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Genetics

Caracterización de una cepa patógena de Escherichia coli derivada de granjas de Oreochromis spp.

Published: December 23, 2022 doi: 10.3791/64404
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1Unidad de Investigaciones en Salud Pública “Dra. Kaethe Willms”, Facultad de Ciencias Químico Biológicas, Universidad Autónoma de Sinaloa, 2Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A. C. (CIAD), Unidad Mazatlán en Acuicultura y Manejo Ambiental

ERRATUM NOTICE

Summary

La viabilidad de las estrategias de secuenciación del genoma completo (WGS) utilizando instrumentos de sobremesa ha simplificado la interrogación del genoma de cada microbio de relevancia para la salud pública en un entorno de laboratorio. Se describe una adaptación metodológica del flujo de trabajo para WGS bacteriano y también se presenta una tubería bioinformática para el análisis.

Abstract

La acuicultura es uno de los sectores productores de alimentos de más rápido crecimiento en todo el mundo y el cultivo de tilapia (Oreochromis spp.) constituye la principal variedad de peces de agua dulce cultivada. Debido a que las prácticas acuícolas son susceptibles a la contaminación microbiana derivada de fuentes antropogénicas, se necesita un uso extensivo de antibióticos, lo que lleva a que los sistemas acuícolas se conviertan en una fuente importante de bacterias patógenas y resistentes a los antibióticos de relevancia clínica como Escherichia coli (E. coli). Aquí, la resistencia antimicrobiana, la virulencia y las características del mobiloma de una cepa patógena de E. coli , recuperada de Oreochromis spp. cultivada en el interior, se dilucidaron mediante secuenciación del genoma completo (WGS) y análisis in silico . Se realizaron pruebas de sensibilidad antimicrobiana (AST) y WGS. Además, el grupo filogenético, el serotipo, la tipificación de secuencias multilocus (MLST), la resistencia antimicrobiana adquirida, la virulencia, el plásmido y el contenido de profagos se determinaron utilizando diversas herramientas web disponibles. El aislado de E. coli solo exhibió susceptibilidad intermedia a la ampicilina y se caracterizó como cepa ONT: H21-B1-ST40 por tipificación basada en WGS. Aunque solo se detectó un único gen relacionado con la resistencia a los antimicrobianos [mdf(A)], se identificaron varios genes asociados a la virulencia (VAG) del patotipo enteropatógeno atípico de E. coli (aEPEC). Además, se detectó la carga de replicones plásmidos de grandes grupos plásmidos y 18 regiones asociadas a profagos. En conclusión, la caracterización WGS de un aislado aEPEC, recuperado de una piscifactoría en Sinaloa, México, permite conocer su potencial patogénico y el posible riesgo para la salud humana de consumir productos acuícolas crudos. Es necesario explotar las técnicas de secuenciación de próxima generación (NGS) para estudiar los microorganismos ambientales y adoptar un marco de salud única para aprender cómo se originan los problemas de salud.

Introduction

La acuicultura es uno de los sectores productores de alimentos de más rápido crecimiento en todo el mundo, y sus prácticas de producción están destinadas a satisfacer la creciente demanda de alimentos para el consumo humano. La producción acuícola mundial se ha triplicado de 34 millones de toneladas (Mt) en 1997 a 112 Mt en 20171. Los principales grupos de especies, que contribuyeron a casi el 75% de la producción, fueron algas, carpas, bivalvos, bagres y tilapia (Oreochromis spp.) 1. Sin embargo, la aparición de enfermedades causadas por entidades microbianas es inevitable debido a la piscicultura intensiva, lo que lleva a posibles pérdidas económicas2.

El uso de antibióticos en las prácticas de piscicultura es bien conocido por prevenir y tratar infecciones bacterianas, el principal factor limitante en la productividad 3,4. Sin embargo, los antibióticos residuales se acumulan en los sedimentos y el agua de la acuicultura, ejerciendo una presión selectiva y modificando las comunidades bacterianas asociadas a los peces y residentes 5,6,7,8. En consecuencia, el ambiente acuícola sirve como reservorio para los genes de resistencia a los antimicrobianos (ARG), y la posterior aparición y propagación de bacterias resistentes a los antibióticos (ARB) en el medio circundante9. Además de los patógenos bacterianos comúnmente observados que afectan las prácticas de piscicultura, a menudo se encuentran miembros de la familia Enterobacteriaceae, incluidas cepas de patógenos humanos de Enterobacter spp., Escherichia coli, Klebsiella spp. y Salmonella spp.10. E. coli es el microorganismo más común aislado de la harina y el agua de pescado en la piscicultura 11,12,13,14,15.

