Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

İskemik İnme In Vitro Çalışması için İnsan Kan-Beyin Bariyerinin Üçlü Birincil Hücre Kültürü Modeli

Published: October 6, 2022 doi: 10.3791/64469
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1,2
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Miller School of Medicine, University of Miami, 2Institute of Physiotherapy and Health Sciences, The Jerzy Kukuczka Academy of Physical Education

Summary

Burada, birincil insan beyni mikrovasküler endotel hücrelerine, astrositlere ve perisitlere dayanan kan-beyin bariyerinin üçlü hücre kültürü modelini oluşturma yöntemini açıklıyoruz. Bu çok hücreli model, in vitro iskemik inme sırasında nörovasküler birim disfonksiyonunun incelenmesi veya ilaç adaylarının taranması için uygundur.

Abstract

İskemik inme, sınırlı tedavi seçenekleri ile dünya çapında önemli bir ölüm ve sakatlık nedenidir. İskemik inmenin nöropatolojisi, hücre ölümüne ve bilişsel işlev bozukluğuna yol açan beyne giden kan akışında bir kesinti ile karakterizedir. İskemik inme sırasında ve sonrasında, kan-beyin bariyeri (BBB) disfonksiyonu yaralanma ilerlemesini kolaylaştırır ve zayıf hasta iyileşmesine katkıda bulunur. Mevcut BBB modelleri öncelikle endotel monokültürlerini ve astrositler veya perisitlerle çift ortak kültürleri içerir.

Bu tür modeller, hücreden hücreye iletişim için gerekli olan dinamik bir beyin mikro çevresini tamamen taklit etme yeteneğinden yoksundur. Ek olarak, yaygın olarak kullanılan BBB modelleri genellikle ölümsüzleştirilmiş insan endotel hücrelerini veya translasyonel sınırlamalar oluşturan hayvan kaynaklı (kemirgen, domuz veya sığır) hücre kültürlerini içerir. Bu yazıda, iskemik beyin hasarının in vitro olarak araştırılmasını sağlayan, sadece primer insan hücrelerini (beyin mikrovasküler endotel hücreleri, astrositler ve beyin vasküler perisitleri) içeren yeni bir iyi yerleştirme tabanlı BBB modeli açıklanmaktadır.

Oksijen-glukoz yoksunluğunun (OGD) bariyer bütünlüğü üzerine etkileri pasif geçirgenlik, transendotelyal elektriksel direnç (TEER) ölçümleri ve hipoksik hücrelerin doğrudan görüntülenmesi ile değerlendirildi. Sunulan protokol, BBB'nin hücreler arası ortamını in vivo olarak taklit eden belirgin bir avantaj sunarak, iskemik beyin hasarı ortamında yeni terapötik stratejiler geliştirmek için daha gerçekçi bir in vitro BBB modeli olarak hizmet vermektedir.

Introduction

İnme, dünya çapında önde gelen ölüm ve uzun süreli sakatlık nedenlerinden biridir1. İnme insidansı yaşla birlikte hızla artar ve 55 yaşından sonra her 10 yılda bir iki katına çıkar2. İskemik inme, tüm inme vakalarının %80'inden fazlasını kapsayan trombotik ve embolik olaylara bağlı serebral kan akımının bozulması sonucu ortaya çıkar3. Şimdi bile, iskemik inme sonrası doku ölümünü en aza indirmek için nispeten az sayıda tedavi seçeneği mevcuttur. Mevcut tedaviler zamana duyarlıdır ve sonuç olarak her zaman iyi klinik sonuçlara yol açmaz. Bu nedenle, inme sonrası iyileşmeyi etkileyen iskemik inmenin karmaşık hücresel mekanizmaları üzerine araştırmalara acilen ihtiyaç vardır.

BBB, kan ve beyin parankimi arasındaki moleküllerin değişimi için dinamik bir arayüzdür. Yapısal olarak, BBB, bir bazal membran, perisitler ve astrositik uç ayaklar4 ile çevrili bileşke kompleksleri ile birbirine bağlanmış beyin mikrovasküler endotel hücrelerinden oluşur. Perisitler ve astrositler, güçlü, sıkı kavşakların oluşumu için gerekli çeşitli faktörlerin salgılanması yoluyla BBB bütünlüğünün korunmasında önemli bir rol oynamaktadır 5,6. BBB'nin parçalanması, iskemik inmenin ayırt edici özelliklerinden biridir. Serebral iskemi ile ilişkili akut inflamatuar yanıt ve oksidatif stres, sıkı bağlantı protein komplekslerinin bozulmasına ve astrositler, perisitler ve endotel hücreleri arasındaki düzensiz çapraz konuşmaya neden olur ve bu da BBB7 boyunca parasellüler çözünür geçirgenliğin artmasına neden olur. BBB disfonksiyonu ayrıca beyin ödemi oluşumunu teşvik eder ve hemorajik transformasyon riskini arttırır8. Yukarıdakilerin tümü göz önüne alındığında, iskemik inme sırasında ve sonrasında BBB düzeyinde meydana gelen moleküler ve hücresel değişikliklerin anlaşılmasına büyük ilgi vardır.

Her ne kadar birçok in vitro BBB modeli son yıllarda geliştirilmiş ve çeşitli çalışmalarda kullanılmış olsa da, hiçbiri in vivo koşullarda tam olarak çoğalamamaktadır9. Bazı modeller, tek başına veya perisitler veya astrositlerle kombinasyon halinde iyi yerleştirilmiş geçirgen destekler üzerinde kültürlenmiş endotel hücre monokatmanlarına dayanırken, sadece daha yeni çalışmalar üçlü hücre kültürü model tasarımlarını ortaya koymuştur. Hemen hemen tüm mevcut üçlü kültür BBB modelleri, hayvan türlerinden izole edilen astrositler ve perisitler veya insan pluripotent kök hücrelerinden türetilen hücreler10,11,12,13 ile birlikte birincil beyin endotel hücrelerini içerir.

İnsan BBB'sini in vitro olarak daha iyi özetleme ihtiyacını kabul ederek, insan beyni mikrovasküler endotel hücreleri (HBMEC), birincil insan astrositleri (HA) ve birincil insan beyni vasküler perisitlerinden (HBVP) oluşan üçlü bir hücre kültürü in vitro BBB modeli kurduk. Bu üçlü kültür BBB modeli, 0,4 μm gözenek boyutuna sahip 6 delikli plakalı, polyester membran uçlar üzerine kurulmuştur. Bu iyi insertler, hücre bağlantısı için en uygun ortamı sağlar ve orta örnekleme veya bileşik uygulaması için hem apikal (kan) hem de bazolateral (beyin) bölmelere kolay erişim sağlar. Bu önerilen üçlü hücre kültürü BBB modelinin özellikleri, in vitro iskemik inmeyi taklit eden OGD sonrası TEER ve parasellüler akı, nemlendirilmiş, kapalı bir oda kullanılarak elde edilen oksijen (% <1O2) ve besin (glikozsuz ortam kullanılarak) eksikliği ile ölçülerek değerlendirilmektedir. Ek olarak, bu modeldeki indüklenmiş iskemik benzeri koşullar, hipoksik hücrelerin doğrudan görselleştirilmesiyle doğru bir şekilde doğrulanır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

NOT: Bu protokolde kullanılan tüm hücreler, malzemeler, ekipmanlar ve çözümlerle ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosu'na bakın.

1. Üçlü hücre kültürü BBB model ayarı

  1. Tohumlama perisitleri
    1. HBVP'yi T75 kültür şişelerinde, birleşene kadar 37 ° C'de% 5'lik bir CO2 inkübatörü içinde hücre yapışması için aktif bir yüzeye sahip olarak yetiştirin. Birleşmeye ulaşıldıktan sonra, eski perisit ortamını aspire edin ve hücreleri 5 mL ılık Dulbecco'nun fosfat tamponlu salini (DPBS) ile yıkayın. DPBS'yi aspire edin ve 4 mL sıcak tripsin-EDTA çözeltisi ve 1 mL DPBS kombinasyonunu kullanarak hücreleri şişeden ayırın.
      NOT: P7'den sonraki pasajları kullanmaktan kaçının.
    2. Şişeyi bir CO2 inkübatöründe 37 ° C'de 5 dakika boyunca inkübe edin. Hücrelerin şişeden ayrılıp ayrılmadığını doğrulamak için mikroskop altında görüntüleyin. Şişeye 5 mL ılık perisit ortamı (% 2 fetal sığır serumu [FBS] içeren) ekleyin ve ayrılan hücreleri 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın.
    3. Hücre süspansiyonunu 200 × g'da 3 dakika boyunca santrifüj ederek hücrelerin tüpün dibinde bir pelet oluşturmasına izin verin. Hücre peletinin bozulmadan kalmasını sağlamak için ortamı tüpten aspire edin.
    4. Hücre peletini perisit ortamında yeniden askıya alın; hücrelerin birleşmesine ve ihtiyaç duyulan kuyu eklerinin sayısına bağlı olarak ortam miktarını hesaplayın. Yeniden askıya alınan hücrelerin 10 μL'sini alın, bunları bir hücre sayma slaytına yerleştirin ve hücre sayısını sayın.
    5. Hücre yoğunluğunu belirleyin ve 300.000 hücreyi tohumlayın / kuyu eklerin abluminal tarafına 1 mL perisit ortamında ekleyin (6 delikli format).
      NOT: HBVP'yi kesici uçların alt tarafına yerleştirirken, önce kuyu ucu plakalarını baş aşağı çevirmek çok önemlidir. Plaka bir yüzeye düz bir şekilde yerleştirilirken, kuyu eklerinin abluminal tarafını ortaya çıkarmak için alt kısmı çıkarın. Abluminal tarafa perisit hücresi süspansiyonu ekledikten sonra, buharlaşmayı önlemek için kuyu eklerini ters çevrilmiş plaka ile örtün. Tüm plakaları gece boyunca 37 ° C'de% 5 CO2 inkübatöründe baş aşağı çevirin.
  2. Astrositlerin tohumlanması
    1. Birleşime ulaşılana kadar 37 °C'de %5'lik bir CO2 inkübatörü içinde T75 şişelerinde HA yetiştirin. Perisit ortamı yerine astrosit ortamı (ayrıca% 2 FBS içeren) kullanarak yukarıdaki 1.1.1-1.1.4 adımlarını izleyin.
      NOT: P9'dan sonraki pasajları kullanmaktan kaçının.
    2. Hücre yoğunluğunu belirleyin ve doku kültürünün dibine 300.000 hücre / kuyu tohumlayın 6 kuyucuklu plakalar. Buharlaşmayı önlemek için plakayı örtün ve tüm plakaları gece boyunca 37 ° C'de% 5'lik bir CO2 inkübatöründe tutun.
  3. Endotel hücrelerinin tohumlanması
    1. HBMEC'yi doku kültürü kaplarında, birleşene kadar 37 ° C'de% 5'lik bir CO2 inkübatöründe yetiştirin. Perisit ortamı yerine tam klasik ortam (%10 FBS içeren) kullanarak yukarıdaki 1.1.1-1.1.4 adımlarını izleyin.
      NOT: P12'den sonraki pasajları kullanmaktan kaçının.
    2. Astrositler içeren doku kültürü 6 kuyucuklu plakaları ve perisitler içeren kuyu eklerini (6 kuyucuklu format) 37 °C'de% 5 CO2 inkübatöründen çıkarın. Astrosit ortamını doku kültürü 6 kuyucuklu plakalardan aspire edin. Her bir kuyucuğa 1 mL perisit ortamı ve 1 mL astrosit ortamı ekleyin.
    3. Perisit ortamını kuyu eklerinden aspire edin ve tohumlanmış astrositleri içeren doku kültürü 6 kuyucuklu plakalara yerleştirin. HBMEC'yi 2 mL'lik tam klasik ortamda 300.000 hücre / kuyucuk yoğunluğunda, aynı kuyu eklerinin apikal tarafına tohumlayın.
      NOT: Endotel hücreleri, kuyu eklerinin abluminal tarafındaki perisitlerin ve doku kültürü 6 delikli plakaların üzerindeki astrositlerin tohumlanmasından sonraki ertesi gün kuyu eklerinin apikal tarafına tohumlanmalıdır. BBB benzeri özellikleri indüklemek için hücreler 6 gün boyunca üçlü kültürde tutulmalıdır. Hücre kültürü ortamı, deneylerden 24 saat önce her iki iyi yerleştirilmiş bölmede değiştirilmelidir.

2. Oksijen-glikoz yoksunluğunun indüksiyonu

  1. Hücreleri DPBS ile 3 kat yıkayın. OGD'ye tabi tutulan üçlü hücre kültürleri için, hem apikal hem de bazolateral bölmelere glikozsuz ortam (L-glutamin ve fenol kırmızısı olmadan) ekleyin. Normozik kontrol hücresi kültürlerinde kültür ortamını taze ortamla değiştirin. Kontrol üçlü kültürlerini 37 °C'de %5 CO2 inkübatöre yerleştirin.
    NOT: OGD'nin indüksiyonundan önce veya OGD'den hemen sonra meydana gelen değişiklikler, endotel hücre monokatmanlarını daha da etkileyecek mekanik stres yaratabilir. Böylece, normoksik kontrol hücre kültürleri için orta replasman ile adımlar dahil edilmiştir.
  2. Kültürlerin yeterli nemlendirilmesini sağlamak için hipoksi inkübatör odasına 20 mL steril su içeren bir Petri kabı yerleştirin. Halka kelepçesini serbest bırakarak odayı açın. Hücre kültürlerini raflara yerleştirin. Halka kelepçesini sabitleyerek odayı kapatın.
  3. Odanın hem giriş hem de çıkış portlarını açın. Debimetrenin üstünden gelen boruyu odaya takın. Debimetrenin altından gelen boruyu, bir hava filtresi aracılığıyla% 95 N2/% 5 CO2 gaz karışımını içeren gaz tankına takın. 
  4. Minimum gaz akışına izin vermek için tank akış kontrol valfini saat yönünün tersine çevirerek açın. Saat yönünde dönerek basınç regülatörü valfini yavaşça açın.
  5. Odayı gaz karışımı ile 5 dakika boyunca 20 L/dak akış hızında yıkayın. Odayı gaz kaynağından ayırın ve her iki beyaz plastik kelepçeyi de sıkıca kapatın.
  6. Saat yönünde dönerek tank akış kontrol valfini kapatın. Saat yönünün tersine dönerek basınç regülatörü valfini kapatın.
  7. Hipoksi odasını 4 saat boyunca 37 ° C'de geleneksel bir inkübatöre yerleştirin.
    NOT: Sonraki reoksijenasyon periyodunu eklemek için, hücreleri DPBS ile 3 kat yıkayın, tüm üçlü kültürlerde taze ortam ekleyin ve 37 ° C'de% 5 CO 2 inkübatöründe24 saat daha saklayın. Üreticinin talimatlarına göre, haznede kalan oksijen konsantrasyonu, 20 L / dak'da anaerobik gaz karışımı ile en az 4 dakika temizlendikten sonra% 0'dır.

3. TEER ölçümleri

  1. Sterilize edilmiş TEER cihazını biyogüvenlik kabinine yerleştirin ve elektrotları epitel voltohmmetresine takın. Elektrotları en az 30 dakika boyunca 30 mL% 70 izopropil alkol çözeltisinde sterilize edin.
  2. TEER cihazını açın ve işlevi ohm olarak ayarlayın.
  3. Elektrotları% 70 izopropil alkol çözeltisinden çıkarın ve TEER cihazındaki dijital okuma 0 ohm okuyana kadar en az 30 dakika boyunca 20 mL DPBS içine yerleştirin.
  4. Elektrotun uzun çatalını, boş kuyu eki kontrolünün kuyu ekleme askısındaki üç açıklıktan birine yerleştirin ve kuyunun dibine değene kadar indirin. Kısa çatalın, kuyu ucunun altındaki apikal kültürün üzerinde durduğundan emin olun.
    NOT: Boş kuyu eki kontrolü, apikal bölmede 2 mL komple klasik ortamdan ve bazolateral bölmede 1 mL perisit ortamı ve 1 mL astrosit ortamının bir kombinasyonundan oluşur. TEER ölçümü yapılırken elektrotların kuyu girişine 90° C'de tutulduğunu tespit edin. Aynı kuyuda elde edilen iki veya üç okumanın ortalamasını kullanmak (açıklık başına) değişkenliği azaltmaya yardımcı olabilir.
  5. Değeri kaydetmeden önce TEER cihazındaki dijital okuma değerleri aynı seviyeye gelene kadar bekleyin. Elektrotları ölçümler arasında yıkamak için tekrar DPBS'ye yerleştirin. İki boş kuyu eki kontrolü için tüm TEER ölçümlerini toplamaya devam edin.
  6. Kontrol ölçümleri için alınan 3.4-3.5 adımlarını kullanarak numune plakalarının TEER ölçümlerini toplayın. Tüm ölçümler yapıldıktan sonra, elektrodu 30 dakika boyunca% 70 izopropil alkol çözeltisine geri yerleştirin. Elektrotları TEER cihazından ayırın ve hava ile kurumasını bekleyin.
  7. TEER değerlerini hesaplayın. Boş kuyu eki kontrolünün ortalama ohm değerini numunenin ohm değerinden çıkarmak için denklem (1)'i kullanın ve ardından bildirilen TEER değerini Ω∙cm2 cinsinden vermek için bu direnç değerini membran ekinin alanıyla (cm2) çarpın.
    Equation 1 (1)

4. BBB parasellüler geçirgenliğinin değerlendirilmesi

NOT: FITC-dextran içeren tüm adımları, ışıklar kapalıyken bir hücre kültürü biyogüvenlik kabininde gerçekleştirin. Fotobeyazlatmayı en aza indirmek için FITC-dextran çözeltilerini alüminyum folyo ile örtün.

  1. Fenol kırmızısı içermeyen endotel hücre büyüme ortamı kullanarak 20 ve 70 kDa'lık (0.1 mg / mL) FITC-dextrans içeren çözeltiler hazırlayın ve sallanan bir platform çalkalayıcıda 1 saat boyunca karıştırılmaya izin verin. 0,22 μm şırınga filtresi kullanarak çözeltileri filtreleyin.
  2. Ortamı bazolateral bölmeden aspire edin ve üçlü hücre kültürü BBB modelinde 2 mL fenol kırmızısız endotel hücre büyüme ortamı ile değiştirin. Apikal bölmedeki hücreleri Hanks'in dengeli tuz çözeltisi (HBSS) ile iki kez yıkayın.
  3. Apikal bölmeye 1 mL FITC-dextran çözeltisi ekleyin ve plakayı alüminyum folyo ile örtün. Plakayı 1 saat boyunca 37 °C'de% 5 CO2 inkübatöre yerleştirin.
  4. Bazolateral bölmelerden 100 μL ortam alın ve siyah 96 delikli bir plakaya aktarın. Floresansı, sırasıyla 480 nm ve 530 nm olarak ayarlanmış uyarma ve emisyon dalga boylarına sahip bir mikroplaka okuyucu kullanarak ölçün.

5. Canlı hücrelerde hipoksi tespiti

  1. Tohum 200 μL HBMEC, HA ve HBVP, poli-d-lizin kaplı, 35 mm cam alt tabakların merkezinde, 150.000 hücre / çanak yoğunluğunda. HBMEC'yi tohumlamadan önce, bulaşıkların dibini bağlantı faktörü ile kaplayın. Hücrelerin bir CO2 inkübatöründe gece boyunca 37 ° C'de bırakarak cam yüzeye yapışmasına izin verin.
    NOT: İnsan birincil hücrelerine sahip çanakları, OGD için bir hipoksi odasına üçlü iyi yerleştirilmiş bir BBB modeli ile aynı anda yerleştirmek önemlidir.
  2. Birleşmeye ulaşıldıktan sonra, kültür ortamını atın ve referans verilen Image-iT yeşil hipoksi reaktifinin (son konsantrasyon 1 μM) 2 μL'lik 1 mM Hoechst 33342 (son konsantrasyon 0.2 μM) ve 0.5 μL 5 mM stok çözeltisi içeren 2 mL önceden ısıtılmış glikozsuz ortam (OGD için) veya normal ortam (kontroller için) ekleyin. OGD tedavisinden sonra, ortamı tüm yemeklerde görüntüleme için optimize edilmiş ortamla değiştirin.
  3. GFP filtresi ve üst aşama konfokal mikroskop inkübatörü ile floresan canlı hücre görüntülemesini daha önce tarif edildiği gibi gerçekleştirin14,15.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Astrositlerin ve perisitlerin HBMEC'nin bariyer fonksiyonu üzerindeki etkilerini incelemek için, HBMEC monokültürü ve kontrol olarak iki çift ko-kültür modeli ile birlikte hücre kültürü ekleri üzerinde üçlü hücre kültürü BBB modelini (Şekil 1A) oluşturduk (Şekil 1B). Çift ko-kültür kontrolleri, HBMEC'nin HA ile temassız bir ortak kültürünü ve HBMEC'nin HBVP ile temas ortak kültürünü içeriyordu. Ko-kültürde 6 gün kaldıktan sonra, tüm deney düzenekleri 4 saat boyunca OGT'ye tabi tutuldu. Belirtilen BBB konfigürasyonlarında endotel monokatmanının bariyer bütünlüğü, OGD'den önce ve sonra ve 24 saatlik reoksijenasyondan sonra TEER belirlenerek değerlendirildi (Şekil 1C). 4 saat boyunca OGD, sadece HBMEC monokültüründe ve HBMEC ve HBVP ile ko-kültür modelinde TEER değerlerinde anlamlı bir düşüşe neden olmuştur. Bu azalan seviyeler, 24 saatlik reoksijenasyonun ardından temel seviyelere ulaştı. OGD'nin HBMEC ve HA ile ko-kültür modeli üzerinde hiçbir etkisi yoktur, astrositlerin in vitro iskemik koşullara karşı koruyucu rolüne işaret etmiştir.

Üçlü ve HBMEC/HBVP çift ortak kültür modelleri arasında temel TEER'de bir fark olmamasına rağmen, üçlü ortak kültür modelindeki TEER değerleri, OGD'den hemen sonra çift ortak kültür kontrolleri veya monokültür kontrolündekilerden anlamlı derecede yüksekti, bu da HA ve HBVP'nin üçlü BBB modeline entegrasyonunun patolojik koşullar altında BBB fonksiyonel bütünlüğünün korunmasında kritik bir rol oynadığını düşündürmektedir (Şekil 1C ). Ayrıca, geliştirilen üçlü kültür modelinde endotel tek katmanı boyunca küçük (20 kDa) ve büyük (70 kDa) moleküler kütle FITC-dekstransın geçirgenliğini araştırdık. Endotel monokatmanlarının 20 kDa moleküler kütle FITC-dextran'a parasellüler geçirgenliği, HBMEC monokültüründe büyük ölçüde ve HBMEC ve HBVP ile ko-kültür modelinde normoksik kontrollere kıyasla daha az ölçüde artmıştır (Şekil 1D). Ayrıca, 20 kDa FITC-dextran geçirgenlik seviyeleri, normoksik ve OGD koşulları altındaki tüm modeller arasında üçlü BBB modelinde en düşük seviyedeydi. Modellerin hiçbirinde endotel monokatmanları arasında 70 kDa FITC-dekstran akısında herhangi bir değişiklik gözlenmedi (Şekil 1E). Bu veriler, iskemik-hipoksik hasarın, plazma proteinleri gibi büyük moleküllere parasellüler geçirgenlikte değişikliklere neden olacak kadar şiddetli olmadığını göstermektedir.

Figure 1
Şekil 1: İnsan primer mono-, co- ve üçlü kültür BBB modellerinde oksijen-glukoz yoksunluğunun transendotelyal elektriksel direnç ve endotel geçirgenliği üzerine etkileri. (A) Üçlü birincil hücre kültürü BBB modelinin ayarlanması için şematik zaman çizelgesi. (B) İn vitro statik insan birincil hücre tabanlı BBB modelleri için konfigürasyonların şematik gösterimleri. Bir monokültür modeli, iyi yerleştirilmiş gözenekli membranın apikal tarafına tohumlanmış HBMEC içerir. Temassız bir ortak kültür, kuyu eki desteğinin üst yüzeyinde tohumlanmış HBMEC ve kültür kuyusunun dibinde tohumlanmış HA içerir. Bir temas ortak kültür modeli, üst yüzeyde HBMEC ile kuyu ekleme desteğinin alt yüzeyinde tohumlanmış HBVP'yi içerir. Üçlü kültür modeli için HBMEC, desteğin üst yüzeyine, HBVP alt yüzeye tohumlanmış ve HA kültür kuyularının dibine tohumlanmıştır. (C) TEER'deki değişiklikler OGD'den hemen önce, 4 saat OGD'den sonra ve 24 saat reoksijenasyondan sonra izlenir. Ortalama ± SEM olarak gösterilen veriler (n = 5-6). P < mono ve ko-kültür modelleriyle (iki yönlü ANOVA) karşılaştırıldığında 0.0001'dir. (D) Endotel monokatmanları boyunca 20 kDa FITC-dekstrana parasellüler geçirgenlik, 4 saatlik OGD'den sonra ölçüldü. (E) Endotel monokatmanları boyunca 70 kDa FITC-dextran'a parasellüler geçirgenlik, 4 saatlik OGD'den sonra ölçüldü. Ortalama ± SD olarak gösterilen veriler (n = 5-6). *P 0,05 <. P < 0.0001 (iki yönlü ANOVA). Kısaltmalar: OGD = oksijen-glikoz yoksunluğu; TEER = transendotelyal elektrik direnci; HBMEC = insan beyni mikrovasküler endotel hücreleri; HA = insan astrositleri; HBVP = insan beyni vasküler perisitleri; FITC-dextran = floresein izotiyosiyanata konjuge edilmiş dekstran; Arb. birimler = rasgele birimler. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

OGD'ye bağlı hipoksik hasarı doğrulamak için, HBMEC, HA ve HBVP, 35mm cam taban tabaklarının kuyucuklarında kültürlendi ve floresan sinyali azalan oksijen seviyeleri ile artan hipoksi reaktifi ile yüklendi. OGD'ye maruz kalan tüm birincil insan tipleri, görüntülenen canlı hücrelerin hipoksik olduğunu kanıtlayan güçlü yeşil floresan sergiledi (Şekil 2). Farklı perivasküler hücre tiplerine (astrositler ve perisitler) sahip olmanın veya BBB modelindeki kombinasyonlarının bir OGD protokolünü takiben bariyer özellikleri üzerindeki etkilerini tahmin ettikten sonra, üçlü modelin test edilen diğer BBB modellerinden daha üstün olduğu sonucuna vardık.

Figure 2
Şekil 2: 4 saatlik oksijen-glikoz yoksunluğunu takiben hipoksik primer insan beyni mikrovasküler endotel hücrelerinin, insan astrositlerinin ve insan beyni vasküler perisitlerinin canlı boyanması. OGD maruziyetleri tüm primer hücrelerde (HBMEC, HA ve HBVP) hipoksi reaktif ve glukozsuz ortam kullanılarak 4 saat boyunca gerçekleştirildi. Dört bağımsız deneyin sonuçları gösterilmiştir. Kültürler 20x büyütmede görüntülendi. Ölçek çubukları = 100 μm. Kısaltmalar: OGD = oksijen-glikoz yoksunluğu; HBMEC = insan beyni mikrovasküler endotel hücreleri; HA = insan astrositleri; HBVP = insan beyni vasküler perisitleri; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu protokolde, in vitro iskemik inme ortamında BBB disfonksiyonunu incelemek için güvenilir bir üçlü endotel hücre-perisit-astrosit kültürü BBB modeli oluşturmak için bir yöntem tanımladık. Perisitlerin in vivo endotel hücrelerinin en yakın komşuları olduğu göz önüne alındığında, HBVP bu model16'daki kuyu eklerinin alt tarafına kaplanmıştır. Bu konfigürasyon, astrositler ve endotel hücreleri arasındaki doğrudan hücreden hücreye iletişimden yoksun olmasına rağmen, bu düzenleme, salgılanan çözünür faktörler aracılığıyla hücre tipleri arasında dolaylı hücreden hücreye iletişime izin verir. Bu sistemde astrositlerin ve perisitlerin varlığı, HBMEC bütünlüğünü büyük ölçüde geliştirir ve tek katmanın parasellüler geçirgenliğini küçük boyutlu izleyicilerle sınırlar. Ek olarak, astrositler ve perisitler OGD koşullarında HBMEC üzerinde koruyucu bir etkiye sahiptir.

Geliştirilen protokolde, bazolateral bölme için hücre oranını (1:1:1) ve kültür ortamı karışımını optimize ettik. Üçlü BBB modeli, 6 günlük birlikte kültürlemeden sonra kontrol HBMEC monokültüründen (112 ± 11 Ω · cm2) neredeyse 2,5 kat daha yüksek TEER değerleri (239 ± 9 Ω · cm2) gösterdi, uygun HBMEC tek katmanlı oluşumu için gerekli süre17,18. Bu üçlü modelde elde edilen TEER değerleri, HA'nın HBMEC ile temas halinde olduğu ve HBVP'nin plaka kuyularının19'unun dibine tohumlandığı daha önce tarif edilen diğer üçlü modeldekilerle karşılaştırılabilir. Aynı hücre konfigürasyonuna ve OGD maruziyet süresine sahip diğer insan primer hücre üçlü kültür modelinde, temel TEER değerleri bu çalışmadakilerden önemli ölçüde daha düşüktü ve standart seviyelere ulaşmadı (100 Ω · cm2)20. Daha büyük bölmelere sahip 6 kuyucuklu kuyucuklu plakaların kullanılması, hücre popülasyonları arasındaki madde değişiminin bozulmasını önlemek için orta değişim sıklığını azaltmamıza izin verdi.

OGD deneyleri, anaerobik gaz karışımı (% 95 azot ve% 5 karbondioksit) içeren kapalı bir hipoksi inkübatör odası kullanılarak gerçekleştirildi. Bu protokolün temel avantajlarından biri, iskemik yaralanmanın şiddetinin, OGD periyodunun uzunluğunu değiştirerek özel ihtiyaçlara kolayca ayarlanabilmesidir. TEER ve dekstran geçirgenliği değerlendirildikten sonra, 4 saatlik OGD, inşa edilen üçlü modelde BBB bütünlüğünden ödün vermemiştir. Bu nedenle, in vitro iskemik inmeyi incelemek için, BBB parçalanmasını indüklemek için OGT'ye daha uzun süre maruz kalmanın uygulanması gerekir. Protokolde sağlanan canlı hücre görüntüleme, farklı hücre tiplerinin gerçek zamanlı olarak izlenmesine ve birçok çalışmada avantaj sağlayan OGD hasarının doğrulanmasına olanak tanır.

Bu protokolde, bu üçlü BBB modeli için temel olarak 0,4 μm polyester kuyu uçları seçilmiştir. Bir polyester membran, floresan görüntüleme uygulamalarında hücre görselleştirme için en iyi kesici uç tipi olarak kabul edilir, bu da gerektiğinde sıkı bağlantı proteinlerinin ve taşıyıcıların modifikasyonlarını görselleştirmek için mükemmel bir fırsat sağlar. Seçilen küçük gözenek çapı, endotel monokatmanları boyunca küçük hidrofilik moleküllere düşük bir geçirgenlik yaratırken, aynı zamanda 3 μm veya 8 μm gözenek boyutlarının gerekli olduğu transendotelyal migrasyon testleri için mevcut üçlü BBB modelinin potansiyel uygulamasını da sınırlar.

Son olarak, bu modelin bir başka sınırlaması, dinamik üçlü BBB in vitro sistemlerde21'de sıkı kavşakların oluşumunu teşvik ettiği gösterilen kesme gerilmesi eksikliği ile ilgili olabilir. Sonuç olarak, birincil insan hücrelerinden oluşan sağlam ve fizyolojik olarak ilgili üçlü kültür BBB modeli, ilaç taraması ve iskemik inme ile ilişkili BBB disfonksiyonunun incelenmesi için değerli bir araçtır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Tüm yazarlar çıkar çatışması olmadığını açıkladı.

Acknowledgments

Bu çalışma, MH128022, MH122235, MH072567, MH122235, HL126559, DA044579, DA039576, DA040537, DA050528 ve DA047157 Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) hibeleri tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24 mm Transwell with 0.4 µm Pore Polyester Membrane Insert Corning 3450
35 mm Glass Bottom Dishes MatTek Life Sciences (FISHERSCI) P35GC-1.5-14-C
Astrocyte Medium Science Cell 1801
Attachment Factor Cell Systems (Fisher Scientific) 4Z0-201
BD 60 mL Syringe BD 309653
BrainPhys Imaging Optimized Medium STEMCELL Technologies 5791
Complete Classic Medium With Serum and CultureBoost 4Z0-500 Cell Systems
Corning 50 mL PP Centrifuge Tubes (Conical Bottom with CentriStar Cap VWR 430829
Corning 75cm² U-Shaped Canted Neck Not Treated Cell Culture Flask  Corning 431464U
Corning CellBIND 96-well Flat Clear Bottom Black Polystyrene Microplates Corning 3340
Countes Cell Counting Chamber Slides Thermo Fisher Scientific C10228
Countess II FL Automated Cell Counter Thermo Fisher Scientific ZGEXSCCOUNTESS2FL
Decon CiDehol 70 Isopropyl Alcohol Solution  Fisher Scientific  04-355-71
Disposable Petri Dishes VWR 25384-088
DMEM Medium (No glucose, No glutamine, No phenol red) ThermoFisher A14430-01 Glucose-free medium
DPBS (No Calcium, No Magnesium) ThermoFisher 14190250
EBM Endothelial Cell Growth Basal Medium, Phenol Red Free, 500 mL Lonza CC-3129
EVOM2 Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter with STX2 electrodes World Precison Instruments NC9792051 Epithelial voltohmmeter 
Fluorescein isothiocyanate–dextran (wt 20,000) Millipore Sigma FD20-250MG
Fluorescein isothiocyanate–dextran (wt 70,000) Millipore Sigma FD70S-250MG
Fluorview FV3000 Confocal Microscope Olympus FV3000
Gas Tank (95% N2, 5% CO2) Airgas X02NI95C2003071
HBSS (No calcium, No magnesium, no phenol red) Thermofisher 14025092
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate - 10 mg/mL Solution in Water ThermoFisher H3570
Human Astrocytes Science Cell 1800
Human Brain Vascular Pericytes Science Cell 1200
Hypoxia Incubator Chamber STEMCELL Technologies 27310
Image-iT Green Hypoxia Reagent ThermoFisher I14834
Pericyte Medium Science Cell 1201
Primary Human Brain Microvascular Endothelial Cells ACBRI 376 Cell Systems
Rocking Platform Shaker, Double VWR 10860-658
Single Flow Meter STEMCELL Technologies 27311
SpectraMax iD3 Microplate Reader Molecular Devices 75886-128
Syringe Filter, 25 mm, 0.22 μm, PVDF, Sterile NEST Scientific 380121
TPP Mutli-well Plates (6 wells) MidSci TP92406
TPP Tissue Culture Flasks T-75 Flasks MidSci TP90075 Flasks with activated surface for cell adhesion
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red ThermoFisher 25200056
UltraPure Distilled Water Invitrogen (Life Technologies) 10977-015
Uno Stage Top Incubator- Oko Lab UNO-T-H-CO2-TTL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mozaffarian, D., et al. Heart disease and stroke statistics-2016 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 133 (94), 38 (2016).
  2. Yousufuddin, M., Young, N. Aging and ischemic stroke. Aging. 11 (9), 2542-2544 (2019).
  3. Donkor, E. S. Stroke in the 21st century: a snapshot of the burden, epidemiology, and quality of life. Stroke Research and Treatment. , 3238165 (2018).
  4. Kadry, H., Noorani, B., Cucullo, L. A blood-brain barrier overview on structure, function, impairment, and biomarkers of integrity. Fluids and Barriers of the CNS. 17 (1), 69 (2020).
  5. Brown, L. S., et al. Pericytes and neurovascular function in the healthy and diseased brain. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 282 (2019).
  6. Cabezas, R., et al. Astrocytic modulation of blood brain barrier: perspectives on Parkinson's disease. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 211 (2014).
  7. Abdullahi, W., Tripathi, D., Ronaldson, P. T. Blood-brain barrier dysfunction in ischemic stroke: targeting tight junctions and transporters for vascular protection. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 315 (3), 343-356 (2018).
  8. Candelario-Jalil, E., Dijkhuizen, R. M., Magnus, T. Neuroinflammation, stroke, blood-brain barrier dysfunction, and imaging modalities. Stroke. 53 (5), 1473-1486 (2022).
  9. He, Y., Yao, Y., Tsirka, S. E., Cao, Y. Cell-culture models of the blood-brain barrier. Stroke. 45 (8), 2514-2526 (2014).
  10. Thomsen, L. B., Burkhart, A., Moos, T. A triple culture model of the blood-brain barrier using porcine brain endothelial cells, astrocytes and pericytes. PLoS One. 10 (8), 0134765 (2015).
  11. Song, Y., Cai, X., Du, D., Dutta, P., Lin, Y. Comparison of blood-brain barrier models for in vitro biological analysis: one cell type vs three cell types. ACS Applied Bio Materials. 2 (3), 1050-1055 (2019).
  12. Xu, L., et al. Silver nanoparticles induce tight junction disruption and astrocyte neurotoxicity in a rat blood-brain barrier primary triple coculture model. International Journal of Nanomedicine. 10, 6105-6118 (2015).
  13. Appelt-Menzel, A. Establishment of a human blood-brain barrier co-culture model mimicking the neurovascular unit using induced pluri- and multipotent stem cells. Stem Cell Reports. 8 (4), 894-906 (2017).
  14. Zhang, Y., et al. Rational construction of a reversible arylazo-based NIR probe for cycling hypoxia imaging in vivo. Nature Communications. 12 (1), 2772 (2021).
  15. Palacio-Castañeda, V., Kooijman, L., Venzac, B., Verdurmen, W. P. R., Le Gac, S. Metabolic switching of tumor cells under hypoxic conditions in a tumor-on-a-chip model. Micromachines. 11 (4), 382 (2020).
  16. Ramsauer, M., Krause, D., Dermietzel, R. Angiogenesis of the blood-brain barrier in vitro and the function of cerebral pericytes. FASEB Journal. 16 (10), 1274-1276 (2002).
  17. Lyck, R., et al. ALCAM (CD166) is involved in extravasation of monocytes rather than T cells across the blood-brain barrier. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 37 (8), 2894-2909 (2017).
  18. Rizzi, E., et al. A triple culture cell system modeling the human blood-brain barrier. Journal of Visualized Experiments. (177), (2021).
  19. Kumar, S., Shaw, L., Lawrence, C., Lea, R., Alder, J. P50: Developing a physiologically relevant blood brain barrier model for the study of drug disposition in glioma. Neuro-Oncology. 16 (6), (2014).
  20. Stone, N. L., England, T. J., O'Sullivan, S. E. A novel transwell blood brain barrier model using primary human cells. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 230 (2019).
  21. Al Ahmad, A., Taboada, C. B., Gassmann, M., Ogunshola, O. O. Astrocytes and pericytes differentially modulate blood-brain barrier characteristics during development and hypoxic insult. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 31 (2), 693-705 (2011).

Tags

Biyokimya Sayı 188
İskemik İnme <em>In Vitro</em> Çalışması için İnsan Kan-Beyin Bariyerinin Üçlü Birincil Hücre Kültürü Modeli
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fattakhov, N., Torices, S., Becker,… More

Fattakhov, N., Torices, S., Becker, S., Teglas, T., Naranjo, O., Toborek, M. A Triple Primary Cell Culture Model of the Human Blood-Brain Barrier for Studying Ischemic Stroke In Vitro. J. Vis. Exp. (188), e64469, doi:10.3791/64469 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter