Summary
Hier beschreiben wir die Methode zur Etablierung eines Dreifachzellkulturmodells der Blut-Hirn-Schranke basierend auf primären mikrovaskulären Endothelzellen des menschlichen Gehirns, Astrozyten und Perizyten. Dieses multizelluläre Modell eignet sich für Studien zur neurovaskulären Einheitendysfunktion während eines ischämischen Schlaganfalls in vitro oder für das Screening von Arzneimittelkandidaten.
Abstract
Der ischämische Schlaganfall ist weltweit eine der Hauptursachen für Tod und Behinderung mit begrenzten therapeutischen Möglichkeiten. Die Neuropathologie des ischämischen Schlaganfalls ist durch eine Unterbrechung der Blutversorgung des Gehirns gekennzeichnet, die zu Zelltod und kognitiver Dysfunktion führt. Während und nach einem ischämischen Schlaganfall erleichtert die Dysfunktion der Blut-Hirn-Schranke (BBB) das Fortschreiten von Verletzungen und trägt zu einer schlechten Genesung des Patienten bei. Aktuelle BBB-Modelle umfassen vor allem endotheliale Monokulturen und Doppelkokulturen mit Astrozyten oder Perizyten.
Solchen Modellen fehlt die Fähigkeit, eine dynamische Gehirnmikroumgebung vollständig zu imitieren, was für die Kommunikation von Zelle zu Zelle unerlässlich ist. Darüber hinaus enthalten häufig verwendete BBB-Modelle oft immortalisierte menschliche Endothelzellen oder tierische Zellkulturen (Nagetier, Schweine oder Rinder), die translationale Einschränkungen darstellen. Dieser Artikel beschreibt ein neuartiges, auf Präparaten basierendes BBB-Modell, das nur primäre menschliche Zellen (mikrovaskuläre Endothelzellen des Gehirns, Astrozyten und vaskuläre Perizyten des Gehirns) enthält, was die Untersuchung von ischämischen Hirnverletzungen in vitro ermöglicht.
Die Auswirkungen von Sauerstoff-Glukose-Deprivation (OGD) auf die Barriereintegrität wurden durch passive Permeabilität, transendotheliale elektrische Widerstandsmessungen (TEER) und direkte Visualisierung hypoxischer Zellen bewertet. Das vorgestellte Protokoll bietet einen deutlichen Vorteil, indem es die interzelluläre Umgebung der BHS in vivo nachahmt und als realistischeres In-vitro-BBB-Modell für die Entwicklung neuer therapeutischer Strategien im Rahmen einer ischämischen Hirnverletzung dient.
Introduction
Schlaganfall ist weltweit eine der häufigsten Todes- und Langzeitinvaliditätsursachen1. Die Inzidenz von Schlaganfällen nimmt mit zunehmendem Alter schnell zu und verdoppelt sich alle 10 Jahre nach dem 55. Lebensjahr2. Der ischämische Schlaganfall tritt als Folge einer Störung des zerebralen Blutflusses aufgrund thrombotischer und embolischer Ereignisse auf, was mehr als 80% aller Schlaganfallfälle ausmacht3. Schon jetzt gibt es relativ wenige Behandlungsmöglichkeiten, um den Gewebetod nach einem ischämischen Schlaganfall zu minimieren. Die Behandlungen, die es gibt, sind zeitkritisch und führen folglich nicht immer zu guten klinischen Ergebnissen. Daher ist die Erforschung komplexer zellulärer Mechanismen des ischämischen Schlaganfalls, die die Erholung nach einem Schlaganfall beeinflussen, dringend erforderlich.
Die BHS ist eine dynamische Schnittstelle für den Austausch von Molekülen zwischen dem Blut und dem Hirnparenchym. Strukturell besteht die BBB aus mikrovaskulären Endothelzellen des Gehirns, die durch Verbindungskomplexe verbunden sind, die von einer Basalmembran, Perizyten und astrozytären Endfüßen umgeben sind4. Perizyten und Astrozyten spielen eine wesentliche Rolle bei der Aufrechterhaltung der BBB-Integrität durch die Sekretion verschiedener Faktoren, die für die Bildung starker Tight Junctions notwendig sind 5,6. Der Zusammenbruch der BBB ist eines der Kennzeichen des ischämischen Schlaganfalls. Akute Entzündungsreaktionen und oxidativer Stress im Zusammenhang mit zerebraler Ischämie führen zur Störung von Tight-Junction-Proteinkomplexen und zu einem gestörten Crosstalk zwischen Astrozyten, Perizyten und Endothelzellen, was zu einer erhöhten parazellulären gelösten Permeabilität über die BBB7 führt. Die BBB-Dysfunktion fördert die Bildung von Hirnödemen weiter und erhöht das Risiko einer hämorrhagischen Transformation8. Unter Berücksichtigung all dessen besteht ein großes Interesse daran, die molekularen und zellulären Veränderungen zu verstehen, die auf BBB-Ebene während und nach einem ischämischen Schlaganfall auftreten.
Obwohl viele In-vitro-BBB-Modelle in den letzten Jahrzehnten entwickelt und in einer Vielzahl von Studien verwendet wurden, kann keines von ihnen In-vivo-Bedingungen vollständig replizieren9. Während einige Modelle auf Endothelzellmonoschichten basieren, die auf gut einsetzenden permeablen Trägern allein oder in Kombination mit Perizyten oder Astrozyten kultiviert wurden, haben erst neuere Studien Triple-Zellkultur-Modelldesigns eingeführt. Fast alle existierenden Dreifachkultur-BBB-Modelle enthalten primäre Hirnendothelzellen zusammen mit Astrozyten und Perizyten, die aus Tierarten oder Zellen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen isoliert wurden10,11,12,13.
In Anerkennung der Notwendigkeit, die menschliche BHS in vitro besser zu rekapitulieren, haben wir ein Dreifachzellkultur-In-vitro-BBB-Modell etabliert, das aus mikrovaskulären Endothelzellen des menschlichen Gehirns (HBMEC), primären menschlichen Astrozyten (HA) und primären vaskulären Perizyten des menschlichen Gehirns (HBVP) besteht. Dieses Dreifachkultur-BBB-Modell ist auf 6-Well-Platten-Polyestermembraneinsätzen mit einer Porengröße von 0,4 μm aufgebaut. Diese Well-Inserts bieten eine optimale Umgebung für die Zellanheftung und ermöglichen einen einfachen Zugang zu apikalen (Blut) und basolateralen (Gehirn) Kompartimenten für die Medienprobenahme oder die Anwendung von Verbindungen. Die Merkmale dieses vorgeschlagenen Dreifachzellkultur-BBB-Modells werden durch Messung von TEER und parazellulärem Fluss nach OGD bewertet, der den ischämischen Schlaganfall in vitro nachahmt, wobei ein Mangel an Sauerstoff (<1% O2) und Nährstoffen (unter Verwendung eines glukosefreien Mediums) durch die Verwendung einer befeuchteten, versiegelten Kammer erreicht wird. Zusätzlich werden induzierte ischämische Zustände in diesem Modell durch direkte Visualisierung hypoxischer Zellen genau verifiziert.
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Protocol
HINWEIS: Weitere Informationen zu allen in diesem Protokoll verwendeten Zellen, Materialien, Geräten und Lösungen finden Sie in der Materialtabelle .
1. Dreifachzellkultur-BBB-Modelleinstellung
- Aussaatperizyten
- Kultivieren Sie HBVP in T75-Kulturkolben mit aktivierter Oberfläche für die Zelladhäsion in einem 5%CO2-Inkubator bei 37 °C bis zum Konfluieren. Sobald der Zusammenfluss erreicht ist, saugen Sie das alte Perizytenmedium ab und waschen Sie die Zellen mit 5 ml warmer phosphatgepufferter Kochsalzlösung (DPBS) von Dulbecco. Das DPBS wird abgesaugt und die Zellen mit einer Kombination aus 4 ml warmer Trypsin-EDTA-Lösung und 1 ml DPBS aus dem Kolben gelöst.
HINWEIS: Vermeiden Sie Passagen, die später als P7 liegen. - Der Kolben wird 5 min bei 37 °C in einemCO2-Inkubator inkubiert. Betrachten Sie unter einem Mikroskop, um zu bestätigen, ob die Zellen vom Kolben gelöst sind. 5 ml warmes Perizytenmedium (mit 2% fetalem Rinderserum [FBS]) in den Kolben geben und die abgelösten Zellen in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen überführen.
- Zentrifugieren Sie die Zellsuspension für 3 min bei 200 × g, so dass die Zellen ein Pellet im Boden des Röhrchens bilden können. Saugen Sie das Medium aus dem Röhrchen ab, um sicherzustellen, dass das Zellpellet intakt bleibt.
- Resuspendieren Sie das Zellpellet in Perizytenmedium; Berechnen Sie die Menge an Medium in Abhängigkeit vom Zusammenfluss der Zellen und der Anzahl der benötigten Bohrlocheinsätze. Nehmen Sie 10 μL der resuspendierten Zellen, legen Sie sie in einen Zellzählobjektträger und zählen Sie die Anzahl der Zellen.
- Bestimmen Sie die Zelldichte und säen Sie 300.000 Zellen / setzen Sie 1 ml Perizytenmedium auf die abluminale Seite der Vertiefungsinserts (6-Well-Format) ein.
HINWEIS: Bei der Aussaat von HBVP auf der Unterseite von Einsätzen ist es sehr wichtig, zuerst die Well-Insert-Platten auf den Kopf zu stellen. Während die Platte flach auf eine Oberfläche gelegt wird, entfernen Sie den unteren Abschnitt, um die abluminale Seite der Muldeneinsätze freizulegen. Nachdem Sie die Perizytenzellsuspension auf die abluminale Seite gegeben haben, decken Sie die Vertiefungen mit der umgedrehten Platte ab, um eine Verdunstung zu verhindern. Alle Platten über Nacht in einem 5% CO2-Inkubator bei 37 °C auf den Kopf gestellt.
- Kultivieren Sie HBVP in T75-Kulturkolben mit aktivierter Oberfläche für die Zelladhäsion in einem 5%CO2-Inkubator bei 37 °C bis zum Konfluieren. Sobald der Zusammenfluss erreicht ist, saugen Sie das alte Perizytenmedium ab und waschen Sie die Zellen mit 5 ml warmer phosphatgepufferter Kochsalzlösung (DPBS) von Dulbecco. Das DPBS wird abgesaugt und die Zellen mit einer Kombination aus 4 ml warmer Trypsin-EDTA-Lösung und 1 ml DPBS aus dem Kolben gelöst.
- Aussaat von Astrozyten
- HA wird in T75-Kolben in einem 5%-CO2-Inkubator bei 37 °C kultiviert, bis der Zusammenfluss erreicht ist. Führen Sie die obigen Schritte 1.1.1-1.1.4 aus, indem Sie Astrozytenmedium (ebenfalls mit 2% FBS) anstelle von Perizytenmedium verwenden.
HINWEIS: Vermeiden Sie Passagen nach P9. - Bestimmen Sie die Zelldichte und säen Sie 300.000 Zellen / Vertiefung auf den Boden der Gewebekultur 6-Well-Platten. Decken Sie die Platte ab, um eine Verdunstung zu verhindern, und bewahren Sie alle Platten über Nacht in einem 5%CO2-Inkubator bei 37 °C auf.
- HA wird in T75-Kolben in einem 5%-CO2-Inkubator bei 37 °C kultiviert, bis der Zusammenfluss erreicht ist. Führen Sie die obigen Schritte 1.1.1-1.1.4 aus, indem Sie Astrozytenmedium (ebenfalls mit 2% FBS) anstelle von Perizytenmedium verwenden.
- Aussaat von Endothelzellen
- Kultivieren Sie HBMEC in Gewebekulturschalen in einem 5% CO2 -Inkubator bei 37 °C bis zum Konfluieren. Befolgen Sie die obigen Schritte 1.1.1-1.1.4 und verwenden Sie ein vollständiges klassisches Medium (mit 10% FBS) anstelle eines Perizytenmediums.
HINWEIS: Vermeiden Sie Passagen, die später als P12 liegen. - Die Gewebekultur-6-Well-Platten mit Astrozyten und die Well-Inserts (6-Well-Format) mit Perizyten entnehmen Sie den 5%-CO2-Inkubator bei 37 °C. Asspirieren Sie das Astrozytenmedium aus den 6-Well-Platten der Gewebekultur. Fügen Sie 1 ml Perizytenmedium und 1 ml Astrozytenmedium zu jeder Vertiefung hinzu.
- Das Perizytenmedium aus den Vertiefungen absaugen und in die 6-Well-Platten der Gewebekultur geben, die die ausgesäten Astrozyten enthalten. Säen Sie HBMEC mit einer Dichte von 300.000 Zellen/Wells in 2 ml komplettem klassischem Medium auf die apikale Seite der gleichen Well-Inserts.
HINWEIS: Die Endothelzellen sollten am nächsten Tag nach der Aussaat von Perizyten auf der abluminalen Seite der Well-Inserts und Astrozyten auf Gewebekultur-6-Well-Platten auf der apikalen Seite der Well-Inserts ausgesät werden. Die Zellen sollten 6 Tage lang in Dreifachkultur gehalten werden, um BBB-ähnliche Eigenschaften zu induzieren. Das Zellkulturmedium sollte in beiden gut einsetzenden Kompartimenten 24 h vor den Experimenten gewechselt werden.
- Kultivieren Sie HBMEC in Gewebekulturschalen in einem 5% CO2 -Inkubator bei 37 °C bis zum Konfluieren. Befolgen Sie die obigen Schritte 1.1.1-1.1.4 und verwenden Sie ein vollständiges klassisches Medium (mit 10% FBS) anstelle eines Perizytenmediums.
2. Induktion des Sauerstoff-Glukose-Entzugs
- Waschen Sie die Zellen 3x mit DPBS. Für Dreifachzellkulturen, die OGD ausgesetzt sind, fügen Sie sowohl den apikalen als auch den basolateralen Kompartimenten ein glukosefreies Medium (ohne L-Glutamin und Phenolrot) hinzu. Ersetzen Sie das Kulturmedium durch frisches Medium in normoxischen Kontrollzellkulturen. Kontroll-Dreifachkulturen in den 5%-CO2-Inkubator bei 37 °C geben.
