Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

نموذج زراعة الخلايا الأولية الثلاثية للحاجز الدموي الدماغي البشري لدراسة السكتة الدماغية الإقفارية في المختبر

Published: October 6, 2022 doi: 10.3791/64469
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1,2
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Miller School of Medicine, University of Miami, 2Institute of Physiotherapy and Health Sciences, The Jerzy Kukuczka Academy of Physical Education

Summary

هنا ، نصف طريقة إنشاء نموذج زراعة الخلايا الثلاثية للحاجز الدموي الدماغي بناء على الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة الأولية للدماغ البشري ، والخلايا النجمية ، والخلايا المحيطة. هذا النموذج متعدد الخلايا مناسب لدراسات الخلل الوظيفي لوحدة الأوعية الدموية العصبية أثناء السكتة الدماغية الإقفارية في المختبر أو لفحص الأدوية المرشحة.

Abstract

السكتة الدماغية الإقفارية هي سبب رئيسي للوفاة والعجز في جميع أنحاء العالم مع خيارات علاجية محدودة. يتميز علم الأمراض العصبية للسكتة الدماغية بانقطاع في تدفق الدم إلى الدماغ مما يؤدي إلى موت الخلايا والخلل المعرفي. أثناء وبعد السكتة الدماغية الإقفارية ، يسهل الخلل الوظيفي للحاجز الدموي الدماغي (BBB) تطور الإصابة ويساهم في ضعف تعافي المريض. تشمل نماذج BBB الحالية في المقام الأول الزراعات الأحادية البطانية والثقافات المشتركة المزدوجة مع الخلايا النجمية أو pericytes.

تفتقر هذه النماذج إلى القدرة على التقليد الكامل لبيئة الدماغ الدقيقة الديناميكية ، وهو أمر ضروري للتواصل من خلية إلى خلية. بالإضافة إلى ذلك ، غالبا ما تحتوي نماذج BBB شائعة الاستخدام على خلايا بطانية بشرية خالدة أو مزارع خلايا مشتقة من الحيوانات (القوارض أو الخنازير أو الأبقار) التي تشكل قيودا متعدية. تصف هذه الورقة نموذج BBB الجديد القائم على الإدراج الجيد والذي يحتوي فقط على الخلايا البشرية الأولية (الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة في الدماغ ، والخلايا النجمية ، والخلايا المحيطة بالأوعية الدموية في الدماغ) مما يتيح التحقيق في إصابة الدماغ الإقفارية في المختبر.

تم تقييم آثار الحرمان من الأكسجين والجلوكوز (OGD) على سلامة الحاجز من خلال النفاذية السلبية ، وقياسات المقاومة الكهربائية عبر البطانية (TEER) ، والتصور المباشر للخلايا التي تعاني من نقص الأكسجين. يقدم البروتوكول المقدم ميزة واضحة تحاكي البيئة بين الخلايا ل BBB في الجسم الحي ، حيث يعمل كنموذج BBB أكثر واقعية في المختبر لتطوير استراتيجيات علاجية جديدة في وضع إصابة الدماغ الإقفارية.

Introduction

السكتة الدماغية هي واحدة من الأسباب الرئيسية للوفاة والعجز على المدى الطويل في جميع أنحاء العالم1. يزداد معدل الإصابة بالسكتة الدماغية بسرعة مع تقدم العمر ، حيث يتضاعف كل 10 سنوات بعد سن 552. تحدث السكتة الدماغية الإقفارية نتيجة لاضطراب تدفق الدم الدماغي بسبب الأحداث الخثارية والصمية ، والتي تشمل أكثر من 80 ٪ من جميع حالات السكتة الدماغية3. حتى الآن ، هناك عدد قليل نسبيا من خيارات العلاج المتاحة لتقليل موت الأنسجة بعد السكتة الدماغية. العلاجات الموجودة حساسة للوقت وبالتالي لا تؤدي دائما إلى نتائج سريرية جيدة. لذلك ، هناك حاجة ماسة للبحث عن الآليات الخلوية المعقدة للسكتة الدماغية التي تؤثر على التعافي بعد السكتة الدماغية.

BBB هي واجهة ديناميكية لتبادل الجزيئات بين الدم وحمة الدماغ. من الناحية الهيكلية ، يتكون BBB من خلايا بطانة الأوعية الدموية الدقيقة في الدماغ مترابطة بواسطة مجمعات متقاطعة محاطة بغشاء قاعدي ، وخلايا محيطية ، وأقدام نجمية4. تلعب الخلايا النجمية والخلايا النجمية دورا أساسيا في الحفاظ على سلامة BBB من خلال إفراز العوامل المختلفة اللازمة لتشكيل تقاطعات قوية وضيقة 5,6. انهيار BBB هو واحد من السمات المميزة للسكتة الدماغية. تؤدي الاستجابة الالتهابية الحادة والإجهاد التأكسدي المرتبط بنقص التروية الدماغية إلى تعطيل مجمعات بروتين الوصلات الضيقة والحديث المتبادل غير المنظم بين الخلايا النجمية والخلايا المحيطة والخلايا البطانية ، مما يؤدي إلى زيادة نفاذية المذاب عبر BBB7. يعزز ضعف BBB تكوين وذمة الدماغ ويزيد من خطر التحول النزفي8. بالنظر إلى كل ما سبق ، هناك اهتمام كبير بفهم التغيرات الجزيئية والخلوية التي تحدث على مستوى BBB أثناء وبعد السكتة الدماغية.