E. coli es una bacteria gramnegativa versátil que habita en el tracto gastrointestinal de mamíferos y aves como miembro comensal de su microbiota intestinal. Sin embargo, E. coli posee una alta capacidad adaptativa para colonizar y persistir en diferentes nichos ambientales, incluyendo suelo, sedimentos, alimentos y agua16. Debido a la ganancia y pérdida de genes a través del fenómeno de transferencia horizontal de genes (HGT), E. coli ha evolucionado rápidamente hasta convertirse en un patógeno resistente a los antibióticos bien adaptado, capaz de causar un amplio espectro de enfermedades en humanos y animales17,18. Según el origen del aislamiento, las variantes patogénicas se definen como E. coli patógena intestinal (InPEC) o E. coli patógena extraintestinal (ExPEC). Además, InPEC y ExPEC se subclasifican en patotipos bien definidos de acuerdo con la manifestación de la enfermedad, los antecedentes genéticos, los rasgos fenotípicos y los factores de virulencia (FV)16,17,19.

El cultivo tradicional y las técnicas moleculares para cepas patógenas de E. coli han permitido la rápida detección e identificación de diferentes patotipos. Sin embargo, pueden llevar mucho tiempo, ser laboriosas y con frecuencia requieren una alta capacitación técnica19. Además, no se puede utilizar un método único para estudiar de manera confiable todas las variantes patogénicas de E. coli debido a la complejidad de sus antecedentes genéticos. Actualmente, estos inconvenientes se han superado con el advenimiento de las tecnologías de secuenciación de alto rendimiento (HTS). Los enfoques de secuenciación del genoma completo (WGS) y las herramientas bioinformáticas han mejorado la exploración del ADN microbiano de manera asequible y a gran escala, facilitando la caracterización en profundidad de los microbios en una sola ejecución, incluidas las variantes patogénicas estrechamente relacionadas20,21,22. Dependiendo de las preguntas biológicas, se pueden utilizar varias herramientas bioinformáticas, algoritmos y bases de datos para realizar análisis de datos. Por ejemplo, si el objetivo principal es evaluar la presencia de ARG, VF y plásmidos, herramientas como ResFinder, VirulenceFinder y PlasmidFinder, junto con sus bases de datos asociadas, podrían ser un buen punto de partida. Carriço et al.22 proporcionaron una visión detallada de los diferentes programas informáticos y bases de datos relacionadas aplicadas para el análisis microbiano de WGS, desde el preprocesamiento de datos brutos hasta la inferencia filogenética.

Varios estudios han demostrado la amplia utilidad de WGS para la interrogación del genoma con respecto a los atributos de resistencia a los antimicrobianos, el potencial patogénico y el seguimiento de la aparición y las relaciones evolutivas de variantes clínicamente relevantes de E. coli procedentes de diversos orígenes23,24,25,26 . WGS ha permitido la identificación de los mecanismos moleculares subyacentes a la resistencia fenotípica a los antimicrobianos, incluidos los mecanismos de resistencia raros o complejos. Esto es a través de la detección de variantes ARG adquiridas, mutaciones novedosas en genes diana de fármacos o regiones promotoras27,28. Además, WGS ofrece el potencial de inferir perfiles de resistencia antimicrobiana sin requerir conocimientos previos sobre el fenotipo de resistencia de una cepa bacteriana29. Alternativamente, WGS ha permitido la caracterización de los elementos genéticos móviles (MGE) portadores de características de resistencia antimicrobiana y virulencia, lo que ha impulsado la evolución del genoma bacteriano de los patógenos existentes. Por ejemplo, la aplicación de WGS durante la investigación del brote alemán de E. coli en 2011 resultó en el descubrimiento de las características genómicas únicas de un patotipo de E. coli aparentemente nuevo; Curiosamente, esas cepas del brote se originaron en el grupo enteroagregativo de E. coli (EAEC), que adquirió el profago que codifica la toxina Shiga del patotipo30 enterohemorrágico de E. coli (EHEC).

Este trabajo presenta una adaptación metodológica del flujo de trabajo para WGS bacteriano utilizando un secuenciador de sobremesa. Además, se proporciona una tubería de bioinformática utilizando herramientas basadas en la web para analizar las secuencias resultantes y apoyar aún más a los investigadores con experiencia limitada o nula en bioinformática. Los métodos descritos permitieron dilucidar la resistencia antimicrobiana, la virulencia y las características del mobiloma de una cepa patógena de E. coli ACM5, aislada en 2011 de Oreochromis spp. cultivada en el interior en Sinaloa, México12.

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Protocol

NOTA: La cepa ACM5 de E. coli se recuperó mediante el procesamiento y cultivo de la muestra de pescado para la determinación de coliformes fecales (FC)12. Durante el muestreo de peces, los peces no mostraron signos clínicos de enfermedad, infección bacteriana o fúngica, y prevaleció una temperatura media de 22,3 °C. Después del aislamiento, el aislado de E. coli se sometió a pruebas bioquímicas y se criopreservó en caldo de infusión cerebral cardíaca (BHI) con DMSO (8% v / v) como agente crioprotector.