HINWEIS: Medienveränderungen vor der Induktion von OGD oder unmittelbar nach OGD können mechanische Belastungen erzeugen, die die Monoschichten der Endothelzellen weiter beeinflussen würden. Somit sind die Schritte mit Mediumersatz für normoxische Kontrollzellkulturen enthalten. - Stellen Sie eine Petrischale mit 20 ml sterilem Wasser in die Hypoxie-Inkubatorkammer, um eine ausreichende Befeuchtung der Kulturen zu gewährleisten. Öffnen Sie die Kammer, indem Sie die Ringklemme lösen. Ordnen Sie die Zellkulturen in den Regalen an. Versiegeln Sie die Kammer, indem Sie die Ringklemme sichern.
- Öffnen Sie sowohl die Einlass- als auch die Auslassöffnungen der Kammer. Befestigen Sie den Schlauch, der von der Oberseite des Durchflussmessers kommt, an der Kammer. Befestigen Sie den Schlauch, der von der Unterseite des Durchflussmessers kommt, über einen Luftfilter an dem Gastank, der das Gasgemisch von 95% N 2/5% CO2 enthält.
- Öffnen Sie das Tankdurchflussregelventil, indem Sie es gegen den Uhrzeigersinn drehen, um einen minimalen Gasfluss zu ermöglichen. Öffnen Sie das Druckregelventil langsam durch Drehen im Uhrzeigersinn.
- Spülen Sie die Kammer mit dem Gasgemisch bei einer Durchflussrate von 20 l/min für 5 min. Trennen Sie die Kammer von der Gasquelle und schließen Sie beide weißen Kunststoffklemmen fest.
- Schalten Sie das Tankdurchflussregelventil aus, indem Sie im Uhrzeigersinn drehen. Schließen Sie das Druckregelventil, indem Sie es gegen den Uhrzeigersinn drehen.
- Stellen Sie die Hypoxiekammer für 4 h in einen herkömmlichen Inkubator bei 37 °C.
HINWEIS: Für die anschließende Reoxygenierungsphase waschen Sie die Zellen 3x mit DPBS, fügen Sie frisches Medium in allen Dreifachkulturen hinzu und bewahren Sie sie weitere 24 Stunden im 5%CO2-Inkubator bei 37 ° C auf. Gemäß den Anweisungen des Herstellers beträgt die in der Kammer verbleibende Sauerstoffkonzentration 0% nach nicht weniger als 4 min Spülen mit anaeroben Gasgemisch bei 20 l / min.
3. TEER-Messungen
- Setzen Sie das sterilisierte TEER-Instrument in die Biosicherheitswerkbank ein und stecken Sie die Elektroden in das Epithelvoltohmmeter. Sterilisieren Sie die Elektroden in 30 ml 70% iger Isopropylalkohollösung für mindestens 30 min.
- Schalten Sie das TEER-Gerät ein und stellen Sie die Funktion auf Ohm ein.
- Entfernen Sie die Elektroden aus der 70%igen Isopropylalkohollösung und legen Sie sie mindestens 30 Minuten lang in 20 ml DPBS, bis die digitale Anzeige am TEER-Gerät 0 Ohm anzeigt.
- Führen Sie den langen Zapfen der Elektrode durch eine der drei Öffnungen im Aufhänger des Locheinschubs der leeren Well-Insert-Steuerung ein und senken Sie ihn, bis er den Boden der Vertiefung berührt. Stellen Sie sicher, dass der kurze Zapfen über der apikalen Kultur auf der Unterseite des Brunneneinsatzes ruht.
HINWEIS: Die Steuerung des Blank-Well-Inserts besteht aus 2 ml vollständigem klassischem Medium im apikalen Kompartiment und einer Kombination aus 1 ml Perizytenmedium und 1 ml Astrozytenmedium im basolateralen Kompartiment. Stellen Sie sicher, dass die Elektroden während der TEER-Messung um 90° zum Bohrlocheinsatz gehalten werden. Die Verwendung des Durchschnitts von zwei oder drei Messwerten, die in derselben Vertiefung (pro Öffnung) erhalten wurden, kann dazu beitragen, die Variabilität zu verringern. - Warten Sie, bis die digitalen Anzeigewerte am TEER-Gerät abgeschaltet sind, bevor Sie den Wert aufzeichnen. Legen Sie die Elektroden wieder in DPBS, um sie zwischen den Messungen zu waschen. Sammeln Sie weiterhin alle TEER-Messungen für zwei weitere leere Bohrlocheinsatzkontrollen.
- Erfassen Sie die TEER-Messungen der Probenplatten anhand der Schritte 3.4-3.5, die für die Kontrollmessungen durchgeführt wurden. Sobald alle Messungen durchgeführt wurden, legen Sie die Elektrode für 30 min wieder in die 70%ige Isopropylalkohollösung. Trennen Sie die Elektroden vom TEER-Gerät und lassen Sie sie an der Luft trocknen.
