Summary
Ici, nous décrivons la méthode pour établir un modèle de culture triple cellulaire de la barrière hémato-encéphalique basé sur les cellules endothéliales microvasculaires primaires du cerveau humain, les astrocytes et les péricytes. Ce modèle multicellulaire est adapté aux études de dysfonctionnement de l’unité neurovasculaire lors d’un AVC ischémique in vitro ou au criblage de candidats médicaments.
Abstract
L’AVC ischémique est une cause majeure de décès et d’invalidité dans le monde entier avec des options thérapeutiques limitées. La neuropathologie de l’AVC ischémique se caractérise par une interruption de l’apport sanguin au cerveau entraînant la mort cellulaire et un dysfonctionnement cognitif. Pendant et après un AVC ischémique, le dysfonctionnement de la barrière hémato-encéphalique (BHE) facilite la progression des blessures et contribue à une mauvaise récupération du patient. Les modèles actuels de BHE comprennent principalement des monocultures endothéliales et des co-cultures doubles avec des astrocytes ou des péricytes.
De tels modèles n’ont pas la capacité d’imiter pleinement un microenvironnement cérébral dynamique, ce qui est essentiel pour la communication de cellule à cellule. De plus, les modèles de BHE couramment utilisés contiennent souvent des cellules endothéliales humaines immortalisées ou des cultures cellulaires d’origine animale (rongeurs, porcins ou bovins) qui posent des limites translationnelles. Cet article décrit un nouveau modèle de BHE bien inséré contenant uniquement des cellules humaines primaires (cellules endothéliales microvasculaires cérébrales, astrocytes et péricytes vasculaires cérébraux) permettant d’étudier les lésions cérébrales ischémiques in vitro.
Les effets de la privation d’oxygène-glucose (OGD) sur l’intégrité de la barrière ont été évalués par perméabilité passive, mesures de résistance électrique transendothéliale (TEER) et visualisation directe des cellules hypoxiques. Le protocole présenté offre un avantage distinct en imitant l’environnement intercellulaire de la BHE in vivo, servant de modèle de BHE in vitro plus réaliste pour développer de nouvelles stratégies thérapeutiques dans le cadre d’une lésion cérébrale ischémique.
Introduction
L’AVC est l’une des principales causes de décès et d’invalidité de longue durée dans le monde1. L’incidence des accidents vasculaires cérébraux augmente rapidement avec l’âge, doublant tous les 10 ans après l’âge de 55 ans2. L’AVC ischémique survient à la suite d’une perturbation du flux sanguin cérébral due à des événements thrombotiques et emboliques, qui englobe plus de 80% de tous les cas d’AVC3. Même maintenant, il existe relativement peu d’options de traitement disponibles pour minimiser la mort tissulaire après un AVC ischémique. Les traitements existants sont sensibles au facteur temps et, par conséquent, ne conduisent pas toujours à de bons résultats cliniques. Par conséquent, il est urgent de mener des recherches sur les mécanismes cellulaires complexes de l’AVC ischémique qui affectent la récupération après un AVC.
La BHE est une interface dynamique pour l’échange de molécules entre le sang et le parenchyme cérébral. Structurellement, la BHE est composée de cellules endothéliales microvasculaires cérébrales interconnectées par des complexes jonctionnels entourés d’une membrane basale, de péricytes et d’extrémités astrocytaires4. Les péricytes et les astrocytes jouent un rôle essentiel dans le maintien de l’intégrité de la BHE par la sécrétion de divers facteurs nécessaires à la formation de jonctions fortes et serrées 5,6. La dégradation de la BHE est l’une des caractéristiques de l’AVC ischémique. La réponse inflammatoire aiguë et le stress oxydatif associés à l’ischémie cérébrale entraînent la perturbation des complexes protéiques de jonction serrée et une diaphonie dérégulée entre les astrocytes, les péricytes et les cellules endothéliales, ce qui entraîne une augmentation de la perméabilité du soluté paracellulaire à travers la BHE7. Le dysfonctionnement de la BHE favorise davantage la formation d’œdème cérébral et augmente le risque de transformation hémorragique8. Compte tenu de tout ce qui précède, il y a un grand intérêt à comprendre les changements moléculaires et cellulaires qui se produisent au niveau de la BHE pendant et après un AVC ischémique.
Bien que de nombreux modèles de BHE in vitro aient été développés au cours des dernières décennies et utilisés dans diverses études, aucun d’entre eux ne peut reproduire pleinement les conditions in vivo 9. Alors que certains modèles sont basés sur des monocouches de cellules endothéliales cultivées sur des supports perméables bien insérés seuls ou en combinaison avec des péricytes ou des astrocytes, seules des études plus récentes ont introduit des modèles de culture triple cellulaire. Presque tous les modèles de BHE à triple culture existants incorporent des cellules endothéliales cérébrales primaires ainsi que des astrocytes et des péricytes isolés d’espèces animales ou des cellules dérivées de cellules souches pluripotentes humaines10,11,12,13.
