Summary
Her beskriver vi metoden til etablering af en tredobbelt cellekulturmodel af blod-hjerne-barrieren baseret på primære menneskelige hjernemikrovaskulære endotelceller, astrocytter og pericytter. Denne multicellulære model er velegnet til undersøgelser af neurovaskulær enhedsdysfunktion under iskæmisk slagtilfælde in vitro eller til screening af lægemiddelkandidater.
Abstract
Iskæmisk slagtilfælde er en væsentlig årsag til død og handicap over hele verden med begrænsede terapeutiske muligheder. Neuropatologien af iskæmisk slagtilfælde er kendetegnet ved en afbrydelse i blodforsyningen til hjernen, der fører til celledød og kognitiv dysfunktion. Under og efter iskæmisk slagtilfælde letter blod-hjerne-barriere (BBB) dysfunktion skadeprogression og bidrager til dårlig patientgendannelse. Nuværende BBB-modeller omfatter primært endotelmonokulturer og dobbeltkulturer med enten astrocytter eller pericytter.
Sådanne modeller mangler evnen til fuldt ud at efterligne et dynamisk hjernemikromiljø, hvilket er afgørende for celle-til-celle-kommunikation. Derudover indeholder almindeligt anvendte BBB-modeller ofte udødeliggjorte humane endotelceller eller dyreafledte (gnaver-, svine- eller kvæg) cellekulturer, der udgør translationelle begrænsninger. Dette papir beskriver en ny velindsætbaseret BBB-model, der kun indeholder primære humane celler (hjernemikrovaskulære endotelceller, astrocytter og hjernevaskulære pericytter), der muliggør undersøgelse af iskæmisk hjerneskade in vitro.
Virkningerne af ilt-glukosemangel (OGD) på barriereintegritet blev vurderet ved passiv permeabilitet, transendotelial elektrisk modstand (TEER) målinger og direkte visualisering af hypoxiske celler. Den præsenterede protokol giver en klar fordel, der efterligner BBB's intercellulære miljø in vivo, og tjener som en mere realistisk in vitro BBB-model til udvikling af nye terapeutiske strategier inden for indstilling af iskæmisk hjerneskade.
Introduction
Slagtilfælde er en af de førende årsager til død og langvarig invaliditet på verdensplan1. Forekomsten af slagtilfælde stiger hurtigt med alderen og fordobles hvert 10. år efter 55 år2. Iskæmisk slagtilfælde opstår som følge af cerebral blodgennemstrømningsforstyrrelse på grund af trombotiske og emboliske hændelser, som omfatter mere end 80% af alle slagtilfældetilfælde 3. Selv nu er der relativt få behandlingsmuligheder til rådighed for at minimere vævsdød efter iskæmisk slagtilfælde. De behandlinger, der findes, er tidsfølsomme og fører derfor ikke altid til gode kliniske resultater. Derfor er der et presserende behov for forskning i komplekse cellulære mekanismer af iskæmisk slagtilfælde, der påvirker genopretning efter slagtilfælde.
BBB er en dynamisk grænseflade til udveksling af molekyler mellem blodet og hjernens parenchym. Strukturelt består BBB af hjernemikrovaskulære endotelceller forbundet med krydsende komplekser omgivet af en kældermembran, pericytter og astrocytiske endfeet4. Pericytter og astrocytter spiller en væsentlig rolle i opretholdelsen af BBB-integritet gennem udskillelse af forskellige faktorer, der er nødvendige for dannelsen af stærke, tætte kryds 5,6. Nedbrydningen af BBB er et af kendetegnene ved iskæmisk slagtilfælde. Akut inflammatorisk respons og oxidativ stress forbundet med cerebral iskæmi resulterer i forstyrrelse af tætte krydsproteinkomplekser og dysreguleret krydstale mellem astrocytter, pericytter og endotelceller, hvilket fører til øget paracellulær opløst stofpermeabilitet på tværs af BBB7. BBB dysfunktion fremmer yderligere dannelsen af hjerneødem og øger risikoen for hæmoragisk transformation8. I betragtning af alt det ovenstående er der stor interesse for at forstå de molekylære og cellulære ændringer, der forekommer på BBB-niveau under og efter iskæmisk slagtilfælde.
Selvom mange in vitro BBB-modeller er blevet udviklet i løbet af de seneste årtier og brugt i en række undersøgelser, kan ingen af dem fuldt ud replikere in vivo-forhold 9. Mens nogle modeller er baseret på endotelcellemonolag dyrket på gennemsatte permeable understøtninger alene eller i kombination med pericytter eller astrocytter, har kun nyere undersøgelser introduceret tredobbelt cellekulturmodeldesign. Næsten alle eksisterende BBB-modeller med tredobbelt kultur inkorporerer primære hjerneendotelceller sammen med astrocytter og pericytter isoleret fra dyrearter eller celler afledt af humane pluripotente stamceller10,11,12,13.