1. Reactivación del cultivo de E . coli ACM5 congelado

  1. De la cepa bacteriana congelada, abra el tubo y use un asa estéril, una punta de pipeta o un palillo de dientes para raspar la superficie del cultivo bacteriano congelado.
  2. Rayar las bacterias en una placa de agar Luria-Bertani (LB) e incubar a 37 ± 2 °C durante 24 h.

2. Determinación de la susceptibilidad antibacteriana

NOTA: La prueba de sensibilidad antimicrobiana descrita aquí corresponde al método de difusión en disco basado en las directrices del Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) (M02 Ed13:2018)31. E. coli La cepa ATCC 25922 es necesaria para fines de control de calidad.

  1. Preparación de inóculo por el método de suspensión de colonias
    1. A partir de la placa LB incubada en el paso 1.2, rayar una o dos colonias en una placa de agar Mueller-Hinton (MH) e incubar a 37 ± 2 °C durante 18-24 h.
    2. Use un bucle estéril para recoger dos o tres colonias del aislado de E. coli recién subcultivado en una placa de agar MH y resuspenderlas en 3 ml de caldo MH estéril o solución salina al 0,85% (p/v), mezclando bien mediante vórtice para obtener una suspensión bacteriana uniforme.
    3. Usando un espectrofotómetro UV-visible (ver Tabla de materiales), ajuste la suspensión bacteriana a una turbidez comparable a un estándar de 0.5 MacFarland (equivalente a aproximadamente 1-2 x 108 células/ml). Si la suspensión bacteriana es demasiado ligera o demasiado pesada, agregue más colonias de E. coli o caldo MH según corresponda. Use el inóculo preparado dentro de los 15 minutos posteriores a la preparación.
  2. Inoculación de las placas de agar problema
    1. Sumerja un hisopo de algodón estéril en la suspensión bacteriana ajustada. Gire el hisopo varias veces y presiónelo firmemente en la pared interior del tubo para eliminar el exceso de líquido del hisopo.
    2. Inocular una placa de agar MH rayando el hisopo 3x sobre toda la superficie del agar, girando la placa 60° cada vez. Frote también el borde del agar para asegurar una distribución uniforme del inóculo.
    3. Deje la tapa de la placa de Petri entreabierta durante 3-5 minutos para permitir que la humedad se evapore.
  3. Aplicación del disco antimicrobiano en placas de agar inoculadas
    1. Distribuir uniformemente y presionar cada disco antimicrobiano (ver Tabla de materiales) hacia abajo sobre la superficie de las placas de agar inoculadas para asegurar un contacto completo. Invertir las placas dentro de los 15 minutos después de la aplicación del disco e incubar a 35 ± 2 °C durante 16-18 h.
      NOTA: Se debe utilizar un máximo de 12 y seis discos en placas de Petri de 150 mm y 100 mm, respectivamente.
  4. Después de la incubación, medir la zona de tamaños de inhibición utilizando un calibrador Vernier e interpretar los diámetros resultantes de acuerdo con los criterios de punto de ruptura CLSI (M100 - Tabla 2A)32.

3. Extracción y cuantificación del ADN genómico (ADNg)

  1. Extracción de ADN genómico
    1. Resuspender un bucle de colonias de E. coli recién cultivadas en 5 ml de caldo LB e incubar durante la noche en una incubadora agitadora (180 rpm) a 37 ± 2 °C.
    2. Centrifugar la suspensión bacteriana a 3.500 x g durante 5 min y desechar cuidadosamente el sobrenadante.
    3. Extraiga gDNA siguiendo las pautas del kit de extracción de ADN (consulte la Tabla de materiales).
    4. Compruebe la pureza del ADNg midiendo la densidad óptica a 260/280 nm (relación: >1,8) y 260/230 nm (relación: 2,0-2,2) utilizando un espectrofotómetro UV-visible. Realice electroforesis en gel de agarosa al 0,8% para verificar la integridad del ADNg.
  2. Cuantificación genómica del ADN
    NOTA: Utilice únicamente tubos de PCR transparentes de 0,5 ml de pared delgada aprobados por el fabricante del kit de ensayo de fluorescencia (consulte la Tabla de materiales).
    1. Configure el número requerido de tubos para muestras y estándares de ensayo. Prepare la solución de ensayo de trabajo mezclando el componente A y el componente B proporcionados en el kit, siguiendo las pautas del fabricante.
    2. Prepare los patrones de ensayo agregando 190 μL de la solución de trabajo y 10 μL de cada patrón al tubo apropiado (se requieren dos estándares).
    3. Añadir 198 μL de la solución de trabajo y 2 μL de la muestra de ADN al tubo apropiado. Mezclar vigorosamente haciendo vórtices de todos los tubos durante 5 s. Tenga cuidado de no crear burbujas.
    4. Incubar todos los tubos durante 2 min a temperatura ambiente, protegidos de la luz. Mida la fluorescencia de todos los tubos según las pautas del fabricante utilizando el fluorómetro (consulte la Tabla de materiales).
    5. Ajuste adecuadamente la concentración de la muestra de ADNg para el procedimiento de secuenciación.

4. Preparación de la biblioteca de ADN

NOTA: La preparación y secuenciación de la biblioteca de ADN se realizó siguiendo las pautas y protocolos del fabricante (consulte la Tabla de materiales). La concentración inicial de ADNg es de 4,0 ng.

  1. Etiquetado, amplificación por PCR e indexación
    1. En un tubo de 0,2 ml, añadir 2,5 μL de tampón de etiquetado y 2 μL de gDNA de entrada (2,0 ng/μL). Mezclar suavemente por pipeteo.
    2. Añadir 1 μL de tampón de amplificación y mezclar suavemente con pipeteo. Girar a 280 x g durante 1 minuto a temperatura ambiente.
    3. Coloque las muestras en un termociclador (consulte la Tabla de materiales) y ejecute el siguiente programa de PCR: 55 °C durante 5 min, luego mantenga a 10 °C. Cuando las muestras alcancen los 10 °C, proceder inmediatamente a neutralizar la reacción.
    4. Añadir 1 μL de tampón neutralizante a los tubos de muestra y mezclar suavemente mediante pipeteo. Girar a 280 x g durante 1 min e incubar durante 5 min a temperatura ambiente.
    5. Agregue 1,7 μL de cada adaptador de índice (es decir, los índices i7 e i5) y 3 μL de mezcla maestra de PCR de indexación. Mezclar suavemente por pipeteo. Girar a 280 x g durante 1 minuto a temperatura ambiente.
    6. Colocar las muestras en el termociclador y realizar una segunda reacción de PCR de la siguiente manera: 72 °C durante 3 min, 95 °C durante 30 s, 18 ciclos de 95 °C durante 10 s, 55 °C durante 30 s, 72 °C durante 30 s, 72 °C durante 5 min, y mantener a 10 °C.
  2. Limpieza amplificada de la biblioteca
    1. Mezcle mediante vórtice la solución comercial de perlas magnéticas (consulte la Tabla de materiales) según las pautas del fabricante.
    2. Transfiera la muestra de ADNg marcada/indexada a un nuevo tubo de 1,5 ml y agregue 0,6 μL de perlas magnéticas por cada μL del volumen final de la muestra de ADNg (≈13 μL). Mezclar suavemente pipeteando e incubar durante 5 min a temperatura ambiente.
    3. Coloque los tubos de muestra en una rejilla magnética (consulte la Tabla de materiales) durante 2 minutos hasta que el sobrenadante se haya aclarado. Retire y deseche el sobrenadante con cuidado sin alterar las cuentas.
    4. Agregue 200 μL de etanol al 80% recién preparado sin mezclar. Incubar durante 30 s hasta que el eluya aclare y retirar y desechar con cuidado el sobrenadante sin perturbar las cuentas.
    5. Realice un segundo paso de lavado. Añadir 200 μL de etanol al 80% a las perlas e incubar durante 30 s. Después de que el eluya se aclare, retire y deseche el sobrenadante y seque al aire las perlas durante 10 minutos.
    6. Añadir 15 μL de tampón tris de 10 mM (pH 8) a las perlas y mezclar suavemente con pipeteo. Incubar durante 2 min a temperatura ambiente. Coloque los tubos de muestra de nuevo en la rejilla magnética durante 2 minutos, dejando que el sobrenadante se aclare.
    7. Transfiera cuidadosamente 14 μL del sobrenadante del tubo de muestra a un nuevo tubo de 0,2 ml. Esta es la biblioteca limpia.
      NOTA: En este punto, la biblioteca limpia se puede almacenar a -20 °C durante un máximo de 7 días.
  3. Normalización de bibliotecas
    1. Proceda a cuantificar las bibliotecas limpiadas mediante ensayo de fluorescencia como se describe en el paso 3.2, excepto el paso 3.2.5.
    2. Visualice las bibliotecas limpias en una electroforesis en gel de agarosa al 1% para determinar el tamaño promedio de los fragmentos.
    3. Calcula el valor de molaridad de la biblioteca usando la siguiente ecuación:
      Equation 1
    4. Usando el valor de molaridad, calcule los volúmenes adecuados de tampón de resuspensión (RSB) y bibliotecas limpias para diluir la biblioteca individual a una concentración inicial de 10 nM.

