Burada, birincil insan beyni mikrovasküler endotel hücrelerine, astrositlere ve perisitlere dayanan kan-beyin bariyerinin üçlü hücre kültürü modelini oluşturma yöntemini açıklıyoruz. Bu çok hücreli model, in vitro iskemik inme sırasında nörovasküler birim disfonksiyonunun incelenmesi veya ilaç adaylarının taranması için uygundur.
İskemik inme, sınırlı tedavi seçenekleri ile dünya çapında önemli bir ölüm ve sakatlık nedenidir. İskemik inmenin nöropatolojisi, hücre ölümüne ve bilişsel işlev bozukluğuna yol açan beyne giden kan akışında bir kesinti ile karakterizedir. İskemik inme sırasında ve sonrasında, kan-beyin bariyeri (BBB) disfonksiyonu yaralanma ilerlemesini kolaylaştırır ve zayıf hasta iyileşmesine katkıda bulunur. Mevcut BBB modelleri öncelikle endotel monokültürlerini ve astrositler veya perisitlerle çift ortak kültürleri içerir.
Bu tür modeller, hücreden hücreye iletişim için gerekli olan dinamik bir beyin mikro çevresini tamamen taklit etme yeteneğinden yoksundur. Ek olarak, yaygın olarak kullanılan BBB modelleri genellikle ölümsüzleştirilmiş insan endotel hücrelerini veya translasyonel sınırlamalar oluşturan hayvan kaynaklı (kemirgen, domuz veya sığır) hücre kültürlerini içerir. Bu yazıda, iskemik beyin hasarının in vitro olarak araştırılmasını sağlayan, sadece primer insan hücrelerini (beyin mikrovasküler endotel hücreleri, astrositler ve beyin vasküler perisitleri) içeren yeni bir iyi yerleştirme tabanlı BBB modeli açıklanmaktadır.
Oksijen-glukoz yoksunluğunun (OGD) bariyer bütünlüğü üzerine etkileri pasif geçirgenlik, transendotelyal elektriksel direnç (TEER) ölçümleri ve hipoksik hücrelerin doğrudan görüntülenmesi ile değerlendirildi. Sunulan protokol, BBB’nin hücreler arası ortamını in vivo olarak taklit eden belirgin bir avantaj sunarak, iskemik beyin hasarı ortamında yeni terapötik stratejiler geliştirmek için daha gerçekçi bir in vitro BBB modeli olarak hizmet vermektedir.
İnme, dünya çapında önde gelen ölüm ve uzun süreli sakatlık nedenlerinden biridir1. İnme insidansı yaşla birlikte hızla artar ve 55 yaşından sonra her 10 yılda bir iki katına çıkar2. İskemik inme, tüm inme vakalarının %80’inden fazlasını kapsayan trombotik ve embolik olaylara bağlı serebral kan akımının bozulması sonucu ortaya çıkar3. Şimdi bile, iskemik inme sonrası doku ölümünü en aza indirmek için nispeten az sayıda tedavi seçeneği mevcuttur. Mevcut tedaviler zamana duyarlıdır ve sonuç olarak her zaman iyi klinik sonuçlara yol açmaz. Bu nedenle, inme sonrası iyileşmeyi etkileyen iskemik inmenin karmaşık hücresel mekanizmaları üzerine araştırmalara acilen ihtiyaç vardır.
BBB, kan ve beyin parankimi arasındaki moleküllerin değişimi için dinamik bir arayüzdür. Yapısal olarak, BBB, bir bazal membran, perisitler ve astrositik uç ayaklar4 ile çevrili bileşke kompleksleri ile birbirine bağlanmış beyin mikrovasküler endotel hücrelerinden oluşur. Perisitler ve astrositler, güçlü, sıkı kavşakların oluşumu için gerekli çeşitli faktörlerin salgılanması yoluyla BBB bütünlüğünün korunmasında önemli bir rol oynamaktadır 5,6. BBB’nin parçalanması, iskemik inmenin ayırt edici özelliklerinden biridir. Serebral iskemi ile ilişkili akut inflamatuar yanıt ve oksidatif stres, sıkı bağlantı protein komplekslerinin bozulmasına ve astrositler, perisitler ve endotel hücreleri arasındaki düzensiz çapraz konuşmaya neden olur ve bu da BBB7 boyunca parasellüler çözünür geçirgenliğin artmasına neden olur. BBB disfonksiyonu ayrıca beyin ödemi oluşumunu teşvik eder ve hemorajik transformasyon riskini arttırır8. Yukarıdakilerin tümü göz önüne alındığında, iskemik inme sırasında ve sonrasında BBB düzeyinde meydana gelen moleküler ve hücresel değişikliklerin anlaşılmasına büyük ilgi vardır.
Her ne kadar birçok in vitro BBB modeli son yıllarda geliştirilmiş ve çeşitli çalışmalarda kullanılmış olsa da, hiçbiri in vivo koşullarda tam olarak çoğalamamaktadır9. Bazı modeller, tek başına veya perisitler veya astrositlerle kombinasyon halinde iyi yerleştirilmiş geçirgen destekler üzerinde kültürlenmiş endotel hücre monokatmanlarına dayanırken, sadece daha yeni çalışmalar üçlü hücre kültürü model tasarımlarını ortaya koymuştur. Hemen hemen tüm mevcut üçlü kültür BBB modelleri, hayvan türlerinden izole edilen astrositler ve perisitler veya insan pluripotent kök hücrelerinden türetilen hücreler10,11,12,13 ile birlikte birincil beyin endotel hücrelerini içerir.
İnsan BBB’sini in vitro olarak daha iyi özetleme ihtiyacını kabul ederek, insan beyni mikrovasküler endotel hücreleri (HBMEC), birincil insan astrositleri (HA) ve birincil insan beyni vasküler perisitlerinden (HBVP) oluşan üçlü bir hücre kültürü in vitro BBB modeli kurduk. Bu üçlü kültür BBB modeli, 0,4 μm gözenek boyutuna sahip 6 delikli plakalı, polyester membran uçlar üzerine kurulmuştur. Bu iyi insertler, hücre bağlantısı için en uygun ortamı sağlar ve orta örnekleme veya bileşik uygulaması için hem apikal (kan) hem de bazolateral (beyin) bölmelere kolay erişim sağlar. Bu önerilen üçlü hücre kültürü BBB modelinin özellikleri, in vitro iskemik inmeyi taklit eden OGD sonrası TEER ve parasellüler akı, nemlendirilmiş, kapalı bir oda kullanılarak elde edilen oksijen (% <1O2) ve besin (glikozsuz ortam kullanılarak) eksikliği ile ölçülerek değerlendirilmektedir. Ek olarak, bu modeldeki indüklenmiş iskemik benzeri koşullar, hipoksik hücrelerin doğrudan görselleştirilmesiyle doğru bir şekilde doğrulanır.
Bu protokolde, in vitro iskemik inme ortamında BBB disfonksiyonunu incelemek için güvenilir bir üçlü endotel hücre-perisit-astrosit kültürü BBB modeli oluşturmak için bir yöntem tanımladık. Perisitlerin in vivo endotel hücrelerinin en yakın komşuları olduğu göz önüne alındığında, HBVP bu model16’daki kuyu eklerinin alt tarafına kaplanmıştır. Bu konfigürasyon, astrositler ve endotel hücreleri arasındaki doğrudan hücreden hücreye iletişimden yo…
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma, MH128022, MH122235, MH072567, MH122235, HL126559, DA044579, DA039576, DA040537, DA050528 ve DA047157 Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) hibeleri tarafından desteklenmiştir.
24 mm Transwell with 0.4 µm Pore Polyester Membrane Insert | Corning | 3450 | |
35 mm Glass Bottom Dishes | MatTek Life Sciences (FISHERSCI) | P35GC-1.5-14-C | |
Astrocyte Medium | Science Cell | 1801 | |
Attachment Factor | Cell Systems (Fisher Scientific) | 4Z0-201 | |
BD 60 mL Syringe | BD | 309653 | |
BrainPhys Imaging Optimized Medium | STEMCELL Technologies | 5791 | |
Complete Classic Medium With Serum and CultureBoost | 4Z0-500 | Cell Systems | |
Corning 50 mL PP Centrifuge Tubes (Conical Bottom with CentriStar Cap | VWR | 430829 | |
Corning 75cm² U-Shaped Canted Neck Not Treated Cell Culture Flask | Corning | 431464U | |
Corning CellBIND 96-well Flat Clear Bottom Black Polystyrene Microplates | Corning | 3340 | |
Countes Cell Counting Chamber Slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
Countess II FL Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | ZGEXSCCOUNTESS2FL | |
Decon CiDehol 70 Isopropyl Alcohol Solution | Fisher Scientific | 04-355-71 | |
Disposable Petri Dishes | VWR | 25384-088 | |
DMEM Medium (No glucose, No glutamine, No phenol red) | ThermoFisher | A14430-01 | Glucose-free medium |
DPBS (No Calcium, No Magnesium) | ThermoFisher | 14190250 | |
EBM Endothelial Cell Growth Basal Medium, Phenol Red Free, 500 mL | Lonza | CC-3129 | |
EVOM2 Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter with STX2 electrodes | World Precison Instruments | NC9792051 | Epithelial voltohmmeter |
Fluorescein isothiocyanate–dextran (wt 20,000) | Millipore Sigma | FD20-250MG | |
Fluorescein isothiocyanate–dextran (wt 70,000) | Millipore Sigma | FD70S-250MG | |
Fluorview FV3000 Confocal Microscope | Olympus | FV3000 | |
Gas Tank (95% N2, 5% CO2) | Airgas | X02NI95C2003071 | |
HBSS (No calcium, No magnesium, no phenol red) | Thermofisher | 14025092 | |
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate – 10 mg/mL Solution in Water | ThermoFisher | H3570 | |
Human Astrocytes | Science Cell | 1800 | |
Human Brain Vascular Pericytes | Science Cell | 1200 | |
Hypoxia Incubator Chamber | STEMCELL Technologies | 27310 | |
Image-iT Green Hypoxia Reagent | ThermoFisher | I14834 | |
Pericyte Medium | Science Cell | 1201 | |
Primary Human Brain Microvascular Endothelial Cells | ACBRI 376 | Cell Systems | |
Rocking Platform Shaker, Double | VWR | 10860-658 | |
Single Flow Meter | STEMCELL Technologies | 27311 | |
SpectraMax iD3 Microplate Reader | Molecular Devices | 75886-128 | |
Syringe Filter, 25 mm, 0.22 μm, PVDF, Sterile | NEST Scientific | 380121 | |
TPP Mutli-well Plates (6 wells) | MidSci | TP92406 | |
TPP Tissue Culture Flasks T-75 Flasks | MidSci | TP90075 | Flasks with activated surface for cell adhesion |
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | ThermoFisher | 25200056 | |
UltraPure Distilled Water | Invitrogen (Life Technologies) | 10977-015 | |
Uno Stage Top Incubator- | Oko Lab | UNO-T-H-CO2-TTL |