeptor (Tir). Das Zusammenspiel zwischen T3SS und seinen Effektoren ist direkt an der Fähigkeit beteiligt, die anhaftenden und auslöschenden (A/E) Läsionen an Darmepithelzellen durch typische enteropathogene E. coli (EPEC) und EHEC, beides Pathotypen, die als Erreger menschlicher lebensmittelbedingter Krankheiten bekannt sind, zu fördern17,19. Das astA-Gen kodiert für ein hitzeresistentes Enterotoxin namens EAST1, und obwohl es zuerst erkannt und mit EAEC-Stämmen assoziiert wurde, ist das EAST1-Toxin unter den E. coli-Pathotypen38 weit verbreitet. Hier zeigte WGS, dass E. coli ACM5 das astA-Gen besitzt, und trotz der Tatsache, dass EAST1-produzierende E. coli-Isolate mit Durchfallerkrankungen bei Menschen und Tieren in Verbindung gebracht wurden, bleibt seine pathogene Rolle bei der Auslösung von Durchfall umstritten39.

Die wesentliche Einschränkung dieses methodischen Ansatzes sollte anerkannt werden; Die anfängliche Assemblierung auf Contig-Ebene führte zu einem fragmentierten Entwurf des Genoms und wurde daher einem weiteren Gerüst gegen ein näheres Referenzgenom ausgesetzt. Die implementierte Sequenzierungs-Leselängenkonfiguration (2 x 150 bp) und das Vorhandensein riesiger, sich wiederholender Elemente im gesamten Genom von E. coli sind die wahrscheinlichsten Erklärungen für die fragmentierte Anordnung auf Contig-Ebene. Short-Read-Datasets können nicht korrekt aufgelöst werden und rekonstruieren daher große, sich wiederholende Elemente, was zu potenziellen Fehlbaugruppen und mehreren Haltepunkten während des Montageprozesses führt. Daher würde die Implementierung von Long-Read-Sequenzierungstechnologien dazu beitragen, diese Einschränkungen zu überwinden und geschlossene Genome zu erhalten40.

Mehrere kritische Schritte müssen im gesamten WGS-Protokoll berücksichtigt werden. Hochwertige gDNA ist der erste Checkpoint, der erforderlich ist, um qualitativ hochwertige Sequenzierungsdaten zu gewährleisten. Zweitens muss bei der Bibliotheksvorbereitung während des Tagmentationsprozesses besondere Vorsicht geboten sein, insbesondere bei der Handhabung mehrerer Proben und der Zugabe von Indexprimern, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden, und bei der Kontrolle der Inkubationszeit, um die DNA-Proben ordnungsgemäß zu fragmentieren. Darüber hinaus sind Quantifizierungs- und Normalisierungsschritte unerlässlich, um jede Verzerrung zu eliminieren, die DNA-Bibliotheken in die endgültigen Sequenzierungsdaten einführen könnten, da ein falsches äquimolares Verhältnis in der gepoolten Bibliothek eine wesentlich ungleiche Verteilung der Anzahl der Lesevorgänge pro Probe begünstigen kann. Die hier vorgestellte Methode ist unkompliziert und stellt eine kostengünstige Alternative dar, vor allem für die optimale Nutzung der in den DNA-Bibliothekspräparationskits enthaltenen Reagenzien. Das oben beschriebene Protokoll für WGS wurde nicht nur auf die Sequenzierung des E . coli-Genoms, sondern auch auf andere nicht verwandte Bakterienarten wie Vibrio parahaemolyticus41 angewendet. Nach Angaben der Ernährungs- und Landwirtschaftsorganisation der Vereinten Nationen (FAO) und der Weltgesundheitsorganisation (WHO) können NGS-Methoden eine entscheidende Rolle bei der Lebensmittelsicherheit spielen, indem sie eine schnelle Identifizierung und Charakterisierung von Mikroorganismen und antimikrobiellen Resistenzen (AMR) mit einer Genauigkeit ermöglichen, die bisher nicht möglich war42. Daher stellen diese Methoden ein Instrument für die Überwachung und Quellenverfolgung von Krankheitserregern dar, nicht nur im klinischen Kontext, sondern auch bei der Risikobewertung lebensmittelbedingter Krankheitserreger, die Einblicke in die ökologischen und physiologischen Eigenschaften dieser Mikroorganismen liefern43.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Acknowledgments

An den Nationalen Rat für Wissenschaft und Technologie von Mexiko (CONACyT durch sein Akronym auf Spanisch) für das Promotionsstipendium an José Antonio Magaña-Lizárraga [Nr. 481143].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Accublock Mini digital dry bath Labnet D0100 Dry bath for incubation of tubes
Agencourt AMPure XP Beckman Coulter A63881 Magnetic beads in solution for DNA library purification
DeNovix DS-11 DeNovix Inc. UV-Vis spectophotometer to check the quality of the gDNA extracted
DNA LoBind Tubes Eppendorf 0030108418 1.5 mL PCR tubes for DNA library pooling
DynaMag-2 Magnet Invitrogen, Thermo Fisher Scientific 12321D Magnetic microtube rack used during magnetic beads-based DNA purification
Gram-negative Multibac I.D. Diagnostic reseach (Mexico) PT-35 Commercial standard antibiotic disks for antimicrobial susceptibility testing
MiniSeq Mid Output Kit (300-cycles) Illumina FC-420-1004 Reagent cartdrige for paired-end sequencing (2x150)
MiniSeq System Instrument Illumina SY-420-1001 Benchtop sequencer used for Next-generation sequencing
MiniSpin centrifuge Eppendorf 5452000816 Standard centrifuge for tubes
Nextera XT DNA Library Preparation Kit Illumina FC-131-1024 Reagents to perform DNA libraries for sequencing. Includes Box 1 and Box 2 reagents for 24 samples
Nextera XT Index Kit v2 Illumina FC-131-2001, FC-131-2002, FC-131-2003, FC-131-2004 Index set A, B, C, D
PhiX Control v3 Illumina FC-110-3001 DNA library control for sequencing
Precision waterbath LabCare America 51221081 Water bath shaker used for bacterial culture
Qubit 1X dsDNA HS Assay Kit Invitrogen, Thermo Fisher Scientific Q33231 Reagents for fluorescence-based DNA quantification assay
Qubit 2.0 Fluorometer Invitrogen, Thermo Fisher Scientific Q32866 Fluorometer used for fluorescence assay 
Qubit Assay tubes Invitrogen, Thermo Fisher Scientific Q32856 0.5 mL PCR tubes for fluorescence-based DNA quantification assay 
SimpliAmp Thermal Cycler Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific A24811 Thermocycler used for DNA library amplification
Spectronic GENESYS 10 Vis Thermo 335900 Spectophotometer used for bacterial suspension in antimicrobial susceptibility testing
ZymoBIOMICS DNA Miniprep Kit Zymo Research Inc. D4300 Kit for genomic DNA extraction (50 preps)

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Tags

Genetik Ausgabe 190 Sequenzierung des gesamten Genoms Escherichia coli aEPEC antimikrobielle Resistenz Aquakultur Oreochromis spp.

Erratum

Formal Correction: Erratum: Characterization of a Pathogenic Escherichia coli Strain Derived from Oreochromis spp. Farms Using Whole-Genome Sequencing
Posted by JoVE Editors on 02/02/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Characterization of a Pathogenic Escherichia coli Strain Derived from Oreochromis spp. Farms Using Whole-Genome Sequencing. The Authors section was updated from:

José Antonio Magaña-Lizárraga1,
Bruno Gómez-Gil2,
Julissa Enciso-Ibarra2,
María Elena Báez-Flores1
1Unidad de Investigaciones en Salud Pública “Dra. Kaethe Willms”, Facultad de Ciencias Químico Biológicas, Universidad Autónoma de Sinaloa, Ciudad Universitaria
2Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A. C. (CIAD), Unidad Mazatlán en Acuicultura y Manejo Ambiental

to:

José Antonio Magaña-Lizárraga1,
Bruno Gómez-Gil2,
Julissa Enciso-Ibarra2,
María Elena Báez-Flores1
1Unidad de Investigaciones en Salud Pública “Dra. Kaethe Willms”, Facultad de Ciencias Químico Biológicas, Universidad Autónoma de Sinaloa
2Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A. C. (CIAD), Unidad Mazatlán en Acuicultura y Manejo Ambiental

Charakterisierung eines pathogenen <em>Escherichia coli-Stammes</em> aus <em>Oreochromis</em> spp. Farmen mit Ganzgenomsequenzierung
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Magaña-Lizárraga, J. A.,… More

Magaña-Lizárraga, J. A., Gómez-Gil, B., Enciso-Ibarra, J., Báez-Flores, M. E. Characterization of a Pathogenic Escherichia coli Strain Derived from Oreochromis spp. Farms Using Whole-Genome Sequencing. J. Vis. Exp. (190), e64404, doi:10.3791/64404 (2022).

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