على الرغم من أن العديد من نماذج BBB في المختبر قد تم تطويرها على مدى العقود الأخيرة واستخدامها في مجموعة متنوعة من الدراسات ، إلا أنه لا يمكن لأي منها التكرار الكامل في ظروف الجسم الحي 9. في حين أن بعض النماذج تعتمد على أحاديات الخلايا البطانية المستزرعة على دعامات نفاذة جيدة الإدخال بمفردها أو بالاشتراك مع pericytes أو الخلايا النجمية ، إلا أن الدراسات الحديثة فقط هي التي أدخلت تصميمات نماذج زراعة الخلايا الثلاثية. تتضمن جميع نماذج BBB الثلاثية الموجودة تقريبا خلايا بطانة الدماغ الأولية جنبا إلى جنب مع الخلايا النجمية والخلايا المحيطة المعزولة من الأنواع الحيوانية أو الخلايا المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات10،11،12،13.

إدراكا للحاجة إلى تلخيص BBB البشري بشكل أفضل في المختبر ، أنشأنا نموذج BBB لثقافة الخلايا الثلاثية في المختبر يتكون من الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة في الدماغ البشري (HBMEC) ، والخلايا النجمية البشرية الأولية (HA) ، والخلايا الوعائية الأولية للدماغ البشري (HBVP). تم إعداد نموذج BBB الثلاثي هذا على 6 آبار ، وإدراج غشاء بوليستر بحجم مسام 0.4 ميكرومتر. توفر هذه الحشوات الجيدة بيئة مثالية لربط الخلايا وتتيح سهولة الوصول إلى كل من المقصورات القمية (الدموية) والقاعدية (الدماغية) لأخذ العينات المتوسطة أو التطبيق المركب. يتم تقييم ميزات نموذج BBB المقترح لثقافة الخلايا الثلاثية عن طريق قياس TEER والتدفق شبه الخلوي بعد OGD الذي يحاكي السكتة الدماغية الإقفارية في المختبر ، مع نقص الأكسجين (<1٪ O2) والمواد المغذية (باستخدام وسط خال من الجلوكوز) يتم تحقيقه باستخدام غرفة رطبة ومغلقة. بالإضافة إلى ذلك ، يتم التحقق بدقة من الحالات الشبيهة بنقص التروية المستحثة في هذا النموذج عن طريق التصور المباشر لخلايا نقص الأكسجين.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: راجع جدول المواد للحصول على التفاصيل المتعلقة بجميع الخلايا والمواد والمعدات والحلول المستخدمة في هذا البروتوكول.

1. إعداد نموذج BBB لثقافة الخلايا الثلاثية

  1. بذر pericytes
    1. قم بزراعة HBVP في قوارير ثقافة T75 بسطح نشط للالتصاق الخلايا داخل حاضنة CO2 بنسبة 5٪ عند 37 درجة مئوية حتى تتلاقى. بمجرد الوصول إلى نقطة التقاء ، استنشق الوسط القديم حول الخلية واغسل الخلايا ب 5 مل من محلول ملحي دافئ من دولبيكو (DPBS). قم بشفط DPBS وافصل الخلايا عن القارورة باستخدام مزيج من 4 مل من محلول التربسين-EDTA الدافئ و 1 مل من DPBS.
      ملاحظة: تجنب استخدام المقاطع بعد P7.
    2. احتضان القارورة لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 . عرض تحت المجهر للتأكد مما إذا كانت الخلايا منفصلة عن القارورة. أضف 5 مل من وسط pericyte الدافئ (يحتوي على 2٪ مصل بقري جنيني [FBS]) إلى القارورة وانقل الخلايا المنفصلة إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل.
    3. قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية لمدة 3 دقائق عند 200 × جم ، مما يسمح للخلايا بتكوين حبيبات في قاع الأنبوب. قم بشفط الوسط من الأنبوب ، مع ضمان بقاء حبيبات الخلية سليمة.
    4. إعادة تعليق بيليه الخلية في وسط pericyte ؛ احسب مقدار الوسيط اعتمادا على التقاء الخلايا وعدد إدخالات البئر المطلوبة. خذ 10 ميكرولتر من الخلايا المعاد تعليقها ، وضعها في شريحة عد الخلايا ، وعد عدد الخلايا.
    5. تحديد كثافة الخلية وزرع 300000 خلية / إدخال في 1 مل من وسط pericyte على الجانب اللميء من إدخالات البئر (تنسيق 6 آبار).
      ملاحظة: عند بذر HBVP على الجانب السفلي من الإدخالات ، من المهم جدا أولا قلب ألواح الإدخال جيدا رأسا على عقب. أثناء وضع اللوحة بشكل مسطح على سطح ، قم بإزالة القسم السفلي لكشف الجانب اللميء من إدخالات البئر. بعد إضافة تعليق خلية pericyte على الجانب اللمعي ، قم بتغطية إدخالات البئر باللوحة المقلوبة لمنع التبخر. حافظ على جميع الأطباق مقلوبة رأسا على عقب في حاضنة 5٪ CO2 عند 37 درجة مئوية طوال الليل.
  2. بذر الخلايا النجمية
    1. قم بزراعة HA في قوارير T75 داخل حاضنة CO2 بنسبة 5٪ عند 37 درجة مئوية حتى يتم الوصول إلى التقاء. اتبع الخطوات المذكورة أعلاه 1.1.1-1.1.4 باستخدام وسط الخلايا النجمية (يحتوي أيضا على 2٪ FBS) بدلا من وسط pericyte.
      ملاحظة: تجنب استخدام مقاطع لاحقة ل P9.
    2. تحديد كثافة الخلية وزرع 300000 خلية / بئر في الجزء السفلي من زراعة الأنسجة 6 ألواح بئر. قم بتغطية اللوحة لمنع التبخر واحتفظ بجميع الألواح في حاضنة CO2 بنسبة 5٪ عند 37 درجة مئوية طوال الليل.
  3. بذر الخلايا البطانية
    1. زراعة "حمدان بن محمد بن محمد بن راشد آل مكتوم في أطباق زراعة الأنسجة" ضمن حاضنة 5٪ CO2 عند 37 درجة مئوية حتى تتلاقى المكونات. اتبع الخطوات المذكورة أعلاه 1.1.1-1.1.4 باستخدام وسيط كلاسيكي كامل (يحتوي على 10٪ FBS) بدلا من وسيط pericyte.
      ملاحظة: تجنب استخدام مقاطع لاحقة ل P12.
    2. أخرج ألواح زراعة الأنسجة المكونة من 6 آبار والتي تحتوي على الخلايا النجمية وإدخالات البئر (تنسيق 6 آبار) التي تحتوي على pericytes من حاضنة CO2 بنسبة 5٪ عند 37 درجة مئوية. نضح وسط الخلية النجمية من لوحات زراعة الأنسجة 6 آبار. أضف 1 مل من وسط pericyte و 1 مل من وسط الخلية النجمية إلى كل بئر.
    3. استنشاق وسط pericyte من إدخالات البئر ووضعها في لوحات زراعة الأنسجة 6 بئر تحتوي على الخلايا النجمية المصنفة. قم بزرع HBMEC بكثافة 300,000 خلية / بئر في 2 مل من الوسط الكلاسيكي الكامل على الجانب القمي من نفس حشوات البئر.
      ملاحظة: يجب أن تزرع الخلايا البطانية على الجانب القمي من إدخالات البئر في اليوم التالي بعد بذر الخلايا المحيطة على الجانب اللامع من إدخالات البئر والخلايا النجمية على ألواح زراعة الأنسجة المكونة من 6 آبار. يجب الحفاظ على الخلايا في ثقافة ثلاثية لمدة 6 أيام للحث على خصائص تشبه BBB. يجب تغيير وسط زراعة الخلية في كل من مقصورات الإدخال الجيد قبل 24 ساعة من التجارب.