- Berechnen Sie die TEER-Werte. Verwenden Sie Gleichung (1), um den mittleren Ohmwert der Leerbohrloch-Kontrolle vom Ohm-Wert der Probe zu subtrahieren, und multiplizieren Sie dann diesen Widerstandswert mit der Fläche des Membraneinsatzes (cm 2), um den gemeldeten TEER-Wert in Ω∙cm2 zu erhalten.
(1)
(1)4. Beurteilung der parazellulären Permeabilität der BHS
HINWEIS: Führen Sie alle Schritte mit FITC-Dextran in einer Zellkultur-Biosicherheitswerkbank mit ausgeschaltetem Licht durch. Decken Sie die FITC-Dextran-Lösungen mit Aluminiumfolie ab, um das Photobleichen zu minimieren.
- Lösungen, die FITC-Dextrans von 20 und 70 kDa (0,1 mg/ml) enthalten, unter Verwendung eines phenolrotfreien Endothelzellwachstumsmediums herstellen und 1 h auf einem schaukelnden Plattformschüttler rühren lassen. Filtern Sie die Lösungen mit einem 0,22 μm Spritzenfilter.
- Asspirieren Sie das Medium aus dem basolateralen Kompartiment und ersetzen Sie es durch 2 ml phenolrot-freies Endothelzellwachstumsmedium im Dreifachzellkultur-BBB-Modell. Waschen Sie die Zellen im apikalen Kompartiment zweimal mit Hanks' ausgewogener Salzlösung (HBSS).
- 1 ml der FITC-Dextranlösung in das apikale Fach geben und die Platte mit Aluminiumfolie abdecken. Die Platte wird 1 h lang in einen 5%igen CO2-Inkubator bei 37 °C gegeben.
- Nehmen Sie 100 μL Medium aus den basolateralen Kompartimenten und geben Sie es in eine schwarze 96-Well-Platte. Messen Sie die Fluoreszenz mit einem Mikrotiterplatten-Reader, wobei die Anregungs- und Emissionswellenlängen auf 480 nm bzw. 530 nm eingestellt sind.
5. Nachweis von Hypoxie in lebenden Zellen
- Aussaat 200 μL HBMEC, HA und HBVP in der Mitte von poly-d-lysinbeschichteten, 35 mm Glasbodenschalen mit einer Dichte von 150.000 Zellen/Schale. Vor der Aussaat von HBMEC den Boden des Geschirrs mit dem Anhaftungsfaktor beschichten. Lassen Sie die Zellen an der Glasoberfläche anhaften, indem Sie sie über Nacht bei 37 °C in einemCO2-Inkubator belassen.
HINWEIS: Es ist wichtig, Geschirr mit menschlichen Primärzellen gleichzeitig mit einem Dreifach-BBB-Modell in einer Hypoxiekammer für OGD zu platzieren. - Sobald der Zusammenfluss erreicht ist, ist das Kulturmedium zu verwerfen und 2 ml vorgewärmtes glukosefreies Medium (für OGD) oder normales Medium (für Kontrollen) hinzuzufügen, das 2 μL 1 mM Hoechst 33342 (Endkonzentration 0,2 μM) und 0,5 μL 5 mM Stammlösung des referenzierten Bild-iT-Grünhypoxie-Reagenzes (Endkonzentration 1 μM) enthält. Ersetzen Sie nach der OGD-Behandlung das Medium in allen Gerichten durch ein bildgebend optimiertes Medium.
- Führen Sie eine Fluoreszenz-Lebendzellbildgebung mit dem GFP-Filter und dem konfokalen Mikroskop-Inkubator der obersten Stufe durch, wie zuvor14,15 beschrieben.
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Representative Results
Um die Auswirkungen von Astrozyten und Perizyten auf die Barrierefunktion von HBMEC zu untersuchen, konstruierten wir das Dreifachzellkultur-BBB-Modell an Zellkulturinserts (Abbildung 1A) zusammen mit HBMEC-Monokulturen und zwei Doppelkokulturmodellen als Kontrollen (Abbildung 1B). Doppelte Kokulturkontrollen umfassten eine kontaktlose Kokultur von HBMEC mit HA und Kontaktkokultur von HBMEC mit HBVP. Nach 6 Tagen in Kokultur wurden alle Versuchsaufbauten für 4 h OGD unterzogen. Die Barriereintegrität der endothelialen Monoschicht in den angegebenen BBB-Konfigurationen wurde durch Bestimmung des TEER vor und nach OGD sowie nach 24 h Reoxygenierung beurteilt (Abbildung 1C). Für 4 h verursachte das OGD nur in der HBMEC-Monokultur und im Kokulturmodell mit HBMEC und HBVP eine signifikante Abnahme der TEER-Werte. Diese verringerten Werte erreichten die Ausgangswerte nach 24 Stunden Reoxygenierung. Keine Wirkung von OGD auf das Kokulturmodell mit HBMEC und HA wies auf die schützende Rolle von Astrozyten gegen ischämische Bedingungen in vitro hin.