5. Agrupación de bibliotecas, desnaturalización e inicio del secuenciador

  1. Descongele el cartucho de reactivo siguiendo las instrucciones del fabricante. Extraiga la celda de flujo del refrigerador (4 °C) y llévela a temperatura ambiente antes de la secuenciación.
  2. Agrupar 5 μL de cada biblioteca normalizada (10 nM) en un tubo de 1,5 ml de unión baja. Diluir la biblioteca agrupada a 4 nM con el volumen adecuado de RSB.
  3. Agregue 5 μL de la biblioteca agrupada (4 nM) y 5 μL de NaOH 0.2 N en un nuevo tubo de 1.5 ml de bajo enlace. Mezclar brevemente por vórtice, girar hacia abajo a 280 x g durante 1 minuto e incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente para desnaturalizar la biblioteca agrupada en hebras individuales.
  4. Mezclar suavemente 10 μL de biblioteca agrupada desnaturalizada y 990 μL de tampón de hibridación preenfriado mediante pipeteo y colocar en hielo hasta que se realice la dilución final para la carga del secuenciador. La concentración de la biblioteca desnaturalizada es de 20 pM.
  5. Descongele y prepare una biblioteca de control (ver Tabla de materiales) a una concentración de 4 nM mezclando 2 μL de biblioteca de control (10 nM) y 3 μL de agua libre de nucleasas.
  6. Mezclar 5 μL de la biblioteca de control (4 nM) y 5 μL de NaOH 0,2 N recién preparado. Mezclar brevemente por vórtice, girar hacia abajo a 280 x g durante 1 minuto e incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente para desnaturalizar la biblioteca de control en hebras individuales.
  7. Mezclar suavemente 10 μL de biblioteca de control desnaturalizada y 990 μL de tampón de hibridación preenfriado mediante pipeteo y colocar en hielo hasta que se realice la dilución final para la carga del secuenciador. La concentración de la biblioteca de control desnaturalizada es de 20 pM.
  8. En un nuevo tubo de 1,5 ml de bajo enlace, combine 594 μL de la biblioteca agrupada desnaturalizada a 20 pM y 6 μL de la biblioteca de control desnaturalizada a 20 pM. Mezclar adecuadamente.
  9. Diluir la mezcla final de biblioteca (20 pM) hasta una concentración de carga final de 1,2 pM en un volumen de 600 μL utilizando el tampón de hibridación preenfriado.
  10. Antes de cargar la mezcla de biblioteca final en el cartucho de reactivo, realice un pretratamiento térmico adicional para lograr una carga eficiente en la celda de flujo. Incubar la mezcla final de la biblioteca durante 2 min a 96 °C. Invierta el tubo para mezclar y coloque el tubo en hielo durante 5 minutos.
  11. Cargue 500 μL de la mezcla final de biblioteca en el depósito diseñado en el cartucho de reactivo. Inicie la secuenciación siguiendo las pautas. Cargue la celda de flujo y el cartucho de reactivo y configure la ejecución de secuenciación.

6. Análisis de datos de secuencia

NOTA: Consulte el Archivo Suplementario 1 para obtener una descripción más detallada del preprocesamiento general de datos WGS, el software, la configuración de parámetros y el análisis de secuencia del genoma de E. coli.

  1. Conéctese al servidor de datos de secuenciación y descargue los archivos FASTQ.
  2. Evalúe la calidad inicial de los datos de secuencia sin procesar con software de terceros. Elimine las secuencias de adaptadores remanentes, las bases de baja calidad (el archivo complementario 1).
  3. Reúna los datos de secuenciación de calidad comprobada en nivel de contig o andamiaje utilizando software de terceros (consulte el Archivo complementario 1).
  4. Realice la anotación del genoma enviando el archivo FASTA que contiene el genoma ensamblado al servidor RAST (https://rast.nmpdr.org/).
  5. Cargue el archivo FASTA en las plataformas web del Centro de Epidemiología del Genoma (CGE) (http://www.genomicepidemiology.org/services/) y ClermonTyping (http://clermontyping.iame-research.center/index.php) para identificar características epidemiológicas, ARG, VAG y plásmidos (consulte el Archivo complementario 1).
  6. Cargue el archivo FASTA en el servidor PHASTER para identificar secuencias de profagos (https://phaster.ca/).

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Representative Results

La susceptibilidad antimicrobiana se determinó mediante el método de difusión en disco y se interpretó mediante criterios de punto de corte CLSI para 12 antibióticos que abarcan seis clases antimicrobianas distintas, es decir, aminoglucósidos, β-lactámicos, fluoroquinolonas, nitrofuranos, fenicoles y antagonistas de la vía del folato. La E. coli ACM5 mostró sensibilidad a todos los antibióticos excepto a un fármaco β-lactámico. Se probaron cuatro fármacos β-lactámicos: ampicilina, carbenicilina, cefalotina y cefotaxima. Entre estos, se midió un halo de inhibición de 14 mm para la ampicilina. Por lo tanto, de acuerdo con las categorías interpretativas CLSI para ampicilina (susceptible: ≥17 mm; intermedio: 14-16 mm; resistente: ≤13 mm) 32, E. coli ACM5 muestra una susceptibilidad intermedia a la ampicilina.

La E. coli ACM5 se sometió a WGS utilizando el secuenciador de sobremesa. Por lo tanto, la muestra de ADN fue preparada, multiplexada y secuenciada siguiendo el protocolo descrito. En general, la ejecución de secuenciación mantenida con la configuración de salida media produjo 3,37 Gb de datos con una tasa de error del 0,73%, y el 89,71% de las bases obtuvieron una calidad superior a Q3033. En particular, la secuenciación de E. coli ACM5 generó un total de 1.490.594 lecturas de extremo pareado (PE). Los datos brutos de la secuencia de este estudio se depositaron en la base de datos del archivo de lectura de secuencias (SRA) en el Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) bajo el número de BioProyecto PRJNA715781.

Después del control de calidad y filtrado inicial, el 96,8% de las lecturas se conservaron a partir de datos de secuenciación sin procesar y se ensamblaron en andamios con una profundidad de cobertura de 38x. El ensamblaje del genoma a nivel de andamio generó 83 andamios (>300 pb), 5.272.433 pb de longitud y con un contenido de GC del 50,61%. La anotación del genoma reveló 5.633 características codificadas, de las cuales 5.524 son genes codificadores de proteínas (CDS) y 109 son secuencias relacionadas con el ARN (Figura 1). Además, la anotación del genoma agrupó los CDS en colecciones de proteínas funcionalmente relacionadas llamadas subsistemas, especialmente aquellas que desempeñan funciones funcionales en carbohidratos, proteínas, aminoácidos y metabolismos derivados, y transporte de membrana (Figura 2).

La tipificación in silico predijo E. coli ACM5 como una cepa O-no tipificable (ONT) asignada al serotipo ONT:H21. Además, mostró que pertenece al filogrupo B1 y al tipo de secuencia (ST) 40. Se identificó un único determinante de resistencia antimicrobiana adquirido que codifica una bomba de eflujo multifármaco de amplio espectro, es decir, el gen mdf(A) (Figura 1).

En cuanto a los rasgos de virulencia, varios VAGs aparecen en el genoma de E. coli en estudio, incluidos los genes que codifican para una enterotoxina termoestable (astA), una proteína de resistencia sérica (iss) y el sistema de secreción tipo III (T3SS) junto con sus proteínas efectoras secretadas (Figura 1). El operón pili formador de haz (BFP) y el grupo de genes perABC no se evidenciaron. En consecuencia, de acuerdo con el perfil de virulencia previsto, E. coli ACM5 se asignó al patotipo aEPEC.

El análisis de WGS también reveló dos plásmidos grandes putativos pertenecientes a diferentes grupos de incompatibilidad (Inc) en el genoma de E. coli (es decir, los grupos de plásmidos IncF e IncI). Sin embargo, ambos carecían de ARG y VAG. Además, se identificaron 18 regiones asociadas a profagos; sin embargo, a diferencia de los plásmidos, estos albergan VAG, incluido el gen iss, el operón sitABCD que codifica para un transportador de hierro / manganeso y algunas proteínas efectoras T3SS (Figura 1).

Figure 1
Figura 1: Mapa circular del borrador del genoma de E. coli ACM5. Los datos de los círculos más externos a los más internos se declaran y colorean de la siguiente manera. Círculo 1: Escala de tamaño del genoma en pares de bases. Círculos 2 y 3: CDS anotados transcritos en la cadena de ADN hacia adelante (azul) y hacia atrás (rojo), respectivamente. Círculos 4 y 5: ARN ribosómicos (negro) y ARN de transferencia (verde), respectivamente. Círculo 6: 83 andamios del borrador del genoma (gris). Círculo 7: Características anotadas: determinantes de la resistencia a los antimicrobianos (rojo), genes asociados a la virulencia (púrpura) y regiones profágicas (aqua). Círculo 8: % Contenido GC (negro). Círculo 9: Sesgo de GC. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Distribución del subsistema de la cepa ACM5 de aEPEC. El análisis se basa en la anotación RAST SEED. El gráfico circular organiza los subsistemas por proceso celular, y los genes codificadores de proteínas involucrados en el proceso celular respectivo se indican entre paréntesis. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Expediente complementario 1. Descripción del preprocesamiento de datos WGS, software, configuración de parámetros y análisis de secuencia del genoma ACM5 de E. coli. Haga clic aquí para descargar este archivo.

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Discussion

Este estudio presenta una adaptación del flujo de trabajo bacteriano de WGS utilizando un secuenciador de sobremesa y una tubería para la caracterización genómica de una variante patógena de E. coli. Dependiendo de la plataforma de secuenciación utilizada, los tiempos de respuesta (ATT) para procedimientos de laboratorio húmedos (cultivo bacteriano, extracción de ADNg, preparación de bibliotecas y secuenciación) y análisis de secuencias podrían variar, particularmente si se estudian bacterias de crecimiento lento. Siguiendo el protocolo para WGS descrito anteriormente, el TAT fue dentro de los 4 días, lo que es comparable a lo que la literatura actualmente afirma (<5 días) 34.