2. تحريض الحرمان من الأكسجين والجلوكوز

  1. اغسل الخلايا 3x باستخدام DPBS. بالنسبة لمزارع الخلايا الثلاثية المعرضة ل OGD ، أضف وسيطا خاليا من الجلوكوز (بدون L-glutamine و phenol red) إلى كل من المقصورات القمية والقاعدية. استبدل وسط الاستزراع بوسط جديد في مزارع خلايا التحكم العادية. ضع الثقافات الثلاثية للتحكم في حاضنة CO2 بنسبة 5٪ عند 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: قد تؤدي التغييرات المتوسطة قبل تحريض OGD أو مباشرة بعد OGD إلى خلق إجهاد ميكانيكي من شأنه أن يؤثر بشكل أكبر على أحاديات الخلايا البطانية. وبالتالي ، يتم تضمين الخطوات مع استبدال المتوسطة لثقافات خلايا التحكم normoxic.
  2. ضع طبق بتري يحتوي على 20 مل من الماء المعقم في غرفة حاضنة نقص الأكسجة لتوفير ترطيب كاف للثقافات. افتح الغرفة عن طريق تحرير المشبك الدائري. ترتيب الثقافات الخلية على الرفوف. أغلق الغرفة عن طريق تأمين المشبك الدائري.
  3. افتح كل من منافذ مدخل ومخرج الغرفة. قم بتوصيل الأنبوب القادم من أعلى مقياس التدفق بالغرفة. قم بتوصيل الأنبوب القادم من أسفل مقياس التدفق بخزان الغاز الذي يحتوي على خليط غاز 95٪ N 2/5٪ CO2عبر مرشح هواء. 
  4. افتح صمام التحكم في تدفق الخزان عن طريق تدويره عكس اتجاه عقارب الساعة للسماح بالحد الأدنى من تدفق الغاز. افتح صمام منظم الضغط ببطء عن طريق الدوران في اتجاه عقارب الساعة.
  5. اغسل الحجرة بخليط الغاز بمعدل تدفق 20 لترا / دقيقة لمدة 5 دقائق. افصل الغرفة عن مصدر الغاز وأغلق المشابك البلاستيكية البيضاء بإحكام.
  6. قم بإيقاف تشغيل صمام التحكم في تدفق الخزان عن طريق الدوران في اتجاه عقارب الساعة. أغلق صمام منظم الضغط عن طريق الدوران عكس اتجاه عقارب الساعة.
  7. ضع غرفة نقص الأكسجة في حاضنة تقليدية عند 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعات.
    ملاحظة: لإضافة فترة إعادة أكسجة لاحقة ، اغسل الخلايا 3x باستخدام DPBS ، وأضف وسيطا جديدا في جميع الثقافات الثلاثية ، واحتفظ بها لمدة 24 ساعة إضافية في حاضنة 5٪ CO2 عند 37 درجة مئوية. وفقا لتعليمات الشركة الصانعة ، يكون تركيز الأكسجين المتبقي في الغرفة 0٪ بعد ما لا يقل عن 4 دقائق من التطهير بخليط الغاز اللاهوائي عند 20 لتر / دقيقة.