Reconnaissant la nécessité de mieux récapituler la BHE humaine in vitro, nous avons établi un modèle de culture de cellules triples in vitro composé de cellules endothéliales microvasculaires du cerveau humain (HBMEC), d’astrocytes humains primaires (HA) et de péricytes vasculaires cérébraux humains primaires (HBVP). Ce modèle BBB à triple culture est installé sur des plaquettes à 6 puits, des inserts de membrane en polyester avec une taille de pores de 0,4 μm. Ces inserts de puits fournissent un environnement optimal pour la fixation des cellules et permettent un accès facile aux compartiments apical (sang) et basolatéral (cerveau) pour un échantillonnage moyen ou une application composée. Les caractéristiques de ce modèle de triple culture de cellules BBB proposé sont évaluées en mesurant le TEER et le flux paracellulaire post-OGD imitant l’AVC ischémique in vitro, avec une pénurie d’oxygène (<1% O2) et de nutriments (en utilisant un milieu sans glucose) obtenue en utilisant une chambre humidifiée et scellée. De plus, les conditions induites de type ischémique dans ce modèle sont vérifiées avec précision par visualisation directe des cellules hypoxiques.
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Protocol
REMARQUE : Consultez le tableau des matériaux pour plus de détails sur toutes les cellules, matériaux, équipements et solutions utilisés dans ce protocole.
1. Réglage du modèle BBB à triple culture cellulaire
- Ensemencement des péricytes
- Cultiver le HBVP dans des flacons de culture T75 avec une surface activée pour l’adhésion cellulaire dans un incubateur à 5% de CO2 à 37 °C jusqu’à confluent. Une fois la confluence atteinte, aspirer l’ancien milieu péricytaire et laver les cellules avec 5 mL de solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS) chaude. Aspirer le DPBS et détacher les cellules du ballon en combinant 4 mL de solution tiède trypsine-EDTA et 1 mL de DPBS.
REMARQUE: Évitez d’utiliser des passages postérieurs à P7. - Incuber la fiole pendant 5 min à 37 °C dans un incubateur à CO2 . Observez au microscope si les cellules sont détachées du ballon. Ajouter 5 mL de milieu péricytaire chaud (contenant 2 % de sérum fœtal bovin [FBS]) dans le ballon et transférer les cellules détachées dans un tube à centrifuger de 50 mL.
- Centrifuger la suspension cellulaire pendant 3 min à 200 × g, permettant aux cellules de former une pastille dans le fond du tube. Aspirez le milieu du tube, en vous assurant que la pastille de la cellule reste intacte.
- Resuspendre la pastille cellulaire dans un milieu péricytaire; Calculer la quantité de milieu en fonction de la confluence des cellules et du nombre d’inserts de puits nécessaires. Prenez 10 μL des cellules en repos, placez-les dans une lame de comptage de cellules et comptez le nombre de cellules.
- Déterminer la densité cellulaire et ensemencer 300 000 cellules/insert dans 1 mL de milieu péricytaire sur le côté abluminal des inserts de puits (format 6 puits).
REMARQUE: Lors de l’ensemencement de HBVP sur la face inférieure des inserts, il est très important de retourner d’abord les plaques bien insérées. Pendant que la plaque est posée à plat sur une surface, retirez la partie inférieure pour exposer le côté abluminal des inserts de puits. Après avoir ajouté la suspension de cellules péricytaires sur le côté aluminal, couvrir les inserts de puits avec la plaque retournée pour empêcher l’évaporation. Gardez toutes les plaques retournées dans un incubateur à 5 % de CO2 à 37 °C pendant la nuit.
- Cultiver le HBVP dans des flacons de culture T75 avec une surface activée pour l’adhésion cellulaire dans un incubateur à 5% de CO2 à 37 °C jusqu’à confluent. Une fois la confluence atteinte, aspirer l’ancien milieu péricytaire et laver les cellules avec 5 mL de solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS) chaude. Aspirer le DPBS et détacher les cellules du ballon en combinant 4 mL de solution tiède trypsine-EDTA et 1 mL de DPBS.
- Ensemencement des astrocytes
- Cultiver l’HA dans des flacons T75 dans un incubateur à 5 % de CO2 à 37 °C jusqu’à ce que la confluence soit atteinte. Suivez les étapes ci-dessus 1.1.1-1.1.4 en utilisant un milieu astrocytaire (contenant également 2% de FBS) au lieu du milieu péricytaire.
REMARQUE : Évitez d’utiliser des passages postérieurs à P9. - Déterminer la densité cellulaire et ensemencer 300 000 cellules/puits au fond des plaques de culture tissulaire à 6 puits. Couvrir la plaque pour éviter l’évaporation et conserver toutes les plaques dans un incubateur à 5% de CO2 à 37 °C pendant la nuit.
- Cultiver l’HA dans des flacons T75 dans un incubateur à 5 % de CO2 à 37 °C jusqu’à ce que la confluence soit atteinte. Suivez les étapes ci-dessus 1.1.1-1.1.4 en utilisant un milieu astrocytaire (contenant également 2% de FBS) au lieu du milieu péricytaire.
- Ensemencement des cellules endothéliales
- Cultiver l’HBMEC dans des boîtes de culture tissulaire dans un incubateur à 5 % de CO2 à 37 °C jusqu’à confluence. Suivez les étapes ci-dessus 1.1.1-1.1.4 en utilisant un milieu classique complet (contenant 10% FBS) au lieu d’un milieu péricytaire.
REMARQUE : Évitez d’utiliser des passages postérieurs à P12. - Retirer les plaques de culture tissulaire à 6 puits contenant les astrocytes et les inserts de puits (format 6 puits) contenant les péricytes de l’incubateur à 5% de CO2 à 37 °C. Aspirer le milieu astrocytaire des plaques de culture tissulaire à 6 puits. Ajouter 1 mL de milieu péricytaire et 1 mL de milieu astrocytaire à chaque puits.
- Aspirer le milieu péricytaire des inserts de puits et les placer dans les plaques de culture tissulaire à 6 puits contenant les astrocytes ensemencés. Ensemencer HBMEC à une densité de 300 000 cellules/puits dans 2 mL de milieu classique complet sur la face apicale des mêmes inserts de puits.
NOTE: Les cellules endothéliales doivent être ensemencées du côté apical des inserts de puits le lendemain après l’ensemencement des péricytes du côté abluminal des inserts de puits et des astrocytes sur des plaques de culture tissulaire à 6 puits. Les cellules doivent être maintenues en triple culture pendant 6 jours pour induire des propriétés semblables à celles de la BHE. Le milieu de culture cellulaire doit être changé dans les deux compartiments bien insérés 24 heures avant les expériences.
- Cultiver l’HBMEC dans des boîtes de culture tissulaire dans un incubateur à 5 % de CO2 à 37 °C jusqu’à confluence. Suivez les étapes ci-dessus 1.1.1-1.1.4 en utilisant un milieu classique complet (contenant 10% FBS) au lieu d’un milieu péricytaire.
2. Induction de la privation oxygène-glucose
- Lavez les cellules 3x avec DPBS. Pour les cultures de cellules triples soumises à l’OGD, ajouter un milieu sans glucose (sans L-glutamine et rouge de phénol) aux compartiments apical et basolatéral. Remplacer le milieu de culture par un milieu frais dans des cultures cellulaires témoins normoxiques. Placer les cultures triples témoins dans l’incubateur à 5 % de CO2 à 37 °C.
REMARQUE : Les changements du milieu avant l’induction de l’OGD ou immédiatement après l’OGD peuvent créer un stress mécanique qui aurait un impact supplémentaire sur les monocouches de cellules endothéliales. Ainsi, les étapes avec remplacement du milieu sont incluses pour les cultures cellulaires témoins normoxiques. - Placez une boîte de Petri contenant 20 ml d’eau stérile dans la chambre de l’incubateur d’hypoxie pour assurer une humidification adéquate des cultures. Ouvrez la chambre en relâchant la pince annulaire. Disposez les cultures cellulaires sur les étagères. Scellez la chambre en fixant la pince annulaire.
- Ouvrez les orifices d’entrée et de sortie de la chambre. Fixez le tube provenant du haut du débitmètre à la chambre. Fixer le tube provenant du bas du débitmètre au réservoir de gaz contenant le mélange gazeux de 95% N 2/5% CO2 via un filtreà air.
- Ouvrez la vanne de régulation du débit du réservoir en la tournant dans le sens inverse des aiguilles d’une montre pour permettre un débit de gaz minimal. Ouvrez lentement la vanne du régulateur de pression en tournant dans le sens des aiguilles d’une montre.
- Rincer la chambre avec le mélange gazeux à un débit de 20 L/min pendant 5 min. Déconnectez la chambre de la source de gaz et fermez fermement les deux pinces en plastique blanc.
- Fermez la vanne de régulation du débit du réservoir en tournant dans le sens des aiguilles d’une montre. Fermez la vanne du régulateur de pression en tournant dans le sens inverse des aiguilles d’une montre.
- Placer la chambre d’hypoxie dans un incubateur conventionnel à 37 °C pendant 4 h.
NOTE: Pour ajouter la période de réoxygénation ultérieure, laver les cellules 3x avec DPBS, ajouter un milieu frais dans toutes les cultures triples et conserver pendant 24 heures supplémentaires dans l’incubateur à 5% de CO2 à 37 ° C. Selon les instructions du fabricant, la concentration d’oxygène restant dans la chambre est de 0% après pas moins de 4 minutes de purge avec un mélange gazeux anaérobie à 20 L / min.
3. Mesures TEER
- Placez l’instrument TEER stérilisé dans l’enceinte de biosécurité et branchez les électrodes dans le voltohmmètre épithélial. Stériliser les électrodes dans 30 mL de solution d’alcool isopropylique à 70 % pendant au moins 30 min.
- Allumez l’instrument TEER et réglez la fonction sur ohms.
- Retirez les électrodes de la solution d’alcool isopropylique à 70 % et placez-les dans 20 mL de DPBS pendant au moins 30 minutes jusqu’à ce que la lecture numérique sur l’appareil TEER indique 0 ohms.
- Insérez la longue broche de l’électrode à travers l’une des trois ouvertures du cintre de puits de la commande d’insertion de puits vierge, en l’abaissant jusqu’à ce qu’elle touche le fond du puits. Assurez-vous que la broche courte repose au-dessus de la culture apicale au fond de l’insert de puits.
REMARQUE : Le témoin de puits blanc est composé de 2 mL de milieu classique complet dans le compartiment apical et d’une combinaison de 1 mL de milieu péricytaire et de 1 mL de milieu astrocytaire dans le compartiment basolatéral. S’assurer que les électrodes sont maintenues à 90° par rapport à l’insert du puits pendant la prise de la mesure TEER. L’utilisation de la moyenne de deux ou trois lectures obtenues dans le même puits (par ouverture) peut aider à réduire la variabilité. - Attendez que les valeurs de lecture numérique sur l’instrument TEER se stabilisent avant d’enregistrer la valeur. Replacez les électrodes dans DPBS pour les laver entre les mesures. Continuer à collecter toutes les mesures TEER pour deux autres commandes d’insertion de puits vierges.
- Recueillir les mesures TEER des plaques d’échantillonnage en utilisant les étapes 3.4 à 3.5 prises pour les mesures de contrôle. Une fois toutes les mesures prises, replacez l’électrode dans la solution d’alcool isopropylique à 70% pendant 30 min. Déconnectez les électrodes de l’instrument TEER et laissez-les sécher à l’air.
- Calculez les valeurs TEER. Utilisez l’équation (1) pour soustraire la valeur moyenne en ohms du témoin d’insertion de puits blanc de la valeur en ohm de l’échantillon, puis multipliez cette valeur de résistance par la surface de l’insert membranaire (cm 2) pour obtenir la valeur TEER rapportée en Ω∙cm2.
(1)
(1)4. Évaluation de la perméabilité paracellulaire de la BHE
REMARQUE: Effectuez toutes les étapes impliquant FITC-dextran dans une enceinte de biosécurité de culture cellulaire avec les lumières éteintes. Couvrir les solutions FITC-dextran avec du papier d’aluminium pour minimiser le photoblanchiment.
- Préparer des solutions contenant des FITC-dextrans de 20 et 70 kDa (0,1 mg/mL) en utilisant un milieu de croissance des cellules endothéliales sans rouge de phénol et laisser agiter sur une plate-forme vibrante pendant 1 h. Filtrer les solutions à l’aide d’un filtre à seringue de 0,22 μm.
- Aspirer le milieu du compartiment basolatéral et le remplacer par 2 mL de milieu de croissance des cellules endothéliales sans rouge phénol dans le modèle de culture triple cellulaire BBB. Lavez deux fois les cellules du compartiment apical avec la solution saline équilibrée de Hanks (HBSS).
- Ajouter 1 mL de la solution FITC-dextran dans le compartiment apical et couvrir la plaque de papier d’aluminium. Placer la plaque dans un incubateur à 5% de CO2 à 37 °C pendant 1 h.
- Prélevez 100 μL de milieu dans les compartiments basolatéraux et transférez-les dans une plaque noire de 96 puits. Mesurer la fluorescence à l’aide d’un lecteur de microplaques avec les longueurs d’onde d’excitation et d’émission réglées sur 480 nm et 530 nm, respectivement.
5. Détection de l’hypoxie dans les cellules vivantes
- Ensemencez 200 μL d’HBMEC, d’HA et de HBVP au centre de plats à fond en verre de 35 mm enrobés de poly-d-lysine à une densité de 150 000 cellules/plat. Avant d’ensemencer HBMEC, enduire le fond de la vaisselle avec le facteur d’attachement. Laisser les cellules se fixer à la surface du verre en les laissant toute la nuit à 37 °C dans un incubateur de CO2.
REMARQUE: Il est important de placer des plats avec des cellules primaires humaines en même temps avec un modèle de BHE à triple puits inséré dans une chambre d’hypoxie pour OGD. - Une fois la confluence atteinte, jeter le milieu de culture et ajouter 2 mL de milieu sans glucose préchauffé (pour les autres ministères) ou de milieu normal (pour les témoins) contenant 2 μL de 1 mM de Hoechst 33342 (concentration finale de 0,2 μM) et 0,5 μL de solution mère de 5 mM du réactif d’hypoxie verte Image-iT référencé (concentration finale de 1 μM). Après le traitement OGD, remplacer le milieu par un milieu optimisé pour l’imagerie dans tous les plats.
- Effectuer l’imagerie de cellules vivantes en fluorescence avec le filtre GFP et l’incubateur de microscope confocale de stade supérieur comme décrit précédemment14,15.
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Representative Results
Pour examiner les effets des astrocytes et des péricytes sur la fonction barrière de HBMEC, nous avons construit le modèle de culture triple cellule BBB sur des inserts de culture cellulaire (Figure 1A) avec la monoculture HBMEC et deux modèles de double co-culture comme témoins (Figure 1B). Les contrôles de co-culture double comprenaient une co-culture sans contact de HBMEC avec HA et une co-culture de contact de HBMEC avec HBVP. Après 6 jours en co-culture, toutes les installations expérimentales ont été soumises à l’OGD pendant 4 h. L’intégrité de la barrière de la monocouche endothéliale dans les configurations de BHE indiquées a été évaluée en déterminant TEER avant et après OGD, ainsi qu’après 24 h de réoxygénation (Figure 1C). Pendant 4 heures, l’OGD a causé une diminution significative des valeurs TEER uniquement dans la monoculture HBMEC et le modèle de co-culture avec HBMEC et HBVP. Ces niveaux réduits ont atteint les niveaux de référence après 24 heures de réoxygénation. Aucun effet de l’OGD sur le modèle de co-culture avec HBMEC et HA n’a mis en évidence le rôle protecteur des astrocytes contre les conditions ischémiques in vitro.
Bien qu’il n’y ait pas eu de différence dans le TEER de base entre les modèles de co-culture triple et HBMEC/HBVP, les valeurs TEER dans le modèle de co-culture triple étaient significativement plus élevées que celles des témoins de double co-culture ou du contrôle de monoculture immédiatement après l’OGD, ce qui suggère que l’intégration de l’HA et du HBVP dans le modèle triple BBB joue un rôle essentiel dans le maintien de l’intégrité fonctionnelle de la BHE dans des conditions pathologiques (Figure 1C ). Nous avons également étudié la perméabilité des petits (20 kDa) et des grands (70 kDa) FITC-dextrans de masse moléculaire à travers la monocouche endothéliale dans le modèle de triple culture développé. La perméabilité paracellulaire des monocouches endothéliales à une masse moléculaire FITC-dextrane de 20 kDa a été considérablement augmentée en monoculture HBMEC et, dans une moindre mesure, dans le modèle de co-culture avec HBMEC et HBVP par rapport aux témoins normoxiques (Figure 1D). De plus, les niveaux de perméabilité FITC-dextran de 20 kDa étaient les plus faibles du modèle triple BBB parmi tous les modèles dans des conditions normoxiques et OGD. Aucun changement n’a été observé dans le flux FITC-dextran de 70 kDa à travers les monocouches endothéliales dans aucun des modèles (Figure 1E). Ces données suggèrent que les dommages ischémiques-hypoxiques n’étaient pas si graves pour provoquer des changements dans la perméabilité paracellulaire aux grosses molécules telles que les protéines plasmatiques.
Figure 1 : Effets de la privation d’oxygène-glucose sur la résistance électrique transendothéliale et la perméabilité endothéliale dans des modèles humains de mono-, co- et triple culture BBB. (A) Chronologie schématique pour la mise en place du modèle de culture cellulaire triple primaire BBB. (B) Représentations schématiques des configurations pour les modèles de BHE statiques in vitro à base de cellules primaires humaines. Un modèle de monoculture contient de l’HBMEC ensemencé sur la face apicale de la membrane poreuse bien insérée. Une coculture sans contact contient de l’HBMEC ensemencé sur la surface supérieure du support du puits et de l’HA ensemencé au fond du puits de culture. Un modèle de co-culture de contact comprend l’HBVP ensemencé sur la surface inférieure du support de l’insert avec HBMEC sur la surface supérieure. Pour le modèle de triple culture, les HBMEC sont ensemencés sur la surface supérieure du support, avec HBVP ensemencé sur la surface inférieure et HA ensemencé au fond des puits de culture. (C) Changements dans le TEER surveillés immédiatement avant les autres ministères, après 4 h d’autres ministères et après 24 heures de réoxygénation. Données représentées sous forme de MEB moyen ± (n = 5-6). P < 0,0001 par rapport aux modèles de monoculture et de co-culture (ANOVA bidirectionnelle). (D) La perméabilité paracellulaire à 20 kDa FITC-dextran à travers les monocouches endothéliales a été mesurée après 4 h d’OGD. (E) La perméabilité paracellulaire à 70 kDa FITC-dextran à travers les monocouches endothéliales a été mesurée après 4 h d’OGD. Données représentées sous forme de moyenne ± ET (n = 5-6). *P < 0,05. P < 0,0001 (ANOVA bidirectionnelle). Abréviations : OGD = privation d’oxygène-glucose; TEER = résistance électrique transendothéliale; HBMEC = cellules endothéliales microvasculaires du cerveau humain; HA = astrocytes humains; HBVP = péricytes vasculaires du cerveau humain; FITC-dextran = dextrane conjugué à l’isothiocyanate de fluorescéine; Arb. unités = unités arbitraires. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Pour vérifier les lésions hypoxiques induites par les autres ministères, HBMEC, HA et HBVP ont été cultivés dans les puits de boîtes à fond de verre de 35 mm et chargés du réactif d’hypoxie, dont le signal fluorescent augmentait avec les niveaux d’oxygène réduits. Tous les types humains primaires exposés à l’OGD présentaient une forte fluorescence verte, prouvant que les cellules vivantes imagées étaient hypoxiques (Figure 2). Après avoir estimé les effets d’avoir différents types de cellules périvasculaires (astrocytes et péricytes), ou leur combinaison dans le modèle BBB sur les propriétés de barrière suivant un protocole OGD, nous avons conclu que le modèle triple était supérieur aux autres modèles BBB testés.
Figure 2 : Coloration vivante de cellules endothéliales microvasculaires hypoxiques du cerveau humain primaire, d’astrocytes humains et de péricytes vasculaires cérébraux humains après 4 h de privation d’oxygène-glucose. Des expositions à d’autres doses ont été effectuées sur toutes les cellules primaires (HBMEC, HA et HBVP) en utilisant un réactif d’hypoxie et un milieu sans glucose pendant 4 heures. Les résultats de quatre expériences indépendantes sont présentés. Les cultures ont été imagées à un grossissement de 20x. Barres d’échelle = 100 μm. Abréviations : OGD = privation d’oxygène-glucose; HBMEC = cellules endothéliales microvasculaires du cerveau humain; HA = astrocytes humains; HBVP = péricytes vasculaires du cerveau humain; DAPI = 4',6-diamidino-2-phénylindole. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Dans ce protocole, nous décrivons une méthode pour mettre en place un modèle fiable de culture BBB à triple cellule endothéliale-péricyte-astrocyte pour étudier le dysfonctionnement de la BHE dans le cadre d’un AVC ischémique in vitro. Considérant que les péricytes sont les plus proches voisins des cellules endothéliales in vivo, les HBVP sont plaqués sur la face inférieure des inserts de puits dans ce modèle16. Bien que cette configuration n’ait pas la communication directe de cellule à cellule entre les astrocytes et les cellules endothéliales, cet arrangement permet une communication indirecte de cellule à cellule entre les types de cellules via des facteurs solubles sécrétés. La présence d’astrocytes et de péricytes dans ce système améliore considérablement l’intégrité de l’HBMEC, limitant la perméabilité paracellulaire de la monocouche aux traceurs de petite taille. De plus, les astrocytes et les péricytes ont un effet protecteur sur l’HBMEC dans les conditions OGD.
Dans le protocole développé, nous avons optimisé le rapport cellulaire (1:1:1) et le mélange de milieu de culture pour le compartiment basolatéral. Le modèle triple BBB affichait des valeurs TEER presque 2,5 fois plus élevées (239 ± 9 Ω·cm 2) que la monoculture HBMEC témoin (112 ± 11 Ω·cm2) après 6 jours de co-culture, le temps nécessaire à la formation correcte de la monocouche HBMEC17,18. Les valeurs TEER obtenues dans ce modèle triple sont comparables à celles de l’autre modèle triple décrit précédemment, dans lequel HA était en contact avec HBMEC et HBVP était ensemencé au fond des puits à plaques19. Dans l’autre modèle de triple culture de cellules primaires humaines avec la même configuration cellulaire et le même temps d’exposition aux autres ministères, les valeurs TEER de base étaient considérablement inférieures à celles de ce travail et n’atteignaient pas les niveaux standard (100 Ω·cm2)20. L’utilisation de plaques bien insérées à 6 puits avec des compartiments plus grands nous a permis de diminuer la fréquence de changement de milieu pour éviter la perturbation de l’échange de substances entre les populations cellulaires.
D’autres expériences ont été réalisées à l’aide d’une chambre d’incubation d’hypoxie scellée contenant un mélange gazeux anaérobie (95 % d’azote et 5 % de dioxyde de carbone). L’un des principaux avantages de ce protocole est que la gravité de la lésion ischémique peut être facilement ajustée aux besoins spécifiques en variant la durée de la période des autres ministères. Après évaluation de la perméabilité TEER et dextran, 4 h d’OGD n’ont pas compromis l’intégrité de la BHE dans le modèle triple construit. Par conséquent, pour étudier l’AVC ischémique in vitro, une exposition plus longue à l’OGD doit être appliquée pour induire la dégradation de la BHE. L’imagerie de cellules vivantes, fournie dans le protocole, permet la surveillance en temps réel de différents types de cellules et la vérification des lésions causées par les autres ministères, ce qui représente un avantage dans de nombreuses études.
Dans ce protocole, des inserts de puits en polyester de 0,4 μm ont été choisis comme base pour ce modèle triple BBB. Une membrane en polyester est considérée comme le meilleur type d’insert pour la visualisation cellulaire dans les applications d’imagerie par fluorescence, ce qui offre une excellente occasion de visualiser les modifications des protéines à jonction serrée et des transporteurs si nécessaire. Bien que le petit diamètre de pores choisi crée une faible perméabilité aux petites molécules hydrophiles à travers les monocouches endothéliales, il limite également l’application potentielle du modèle actuel de triple BHE pour les essais de migration transendothéliale, dans lesquels des tailles de pores de 3 μm ou 8 μm sont requises.
Enfin, une autre limitation de ce modèle peut être liée à l’absence de contrainte de cisaillement, dont il a été démontré qu’elle favorise la formation de jonctions serrées dans les systèmes dynamiques triple BBB in vitro 21. En conclusion, le modèle de triple culture BBB robuste et physiologiquement pertinent, composé de cellules humaines primaires, représente un outil précieux pour le dépistage de médicaments et l’étude du dysfonctionnement de la BHE associé à l’AVC ischémique.
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Disclosures
Tous les auteurs ont révélé qu’il n’y avait pas de conflits d’intérêts.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par les subventions MH128022, MH122235, MH072567, MH122235, HL126559, DA044579, DA039576, DA040537, DA050528 et DA047157 des National Institutes of Health (NIH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 mm Transwell with 0.4 µm Pore Polyester Membrane Insert | Corning | 3450 | |
| 35 mm Glass Bottom Dishes | MatTek Life Sciences (FISHERSCI) | P35GC-1.5-14-C | |
| Astrocyte Medium | Science Cell | 1801 | |
| Attachment Factor | Cell Systems (Fisher Scientific) | 4Z0-201 | |
| BD 60 mL Syringe | BD | 309653 | |
| BrainPhys Imaging Optimized Medium | STEMCELL Technologies | 5791 | |
| Complete Classic Medium With Serum and CultureBoost | 4Z0-500 | Cell Systems | |
| Corning 50 mL PP Centrifuge Tubes (Conical Bottom with CentriStar Cap | VWR | 430829 | |
| Corning 75cm² U-Shaped Canted Neck Not Treated Cell Culture Flask | Corning | 431464U | |
| Corning CellBIND 96-well Flat Clear Bottom Black Polystyrene Microplates | Corning | 3340 | |
| Countes Cell Counting Chamber Slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | ZGEXSCCOUNTESS2FL | |
| Decon CiDehol 70 Isopropyl Alcohol Solution | Fisher Scientific | 04-355-71 | |
| Disposable Petri Dishes | VWR | 25384-088 | |
| DMEM Medium (No glucose, No glutamine, No phenol red) | ThermoFisher | A14430-01 | Glucose-free medium |
| DPBS (No Calcium, No Magnesium) | ThermoFisher | 14190250 | |
| EBM Endothelial Cell Growth Basal Medium, Phenol Red Free, 500 mL | Lonza | CC-3129 | |
| EVOM2 Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter with STX2 electrodes | World Precison Instruments | NC9792051 | Epithelial voltohmmeter |
| Fluorescein isothiocyanate–dextran (wt 20,000) | Millipore Sigma | FD20-250MG | |
| Fluorescein isothiocyanate–dextran (wt 70,000) | Millipore Sigma | FD70S-250MG | |
| Fluorview FV3000 Confocal Microscope | Olympus | FV3000 | |
| Gas Tank (95% N2, 5% CO2) | Airgas | X02NI95C2003071 | |
| HBSS (No calcium, No magnesium, no phenol red) | Thermofisher | 14025092 | |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate - 10 mg/mL Solution in Water | ThermoFisher | H3570 | |
| Human Astrocytes | Science Cell | 1800 | |
| Human Brain Vascular Pericytes | Science Cell | 1200 | |
| Hypoxia Incubator Chamber | STEMCELL Technologies | 27310 | |
| Image-iT Green Hypoxia Reagent | ThermoFisher | I14834 | |
| Pericyte Medium | Science Cell | 1201 | |
| Primary Human Brain Microvascular Endothelial Cells | ACBRI 376 | Cell Systems | |
| Rocking Platform Shaker, Double | VWR | 10860-658 | |
| Single Flow Meter | STEMCELL Technologies | 27311 | |
| SpectraMax iD3 Microplate Reader | Molecular Devices | 75886-128 | |
| Syringe Filter, 25 mm, 0.22 μm, PVDF, Sterile | NEST Scientific | 380121 | |
| TPP Mutli-well Plates (6 wells) | MidSci | TP92406 | |
| TPP Tissue Culture Flasks T-75 Flasks | MidSci | TP90075 | Flasks with activated surface for cell adhesion |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | ThermoFisher | 25200056 | |
| UltraPure Distilled Water | Invitrogen (Life Technologies) | 10977-015 | |
| Uno Stage Top Incubator- | Oko Lab | UNO-T-H-CO2-TTL |
References
- Mozaffarian, D., et al. Heart disease and stroke statistics-2016 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 133 (94), 38 (2016).
- Yousufuddin, M., Young, N. Aging and ischemic stroke. Aging. 11 (9), 2542-2544 (2019).
- Donkor, E. S. Stroke in the 21st century: a snapshot of the burden, epidemiology, and quality of life. Stroke Research and Treatment. , 3238165 (2018).
- Kadry, H., Noorani, B., Cucullo, L. A blood-brain barrier overview on structure, function, impairment, and biomarkers of integrity. Fluids and Barriers of the CNS. 17 (1), 69 (2020).
- Brown, L. S., et al. Pericytes and neurovascular function in the healthy and diseased brain. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 282 (2019).
- Cabezas, R., et al. Astrocytic modulation of blood brain barrier: perspectives on Parkinson's disease. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 211 (2014).
- Abdullahi, W., Tripathi, D., Ronaldson, P. T. Blood-brain barrier dysfunction in ischemic stroke: targeting tight junctions and transporters for vascular protection. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 315 (3), 343-356 (2018).
- Candelario-Jalil, E., Dijkhuizen, R. M., Magnus, T. Neuroinflammation, stroke, blood-brain barrier dysfunction, and imaging modalities. Stroke. 53 (5), 1473-1486 (2022).
- He, Y., Yao, Y., Tsirka, S. E., Cao, Y. Cell-culture models of the blood-brain barrier. Stroke. 45 (8), 2514-2526 (2014).
- Thomsen, L. B., Burkhart, A., Moos, T. A triple culture model of the blood-brain barrier using porcine brain endothelial cells, astrocytes and pericytes. PLoS One. 10 (8), 0134765 (2015).
- Song, Y., Cai, X., Du, D., Dutta, P., Lin, Y. Comparison of blood-brain barrier models for in vitro biological analysis: one cell type vs three cell types. ACS Applied Bio Materials. 2 (3), 1050-1055 (2019).
- Xu, L., et al. Silver nanoparticles induce tight junction disruption and astrocyte neurotoxicity in a rat blood-brain barrier primary triple coculture model. International Journal of Nanomedicine. 10, 6105-6118 (2015).
- Appelt-Menzel, A. Establishment of a human blood-brain barrier co-culture model mimicking the neurovascular unit using induced pluri- and multipotent stem cells. Stem Cell Reports. 8 (4), 894-906 (2017).
- Zhang, Y., et al. Rational construction of a reversible arylazo-based NIR probe for cycling hypoxia imaging in vivo. Nature Communications. 12 (1), 2772 (2021).
- Palacio-Castañeda, V., Kooijman, L., Venzac, B., Verdurmen, W. P. R., Le Gac, S. Metabolic switching of tumor cells under hypoxic conditions in a tumor-on-a-chip model. Micromachines. 11 (4), 382 (2020).
- Ramsauer, M., Krause, D., Dermietzel, R. Angiogenesis of the blood-brain barrier in vitro and the function of cerebral pericytes. FASEB Journal. 16 (10), 1274-1276 (2002).
- Lyck, R., et al. ALCAM (CD166) is involved in extravasation of monocytes rather than T cells across the blood-brain barrier. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 37 (8), 2894-2909 (2017).
- Rizzi, E., et al. A triple culture cell system modeling the human blood-brain barrier. Journal of Visualized Experiments. (177), (2021).
- Kumar, S., Shaw, L., Lawrence, C., Lea, R., Alder, J. P50: Developing a physiologically relevant blood brain barrier model for the study of drug disposition in glioma. Neuro-Oncology. 16 (6), (2014).
- Stone, N. L., England, T. J., O'Sullivan, S. E. A novel transwell blood brain barrier model using primary human cells. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 230 (2019).
- Al Ahmad, A., Taboada, C. B., Gassmann, M., Ogunshola, O. O. Astrocytes and pericytes differentially modulate blood-brain barrier characteristics during development and hypoxic insult. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 31 (2), 693-705 (2011).