La profundidad teórica de cobertura para la secuenciación del genoma de E. coli ACM5 se calculó en 30x. No obstante, la secuenciación generó datos empíricos para el ensamblaje del genoma a una profundidad 38x. Como se recomendó anteriormente35, esto fue suficiente para obtener una representación completa del genoma y seguir el análisis de datos posteriores con respecto a la resistencia antimicrobiana, la virulencia y las características del mobiloma de E. coli ACM5 . Respetando la resistencia a los antimicrobianos, solo se investigaron los determinantes adquiridos. E. coli ACM5 es un aislado resistente a la ampicilina, pero solo se observó el gen que codifica la bomba de eflujo multifármaco MdfA. Sin embargo, esto no confiere resistencia a β-lactámicos36, y no se identificó ningún otro determinante adquirido involucrado en la resistencia a β-lactámicos. Por lo tanto, es probable que una combinación de otros mecanismos moleculares, como la disminución de la permeabilidad de la membrana celular y el aumento de la expresión de distintos sistemas de bomba de eflujo, esté subyacente a la resistencia a la ampicilina observada37.

En cuanto a los rasgos de virulencia, la sola presencia del gen codificador de intimina (eae) es el marcador genético distintivo de las cepas aEPEC. El patotipo aEPEC es un subconjunto de cepa patógena intestinal de E. coli que lleva el locus de la isla de patogenicidad de borramiento de enterocitos (LEE), donde se codifican una T3SS y proteínas efectoras/translocadoras asociadas, incluyendo Cif, EspA/B/D, EspF, intimina y el receptor de intimina translocado (Tir). La interacción entre T3SS y sus efectores está directamente involucrada en la capacidad de promover la adhesión y eliminación de lesiones (A/E) en las células epiteliales intestinales por E. coli enteropatógena típica (EPEC) y EHEC, ambos patotipos conocidos como agentes causantes de enfermedades transmitidas por alimentos humanos17,19. El gen astA codifica una enterotoxina resistente al calor denominada EAST1, y aunque fue reconocida y asociada por primera vez con cepas EAEC, la toxina EAST1 está ampliamente distribuida entre los patotipos de E. coli 38. Aquí, WGS demostró que E. coli ACM5 posee el gen astA, y a pesar del hecho de que los aislados de E. coli productores de EAST1 se han asociado con enfermedades diarreicas en humanos y animales, su papel patogénico en la provocación de diarrea sigue siendo controvertido39.

Debe reconocerse la limitación clave de este enfoque metodológico; El ensamblaje inicial a nivel de contig dio como resultado un borrador de genoma fragmentado y, por lo tanto, se sometió a un andamiaje contra un genoma de referencia más cercano. La configuración de longitud de lectura de secuenciación implementada (2 x 150 pb) y la presencia de elementos vastos y repetitivos en todo el genoma de E. coli son las explicaciones más presumibles para el ensamblaje fragmentado a nivel de contig. Los conjuntos de datos de lectura corta no pueden resolver correctamente y, por lo tanto, reconstruir elementos repetitivos grandes, lo que provoca posibles errores de ensamblaje y varios puntos de interrupción durante el proceso de ensamblaje. Por lo tanto, la implementación de tecnologías de secuenciación de lectura larga ayudaría a superar estas limitaciones y obtener genomas cerrados40.