3. قياسات TEER

  1. ضع أداة TEER المعقمة في خزانة السلامة الحيوية وقم بتوصيل الأقطاب الكهربائية بمقياس الفولتوهمتري الظهاري. تعقيم الأقطاب الكهربائية في 30 مل من محلول كحول الأيزوبروبيل 70٪ لمدة لا تقل عن 30 دقيقة.
  2. قم بتشغيل أداة TEER واضبط الوظيفة على أوم.
  3. قم بإزالة الأقطاب الكهربائية من محلول كحول الأيزوبروبيل بنسبة 70٪ وضعها في 20 مل من DPBS لمدة لا تقل عن 30 دقيقة حتى تقرأ القراءة الرقمية على جهاز TEER 0 أوم.
  4. أدخل الشق الطويل للقطب من خلال إحدى الفتحات الثلاث في شماعات إدخال البئر للتحكم في إدخال البئر الفارغ ، وقم بخفضه حتى يلامس قاع البئر. تأكد من أن الشق القصير يستقر فوق الثقافة القمية في الجزء السفلي من إدخال البئر.
    ملاحظة: يتكون عنصر التحكم في إدخال البئر الفارغ من 2 مل من الوسط الكلاسيكي الكامل في المقصورة القمية ومزيج من 1 مل من وسط pericyte و 1 مل من وسط الخلايا النجمية في المقصورة القاعدية. تأكد من أن الأقطاب الكهربائية مثبتة عند 90 درجة في إدخال البئر أثناء أخذ قياس TEER. يمكن أن يساعد استخدام متوسط قراءتين أو ثلاث قراءات تم الحصول عليها في نفس البئر (لكل فتحة) في تقليل التباين.
  5. انتظر حتى يتم إيقاف قيم القراءة الرقمية على مستوى أداة TEER قبل تسجيل القيمة. ضع الأقطاب الكهربائية مرة أخرى في DPBS لغسلها بين القياسات. استمر في جمع جميع قياسات TEER لاثنين من عناصر التحكم الفارغة في الإدراج الجيد.
  6. اجمع قياسات TEER لألواح العينات باستخدام الخطوات 3.4-3.5 المأخوذة لقياسات التحكم. بمجرد أخذ جميع القياسات ، ضع القطب مرة أخرى في محلول كحول الأيزوبروبيل بنسبة 70٪ لمدة 30 دقيقة. افصل الأقطاب الكهربائية عن جهاز TEER واتركها تجف في الهواء.
  7. احسب قيم TEER. استخدم المعادلة (1) لطرح متوسط قيمة أوم لعنصر التحكم في إدخال البئر الفارغ من قيمة أوم للعينة ، ثم اضرب قيمة المقاومة هذه في مساحة إدخال الغشاء (سم 2) لإعطاء قيمة TEER المبلغ عنها في Ω∙cm2.
    Equation 1 (1)

4. تقييم نفاذية BBB شبه الخلوية

ملاحظة: نفذ جميع الخطوات التي تنطوي على FITC-dextran في خزانة السلامة الحيوية لزراعة الخلايا مع إطفاء الأنوار. قم بتغطية محاليل FITC-dextran بورق الألمنيوم لتقليل التبييض الضوئي.

  1. تحضير المحاليل التي تحتوي على FITC-dextrans من 20 و 70 كيلو دالتون (0.1 ملغ / مل) باستخدام وسط نمو الخلايا البطانية الخالية من الفينول الأحمر والسماح للتحريك على شاكر منصة هزاز لمدة 1 ساعة. قم بتصفية المحاليل باستخدام مرشح حقنة 0.22 ميكرومتر.
  2. قم بشفط الوسط من المقصورة القاعدية واستبدله ب 2 مل من وسط نمو الخلايا البطانية الخالية من الفينول الأحمر في نموذج BBB لزراعة الخلايا الثلاثية. اغسل الخلايا في المقصورة القمية مرتين باستخدام محلول الملح المتوازن من هانكس (HBSS).
  3. أضف 1 مل من محلول FITC-dextran في المقصورة القمية وقم بتغطية اللوحة بورق الألمنيوم. ضع اللوحة في حاضنة 5٪ CO2 عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
  4. خذ 100 ميكرولتر من الوسط من المقصورات القاعدية وانقله إلى لوحة سوداء ذات 96 بئرا. قم بقياس التألق باستخدام قارئ الصفائح الدقيقة مع ضبط الأطوال الموجية للإثارة والانبعاث على 480 نانومتر و 530 نانومتر على التوالي.

5. الكشف عن نقص الأكسجة في الخلايا الحية

  1. بذرة 200 ميكرولتر من HBMEC و HA و HBVP في وسط أطباق قاع زجاجي 35 مم مطلية ببولي دي ليسين بكثافة 150000 خلية / طبق. قبل بذر "إتش بي إم إي سي"، قم بتغطية الجزء السفلي من الأطباق بعامل الربط. اسمح للخلايا بالالتصاق بالسطح الزجاجي عن طريق تركها طوال الليل عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 .
    ملاحظة: من المهم وضع الأطباق مع الخلايا الأولية البشرية في نفس الوقت مع نموذج BBB ثلاثي الإدخال جيدا في غرفة نقص الأكسجة ل OGD.
  2. بمجرد الوصول إلى نقطة التقاء ، تخلص من وسط الاستزراع وأضف 2 مل من الوسط الخالي من الجلوكوز قبل التسخين (ل OGD) أو الوسط العادي (للضوابط) الذي يحتوي على 2 ميكرولتر من 1 mM Hoechst 33342 (التركيز النهائي 0.2 ميكرومتر) و 0.5 ميكرولتر من محلول مخزون 5 mM لكاشف نقص الأكسجة الأخضر Image-iT المشار إليه (التركيز النهائي 1 ميكرومتر). بعد علاج OGD ، استبدل الوسيط بوسيط التصوير المحسن في جميع الأطباق.
  3. قم بإجراء تصوير الخلايا الحية الفلورية باستخدام مرشح GFP وحاضنة المجهر متحد البؤر في المرحلة العليا كما هو موضح سابقا14,15.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

