Summary

מודל תלת-תאי ראשוני של מחסום הדם-מוח האנושי לחקר שבץ איסכמי במבחנה

Published: October 06, 2022
doi:

Summary

במאמר זה נתאר את השיטה לביסוס מודל של תרבית תאים משולשת של מחסום הדם-מוח המבוסס על תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים ראשוניים במוח האנושי, אסטרוציטים ופריציטים. מודל רב-תאי זה מתאים למחקרים על תפקוד לקוי של יחידות נוירו-וסקולריות במהלך שבץ איסכמי במבחנה או לסינון מועמדים לתרופות.

Abstract

שבץ איסכמי הוא גורם מרכזי למוות ולנכות ברחבי העולם עם אפשרויות טיפוליות מוגבלות. הנוירופתולוגיה של שבץ איסכמי מאופיינת על ידי הפרעה באספקת הדם למוח המובילה למוות תאי ותפקוד קוגניטיבי. במהלך ואחרי שבץ איסכמי, תפקוד לקוי של מחסום דם-מוח (BBB) מקל על התקדמות הפציעה ותורם להחלמה לקויה של המטופל. המודלים הנוכחיים של BBB כוללים בעיקר מונוקולטורות אנדותל ותרביות כפולות עם אסטרוציטים או פריציטים.

מודלים כאלה חסרים את היכולת לחקות באופן מלא מיקרו-סביבה מוחית דינמית, החיונית לתקשורת בין תאים. בנוסף, מודלים נפוצים של BBB מכילים לעתים קרובות תאי אנדותל אנושיים מונצחים או תרביות תאים שמקורן בבעלי חיים (מכרסם, חזיר או בקר) המציבות מגבלות תרגום. מאמר זה מתאר מודל BBB חדשני המבוסס על הכנסה טובה המכיל רק תאים אנושיים ראשוניים (תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים במוח, אסטרוציטים ופריסיטים של כלי דם במוח) המאפשרים לחקור פגיעה מוחית איסכמית במבחנה.

ההשפעות של מחסור בחמצן-גלוקוז (OGD) על שלמות המחסום הוערכו על ידי חדירות פסיבית, מדידות התנגדות חשמלית טרנסאנדותליאלית (TEER) והדמיה ישירה של תאים היפוקסיים. הפרוטוקול המוצג מציע יתרון מובהק בחיקוי הסביבה הבין-תאית של ה-BBB in vivo, ומשמש כמודל BBB מציאותי יותר במבחנה לפיתוח אסטרטגיות טיפוליות חדשות במסגרת פגיעה מוחית איסכמית.

Introduction

שבץ מוחי הוא אחד הגורמים המובילים למוות ולנכות ארוכת טווח ברחבי העולם1. שכיחות השבץ עולה במהירות עם הגיל, ומכפילה את עצמה כל 10 שנים לאחר גיל 552. שבץ איסכמי מתרחש כתוצאה מהפרעה בזרימת הדם במוח עקב אירועים טרומבוטיים ותסחיפיים, המקיפים יותר מ -80% מכלל מקרי השבץ3. גם כיום, קיימות אפשרויות טיפול מעטות יחסית למזעור מוות של רקמות בעקבות שבץ איסכמי. הטיפולים שכן קיימים הם תלויי זמן וכתוצאה מכך לא תמיד מובילים לתוצאות קליניות טובות. לכן, מחקר על מנגנונים תאיים מורכבים של שבץ איסכמי המשפיעים על התאוששות לאחר שבץ הוא נחוץ בדחיפות.

ה-BBB הוא ממשק דינמי להחלפת מולקולות בין הדם לפרנכימה של המוח. מבחינה מבנית, ה-BBB מורכב מתאי אנדותל מיקרו-וסקולריים במוח המחוברים ביניהם על ידי קומפלקסים צומתיים המוקפים בקרום מרתף, פריציטים ואנדפיטים אסטרוציטיים4. פריסיטים ואסטרוציטים ממלאים תפקיד חיוני בשמירה על שלמות BBB באמצעות הפרשת גורמים שונים הדרושים להיווצרות צמתים חזקים והדוקים 5,6. התמוטטות ה- BBB היא אחד מסימני ההיכר של שבץ איסכמי. תגובה דלקתית חריפה ועקה חמצונית הקשורה לאיסכמיה מוחית גורמת לשיבוש של קומפלקסים של חלבונים בצמתים הדוקים ולהצלבה לא מווסתת בין אסטרוציטים, פריציטים ותאי אנדותל, מה שמוביל לחדירות מוגברת של מומסים פרא-תאיים ברחבי BBB7. תפקוד לקוי של BBB מקדם עוד יותר את היווצרות בצקת המוח ומגביר את הסיכון לטרנספורמציה דימומית8. בהתחשב בכל האמור לעיל, יש עניין רב בהבנת השינויים המולקולריים והתאיים המתרחשים ברמת BBB במהלך ואחרי שבץ איסכמי.

למרות שמודלים רבים של BBB במבחנה פותחו בעשורים האחרונים ומשמשים במגוון מחקרים, אף אחד מהם לא יכול לשכפל באופן מלא בתנאי in vivo 9. בעוד שחלק מהמודלים מבוססים על מונולרים של תאי אנדותל שגודלו בתרבית על תמיכות חדירות היטב לבדן או בשילוב עם פריסיטים או אסטרוציטים, רק מחקרים עדכניים יותר הציגו עיצובים של מודלים של תרביות תאים משולשות. כמעט כל המודלים הקיימים של BBB בתרבית משולשת משלבים תאי אנדותל ראשוניים במוח יחד עם אסטרוציטים ופריסיטים שבודדו ממיני בעלי חיים או תאים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים10,11,12,13.

מתוך הכרה בצורך לשחזר טוב יותר את ה-BBB במבחנה האנושית, הקמנו תרבית תאים משולשת במבחנה מודל BBB המורכב מתאי אנדותל מיקרו-וסקולריים במוח האנושי (HBMEC), אסטרוציטים אנושיים ראשוניים (HA) ופריסיטים וסקולריים ראשוניים במוח האנושי (HBVP). דגם BBB תלת-תרבותי זה ממוקם על צלחת 6 בארות, תוספות קרום פוליאסטר בגודל נקבוביות של 0.4 מיקרומטר. תוספות טובות אלה מספקות סביבה אופטימלית לחיבור תאים ומאפשרות גישה נוחה הן לתאים אפיקליים (דם) והן לתאים בזולטרליים (מוח) לדגימה בינונית או ליישום מורכב. התכונות של מודל BBB מוצע זה של תרבית תאים משולשת מוערכות על ידי מדידת TEER ושטף על-תאי לאחר OGD המחקה שבץ איסכמי במבחנה, עם מחסור בחמצן (<1% O2) וחומרים מזינים (על ידי שימוש במדיום נטול גלוקוז) המושג באמצעות תא לח ואטום. בנוסף, תנאים דמויי איסכמיה המושרים במודל זה מאומתים במדויק על ידי הדמיה ישירה של תאים היפוקסיים.

Protocol

הערה: עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים הקשורים לכל התאים, החומרים, הציוד והפתרונות המשמשים בפרוטוקול זה. 1. הגדרת מודל BBB של תרבית תאים משולשת זריעת פריציטיםטפחו HBVP בבקבוקי תרבית T75 עם משטח פעיל להידבקות תאים בתוך אינקובטור 5% CO2 בטמפרטורה של 37 ?…

Representative Results

כדי לבחון את ההשפעות של אסטרוציטים ופריסיטים על תפקוד המחסום של HBMEC, בנינו את מודל ה-BBB של תרבית תאים משולשת על תוספות תרביות תאים (איור 1A) יחד עם מונוקולטורה של HBMEC ושני מודלים של תרביות משותפות כפולות כבקרות (איור 1B). בקרות כפולות של תרבית משותפת כללו תרבית מ?…

Discussion

בפרוטוקול זה אנו מתארים שיטה להקמת מודל BBB אמין של תרבית תאי אנדותל-פריציטים-אסטרוציטים לחקר תפקוד לקוי של BBB בהגדרה של שבץ איסכמי במבחנה. בהתחשב בכך pericytes הם השכנים הקרובים ביותר של תאי אנדותל in vivo, HBVP מצופים על החלק התחתון של מוסיף היטב מודלזה 16. למרות שתצורה זו חסרה ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי מענקי המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) MH128022, MH122235, MH072567, MH122235, HL126559, DA044579, DA039576, DA040537, DA050528 ו- DA047157.

Materials

24 mm Transwell with 0.4 µm Pore Polyester Membrane Insert Corning 3450
35 mm Glass Bottom Dishes MatTek Life Sciences (FISHERSCI) P35GC-1.5-14-C
Astrocyte Medium Science Cell 1801
Attachment Factor Cell Systems (Fisher Scientific) 4Z0-201
BD 60 mL Syringe BD 309653
BrainPhys Imaging Optimized Medium STEMCELL Technologies 5791
Complete Classic Medium With Serum and CultureBoost 4Z0-500 Cell Systems
Corning 50 mL PP Centrifuge Tubes (Conical Bottom with CentriStar Cap VWR 430829
Corning 75cm² U-Shaped Canted Neck Not Treated Cell Culture Flask  Corning 431464U
Corning CellBIND 96-well Flat Clear Bottom Black Polystyrene Microplates Corning 3340
Countes Cell Counting Chamber Slides Thermo Fisher Scientific C10228
Countess II FL Automated Cell Counter Thermo Fisher Scientific ZGEXSCCOUNTESS2FL
Decon CiDehol 70 Isopropyl Alcohol Solution  Fisher Scientific  04-355-71
Disposable Petri Dishes VWR 25384-088
DMEM Medium (No glucose, No glutamine, No phenol red) ThermoFisher A14430-01 Glucose-free medium
DPBS (No Calcium, No Magnesium) ThermoFisher 14190250
EBM Endothelial Cell Growth Basal Medium, Phenol Red Free, 500 mL Lonza CC-3129
EVOM2 Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter with STX2 electrodes World Precison Instruments NC9792051 Epithelial voltohmmeter 
Fluorescein isothiocyanate–dextran (wt 20,000) Millipore Sigma FD20-250MG
Fluorescein isothiocyanate–dextran (wt 70,000) Millipore Sigma FD70S-250MG
Fluorview FV3000 Confocal Microscope Olympus FV3000
Gas Tank (95% N2, 5% CO2) Airgas X02NI95C2003071
HBSS (No calcium, No magnesium, no phenol red) Thermofisher 14025092
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate – 10 mg/mL Solution in Water ThermoFisher H3570
Human Astrocytes Science Cell 1800
Human Brain Vascular Pericytes Science Cell 1200
Hypoxia Incubator Chamber STEMCELL Technologies 27310
Image-iT Green Hypoxia Reagent ThermoFisher I14834
Pericyte Medium Science Cell 1201
Primary Human Brain Microvascular Endothelial Cells ACBRI 376 Cell Systems
Rocking Platform Shaker, Double VWR 10860-658
Single Flow Meter STEMCELL Technologies 27311
SpectraMax iD3 Microplate Reader Molecular Devices 75886-128
Syringe Filter, 25 mm, 0.22 μm, PVDF, Sterile NEST Scientific 380121
TPP Mutli-well Plates (6 wells) MidSci TP92406
TPP Tissue Culture Flasks T-75 Flasks MidSci TP90075 Flasks with activated surface for cell adhesion
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red ThermoFisher 25200056
UltraPure Distilled Water Invitrogen (Life Technologies) 10977-015
Uno Stage Top Incubator- Oko Lab UNO-T-H-CO2-TTL

References

  1. Mozaffarian, D., et al. Heart disease and stroke statistics-2016 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 133 (94), 38 (2016).
  2. Yousufuddin, M., Young, N. Aging and ischemic stroke. Aging. 11 (9), 2542-2544 (2019).
  3. Donkor, E. S. Stroke in the 21st century: a snapshot of the burden, epidemiology, and quality of life. Stroke Research and Treatment. , 3238165 (2018).
  4. Kadry, H., Noorani, B., Cucullo, L. A blood-brain barrier overview on structure, function, impairment, and biomarkers of integrity. Fluids and Barriers of the CNS. 17 (1), 69 (2020).
  5. Brown, L. S., et al. Pericytes and neurovascular function in the healthy and diseased brain. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 282 (2019).
  6. Cabezas, R., et al. Astrocytic modulation of blood brain barrier: perspectives on Parkinson’s disease. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 211 (2014).
  7. Abdullahi, W., Tripathi, D., Ronaldson, P. T. Blood-brain barrier dysfunction in ischemic stroke: targeting tight junctions and transporters for vascular protection. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 315 (3), 343-356 (2018).
  8. Candelario-Jalil, E., Dijkhuizen, R. M., Magnus, T. Neuroinflammation, stroke, blood-brain barrier dysfunction, and imaging modalities. Stroke. 53 (5), 1473-1486 (2022).
  9. He, Y., Yao, Y., Tsirka, S. E., Cao, Y. Cell-culture models of the blood-brain barrier. Stroke. 45 (8), 2514-2526 (2014).
  10. Thomsen, L. B., Burkhart, A., Moos, T. A triple culture model of the blood-brain barrier using porcine brain endothelial cells, astrocytes and pericytes. PLoS One. 10 (8), 0134765 (2015).
  11. Song, Y., Cai, X., Du, D., Dutta, P., Lin, Y. Comparison of blood-brain barrier models for in vitro biological analysis: one cell type vs three cell types. ACS Applied Bio Materials. 2 (3), 1050-1055 (2019).
  12. Xu, L., et al. Silver nanoparticles induce tight junction disruption and astrocyte neurotoxicity in a rat blood-brain barrier primary triple coculture model. International Journal of Nanomedicine. 10, 6105-6118 (2015).
  13. Appelt-Menzel, A. Establishment of a human blood-brain barrier co-culture model mimicking the neurovascular unit using induced pluri- and multipotent stem cells. Stem Cell Reports. 8 (4), 894-906 (2017).
  14. Zhang, Y., et al. Rational construction of a reversible arylazo-based NIR probe for cycling hypoxia imaging in vivo. Nature Communications. 12 (1), 2772 (2021).
  15. Palacio-Castañeda, V., Kooijman, L., Venzac, B., Verdurmen, W. P. R., Le Gac, S. Metabolic switching of tumor cells under hypoxic conditions in a tumor-on-a-chip model. Micromachines. 11 (4), 382 (2020).
  16. Ramsauer, M., Krause, D., Dermietzel, R. Angiogenesis of the blood-brain barrier in vitro and the function of cerebral pericytes. FASEB Journal. 16 (10), 1274-1276 (2002).
  17. Lyck, R., et al. ALCAM (CD166) is involved in extravasation of monocytes rather than T cells across the blood-brain barrier. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 37 (8), 2894-2909 (2017).
  18. Rizzi, E., et al. A triple culture cell system modeling the human blood-brain barrier. Journal of Visualized Experiments. (177), (2021).
  19. Kumar, S., Shaw, L., Lawrence, C., Lea, R., Alder, J. P50: Developing a physiologically relevant blood brain barrier model for the study of drug disposition in glioma. Neuro-Oncology. 16 (6), (2014).
  20. Stone, N. L., England, T. J., O’Sullivan, S. E. A novel transwell blood brain barrier model using primary human cells. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 230 (2019).
  21. Al Ahmad, A., Taboada, C. B., Gassmann, M., Ogunshola, O. O. Astrocytes and pericytes differentially modulate blood-brain barrier characteristics during development and hypoxic insult. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 31 (2), 693-705 (2011).

Play Video

Cite This Article
Fattakhov, N., Torices, S., Becker, S., Teglas, T., Naranjo, O., Toborek, M. A Triple Primary Cell Culture Model of the Human Blood-Brain Barrier for Studying Ischemic Stroke In Vitro. J. Vis. Exp. (188), e64469, doi:10.3791/64469 (2022).

View Video