Se deben considerar varios pasos críticos a lo largo del protocolo WGS. El ADNg de alta calidad es el primer punto de control necesario para garantizar datos de secuenciación de alta calidad. En segundo lugar, en la preparación de la biblioteca, se debe tener especial precaución durante el proceso de marcado, especialmente en el manejo de múltiples muestras y la adición de cebadores índice, para evitar la contaminación cruzada, y en el control del tiempo de incubación, para fragmentar adecuadamente las muestras de ADN. Además, los pasos de cuantificación y normalización son esenciales para eliminar cualquier sesgo que las bibliotecas de ADN puedan introducir en los datos finales de secuenciación, ya que una relación equimolar incorrecta en la biblioteca agrupada puede favorecer una distribución sustancialmente desigual en el número de lecturas por muestra. El método presentado aquí es sencillo y representa una alternativa rentable, principalmente, para el uso óptimo de los reactivos contenidos en los kits de preparación de la biblioteca de ADN. El protocolo para WGS descrito anteriormente se ha aplicado no solo a la secuenciación del genoma de E. coli sino también a otras especies bacterianas no relacionadas como Vibrio parahaemolyticus41. Según la Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura (FAO) y la Organización Mundial de la Salud (OMS), las metodologías NGS pueden desempeñar un papel determinante en la inocuidad de los alimentos al proporcionar una rápida identificación y caracterización de microorganismos y resistencia a los antimicrobianos (RAM) con una precisión que antes no era posible42. Por lo tanto, estas metodologías constituyen una herramienta para la vigilancia y el seguimiento de la fuente de patógenos, no solo en el contexto clínico sino también en la evaluación del riesgo de patógenos transmitidos por los alimentos, revelando información sobre las propiedades ecológicas y fisiológicas de estos microorganismos43.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología de México (CONACyT) por la beca de doctorado otorgada a José Antonio Magaña-Lizárraga [No. 481143].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Accublock Mini digital dry bath Labnet D0100 Dry bath for incubation of tubes
Agencourt AMPure XP Beckman Coulter A63881 Magnetic beads in solution for DNA library purification
DeNovix DS-11 DeNovix Inc. UV-Vis spectophotometer to check the quality of the gDNA extracted
DNA LoBind Tubes Eppendorf 0030108418 1.5 mL PCR tubes for DNA library pooling
DynaMag-2 Magnet Invitrogen, Thermo Fisher Scientific 12321D Magnetic microtube rack used during magnetic beads-based DNA purification
Gram-negative Multibac I.D. Diagnostic reseach (Mexico) PT-35 Commercial standard antibiotic disks for antimicrobial susceptibility testing
MiniSeq Mid Output Kit (300-cycles) Illumina FC-420-1004 Reagent cartdrige for paired-end sequencing (2x150)
MiniSeq System Instrument Illumina SY-420-1001 Benchtop sequencer used for Next-generation sequencing
MiniSpin centrifuge Eppendorf 5452000816 Standard centrifuge for tubes
Nextera XT DNA Library Preparation Kit Illumina FC-131-1024 Reagents to perform DNA libraries for sequencing. Includes Box 1 and Box 2 reagents for 24 samples
Nextera XT Index Kit v2 Illumina FC-131-2001, FC-131-2002, FC-131-2003, FC-131-2004 Index set A, B, C, D
PhiX Control v3 Illumina FC-110-3001 DNA library control for sequencing
Precision waterbath LabCare America 51221081 Water bath shaker used for bacterial culture
Qubit 1X dsDNA HS Assay Kit Invitrogen, Thermo Fisher Scientific Q33231 Reagents for fluorescence-based DNA quantification assay
Qubit 2.0 Fluorometer Invitrogen, Thermo Fisher Scientific Q32866 Fluorometer used for fluorescence assay 
Qubit Assay tubes Invitrogen, Thermo Fisher Scientific Q32856 0.5 mL PCR tubes for fluorescence-based DNA quantification assay 
SimpliAmp Thermal Cycler Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific A24811 Thermocycler used for DNA library amplification
Spectronic GENESYS 10 Vis Thermo 335900 Spectophotometer used for bacterial suspension in antimicrobial susceptibility testing
ZymoBIOMICS DNA Miniprep Kit Zymo Research Inc. D4300 Kit for genomic DNA extraction (50 preps)

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Genética Número 190 secuenciación del genoma completo Escherichia coli aEPEC resistencia antimicrobiana acuicultura Oreochromis spp.

Erratum

Formal Correction: Erratum: Characterization of a Pathogenic Escherichia coli Strain Derived from Oreochromis spp. Farms Using Whole-Genome Sequencing
Posted by JoVE Editors on 02/02/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Characterization of a Pathogenic Escherichia coli Strain Derived from Oreochromis spp. Farms Using Whole-Genome Sequencing. The Authors section was updated from:

José Antonio Magaña-Lizárraga1,
Bruno Gómez-Gil2,
Julissa Enciso-Ibarra2,
María Elena Báez-Flores1
1Unidad de Investigaciones en Salud Pública “Dra. Kaethe Willms”, Facultad de Ciencias Químico Biológicas, Universidad Autónoma de Sinaloa, Ciudad Universitaria
2Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A. C. (CIAD), Unidad Mazatlán en Acuicultura y Manejo Ambiental

to:

José Antonio Magaña-Lizárraga1,
Bruno Gómez-Gil2,
Julissa Enciso-Ibarra2,
María Elena Báez-Flores1
1Unidad de Investigaciones en Salud Pública “Dra. Kaethe Willms”, Facultad de Ciencias Químico Biológicas, Universidad Autónoma de Sinaloa
2Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A. C. (CIAD), Unidad Mazatlán en Acuicultura y Manejo Ambiental

Caracterización de una cepa patógena de <em>Escherichia coli</em> derivada de <em>granjas de Oreochromis</em> spp.
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Magaña-Lizárraga, J. A.,… More

Magaña-Lizárraga, J. A., Gómez-Gil, B., Enciso-Ibarra, J., Báez-Flores, M. E. Characterization of a Pathogenic Escherichia coli Strain Derived from Oreochromis spp. Farms Using Whole-Genome Sequencing. J. Vis. Exp. (190), e64404, doi:10.3791/64404 (2022).

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