لدراسة تأثيرات الخلايا النجمية والخلايا المحيطة على وظيفة الحاجز الواقي ل HBMEC ، قمنا ببناء نموذج BBB لزراعة الخلايا الثلاثية على إدخالات زراعة الخلايا (الشكل 1 أ) جنبا إلى جنب مع الزراعة الأحادية HBMEC ونموذجين مزدوجين للثقافة المشتركة كعناصر تحكم (الشكل 1B). وشملت ضوابط الثقافة المشتركة المزدوجة الثقافة المشتركة غير التلامسية ل "حمدان بن محمد بن راشد آل مكتوم و HA" والثقافة المشتركة التلامسية لل"هم" مع "إتش بي في بي". بعد 6 أيام في الاستزراع المشترك ، خضعت جميع الإعدادات التجريبية ل OGD لمدة 4 ساعات. تم تقييم سلامة الحاجز للطبقة الأحادية البطانية في تكوينات BBB المشار إليها من خلال تحديد TEER قبل وبعد OGD ، وكذلك بعد 24 ساعة من إعادة الأكسجين (الشكل 1C). لمدة 4 ساعات، تسبب OGD في انخفاض كبير في قيم TEER فقط في الزراعة الأحادية ل HBMEC ونموذج الاستزراع المشترك مع HBMEC و HBVP. وصلت هذه المستويات المنخفضة إلى مستويات خط الأساس بعد 24 ساعة من إعادة الأكسجين. لم يكن هناك تأثير ل OGD على نموذج الاستزراع المشترك مع HBMEC و HA يشير إلى الدور الوقائي للخلايا النجمية ضد الظروف الإقفارية في المختبر.

على الرغم من عدم وجود فرق في TEER الأساسي بين نماذج الاستزراع المشترك المزدوج HBMEC و HBMEC / HBVP ، إلا أن قيم TEER في نموذج الاستزراع المشترك الثلاثي كانت أعلى بكثير من تلك الموجودة في ضوابط الاستزراع المشترك المزدوج أو التحكم في الزراعة الأحادية مباشرة بعد OGD ، مما يشير إلى أن دمج HA و HBVP في نموذج BBB الثلاثي يلعب دورا حاسما في الحفاظ على السلامة الوظيفية ل BBB في ظل الظروف المرضية (الشكل 1 ج ). قمنا أيضا بالتحقيق في نفاذية الكتلة الجزيئية الصغيرة (20 كيلو دالتون) والكبيرة (70 كيلو دالتون) FITC-dextrans عبر الطبقة الأحادية البطانية في نموذج الثقافة الثلاثية المطور. تمت زيادة نفاذية الخلايا الأحادية البطانية إلى 20 كيلو دالتون من الكتلة الجزيئية FITC-dextran بشكل كبير في الزراعة الأحادية HBMEC وبدرجة أقل في نموذج الاستزراع المشترك مع HBMEC و HBVP مقارنة بالضوابط المعيارية (الشكل 1D). علاوة على ذلك ، كانت مستويات نفاذية 20 كيلو دالتون FITC-dextran هي الأدنى في نموذج BBB الثلاثي بين جميع النماذج في ظل ظروف normoxic و OGD. لم تلاحظ أي تغييرات في تدفق 70 كيلو دالتون FITC-dextran عبر أحاديات الطبقة البطانية في أي من النماذج (الشكل 1E). تشير هذه البيانات إلى أن الضرر الإقفاري لنقص الأكسجين لم يكن شديدا لدرجة أنه تسبب تغيرات في نفاذية الخلايا للجزيئات الكبيرة مثل بروتينات البلازما.

Figure 1
الشكل 1: آثار الحرمان من الأكسجين والجلوكوز على المقاومة الكهربائية عبر البطانية ونفاذية البطانة في نماذج BBB الأولية الأحادية والمشتركة والثلاثية للثقافة البشرية. (أ) جدول زمني تخطيطي لإعداد نموذج BBB لثقافة الخلية الأولية الثلاثية. (ب) تمثيلات تخطيطية لتكوينات نماذج BBB القائمة على الخلايا الأولية البشرية الثابتة في المختبر . يحتوي نموذج الزراعة الأحادية على "حمدان بن محمد بن ميميك" المصنف على الجانب القمي من الغشاء المسامي الذي يتم إدخاله جيدا. تحتوي المستنبتة المشتركة غير الملامسة على "حمدان بن محمد بن ميميك" المصنف على السطح العلوي لدعامة إدخال البئر وحمض الحمد البذر في قاع بئر الاستزراع. يتضمن نموذج الاستزراع المشترك للتلامس HBVP المصنف على السطح السفلي لدعامة إدخال البئر مع HBMEC على السطح العلوي. وبالنسبة لنموذج الاستزراع الثلاثي، يتم بذر "حمدان بن محمد بن محمد بن ميميك" على السطح العلوي للدعامة، مع بذر HBVP على السطح السفلي وبذر HA في قاع آبار الاستزراع. (ج) التغيرات في TEER التي تم رصدها مباشرة قبل OGD ، وبعد 4 ساعات من OGD ، وبعد 24 ساعة من إعادة الأكسجين. البيانات ممثلة كمتوسط ± SEM (ن = 5-6). P < 0.0001 مقارنة بنماذج الاستزراع الأحادي والمشترك (ANOVA ثنائي الاتجاه). (د) تم قياس نفاذية الخلايا إلى 20 كيلو دالتون FITC-dextran عبر الطبقات الأحادية البطانية بعد 4 ساعات من OGD. (ه) تم قياس نفاذية الخلايا إلى 70 كيلو دالتون FITC-dextran عبر الطبقات الأحادية البطانية بعد 4 ساعات من OGD. البيانات الممثلة كمتوسط ± SD (ن = 5-6). *ف < 0.05. P < 0.0001 (ANOVA ثنائي الاتجاه). الاختصارات: OGD = الحرمان من الأكسجين والجلوكوز ؛ TEER = المقاومة الكهربائية عبر البطانية ؛ HBMEC = الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة في الدماغ البشري ؛ HA = الخلايا النجمية البشرية ؛ HBVP = pericytes الأوعية الدموية في الدماغ البشري. FITC-ديكستران = ديكستران مترافق مع إيزوثيوسيانات الفلوريسئين ؛ عرب. الوحدات = الوحدات التعسفية. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

