Her beskriver vi metoden til etablering af en tredobbelt cellekulturmodel af blod-hjerne-barrieren baseret på primære menneskelige hjernemikrovaskulære endotelceller, astrocytter og pericytter. Denne multicellulære model er velegnet til undersøgelser af neurovaskulær enhedsdysfunktion under iskæmisk slagtilfælde in vitro eller til screening af lægemiddelkandidater.
Iskæmisk slagtilfælde er en væsentlig årsag til død og handicap over hele verden med begrænsede terapeutiske muligheder. Neuropatologien af iskæmisk slagtilfælde er kendetegnet ved en afbrydelse i blodforsyningen til hjernen, der fører til celledød og kognitiv dysfunktion. Under og efter iskæmisk slagtilfælde letter blod-hjerne-barriere (BBB) dysfunktion skadeprogression og bidrager til dårlig patientgendannelse. Nuværende BBB-modeller omfatter primært endotelmonokulturer og dobbeltkulturer med enten astrocytter eller pericytter.
Sådanne modeller mangler evnen til fuldt ud at efterligne et dynamisk hjernemikromiljø, hvilket er afgørende for celle-til-celle-kommunikation. Derudover indeholder almindeligt anvendte BBB-modeller ofte udødeliggjorte humane endotelceller eller dyreafledte (gnaver-, svine- eller kvæg) cellekulturer, der udgør translationelle begrænsninger. Dette papir beskriver en ny velindsætbaseret BBB-model, der kun indeholder primære humane celler (hjernemikrovaskulære endotelceller, astrocytter og hjernevaskulære pericytter), der muliggør undersøgelse af iskæmisk hjerneskade in vitro.
Virkningerne af ilt-glukosemangel (OGD) på barriereintegritet blev vurderet ved passiv permeabilitet, transendotelial elektrisk modstand (TEER) målinger og direkte visualisering af hypoxiske celler. Den præsenterede protokol giver en klar fordel, der efterligner BBB’s intercellulære miljø in vivo, og tjener som en mere realistisk in vitro BBB-model til udvikling af nye terapeutiske strategier inden for indstilling af iskæmisk hjerneskade.
Slagtilfælde er en af de førende årsager til død og langvarig invaliditet på verdensplan1. Forekomsten af slagtilfælde stiger hurtigt med alderen og fordobles hvert 10. år efter 55 år2. Iskæmisk slagtilfælde opstår som følge af cerebral blodgennemstrømningsforstyrrelse på grund af trombotiske og emboliske hændelser, som omfatter mere end 80% af alle slagtilfældetilfælde 3. Selv nu er der relativt få behandlingsmuligheder til rådighed for at minimere vævsdød efter iskæmisk slagtilfælde. De behandlinger, der findes, er tidsfølsomme og fører derfor ikke altid til gode kliniske resultater. Derfor er der et presserende behov for forskning i komplekse cellulære mekanismer af iskæmisk slagtilfælde, der påvirker genopretning efter slagtilfælde.
BBB er en dynamisk grænseflade til udveksling af molekyler mellem blodet og hjernens parenchym. Strukturelt består BBB af hjernemikrovaskulære endotelceller forbundet med krydsende komplekser omgivet af en kældermembran, pericytter og astrocytiske endfeet4. Pericytter og astrocytter spiller en væsentlig rolle i opretholdelsen af BBB-integritet gennem udskillelse af forskellige faktorer, der er nødvendige for dannelsen af stærke, tætte kryds 5,6. Nedbrydningen af BBB er et af kendetegnene ved iskæmisk slagtilfælde. Akut inflammatorisk respons og oxidativ stress forbundet med cerebral iskæmi resulterer i forstyrrelse af tætte krydsproteinkomplekser og dysreguleret krydstale mellem astrocytter, pericytter og endotelceller, hvilket fører til øget paracellulær opløst stofpermeabilitet på tværs af BBB7. BBB dysfunktion fremmer yderligere dannelsen af hjerneødem og øger risikoen for hæmoragisk transformation8. I betragtning af alt det ovenstående er der stor interesse for at forstå de molekylære og cellulære ændringer, der forekommer på BBB-niveau under og efter iskæmisk slagtilfælde.
Selvom mange in vitro BBB-modeller er blevet udviklet i løbet af de seneste årtier og brugt i en række undersøgelser, kan ingen af dem fuldt ud replikere in vivo-forhold 9. Mens nogle modeller er baseret på endotelcellemonolag dyrket på gennemsatte permeable understøtninger alene eller i kombination med pericytter eller astrocytter, har kun nyere undersøgelser introduceret tredobbelt cellekulturmodeldesign. Næsten alle eksisterende BBB-modeller med tredobbelt kultur inkorporerer primære hjerneendotelceller sammen med astrocytter og pericytter isoleret fra dyrearter eller celler afledt af humane pluripotente stamceller10,11,12,13.
I erkendelse af behovet for bedre at rekapitulere den menneskelige BBB in vitro etablerede vi en tredobbelt cellekultur in vitro BBB-model sammensat af humane hjernemikrovaskulære endotelceller (HBMEC), primære humane astrocytter (HA) og primære humane hjernevaskulære pericytter (HBVP). Denne tredobbelte kultur BBB-model er sat op på 6-brønds plade, polyestermembranindsatser med 0,4 μm porestørrelse. Disse brøndindsatser giver et optimalt miljø for cellefastgørelse og muliggør nem adgang til både apikale (blod) og basolaterale (hjerne) rum til medium prøveudtagning eller sammensat anvendelse. Funktionerne i denne foreslåede tredobbelte cellekultur BBB-model vurderes ved at måle TEER og paracellulær flux efter OGD, der efterligner iskæmisk slagtilfælde in vitro, med mangel på ilt (<1%O2) og næringsstoffer (ved anvendelse af glukosefrit medium) opnået ved anvendelse af et befugtet, forseglet kammer. Derudover verificeres inducerede iskæmiske tilstande i denne model nøjagtigt ved direkte visualisering af hypoxiske celler.
I denne protokol beskriver vi en metode til at oprette en pålidelig tredobbelt endotelcelle-pericyt-astrocytkultur BBB-model til undersøgelse af BBB-dysfunktion i indstillingen af iskæmisk slagtilfælde in vitro. I betragtning af at pericytter er de nærmeste naboer til endotelceller in vivo, er HBVP belagt på undersiden af brøndindsatserne i denne model16. Selvom denne konfiguration mangler den direkte celle-til-celle-kommunikation mellem astrocytter og endotelceller, giver…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health (NIH) tilskud MH128022, MH122235, MH072567, MH122235, HL126559, DA044579, DA039576, DA040537, DA050528 og DA047157.
24 mm Transwell with 0.4 µm Pore Polyester Membrane Insert | Corning | 3450 | |
35 mm Glass Bottom Dishes | MatTek Life Sciences (FISHERSCI) | P35GC-1.5-14-C | |
Astrocyte Medium | Science Cell | 1801 | |
Attachment Factor | Cell Systems (Fisher Scientific) | 4Z0-201 | |
BD 60 mL Syringe | BD | 309653 | |
BrainPhys Imaging Optimized Medium | STEMCELL Technologies | 5791 | |
Complete Classic Medium With Serum and CultureBoost | 4Z0-500 | Cell Systems | |
Corning 50 mL PP Centrifuge Tubes (Conical Bottom with CentriStar Cap | VWR | 430829 | |
Corning 75cm² U-Shaped Canted Neck Not Treated Cell Culture Flask | Corning | 431464U | |
Corning CellBIND 96-well Flat Clear Bottom Black Polystyrene Microplates | Corning | 3340 | |
Countes Cell Counting Chamber Slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
Countess II FL Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | ZGEXSCCOUNTESS2FL | |
Decon CiDehol 70 Isopropyl Alcohol Solution | Fisher Scientific | 04-355-71 | |
Disposable Petri Dishes | VWR | 25384-088 | |
DMEM Medium (No glucose, No glutamine, No phenol red) | ThermoFisher | A14430-01 | Glucose-free medium |
DPBS (No Calcium, No Magnesium) | ThermoFisher | 14190250 | |
EBM Endothelial Cell Growth Basal Medium, Phenol Red Free, 500 mL | Lonza | CC-3129 | |
EVOM2 Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter with STX2 electrodes | World Precison Instruments | NC9792051 | Epithelial voltohmmeter |
Fluorescein isothiocyanate–dextran (wt 20,000) | Millipore Sigma | FD20-250MG | |
Fluorescein isothiocyanate–dextran (wt 70,000) | Millipore Sigma | FD70S-250MG | |
Fluorview FV3000 Confocal Microscope | Olympus | FV3000 | |
Gas Tank (95% N2, 5% CO2) | Airgas | X02NI95C2003071 | |
HBSS (No calcium, No magnesium, no phenol red) | Thermofisher | 14025092 | |
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate – 10 mg/mL Solution in Water | ThermoFisher | H3570 | |
Human Astrocytes | Science Cell | 1800 | |
Human Brain Vascular Pericytes | Science Cell | 1200 | |
Hypoxia Incubator Chamber | STEMCELL Technologies | 27310 | |
Image-iT Green Hypoxia Reagent | ThermoFisher | I14834 | |
Pericyte Medium | Science Cell | 1201 | |
Primary Human Brain Microvascular Endothelial Cells | ACBRI 376 | Cell Systems | |
Rocking Platform Shaker, Double | VWR | 10860-658 | |
Single Flow Meter | STEMCELL Technologies | 27311 | |
SpectraMax iD3 Microplate Reader | Molecular Devices | 75886-128 | |
Syringe Filter, 25 mm, 0.22 μm, PVDF, Sterile | NEST Scientific | 380121 | |
TPP Mutli-well Plates (6 wells) | MidSci | TP92406 | |
TPP Tissue Culture Flasks T-75 Flasks | MidSci | TP90075 | Flasks with activated surface for cell adhesion |
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | ThermoFisher | 25200056 | |
UltraPure Distilled Water | Invitrogen (Life Technologies) | 10977-015 | |
Uno Stage Top Incubator- | Oko Lab | UNO-T-H-CO2-TTL |