I erkendelse af behovet for bedre at rekapitulere den menneskelige BBB in vitro etablerede vi en tredobbelt cellekultur in vitro BBB-model sammensat af humane hjernemikrovaskulære endotelceller (HBMEC), primære humane astrocytter (HA) og primære humane hjernevaskulære pericytter (HBVP). Denne tredobbelte kultur BBB-model er sat op på 6-brønds plade, polyestermembranindsatser med 0,4 μm porestørrelse. Disse brøndindsatser giver et optimalt miljø for cellefastgørelse og muliggør nem adgang til både apikale (blod) og basolaterale (hjerne) rum til medium prøveudtagning eller sammensat anvendelse. Funktionerne i denne foreslåede tredobbelte cellekultur BBB-model vurderes ved at måle TEER og paracellulær flux efter OGD, der efterligner iskæmisk slagtilfælde in vitro, med mangel på ilt (<1%O2) og næringsstoffer (ved anvendelse af glukosefrit medium) opnået ved anvendelse af et befugtet, forseglet kammer. Derudover verificeres inducerede iskæmiske tilstande i denne model nøjagtigt ved direkte visualisering af hypoxiske celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Se materialetabellen for detaljer relateret til alle celler, materialer, udstyr og løsninger, der bruges i denne protokol.
1. Indstilling af BBB-model med tredobbelt cellekultur
- Såning pericytter
- Dyrk HBVP i T75-kulturkolber med en aktiveret overflade til celleadhæsion i en 5% CO2 -inkubator ved 37 ° C, indtil den er sammenflydende. Når sammenløbet er nået, skal du opsuge det gamle pericytmedium og vaske cellerne med 5 ml varmt Dulbeccos fosfatbufferede saltvand (DPBS). DPBS aspireres og cellerne løsnes fra kolben ved hjælp af en kombination af 4 ml varm trypsin-EDTA-opløsning og 1 ml DPBS.
BEMÆRK: Undgå at bruge passager senere end P7. - Kolben inkuberes i 5 minutter ved 37 °C i en CO2 -inkubator. Se under et mikroskop for at bekræfte, om cellerne er løsrevet fra kolben. Der tilsættes 5 ml varmt pericytmedium (indeholdende 2% føtalt bovint serum [FBS]) til kolben, og de løsrevne celler overføres til et 50 ml centrifugerør.
- Centrifuger cellesuspensionen i 3 minutter ved 200 × g, så cellerne kan danne en pellet i bunden af røret. Aspirer mediet fra røret, hvilket sikrer, at cellepelleten forbliver intakt.
- Resuspender cellepellet i pericytmedium; Beregn mængden af medium afhængigt af cellernes sammenløb og antallet af nødvendige brøndindsatser. Tag 10 μL af de resuspenderede celler, placer dem i et celletællingsdias, og tæl antallet af celler.
- Celletætheden bestemmes og frø 300.000 celler / indsats i 1 ml pericytmedium på den abluminale side af brøndindsatserne (6-brøndsformat).
BEMÆRK: Ved såning af HBVP på undersiden af indsatser er det meget vigtigt først at vende brøndindsatspladerne på hovedet. Mens pladen lægges fladt på en overflade, skal du fjerne den nederste sektion for at udsætte den abluminale side af brøndindsatserne. Når du har tilføjet pericytcellesuspension på den abluminale side, skal du dække brøndindsatserne med den vendte plade for at forhindre fordampning. Hold alle plader vendt på hovedet i en 5% CO2 -inkubator ved 37 °C natten over.
- Dyrk HBVP i T75-kulturkolber med en aktiveret overflade til celleadhæsion i en 5% CO2 -inkubator ved 37 ° C, indtil den er sammenflydende. Når sammenløbet er nået, skal du opsuge det gamle pericytmedium og vaske cellerne med 5 ml varmt Dulbeccos fosfatbufferede saltvand (DPBS). DPBS aspireres og cellerne løsnes fra kolben ved hjælp af en kombination af 4 ml varm trypsin-EDTA-opløsning og 1 ml DPBS.
- Såning af astrocytter
- Hak dyrkes i T75-kolber i en 5% CO2 -inkubator ved 37 °C, indtil sammenløbet er nået. Følg ovenstående trin 1.1.1-1.1.4 ved hjælp af astrocytmedium (indeholder også 2% FBS) i stedet for pericytmedium.
BEMÆRK: Undgå at bruge passager senere end P9. - Bestem celletætheden og frø 300.000 celler / brønd på bunden af vævskulturen 6-brøndsplader. Dæk pladen for at forhindre fordampning, og opbevar alle plader i en 5% CO2 -inkubator ved 37 °C natten over.
- Hak dyrkes i T75-kolber i en 5% CO2 -inkubator ved 37 °C, indtil sammenløbet er nået. Følg ovenstående trin 1.1.1-1.1.4 ved hjælp af astrocytmedium (indeholder også 2% FBS) i stedet for pericytmedium.
- Såning endotelceller
- Dyrk HBMEC i servietter i en 5% CO2 -inkubator ved 37 ° C, indtil den er sammenflydende. Følg ovenstående trin 1.1.1-1.1.4 ved hjælp af komplet klassisk medium (indeholdende 10% FBS) i stedet for pericytmedium.
BEMÆRK: Undgå at bruge passager senere end P12. - Tag vævskulturens 6-brøndsplader med astrocytter og brøndindsatserne (6-brøndsformat) indeholdende pericytter ud af 5% CO2 -inkubatoren ved 37 °C. Aspirer astrocytmediet fra vævskulturen 6-brøndplader. Tilsæt 1 ml pericytmedium og 1 ml astrocytmedium til hver brønd.
- Aspirer pericytmediet fra brøndindsatserne og læg dem i vævskulturen 6-brøndsplader indeholdende de seedede astrocytter. Frø HBMEC med en tæthed på 300.000 celler / brønd i 2 ml komplet klassisk medium på den apikale side af de samme brøndindsatser.
BEMÆRK: Endotelcellerne skal podes på den apikale side af brøndindsatserne den næste dag efter såning af pericytter på den abluminale side af brøndindsatserne og astrocytter på vævskultur 6-brøndsplader. Celler bør opretholdes i tredobbelt kultur i 6 dage for at inducere BBB-lignende egenskaber. Cellekulturmediet skal ændres i begge rum med indsæt 24 timer før forsøg.
- Dyrk HBMEC i servietter i en 5% CO2 -inkubator ved 37 ° C, indtil den er sammenflydende. Følg ovenstående trin 1.1.1-1.1.4 ved hjælp af komplet klassisk medium (indeholdende 10% FBS) i stedet for pericytmedium.
2. Induktion af ilt-glukosemangel
- Vask cellerne 3x med DPBS. For trecellekulturer, der udsættes for OGD, tilsættes glukosefrit medium (uden L-glutamin og phenolrødt) til både de apikale og basolaterale rum. Udskift kulturmediet med frisk medium i normoxiske kontrolcellekulturer. Kontrol tredobbelt kulturer anbringes i 5% CO2 -inkubatoren ved 37 °C.
BEMÆRK: Mellemstore ændringer før induktion af OGD eller umiddelbart efter OGD kan skabe mekanisk belastning, der yderligere vil påvirke endotelcellemonolagene. Således er trinene med medium udskiftning inkluderet for normoxiske kontrolcellekulturer. - Anbring en petriskål indeholdende 20 ml sterilt vand i hypoxi-inkubatorkammeret for at give tilstrækkelig befugtning af kulturerne. Åbn kammeret ved at frigøre ringklemmen. Arranger cellekulturerne på hylderne. Forsegl kammeret ved at fastgøre ringklemmen.
- Åbn både indløbs- og udløbsportene i kammeret. Fastgør slangen, der kommer fra toppen af flowmåleren, til kammeret. Fastgør slangen, der kommer fra bunden af flowmåleren, til gastanken, der indeholder gasblandingen af 95% N 2/5% CO2via et luftfilter.
- Åbn tankflowreguleringsventilen ved at dreje den mod uret for at tillade minimal gasstrøm. Åbn langsomt trykregulatorventilen ved at dreje med uret.
- Skyl kammeret med gasblandingen med en strømningshastighed på 20 L/min i 5 min. Frakobl kammeret fra gaskilden, og luk begge hvide plastklemmer fast.
- Sluk for tankens flowkontrolventil ved at dreje med uret. Luk trykregulatorventilen ved at dreje mod uret.
- Hypoxikammeret anbringes i en konventionel inkubator ved 37 °C i 4 timer.
BEMÆRK: For at tilføje efterfølgende reoxygeneringsperiode vaskes cellerne 3x med DPBS, tilsættes frisk medium i alle tredobbelte kulturer og opbevares i yderligere 24 timer i 5% CO2 -inkubatoren ved 37 ° C. Ifølge producentens anvisninger er iltkoncentrationen, der er tilbage i kammeret, 0% efter ikke mindre end 4 minutters rensning med anaerob gasblanding ved 20 l / min.
3. TEER-målinger
- Anbring det steriliserede TEER-instrument i biosikkerhedsskabet, og sæt elektroderne i epitelvoltohmmeteret. Steriliser elektroderne i 30 ml 70% isopropylalkoholopløsning i mindst 30 min.
- Tænd for TEER-instrumentet, og indstil funktionen til ohm.
- Fjern elektroderne fra 70% isopropylalkoholopløsningen, og anbring dem i 20 ml DPBS i mindst 30 minutter, indtil den digitale udlæsning på TEER-enheden læser 0 ohm.
- Indsæt elektrodens lange spids gennem en af de tre åbninger i brøndindsætningsbøjlen på den tomme brøndindsatskontrol, sænk den, indtil den berører bunden af brønden. Sørg for, at den korte spids hviler over den apikale kultur på bunden af brøndindsatsen.
BEMÆRK: Den tomme brøndindsatskontrol består af 2 ml komplet klassisk medium i det apikale rum og en kombination af 1 ml pericytmedium og 1 ml astrocytmedium i det basolaterale rum. Sørg for, at elektroderne holdes 90° i forhold til brøndindsatsen, mens du foretager TEER-målingen. Brug af gennemsnittet af to eller tre aflæsninger opnået i samme brønd (pr. Åbning) kan bidrage til at reducere variabiliteten. - Vent, indtil de digitale udlæsningsværdier på TEER-instrumentet er slået fra, før værdien registreres. Placer elektroderne tilbage i DPBS for at vaske dem mellem målingerne. Fortsæt med at indsamle alle TEER-målingerne til yderligere to tomme brøndindsatskontroller.
- Der indsamles TEER-målingerne af prøvepladerne ved hjælp af trin 3.4-3.5, der er taget til kontrolmålingerne. Når alle målinger er foretaget, placeres elektroden tilbage i 70% isopropylalkoholopløsningen i 30 min. Frakobl elektroderne fra TEER-instrumentet, og lad dem lufttørre.
- Beregn TEER-værdierne. Brug ligning (1) til at trække den gennemsnitlige ohm-værdi af den tomme brøndindsætningskontrol fra prøvens ohm-værdi, og multiplicer derefter denne modstandsværdi med arealet af membranindsatsen (cm 2) for at give den rapporterede TEER-værdi i Ω∙cm2.
(1)
(1)4. Vurdering af BBB's paracellulære permeabilitet
BEMÆRK: Udfør alle trin, der involverer FITC-dextran i et cellekulturbiosikkerhedsskab med lysene slukket. Dæk FITC-dextran-opløsningerne med aluminiumsfolie for at minimere fotoblegning.
- Der fremstilles opløsninger indeholdende FITC-dextraner på 20 og 70 kDa (0,1 mg/ml) ved hjælp af phenolrødfrit endotelcellevækstmedium, og der tillades omrøring på en rokkeplatformsryster i 1 time. Opløsningerne filtreres ved hjælp af et sprøjtefilter på 0,22 μm.
- Aspirer mediet fra det basolaterale rum og udskift det med 2 ml phenol rødfri endotelcellevækstmedium i BBB-modellen med tredobbelt cellekultur. Vask cellerne i det apikale rum to gange med Hanks 'afbalancerede saltopløsning (HBSS).
- Tilsæt 1 ml FITC-dextran-opløsningen i det apikale rum og dæk pladen med aluminiumsfolie. Pladen anbringes i en 5 % CO2 -kuvøse ved 37 °C i 1 time.
- Tag 100 μL medium fra de basolaterale rum og overfør det til en sort 96-brøndplade. Fluorescensen måles ved hjælp af en mikropladelæser med excitations- og emissionsbølgelængderne indstillet til henholdsvis 480 nm og 530 nm.
5. Påvisning af hypoxi i levende celler
- Frø 200 μL HBMEC, HA og HBVP i midten af poly-d-lysinbelagte, 35 mm glasbundskåle med en tæthed på 150.000 celler / skål. Før såning af HBMEC skal du belægge bunden af opvasken med fastgørelsesfaktoren. Cellerne sættes fast på glasoverfladen ved at lade dem stå natten over ved 37 °C i en CO2 -inkubator.
BEMÆRK: Det er vigtigt at placere retter med humane primære celler på samme tid med en tredobbelt velindsat BBB-model i et hypoxikammer til OGD. - Når sammenløbet er nået, kasseres dyrkningsmediet, og der tilsættes 2 ml forvarmet glucosefrit medium (for OGD) eller normalt medium (til kontroller) indeholdende 2 μL 1 mM Hoechst 33342 (slutkoncentration 0,2 μM) og 0,5 μL 5 mM stamopløsning af det refererede Image-iT grønne hypoxireagens (endelig koncentration 1 μM). Efter OGD-behandling udskiftes mediet med billeddannende optimeret medium i alle retter.
- Udfør fluorescens levende cellebilleddannelse med GFP-filteret og top-stage konfokal mikroskop inkubator som beskrevet tidligere14,15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at undersøge virkningerne af astrocytter og pericytter på barrierefunktionen af HBMEC konstruerede vi BBB-modellen med tredobbelt cellekultur på cellekulturindsatser (figur 1A) sammen med HBMEC-monokultur og to dobbelte co-kulturmodeller som kontroller (figur 1B). Dobbelt co-kultur kontrol omfattede en ikke-kontakt co-kultur af HBMEC med HA og kontakt co-kultur af HBMEC med HBVP. Efter 6 dage i samkultur blev alle eksperimentelle opsætninger udsat for OGD i 4 timer. Barriereintegriteten af endotelmonolaget i de angivne BBB-konfigurationer blev vurderet ved at bestemme TEER før og efter OGD såvel som efter 24 timers reoxygenering (figur 1C). I 4 timer forårsagede OGD kun et signifikant fald i TEER-værdier i HBMEC-monokultur og co-kulturmodellen med HBMEC og HBVP. Disse nedsatte niveauer nåede basisniveauerne efter 24 timers reoxygenering. Ingen effekt af OGD på samkulturmodellen med HBMEC og HA pegede på astrocytternes beskyttende rolle mod iskæmiske tilstande in vitro.
Selv om der ikke var nogen forskel i baseline TEER mellem triple- og HBMEC/HBVP-dobbelt-co-culture-modeller, var TEER-værdierne i triple co-culture-modellen signifikant højere end i de dobbelte co-culture-kontroller eller monokulturkontrol umiddelbart efter OGD, hvilket tyder på, at integration af HA og HBVP i triple BBB-modellen spiller en afgørende rolle for at opretholde BBB's funktionelle integritet under patologiske forhold (figur 1C ). Vi undersøgte også permeabiliteten af små (20 kDa) og store (70 kDa) molekylmasse FITC-dextrans på tværs af endotelmonolaget i den udviklede tredobbelte kulturmodel. Den paracellulære permeabilitet af endotelmonolag til 20 kDa molekylmasse FITC-dextran blev drastisk øget i HBMEC-monokultur og i mindre grad i samkulturmodellen med HBMEC og HBVP sammenlignet med normoxiske kontroller (figur 1D). Desuden var 20 kDa FITC-dextranpermeabilitetsniveauer de laveste i den tredobbelte BBB-model blandt alle modeller under normoxiske og OGG-forhold. Der blev ikke observeret ændringer i 70 kDa FITC-dextran flux på tværs af endotel monolag i nogen af modellerne (figur 1E). Disse data tyder på, at iskæmisk-hypoxisk skade ikke var så alvorlig at forårsage ændringer i paracellulær permeabilitet til store molekyler såsom plasmaproteiner.
Figur 1: Effekter af ilt-glukosemangel på transendotelial elektrisk resistens og endotelpermeabilitet i humane primære mono-, co- og triple culture BBB-modeller. (A) Skematisk tidslinje for indstilling af BBB-modellen for tredobbelt primærcellekultur. (B) Skematiske repræsentationer af konfigurationerne for in vitro statiske primære cellebaserede BBB-modeller baseret på human primærcelle. En monokulturmodel indeholder HBMEC podet på den apikale side af den godt indsatte porøse membran. En berøringsfri samkultur indeholder HBMEC podet på den øverste overflade af brøndindsatsstøtten og HA podet i bunden af kulturbrønden. En kontakt-co-kulturmodel inkluderer HBVP podet på den nederste overflade af brøndindsatsstøtten med HBMEC på den øverste overflade. Til den tredobbelte kulturmodel er HBMEC podet på den øverste overflade af understøtningen med HBVP podet på den nederste overflade og HA sået på bunden af kulturbrøndene. (C) Ændringer i TEER overvåget umiddelbart før OGD, efter 4 timers OGD og efter 24 timers reoxygenering. Data repræsenteret som gennemsnit ± SEM (n = 5-6). P < 0,0001 sammenlignet med mono- og samkulturmodeller (tovejs ANOVA). (D) Paracellulær permeabilitet til 20 kDa FITC-dextran på tværs af endotelmonolag blev målt efter 4 timers OGD. (E) Paracellulær permeabilitet til 70 kDa FITC-dextran på tværs af endotelmonolag blev målt efter 4 timers OGD. Data repræsenteret som middel ± SD (n = 5-6). *P < 0,05. P < 0,0001 (tovejs ANOVA). Forkortelser: OGD = ilt-glukosemangel; TEER = transendotel elektrisk modstand; HBMEC = mikrovaskulære endotelceller i hjernen HA = menneskelige astrocytter; HBVP = menneskelige hjerne vaskulære pericytter; FITC-dextran = dextran konjugeret til fluoresceinisothiocyanat; arb. enheder = vilkårlige enheder. Klik her for at se en større version af denne figur.
For at verificere OGD-induceret hypoxisk skade blev HBMEC, HA og HBVP dyrket i brøndene i 35 mm glasbundskåle og fyldt med hypoxireagenset, hvis fluorescerende signal steg med reducerede iltniveauer. Alle primære mennesketyper udsat for OGD udviste stærk grøn fluorescens, hvilket beviste, at de afbildede levende celler var hypoxiske (figur 2). Efter at have estimeret virkningerne af at have forskellige perivaskulære celletyper (astrocytter og pericytter) eller deres kombination i BBB-modellen på barriereegenskaberne efter en OG-protokol, konkluderede vi, at den tredobbelte model var bedre end de andre testede BBB-modeller.
Figur 2: Levende farvning af hypoxiske primære humane hjernemikrovaskulære endotelceller, humane astrocytter og humane hjernevaskulære pericytter efter 4 timers ilt-glukosemangel. OGD-eksponeringer blev udført på alle primære celler (HBMEC, HA og HBVP) ved anvendelse af et hypoxireagens og glukosefrit medium i 4 timer. Resultater fra fire uafhængige eksperimenter vises. Kulturer blev afbildet ved 20x forstørrelse. Skala søjler = 100 μm. Forkortelser: OGD = ilt-glukosemangel; HBMEC = mikrovaskulære endotelceller i hjernen HA = menneskelige astrocytter; HBVP = menneskelige hjerne vaskulære pericytter; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindol. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne protokol beskriver vi en metode til at oprette en pålidelig tredobbelt endotelcelle-pericyt-astrocytkultur BBB-model til undersøgelse af BBB-dysfunktion i indstillingen af iskæmisk slagtilfælde in vitro. I betragtning af at pericytter er de nærmeste naboer til endotelceller in vivo, er HBVP belagt på undersiden af brøndindsatserne i denne model16. Selvom denne konfiguration mangler den direkte celle-til-celle-kommunikation mellem astrocytter og endotelceller, giver dette arrangement mulighed for indirekte celle-til-celle-kommunikation mellem celletyper via udskillede opløselige faktorer. Tilstedeværelsen af astrocytter og pericytter i dette system forbedrer HBMEC-integriteten betydeligt, hvilket begrænser monolagets paracellulære permeabilitet til små sporstoffer. Derudover har astrocytter og pericytter en beskyttende virkning på HBMEC under OGT-forhold.
I den udviklede protokol optimerede vi celleforholdet (1:1:1) og dyrkningsmediumblandingen til det basolaterale rum. Den tredobbelte BBB-model viste næsten 2,5 gange højere TEER-værdier (239 ± 9 Ω·cm 2) end kontrol-HBMEC-monokulturen (112 ± 11 Ω·cm2) efter 6 dages samdyrkning, den tid, der var nødvendig for den korrekte HBMEC-monolagsdannelse17,18. De TEER-værdier, der er opnået i denne tredobbelte model, er sammenlignelige med dem i den anden tidligere beskrevne triplemodel, hvor HA var i kontakt med HBMEC, og HBVP blev podet på bunden af pladebrøndene19. I den anden humane primære celle tredobbelte kulturmodel med samme cellekonfiguration og OGD-eksponeringstid var baseline TEER-værdierne væsentligt lavere end dem i dette arbejde og nåede ikke standardniveauerne (100 Ω·cm2)20. Brugen af 6-brønds brøndindsatsplader med større rum tillod os at reducere den mellemstore ændringsfrekvens for at undgå forstyrrelse af stofudveksling mellem cellepopulationerne.
OGT-eksperimenter blev udført ved anvendelse af et forseglet hypoxiinkubatorkammer indeholdende en anaerob gasblanding (95% nitrogen og 5% kuldioxid). En af de største fordele ved denne protokol er, at sværhedsgraden af den iskæmiske skade let kan justeres til specifikke behov ved at variere længden af OGD-perioden. Efter evaluering af TEER- og dextranpermeabiliteten kompromitterede 4 timers OGD ikke BBB-integriteten i den konstruerede tredobbelte model. For at studere iskæmisk slagtilfælde in vitro skal der derfor anvendes længere eksponering for OGD for at inducere BBB-nedbrydning. Levende cellebilleddannelse, der er angivet i protokollen, muliggør realtidsovervågning af forskellige celletyper og verifikation af OG-skade, hvilket repræsenterer en fordel i mange undersøgelser.
I denne protokol blev 0,4 μm polyesterbrøndindsatser valgt som grundlag for denne tredobbelte BBB-model. En polyestermembran betragtes som den bedste indsatstype til cellevisualisering i fluorescensbilleddannelsesapplikationer, hvilket giver en glimrende mulighed for at visualisere modifikationer af tætte krydsproteiner og transportører, hvis det er nødvendigt. Mens den valgte lille porediameter skaber en lav permeabilitet for små hydrofile molekyler på tværs af endotelmonolag, begrænser den også den potentielle anvendelse af den nuværende tredobbelte BBB-model til transendotelmigrationsassays, hvor der kræves 3 μm eller 8 μm porestørrelser.
Endelig kan en anden begrænsning af denne model relateres til manglen på forskydningsspænding, som har vist sig at fremme dannelsen af tætte kryds i dynamiske tredobbelte BBB in vitro-systemer 21. Afslutningsvis repræsenterer den etablerede robuste og fysiologisk relevante BBB-model med tredobbelt kultur, der består af primære humane celler, et værdifuldt værktøj til lægemiddelscreening og undersøgelse af BBB-dysfunktion forbundet med iskæmisk slagtilfælde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle forfatterne oplyste, at der ikke er nogen interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health (NIH) tilskud MH128022, MH122235, MH072567, MH122235, HL126559, DA044579, DA039576, DA040537, DA050528 og DA047157.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 mm Transwell with 0.4 µm Pore Polyester Membrane Insert | Corning | 3450 | |
| 35 mm Glass Bottom Dishes | MatTek Life Sciences (FISHERSCI) | P35GC-1.5-14-C | |
| Astrocyte Medium | Science Cell | 1801 | |
| Attachment Factor | Cell Systems (Fisher Scientific) | 4Z0-201 | |
| BD 60 mL Syringe | BD | 309653 | |
| BrainPhys Imaging Optimized Medium | STEMCELL Technologies | 5791 | |
| Complete Classic Medium With Serum and CultureBoost | 4Z0-500 | Cell Systems | |
| Corning 50 mL PP Centrifuge Tubes (Conical Bottom with CentriStar Cap | VWR | 430829 | |
| Corning 75cm² U-Shaped Canted Neck Not Treated Cell Culture Flask | Corning | 431464U | |
| Corning CellBIND 96-well Flat Clear Bottom Black Polystyrene Microplates | Corning | 3340 | |
| Countes Cell Counting Chamber Slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | ZGEXSCCOUNTESS2FL | |
| Decon CiDehol 70 Isopropyl Alcohol Solution | Fisher Scientific | 04-355-71 | |
| Disposable Petri Dishes | VWR | 25384-088 | |
| DMEM Medium (No glucose, No glutamine, No phenol red) | ThermoFisher | A14430-01 | Glucose-free medium |
| DPBS (No Calcium, No Magnesium) | ThermoFisher | 14190250 | |
| EBM Endothelial Cell Growth Basal Medium, Phenol Red Free, 500 mL | Lonza | CC-3129 | |
| EVOM2 Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter with STX2 electrodes | World Precison Instruments | NC9792051 | Epithelial voltohmmeter |
| Fluorescein isothiocyanate–dextran (wt 20,000) | Millipore Sigma | FD20-250MG | |
| Fluorescein isothiocyanate–dextran (wt 70,000) | Millipore Sigma | FD70S-250MG | |
| Fluorview FV3000 Confocal Microscope | Olympus | FV3000 | |
| Gas Tank (95% N2, 5% CO2) | Airgas | X02NI95C2003071 | |
| HBSS (No calcium, No magnesium, no phenol red) | Thermofisher | 14025092 | |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate - 10 mg/mL Solution in Water | ThermoFisher | H3570 | |
| Human Astrocytes | Science Cell | 1800 | |
| Human Brain Vascular Pericytes | Science Cell | 1200 | |
| Hypoxia Incubator Chamber | STEMCELL Technologies | 27310 | |
| Image-iT Green Hypoxia Reagent | ThermoFisher | I14834 | |
| Pericyte Medium | Science Cell | 1201 | |
| Primary Human Brain Microvascular Endothelial Cells | ACBRI 376 | Cell Systems | |
| Rocking Platform Shaker, Double | VWR | 10860-658 | |
| Single Flow Meter | STEMCELL Technologies | 27311 | |
| SpectraMax iD3 Microplate Reader | Molecular Devices | 75886-128 | |
| Syringe Filter, 25 mm, 0.22 μm, PVDF, Sterile | NEST Scientific | 380121 | |
| TPP Mutli-well Plates (6 wells) | MidSci | TP92406 | |
| TPP Tissue Culture Flasks T-75 Flasks | MidSci | TP90075 | Flasks with activated surface for cell adhesion |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | ThermoFisher | 25200056 | |
| UltraPure Distilled Water | Invitrogen (Life Technologies) | 10977-015 | |
| Uno Stage Top Incubator- | Oko Lab | UNO-T-H-CO2-TTL |
References
- Mozaffarian, D., et al. Heart disease and stroke statistics-2016 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 133 (94), 38 (2016).
- Yousufuddin, M., Young, N.
- Donkor, E. S. Stroke in the 21st century: a snapshot of the burden, epidemiology, and quality of life. Stroke Research and Treatment. , 3238165 (2018).
- Kadry, H., Noorani, B., Cucullo, L. A blood-brain barrier overview on structure, function, impairment, and biomarkers of integrity. Fluids and Barriers of the CNS. 17 (1), 69 (2020).
- Brown, L. S., et al. Pericytes and neurovascular function in the healthy and diseased brain. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 282 (2019).
- Cabezas, R., et al. Astrocytic modulation of blood brain barrier: perspectives on Parkinson's disease. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 211 (2014).
- Abdullahi, W., Tripathi, D., Ronaldson, P. T. Blood-brain barrier dysfunction in ischemic stroke: targeting tight junctions and transporters for vascular protection. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 315 (3), 343-356 (2018).
- Candelario-Jalil, E., Dijkhuizen, R. M., Magnus, T. Neuroinflammation, stroke, blood-brain barrier dysfunction, and imaging modalities. Stroke. 53 (5), 1473-1486 (2022).
- He, Y., Yao, Y., Tsirka, S. E., Cao, Y.
- Thomsen, L. B., Burkhart, A., Moos, T. A triple culture model of the blood-brain barrier using porcine brain endothelial cells, astrocytes and pericytes. PLoS One. 10 (8), 0134765 (2015).
- Song, Y., Cai, X., Du, D., Dutta, P., Lin, Y. Comparison of blood-brain barrier models for in vitro biological analysis: one cell type vs three cell types. ACS Applied Bio Materials. 2 (3), 1050-1055 (2019).
- Xu, L., et al. Silver nanoparticles induce tight junction disruption and astrocyte neurotoxicity in a rat blood-brain barrier primary triple coculture model. International Journal of Nanomedicine. 10, 6105-6118 (2015).
- Appelt-Menzel, A. Establishment of a human blood-brain barrier co-culture model mimicking the neurovascular unit using induced pluri- and multipotent stem cells. Stem Cell Reports. 8 (4), 894-906 (2017).
- Zhang, Y., et al. Rational construction of a reversible arylazo-based NIR probe for cycling hypoxia imaging in vivo. Nature Communications. 12 (1), 2772 (2021).
- Palacio-Castañeda, V., Kooijman, L., Venzac, B., Verdurmen, W. P. R., Le Gac, S. Metabolic switching of tumor cells under hypoxic conditions in a tumor-on-a-chip model. Micromachines. 11 (4), 382 (2020).
- Ramsauer, M., Krause, D., Dermietzel, R. Angiogenesis of the blood-brain barrier in vitro and the function of cerebral pericytes. FASEB Journal. 16 (10), 1274-1276 (2002).
- Lyck, R., et al. ALCAM (CD166) is involved in extravasation of monocytes rather than T cells across the blood-brain barrier. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 37 (8), 2894-2909 (2017).
- Rizzi, E., et al. A triple culture cell system modeling the human blood-brain barrier. Journal of Visualized Experiments. (177), (2021).
- Kumar, S., Shaw, L., Lawrence, C., Lea, R., Alder, J. P50: Developing a physiologically relevant blood brain barrier model for the study of drug disposition in glioma. Neuro-Oncology. 16 (6), (2014).
- Stone, N. L., England, T. J., O'Sullivan, S. E. A novel transwell blood brain barrier model using primary human cells. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 230 (2019).
- Al Ahmad, A., Taboada, C. B., Gassmann, M., Ogunshola, O. O. Astrocytes and pericytes differentially modulate blood-brain barrier characteristics during development and hypoxic insult. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 31 (2), 693-705 (2011).