للتحقق من إصابة نقص الأكسجين الناجم عن OGD ، تم استزراع HBMEC و HA و HBVP في آبار الأطباق ذات القاع الزجاجي مقاس 35 مم وتحميلها بكاشف نقص الأكسجة ، الذي زادت إشارة الفلورسنت مع انخفاض مستويات الأكسجين. أظهرت جميع الأنواع البشرية الأولية المعرضة ل OGD مضانا أخضر قويا ، مما يثبت أن الخلايا الحية المصورة كانت تعاني من نقص الأكسجين (الشكل 2). بعد تقدير تأثيرات وجود أنواع مختلفة من الخلايا المحيطة بالأوعية الدموية (الخلايا النجمية والخلايا المحيطة بالخلايا) ، أو دمجها في نموذج BBB على خصائص الحاجز باتباع بروتوكول OGD ، استنتجنا أن النموذج الثلاثي كان متفوقا على نماذج BBB الأخرى التي تم اختبارها.

Figure 2
الشكل 2: تلطيخ حي للخلايا البطانية الوعائية الدقيقة الأولية للدماغ البشري ناقص التأكسج ، والخلايا النجمية البشرية ، والخلايا الوعائية في الدماغ البشري بعد 4 ساعات من الحرمان من الأكسجين والجلوكوز. تم إجراء التعرض ل OGD على جميع الخلايا الأولية (HBMEC و HA و HBVP) باستخدام كاشف نقص الأكسجة ووسط خال من الجلوكوز لمدة 4 ساعات. يتم عرض نتائج أربع تجارب مستقلة. تم تصوير الثقافات بتكبير 20x. قضبان المقياس = 100 ميكرومتر. الاختصارات: OGD = الحرمان من الأكسجين والجلوكوز ؛ HBMEC = الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة في الدماغ البشري ؛ HA = الخلايا النجمية البشرية ؛ HBVP = pericytes الأوعية الدموية في الدماغ البشري. DAPI = 4',6-دياميدينو-2-فينيليندول. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في هذا البروتوكول ، وصفنا طريقة لإعداد نموذج BBB موثوق به لثقافة الخلايا البطانية الثلاثية - pericyte - النجمية لدراسة خلل BBB في وضع السكتة الدماغية الإقفارية في المختبر. بالنظر إلى أن pericytes هي أقرب جيران الخلايا البطانية في الجسم الحي ، فإن HBVP مطلي على الجانب السفلي من إدخالات البئر في هذا النموذج16. على الرغم من أن هذا التكوين يفتقر إلى الاتصال المباشر من خلية إلى خلية بين الخلايا النجمية والخلايا البطانية ، إلا أن هذا الترتيب يسمح بالاتصال غير المباشر من خلية إلى خلية بين أنواع الخلايا عبر عوامل قابلة للذوبان مفرزة. إن وجود الخلايا النجمية والخلايا المحيطة في هذا النظام يحسن بشكل كبير من سلامة HBMEC ، مما يحد من نفاذية الطبقة الأحادية إلى مقتفيات صغيرة الحجم. بالإضافة إلى ذلك، يكون للخلايا النجمية والخلايا المحيطة تأثير وقائي على "حمدان بن محمد بن محمد بن أكسد" في ظروف البيانات الحكومية المفتوحة.

في البروتوكول المطور ، قمنا بتحسين نسبة الخلية (1: 1: 1) وخليط وسط الاستزراع للمقصورة القاعدية. أظهر نموذج BBB الثلاثي قيم TEER أعلى بحوالي 2.5 مرة (239 ± 9 Ω سم 2) من الزراعة الأحادية الضابطة (112 ± 11 Ω سم2) بعد 6 أيام من الزراعة المشتركة ، وهو الوقت اللازم لتشكيل طبقة أحادية اللون المناسبة ل HBMEC17,18. قيم TEER التي تم تحقيقها في هذا النموذج الثلاثي قابلة للمقارنة مع تلك الموجودة في النموذج الثلاثي الآخر الموصوف سابقا ، حيث كان HA على اتصال مع HBMEC وتم زرع HBVP في قاع آبار الألواح19. في نموذج الزراعة الثلاثية للخلايا الأولية البشرية الأخرى بنفس تكوين الخلية ووقت التعرض ل OGD ، كانت قيم TEER الأساسية أقل بكثير من تلك الموجودة في هذا العمل ولم تصل إلى المستويات القياسية (100 Ω سم2)20. سمح لنا استخدام ألواح إدخال 6 آبار مع مقصورات أكبر بتقليل تردد التغيير المتوسط لتجنب تعطيل تبادل المواد بين مجموعات الخلايا.