Obwohl es keinen Unterschied im Basis-TEER zwischen Triple- und HBMEC/HBVP-Doppelkokulturmodellen gab, waren die TEER-Werte im Triple-Co-Kultur-Modell signifikant höher als die in den Doppel-Kokultur-Kontrollen oder der Monokultur-Kontrolle unmittelbar nach OGD, was darauf hindeutet, dass die Integration von HA und HBVP in das Triple-BBB-Modell eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der funktionellen Integrität der BHS unter pathologischen Bedingungen spielt (Abbildung 1C ). Wir untersuchten auch die Permeabilität von FITC-Dextrans mit kleiner (20 kDa) und großer (70 kDa) Molekülmasse über die endotheliale Monoschicht im entwickelten Triple-Kulturmodell. Die parazelluläre Permeabilität von endothelialen Monoschichten auf 20 kDa Molekülmasse FITC-Dextran war in der HBMEC-Monokultur und in geringerem Maße im Kokulturmodell mit HBMEC und HBVP im Vergleich zu normoxischen Kontrollen drastisch erhöht (Abbildung 1D). Darüber hinaus waren die 20 kDa FITC-Dextran-Permeabilitätswerte im Triple-BBB-Modell unter allen Modellen unter normoxischen und OGD-Bedingungen am niedrigsten. In keinem der Modelle wurden Veränderungen im 70 kDa FITC-Dextranfluss über endotheliale Monoschichten beobachtet (Abbildung 1E). Diese Daten deuten darauf hin, dass ischämisch-hypoxische Schäden nicht so schwerwiegend waren, dass sie Veränderungen der parazellulären Permeabilität für große Moleküle wie Plasmaproteine verursachten.
Abbildung 1: Auswirkungen von Sauerstoff-Glukose-Deprivation auf den transendothelialen elektrischen Widerstand und die endotheliale Permeabilität in humanen primären Mono-, Co- und Triple-Kultur-BBB-Modellen. (A) Schematische Zeitleiste für die Einstellung des dreifachen primären Zellkultur-BBB-Modells. (B) Schematische Darstellungen der Konfigurationen für in vitro statische humane primäre zellbasierte BBB-Modelle. Ein Monokulturmodell enthält HBMEC-Saatgut auf der apikalen Seite der gut einsetzenden porösen Membran. Eine berührungslose Kokultur enthält HBMEC-Saatgut auf der Oberseite des Bohrlochträgers und HA-Saatgut auf der Unterseite der Kulturmulde. Ein Kontaktkokulturmodell umfasst HBVP, das auf der Unterseite des Bohrlochträgers mit HBMEC auf der Oberseite ausgesät wird. Für das Dreifachkulturmodell werden HBMEC auf der oberen Oberfläche des Trägers ausgesät, wobei HBVP auf der unteren Oberfläche und HA auf der Unterseite der Kulturmulden ausgesät werden. (C) Veränderungen des TEER, die unmittelbar vor OGD, nach 4 Stunden OGD und nach 24 Stunden Reoxygenierung überwacht werden. Daten werden als Mittelwert ± SEM dargestellt (n = 5-6). P < 0,0001 im Vergleich zu Mono- und Kokulturmodellen (Zwei-Wege-ANOVA). (D) Die parazelluläre Permeabilität für 20 kDa FITC-Dextran über endotheliale Monoschichten wurde nach 4 h OGD gemessen. (E) Die parazelluläre Permeabilität für 70 kDa FITC-Dextran über endotheliale Monoschichten wurde nach 4 h OGD gemessen. Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt (n = 5-6). *P < 0,05. P < 0,0001 (Zwei-Wege-ANOVA). Abkürzungen: OGD = Sauerstoff-Glukose-Deprivation; TEER = transendothelialer elektrischer Widerstand; HBMEC = human brain microvascular endothelial cells; HA = menschliche Astrozyten; HBVP = vaskuläre Perizyten des menschlichen Gehirns; FITC-Dextran = Dextran konjugiert zu Fluoresceinisothiocyanat; Arb. Einheiten = beliebige Einheiten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Um die OGD-induzierte hypoxische Verletzung zu verifizieren, wurden HBMEC, HA und HBVP in den Vertiefungen von 35-mm-Glasbodenschalen kultiviert und mit dem Hypoxie-Reagenz beladen, dessen Fluoreszenzsignal mit reduziertem Sauerstoffgehalt zunahm. Alle primären menschlichen Typen, die OGD ausgesetzt waren, zeigten eine starke grüne Fluoreszenz, was beweist, dass die abgebildeten lebenden Zellen hypoxisch waren (Abbildung 2). Nach der Abschätzung der Auswirkungen verschiedener perivaskulärer Zelltypen (Astrozyten und Perizyten) oder deren Kombination im BBB-Modell auf die Barriereeigenschaften nach einem OGD-Protokoll kamen wir zu dem Schluss, dass das Dreifachmodell den anderen getesteten BBB-Modellen überlegen war.
Abbildung 2: Lebendfärbung von hypoxischen primären mikrovaskulären Endothelzellen des menschlichen Gehirns, menschlichen Astrozyten und vaskulären Perizyten des menschlichen Gehirns nach 4 Stunden Sauerstoff-Glukose-Entzug. OGD-Expositionen wurden an allen Primärzellen (HBMEC, HA und HBVP) unter Verwendung eines Hypoxie-Reagenzes und eines glukosefreien Mediums für 4 h durchgeführt. Ergebnisse aus vier unabhängigen Experimenten werden gezeigt. Kulturen wurden mit 20-facher Vergrößerung abgebildet. Maßstabsbalken = 100 μm. Abkürzungen: OGD = Sauerstoff-Glukose-Deprivation; HBMEC = human brain microvascular endothelial cells; HA = menschliche Astrozyten; HBVP = vaskuläre Perizyten des menschlichen Gehirns; DAPI = 4',6-Diamidino-2-phenylindol. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
In diesem Protokoll beschreiben wir eine Methode zum Aufbau eines zuverlässigen dreifachen Endothelzell-Perizyten-Astrozyten-Kultur-BBB-Modells zur Untersuchung der BBB-Dysfunktion im Rahmen eines ischämischen Schlaganfalls in vitro. In Anbetracht der Tatsache, dass Perizyten in vivo die nächsten Nachbarn von Endothelzellen sind, sind HBVP in diesem Modell16 auf der Unterseite der Well-Inserts plattiert. Obwohl dieser Konfiguration die direkte Zell-zu-Zell-Kommunikation zwischen Astrozyten und Endothelzellen fehlt, ermöglicht diese Anordnung eine indirekte Zell-zu-Zell-Kommunikation zwischen Zelltypen über sekretierte lösliche Faktoren. Das Vorhandensein von Astrozyten und Perizyten in diesem System verbessert die HBMEC-Integrität erheblich und begrenzt die parazelluläre Permeabilität der Monoschicht auf kleine Tracer. Darüber hinaus haben Astrozyten und Perizyten eine schützende Wirkung auf HBMEC unter OGD-Bedingungen.
Im entwickelten Protokoll haben wir das Zellverhältnis (1:1:1) und die Kulturmediummischung für das basolaterale Kompartiment optimiert. Das Triple-BBB-Modell zeigte nach 6 Tagen Co-Kultivierung fast 2,5x höhere TEER-Werte (239 ± 9 Ω·cm 2) als die Kontroll-HBMEC-Monokultur (112 ± 11 Ω·cm2), die für die korrekte HBMEC-Monoschichtbildung erforderliche Zeit17,18. Die in diesem Dreifachmodell erreichten TEER-Werte sind vergleichbar mit denen des anderen zuvor beschriebenen Dreifachmodells, bei dem HA in Kontakt mit HBMEC standen und HBVP auf den Boden der Plattenbohrungen19 gesät wurden. Im anderen humanen Primärzell-Triple-Kulturmodell mit der gleichen Zellkonfiguration und OGD-Expositionszeit waren die TEER-Ausgangswerte wesentlich niedriger als in dieser Arbeit und erreichten nicht die Standardwerte (100 Ω·cm2)20. Die Verwendung von 6-Well-Insert-Platten mit größeren Kompartimenten ermöglichte es uns, die Mediumwechselfrequenz zu verringern, um die Störung des Substanzaustauschs zwischen den Zellpopulationen zu vermeiden.
OGD-Experimente wurden mit einer verschlossenen Hypoxie-Inkubatorkammer durchgeführt, die ein anaerobes Gasgemisch (95% Stickstoff und 5% Kohlendioxid) enthielt. Einer der Hauptvorteile dieses Protokolls besteht darin, dass die Schwere der ischämischen Verletzung leicht an spezifische Bedürfnisse angepasst werden kann, indem die Länge der OGD-Periode variiert wird. Nach der Bewertung der TEER- und Dextranpermeabilität beeinträchtigten 4 Stunden OGD die BBB-Integrität im konstruierten Triple-Modell nicht. Um den ischämischen Schlaganfall in vitro zu untersuchen, muss daher eine längere Exposition gegenüber OGD angewendet werden, um einen BBB-Abbau zu induzieren. Die im Protokoll enthaltene Lebendzellbildgebung ermöglicht die Echtzeitüberwachung verschiedener Zelltypen und die Überprüfung von OGD-Verletzungen, was in vielen Studien einen Vorteil darstellt.
In diesem Protokoll wurden 0,4 μm Polyester-Well-Einsätze als Basis für dieses Dreifach-BBB-Modell gewählt. Eine Polyestermembran gilt als der beste Insert-Typ für die Zellvisualisierung in Fluoreszenz-Imaging-Anwendungen, was eine hervorragende Gelegenheit bietet, bei Bedarf Modifikationen von Tight-Junction-Proteinen und Transportern zu visualisieren. Während der gewählte kleine Porendurchmesser eine geringe Permeabilität für kleine hydrophile Moleküle über endotheliale Monoschichten hinweg erzeugt, begrenzt er auch die mögliche Anwendung des vorliegenden Triple-BBB-Modells für transendotheliale Migrationsassays, in denen 3 μm oder 8 μm Porengrößen erforderlich sind.
Schließlich kann eine weitere Einschränkung dieses Modells mit dem Fehlen von Scherspannungen zusammenhängen, von denen gezeigt wurde, dass sie die Bildung von Tight Junctions in dynamischen Dreifach-BBB-In-vitro-Systemen fördert21. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das etablierte robuste und physiologisch relevante Dreifachkultur-BBB-Modell, das sich aus primären menschlichen Zellen zusammensetzt, ein wertvolles Werkzeug für das Drogenscreening und die Untersuchung der BBB-Dysfunktion im Zusammenhang mit einem ischämischen Schlaganfall darstellt.
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Disclosures
Alle Autoren gaben bekannt, dass es keine Interessenkonflikte gibt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health (NIH) Grants MH128022, MH122235, MH072567, MH122235, HL126559, DA044579, DA039576, DA040537, DA050528 und DA047157 unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 mm Transwell with 0.4 µm Pore Polyester Membrane Insert | Corning | 3450 | |
| 35 mm Glass Bottom Dishes | MatTek Life Sciences (FISHERSCI) | P35GC-1.5-14-C | |
| Astrocyte Medium | Science Cell | 1801 | |
| Attachment Factor | Cell Systems (Fisher Scientific) | 4Z0-201 | |
| BD 60 mL Syringe | BD | 309653 | |
| BrainPhys Imaging Optimized Medium | STEMCELL Technologies | 5791 | |
| Complete Classic Medium With Serum and CultureBoost | 4Z0-500 | Cell Systems | |
| Corning 50 mL PP Centrifuge Tubes (Conical Bottom with CentriStar Cap | VWR | 430829 | |
| Corning 75cm² U-Shaped Canted Neck Not Treated Cell Culture Flask | Corning | 431464U | |
| Corning CellBIND 96-well Flat Clear Bottom Black Polystyrene Microplates | Corning | 3340 | |
| Countes Cell Counting Chamber Slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | ZGEXSCCOUNTESS2FL | |
| Decon CiDehol 70 Isopropyl Alcohol Solution | Fisher Scientific | 04-355-71 | |
| Disposable Petri Dishes | VWR | 25384-088 | |
| DMEM Medium (No glucose, No glutamine, No phenol red) | ThermoFisher | A14430-01 | Glucose-free medium |
| DPBS (No Calcium, No Magnesium) | ThermoFisher | 14190250 | |
| EBM Endothelial Cell Growth Basal Medium, Phenol Red Free, 500 mL | Lonza | CC-3129 | |
| EVOM2 Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter with STX2 electrodes | World Precison Instruments | NC9792051 | Epithelial voltohmmeter |
| Fluorescein isothiocyanate–dextran (wt 20,000) | Millipore Sigma | FD20-250MG | |
| Fluorescein isothiocyanate–dextran (wt 70,000) | Millipore Sigma | FD70S-250MG | |
| Fluorview FV3000 Confocal Microscope | Olympus | FV3000 | |
| Gas Tank (95% N2, 5% CO2) | Airgas | X02NI95C2003071 | |
| HBSS (No calcium, No magnesium, no phenol red) | Thermofisher | 14025092 | |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate - 10 mg/mL Solution in Water | ThermoFisher | H3570 | |
| Human Astrocytes | Science Cell | 1800 | |
| Human Brain Vascular Pericytes | Science Cell | 1200 | |
| Hypoxia Incubator Chamber | STEMCELL Technologies | 27310 | |
| Image-iT Green Hypoxia Reagent | ThermoFisher | I14834 | |
| Pericyte Medium | Science Cell | 1201 | |
| Primary Human Brain Microvascular Endothelial Cells | ACBRI 376 | Cell Systems | |
| Rocking Platform Shaker, Double | VWR | 10860-658 | |
| Single Flow Meter | STEMCELL Technologies | 27311 | |
| SpectraMax iD3 Microplate Reader | Molecular Devices | 75886-128 | |
| Syringe Filter, 25 mm, 0.22 μm, PVDF, Sterile | NEST Scientific | 380121 | |
| TPP Mutli-well Plates (6 wells) | MidSci | TP92406 | |
| TPP Tissue Culture Flasks T-75 Flasks | MidSci | TP90075 | Flasks with activated surface for cell adhesion |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | ThermoFisher | 25200056 | |
| UltraPure Distilled Water | Invitrogen (Life Technologies) | 10977-015 | |
| Uno Stage Top Incubator- | Oko Lab | UNO-T-H-CO2-TTL |
References
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