تم إجراء تجارب OGD باستخدام غرفة حاضنة نقص الأكسجة محكمة الغلق تحتوي على خليط غاز لاهوائي (95٪ نيتروجين و 5٪ ثاني أكسيد الكربون). تتمثل إحدى المزايا الرئيسية لهذا البروتوكول في أنه يمكن تعديل شدة الإصابة الإقفارية بسهولة وفقا لاحتياجات محددة عن طريق تغيير طول فترة OGD. بعد تقييم نفاذية TEER و dextran ، لم تؤثر 4 h من OGD على سلامة BBB في النموذج الثلاثي المركب. لذلك ، لدراسة السكتة الدماغية الإقفارية في المختبر ، يجب تطبيق التعرض لفترة أطول ل OGD للحث على انهيار BBB. يسمح تصوير الخلايا الحية ، المنصوص عليه في البروتوكول ، بالمراقبة في الوقت الفعلي لأنواع الخلايا المختلفة والتحقق من إصابة OGD ، والتي تمثل ميزة في العديد من الدراسات.

في هذا البروتوكول ، تم اختيار 0.4 ميكرومتر من البوليستر كأساس لنموذج BBB الثلاثي هذا. يعتبر غشاء البوليستر أفضل نوع إدراج لتصور الخلايا في تطبيقات التصوير الفلوري ، مما يوفر فرصة ممتازة لتصور تعديلات بروتينات الوصلات الضيقة والناقلات إذا لزم الأمر. في حين أن قطر المسام الصغير المختار يخلق نفاذية منخفضة للجزيئات الصغيرة المحبة للماء عبر الطبقات الأحادية البطانية ، فإنه يحد أيضا من التطبيق المحتمل لنموذج BBB الثلاثي الحالي لمقايسات الهجرة عبر البطانية ، حيث يلزم أحجام مسام 3 ميكرومتر أو 8 ميكرومتر.

أخيرا ، يمكن أن يكون هناك قيد آخر لهذا النموذج مرتبط بنقص إجهاد القص ، والذي ثبت أنه يعزز تكوين تقاطعات ضيقة في BBB الثلاثي الديناميكي في أنظمة المختبر 21. في الختام ، يمثل نموذج BBB للثقافة الثلاثية القوي وذو الصلة من الناحية الفسيولوجية ، والذي يتكون من خلايا بشرية أولية ، أداة قيمة لفحص الأدوية ودراسة خلل BBB المرتبط بالسكتة الدماغية الإقفارية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

كشف جميع المؤلفين أنه لا يوجد تضارب في المصالح.

Acknowledgments

تم دعم هذا العمل من قبل منح المعاهد الوطنية للصحة (NIH) MH128022 و MH122235 و MH072567 و MH122235 و HL126559 و DA044579 و DA039576 و DA040537 و DA050528 و DA047157.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24 mm Transwell with 0.4 µm Pore Polyester Membrane Insert Corning 3450
35 mm Glass Bottom Dishes MatTek Life Sciences (FISHERSCI) P35GC-1.5-14-C
Astrocyte Medium Science Cell 1801
Attachment Factor Cell Systems (Fisher Scientific) 4Z0-201
BD 60 mL Syringe BD 309653
BrainPhys Imaging Optimized Medium STEMCELL Technologies 5791
Complete Classic Medium With Serum and CultureBoost 4Z0-500 Cell Systems
Corning 50 mL PP Centrifuge Tubes (Conical Bottom with CentriStar Cap VWR 430829
Corning 75cm² U-Shaped Canted Neck Not Treated Cell Culture Flask  Corning 431464U
Corning CellBIND 96-well Flat Clear Bottom Black Polystyrene Microplates Corning 3340
Countes Cell Counting Chamber Slides Thermo Fisher Scientific C10228
Countess II FL Automated Cell Counter Thermo Fisher Scientific ZGEXSCCOUNTESS2FL
Decon CiDehol 70 Isopropyl Alcohol Solution  Fisher Scientific  04-355-71
Disposable Petri Dishes VWR 25384-088
DMEM Medium (No glucose, No glutamine, No phenol red) ThermoFisher A14430-01 Glucose-free medium
DPBS (No Calcium, No Magnesium) ThermoFisher 14190250
EBM Endothelial Cell Growth Basal Medium, Phenol Red Free, 500 mL Lonza CC-3129
EVOM2 Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter with STX2 electrodes World Precison Instruments NC9792051 Epithelial voltohmmeter 
Fluorescein isothiocyanate–dextran (wt 20,000) Millipore Sigma FD20-250MG
Fluorescein isothiocyanate–dextran (wt 70,000) Millipore Sigma FD70S-250MG
Fluorview FV3000 Confocal Microscope Olympus FV3000
Gas Tank (95% N2, 5% CO2) Airgas X02NI95C2003071
HBSS (No calcium, No magnesium, no phenol red) Thermofisher 14025092
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate - 10 mg/mL Solution in Water ThermoFisher H3570
Human Astrocytes Science Cell 1800
Human Brain Vascular Pericytes Science Cell 1200
Hypoxia Incubator Chamber STEMCELL Technologies 27310
Image-iT Green Hypoxia Reagent ThermoFisher I14834
Pericyte Medium Science Cell 1201
Primary Human Brain Microvascular Endothelial Cells ACBRI 376 Cell Systems
Rocking Platform Shaker, Double VWR 10860-658
Single Flow Meter STEMCELL Technologies 27311
SpectraMax iD3 Microplate Reader Molecular Devices 75886-128
Syringe Filter, 25 mm, 0.22 μm, PVDF, Sterile NEST Scientific 380121
TPP Mutli-well Plates (6 wells) MidSci TP92406
TPP Tissue Culture Flasks T-75 Flasks MidSci TP90075 Flasks with activated surface for cell adhesion
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red ThermoFisher 25200056
UltraPure Distilled Water Invitrogen (Life Technologies) 10977-015
Uno Stage Top Incubator- Oko Lab UNO-T-H-CO2-TTL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mozaffarian, D., et al. Heart disease and stroke statistics-2016 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 133 (94), 38 (2016).
  2. Yousufuddin, M., Young, N. Aging and ischemic stroke. Aging. 11 (9), 2542-2544 (2019).
  3. Donkor, E. S. Stroke in the 21st century: a snapshot of the burden, epidemiology, and quality of life. Stroke Research and Treatment. , 3238165 (2018).
  4. Kadry, H., Noorani, B., Cucullo, L. A blood-brain barrier overview on structure, function, impairment, and biomarkers of integrity. Fluids and Barriers of the CNS. 17 (1), 69 (2020).
  5. Brown, L. S., et al. Pericytes and neurovascular function in the healthy and diseased brain. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 282 (2019).
  6. Cabezas, R., et al. Astrocytic modulation of blood brain barrier: perspectives on Parkinson's disease. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 211 (2014).
  7. Abdullahi, W., Tripathi, D., Ronaldson, P. T. Blood-brain barrier dysfunction in ischemic stroke: targeting tight junctions and transporters for vascular protection. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 315 (3), 343-356 (2018).
  8. Candelario-Jalil, E., Dijkhuizen, R. M., Magnus, T. Neuroinflammation, stroke, blood-brain barrier dysfunction, and imaging modalities. Stroke. 53 (5), 1473-1486 (2022).
  9. He, Y., Yao, Y., Tsirka, S. E., Cao, Y. Cell-culture models of the blood-brain barrier. Stroke. 45 (8), 2514-2526 (2014).
  10. Thomsen, L. B., Burkhart, A., Moos, T. A triple culture model of the blood-brain barrier using porcine brain endothelial cells, astrocytes and pericytes. PLoS One. 10 (8), 0134765 (2015).
  11. Song, Y., Cai, X., Du, D., Dutta, P., Lin, Y. Comparison of blood-brain barrier models for in vitro biological analysis: one cell type vs three cell types. ACS Applied Bio Materials. 2 (3), 1050-1055 (2019).
  12. Xu, L., et al. Silver nanoparticles induce tight junction disruption and astrocyte neurotoxicity in a rat blood-brain barrier primary triple coculture model. International Journal of Nanomedicine. 10, 6105-6118 (2015).
  13. Appelt-Menzel, A. Establishment of a human blood-brain barrier co-culture model mimicking the neurovascular unit using induced pluri- and multipotent stem cells. Stem Cell Reports. 8 (4), 894-906 (2017).
  14. Zhang, Y., et al. Rational construction of a reversible arylazo-based NIR probe for cycling hypoxia imaging in vivo. Nature Communications. 12 (1), 2772 (2021).
  15. Palacio-Castañeda, V., Kooijman, L., Venzac, B., Verdurmen, W. P. R., Le Gac, S. Metabolic switching of tumor cells under hypoxic conditions in a tumor-on-a-chip model. Micromachines. 11 (4), 382 (2020).
  16. Ramsauer, M., Krause, D., Dermietzel, R. Angiogenesis of the blood-brain barrier in vitro and the function of cerebral pericytes. FASEB Journal. 16 (10), 1274-1276 (2002).
  17. Lyck, R., et al. ALCAM (CD166) is involved in extravasation of monocytes rather than T cells across the blood-brain barrier. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 37 (8), 2894-2909 (2017).
  18. Rizzi, E., et al. A triple culture cell system modeling the human blood-brain barrier. Journal of Visualized Experiments. (177), (2021).
  19. Kumar, S., Shaw, L., Lawrence, C., Lea, R., Alder, J. P50: Developing a physiologically relevant blood brain barrier model for the study of drug disposition in glioma. Neuro-Oncology. 16 (6), (2014).
  20. Stone, N. L., England, T. J., O'Sullivan, S. E. A novel transwell blood brain barrier model using primary human cells. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 230 (2019).
  21. Al Ahmad, A., Taboada, C. B., Gassmann, M., Ogunshola, O. O. Astrocytes and pericytes differentially modulate blood-brain barrier characteristics during development and hypoxic insult. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 31 (2), 693-705 (2011).

Tags

الكيمياء الحيوية، العدد 188،
نموذج زراعة الخلايا الأولية الثلاثية للحاجز الدموي الدماغي البشري لدراسة السكتة الدماغية <em>الإقفارية في المختبر</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fattakhov, N., Torices, S., Becker,… More

Fattakhov, N., Torices, S., Becker, S., Teglas, T., Naranjo, O., Toborek, M. A Triple Primary Cell Culture Model of the Human Blood-Brain Barrier for Studying Ischemic Stroke In Vitro. J. Vis. Exp. (188), e64469, doi:10.3791/64469 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter