Summary
Här beskriver vi metoden för att etablera en trippelcellsodlingsmodell av blod-hjärnbarriären baserad på primära mänskliga hjärnmikrovaskulära endotelceller, astrocyter och pericyter. Denna flercelliga modell är lämplig för studier av neurovaskulär enhetsdysfunktion under ischemisk stroke in vitro eller för screening av läkemedelskandidater.
Abstract
Ischemisk stroke är en viktig orsak till dödsfall och funktionshinder över hela världen med begränsade terapeutiska alternativ. Neuropatologin för ischemisk stroke kännetecknas av ett avbrott i blodtillförseln till hjärnan som leder till celldöd och kognitiv dysfunktion. Under och efter ischemisk stroke underlättar dysfunktion i blod-hjärnbarriären (BBB) skadeprogression och bidrar till dålig patientåterhämtning. Nuvarande BBB-modeller inkluderar främst endotelmonokulturer och dubbla samkulturer med antingen astrocyter eller pericyter.
Sådana modeller saknar förmågan att fullt ut imitera en dynamisk hjärnmikromiljö, vilket är viktigt för cell-till-cell-kommunikation. Dessutom innehåller vanliga BBB-modeller ofta odödliga mänskliga endotelceller eller djur-härledda (gnagare, svin eller nötkreatur) cellkulturer som utgör translationella begränsningar. Denna artikel beskriver en ny välinsättningsbaserad BBB-modell som endast innehåller primära mänskliga celler (hjärnmikrovaskulära endotelceller, astrocyter och hjärnvaskulära pericyter) som möjliggör undersökning av ischemisk hjärnskada in vitro.
Effekterna av syre-glukosbrist (OGD) på barriärintegritet bedömdes genom passiv permeabilitet, transendotelial elektrisk resistans (TEER) -mätningar och direkt visualisering av hypoxiska celler. Det presenterade protokollet erbjuder en tydlig fördel som efterliknar den intercellulära miljön hos BBB in vivo, vilket fungerar som en mer realistisk in vitro BBB-modell för att utveckla nya terapeutiska strategier vid inställning av ischemisk hjärnskada.
Introduction
Stroke är en av de främsta orsakerna till dödsfall och långvarig funktionsnedsättning över hela världen1. Förekomsten av stroke ökar snabbt med åldern och fördubblas var 10: e år efter 55års ålder 2. Ischemisk stroke uppstår som ett resultat av cerebral blodflödesstörning på grund av trombotiska och emboliska händelser, som omfattar mer än 80% av alla strokefall3. Även nu finns det relativt få behandlingsalternativ tillgängliga för att minimera vävnadsdöd efter ischemisk stroke. De behandlingar som finns är tidskänsliga och leder därför inte alltid till goda kliniska resultat. Därför behövs forskning om komplexa cellulära mekanismer för ischemisk stroke som påverkar återhämtning efter stroke.
BBB är ett dynamiskt gränssnitt för utbyte av molekyler mellan blodet och hjärnans parenkym. Strukturellt består BBB av hjärnans mikrovaskulära endotelceller sammankopplade av korsningskomplex omgivna av ett källarmembran, pericyter och astrocytiska endfeet4. Pericyter och astrocyter spelar en viktig roll i upprätthållandet av BBB-integritet genom utsöndring av olika faktorer som är nödvändiga för bildandet av starka, täta korsningar 5,6. Nedbrytningen av BBB är ett av kännetecknen för ischemisk stroke. Akut inflammatoriskt svar och oxidativ stress i samband med cerebral ischemi resulterar i störningar av proteinkomplex med tät korsning och dysreglerad överhörning mellan astrocyter, pericyter och endotelceller, vilket leder till ökad paracellulär löst permeabilitet över BBB7. BBB-dysfunktion främjar ytterligare bildandet av hjärnödem och ökar risken för hemorragisk transformation8. Med tanke på allt ovanstående finns det stort intresse för att förstå de molekylära och cellulära förändringar som uppstår på BBB-nivå under och efter ischemisk stroke.
Även om många in vitro BBB-modeller har utvecklats under de senaste decennierna och använts i en mängd olika studier, kan ingen av dem helt replikera in vivo-förhållanden 9. Medan vissa modeller är baserade på endotelcellmonolager odlade på välplacerade permeabla stöd ensamma eller i kombination med pericyter eller astrocyter, har endast nyare studier introducerat trippelcellodlingsmodelldesigner. Nästan alla befintliga trippelodlings-BBB-modeller innehåller primära hjärnendotelceller tillsammans med astrocyter och pericyter isolerade från djurarter eller celler som härrör från mänskliga pluripotenta stamceller10,11,12,13.
Genom att erkänna behovet av att bättre rekapitulera den mänskliga BBB in vitro, etablerade vi en trippelcellodling in vitro BBB-modell bestående av mänskliga hjärnmikrovaskulära endotelceller (HBMEC), primära mänskliga astrocyter (HA) och primära humana hjärnvaskulära pericyter (HBVP). Denna trippelkultur BBB-modell är inställd på 6-brunnsplatta, polyestermembraninsatser med 0,4 μm porstorlek. Dessa brunnsinsatser ger en optimal miljö för cellfästning och möjliggör enkel åtkomst till både apikala (blod) och basolaterala (hjärn) fack för medium provtagning eller föreningsapplikation. Egenskaperna hos denna föreslagna trippelcellodlings-BBB-modell bedöms genom att mäta TEER och paracellulärt flöde efter OGD som efterliknar ischemisk stroke in vitro, med brist på syre (<1%O2) och näringsämnen (genom att använda glukosfritt medium) som uppnås genom att använda en fuktad, förseglad kammare. Dessutom verifieras inducerade ischemiska liknande förhållanden i denna modell exakt genom direkt visualisering av hypoxiska celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Se materialförteckningen för detaljer relaterade till alla celler, material, utrustning och lösningar som används i detta protokoll.
1. BBB-modellinställning för trippelcellsodling
- Sädande pericyter
- Odla HBVP i T75-odlingskolvar med en aktiverad yta för celladhesion i en 5%CO2-inkubator vid 37 °C tills den är sammanflytande. När sammanflödet har uppnåtts, aspirera det gamla pericytmediet och tvätta cellerna med 5 ml varm Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning (DPBS). Aspirera DPBS och lossa cellerna från kolven med en kombination av 4 ml varm trypsin-EDTA-lösning och 1 ml DPBS.
OBS: Undvik att använda passager senare än P7. - Inkubera kolven i 5 minuter vid 37 °C i en CO 2-inkubator. Visa under ett mikroskop för att bekräfta om cellerna är lossnade från kolven. Tillsätt 5 ml varmt pericytmedium (innehållande 2 % fetalt bovint serum [FBS]) till kolven och överför de fristående cellerna till ett 50 ml centrifugrör.
- Centrifugera cellsuspensionen i 3 minuter vid 200 × g, så att cellerna kan bilda en pellet i rörets botten. Aspirera mediet från röret, så att cellpelleten förblir intakt.
- Återsuspendera cellpelleten i pericytmedium; beräkna mängden medium beroende på cellernas sammanflöde och antalet brunninsatser som behövs. Ta 10 μL av de återsuspenderade cellerna, placera dem i en cellräkningsbild och räkna antalet celler.
- Bestäm celldensiteten och frö 300 000 celler / sätt in i 1 ml pericytmedium på den abluminala sidan av brunnsinsatserna (6-brunnsformat).
OBS: Vid sådd av HBVP på undersidan av skär är det mycket viktigt att först vända brunnsplattorna upp och ner. Medan plattan läggs platt på en yta, ta bort den nedre delen för att exponera den abluminala sidan av brunninsatserna. Efter tillsats av pericytcellsuspension på den abluminala sidan, täck brunnsinsatserna med den vända plattan för att förhindra avdunstning. Förvara alla plattor upp och ner i en 5% CO 2-inkubator vid 37 ° C över natten.
- Odla HBVP i T75-odlingskolvar med en aktiverad yta för celladhesion i en 5%CO2-inkubator vid 37 °C tills den är sammanflytande. När sammanflödet har uppnåtts, aspirera det gamla pericytmediet och tvätta cellerna med 5 ml varm Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning (DPBS). Aspirera DPBS och lossa cellerna från kolven med en kombination av 4 ml varm trypsin-EDTA-lösning och 1 ml DPBS.
- Såning av astrocyter
- Odla HA i T75-kolvar i en 5% CO 2-inkubator vid 37 °C tills sammanflödet har uppnåtts. Följ stegen ovan 1.1.1-1.1.4 med astrocytmedium (även innehållande 2% FBS) istället för pericytmedium.
OBS: Undvik att använda passager senare än P9. - Bestäm celltätheten och frö 300 000 celler / brunn på botten av vävnadsodlingens 6-brunnsplattor. Täck plattan för att förhindra avdunstning och förvara alla plattor i en 5% CO 2-inkubator vid 37 ° C över natten.
- Odla HA i T75-kolvar i en 5% CO 2-inkubator vid 37 °C tills sammanflödet har uppnåtts. Följ stegen ovan 1.1.1-1.1.4 med astrocytmedium (även innehållande 2% FBS) istället för pericytmedium.
- Sädning av endotelceller
- Odla HBMEC i vävnadsodlingsskålar inom en 5%CO2-inkubator vid 37 ° C tills den är sammanflytande. Följ stegen ovan 1.1.1-1.1.4 med komplett klassiskt medium (innehållande 10% FBS) istället för pericytmedium.
OBS: Undvik att använda passager senare än P12. - Ta ut vävnadsodlingens 6-brunnsplattor som innehåller astrocyter och brunnsinsatserna (6-brunnsformat) som innehåller pericyter från 5% CO2-inkubatorn vid 37 °C. Aspirera astrocytmediet från vävnadsodlingens 6-brunnsplattor. Tillsätt 1 ml pericytmedium och 1 ml astrocytmedium till varje brunn.
- Aspirera pericytmediet från brunnsinsatserna och placera dem i vävnadskulturen 6-brunnsplattor som innehåller de fröade astrocyterna. Frö HBMEC med en densitet av 300 000 celler/brunn i 2 ml komplett klassiskt medium på den apikala sidan av samma brunnsinsatser.
OBS: Endotelcellerna bör fröas på den apikala sidan av brunnsinsatserna nästa dag efter sådd av pericyter på den abluminala sidan av brunnsinsatserna och astrocyter på vävnadsodling 6-brunnsplattor. Cellerna bör bibehållas i trippelodling i 6 dagar för att inducera BBB-liknande egenskaper. Cellodlingsmediet bör bytas i båda välinsatsfacken 24 timmar före experiment.
- Odla HBMEC i vävnadsodlingsskålar inom en 5%CO2-inkubator vid 37 ° C tills den är sammanflytande. Följ stegen ovan 1.1.1-1.1.4 med komplett klassiskt medium (innehållande 10% FBS) istället för pericytmedium.
2. Induktion av syre-glukosbrist
- Tvätta cellerna 3x med DPBS. För trippelcellkulturer som utsätts för OGD, tillsätt glukosfritt medium (utan L-glutamin och fenolrött) till både apikala och basolaterala fack. Ersätt odlingsmediet med färskt medium i normoxiska kontrollcellkulturer. Placera tredubbla kontrollkulturer i 5% CO2-inkubatorn vid 37 °C.
OBS: Medelstora förändringar före induktionen av OGD eller omedelbart efter OGD kan skapa mekanisk spänning som ytterligare skulle påverka endotelcellmonolagren. Således ingår stegen med medium ersättning för normoxiska kontrollcellkulturer. - Placera en petriskål som innehåller 20 ml sterilt vatten i hypoxiinkubatorkammaren för att ge tillräcklig befuktning av kulturerna. Öppna kammaren genom att släppa ringklämman. Ordna cellkulturerna på hyllorna. Försegla kammaren genom att fästa ringklämman.
- Öppna både kammarens inlopps- och utloppsportar. Fäst slangen som kommer från toppen av flödesmätaren till kammaren. Fäst slangen som kommer från botten av flödesmätaren till bensintanken som innehåller gasblandningen på 95% N 2/5% CO2via ett luftfilter.
- Öppna tankens flödesreglerventil genom att vrida den moturs för att tillåta minimalt gasflöde. Öppna långsamt tryckregulatorventilen genom att vrida medurs.
- Spola kammaren med gasblandningen med en flödeshastighet på 20 l/min i 5 minuter. Koppla bort kammaren från gaskällan och stäng båda vita plastklämmorna ordentligt.
- Stäng av tankens flödesreglerventil genom att vrida medurs. Stäng tryckregulatorventilen genom att vrida moturs.
- Placera hypoxikammaren i en konventionell inkubator vid 37 °C i 4 timmar.
OBS: För att lägga till efterföljande reoxygeneringsperiod, tvätta cellerna 3x med DPBS, tillsätt färskt medium i alla trippelkulturer och håll i ytterligare 24 timmar i 5% CO 2-inkubatorn vid 37 ° C. Enligt tillverkarens instruktioner är syrekoncentrationen som finns kvar i kammaren 0% efter minst 4 minuters rensning med anaerob gasblandning vid 20 l / min.
3. TEER-mätningar
- Placera det steriliserade TEER-instrumentet i biosäkerhetsskåpet och anslut elektroderna till epitelvoltohmmetern. Sterilisera elektroderna i 30 ml 70% isopropylalkohollösning i minst 30 minuter.
- Slå på TEER-instrumentet och ställ in funktionen på ohm.
- Ta bort elektroderna från 70% isopropylalkohollösning och placera dem i 20 ml DPBS i minst 30 minuter tills den digitala avläsningen på TEER-enheten läser 0 ohm.
- För in elektrodens långa stift genom en av de tre öppningarna i brunnssättningshängaren på den tomma brunnsinsatskontrollen och sänk den tills den vidrör botten av brunnen. Se till att den korta spetsen vilar ovanför den apikala kulturen på botten av brunnsinsatsen.
OBS: Den tomma brunnsinsatskontrollen består av 2 ml komplett klassiskt medium i det apikala facket och en kombination av 1 ml pericytmedium och 1 ml astrocytmedium i det basolaterala facket. Kontrollera att elektroderna hålls 90° mot brunnsinsatsen medan TEER-mätningen görs. Att använda genomsnittet av två eller tre avläsningar som erhållits i samma brunn (per öppning) kan bidra till att minska variationen. - Vänta tills de digitala avläsningsvärdena på TEER-instrumentet planar ut innan du registrerar värdet. Placera elektroderna tillbaka i DPBS för att tvätta dem mellan mätningarna. Fortsätt att samla in alla TEER-mätningar för ytterligare två tomma välinsatskontroller.
- Samla in TEER-mätningarna av provplattorna med hjälp av steg 3.4–3.5 som tagits för kontrollmätningarna. När alla mätningar har gjorts, placera elektroden tillbaka i 70% isopropylalkohollösning i 30 minuter. Koppla bort elektroderna från TEER-instrumentet och låt dem lufttorka.
- Beräkna TEER-värdena. Använd ekvation (1) för att subtrahera medelvärdet av ohm-värdet för den tomma brunnsinsatskontrollen från ohm-värdet för provet och multiplicera sedan detta motståndsvärde med området för membraninsatsen (cm 2) för att ge det rapporterade TEER-värdet i Ω∙cm2.
(1)
(1)4. Bedömning av BBB:s paracellulära permeabilitet
OBS: Utför alla steg som involverar FITC-dextran i ett cellodlingsbiosäkerhetsskåp med lamporna släckta. Täck FITC-dextran-lösningarna med aluminiumfolie för att minimera fotoblekning.
- Bered lösningar som innehåller FITC-dextrans på 20 och 70 kDa (0,1 mg/ml) med fenolrödfritt endotelcellstillväxtmedium och låt röra om på en gungande plattformsskakare i 1 timme. Filtrera lösningarna med ett 0,22 μm sprutfilter.
- Aspirera mediet från det basolaterala facket och ersätt det med 2 ml fenolrödfritt endotelcellstillväxtmedium i BBB-modellen för trippelcellodling. Tvätta cellerna i det apikala facket två gånger med Hanks balanserade saltlösning (HBSS).
- Tillsätt 1 ml av FITC-dextran-lösningen i det apikala facket och täck plattan med aluminiumfolie. Placera plattan i en 5%CO2-inkubator vid 37 °C i 1 timme.
- Ta 100 μL medium från de basolaterala facken och överför det till en svart 96-brunnsplatta. Mät fluorescensen med hjälp av en mikroplattläsare med excitations- och emissionsvåglängderna inställda på 480 nm respektive 530 nm.
5. Detektion av hypoxi i levande celler
- Frö 200 μL HBMEC, HA och HBVP i mitten av poly-d-lysinbelagda, 35 mm glasbottenskålar med en densitet av 150 000 celler / skål. Innan du sår HBMEC, täck botten av diskarna med fästfaktorn. Låt cellerna fästa på glasytan genom att lämna dem över natten vid 37 °C i en CO 2-inkubator.
OBS: Det är viktigt att placera rätter med mänskliga primära celler samtidigt med en trippel välinsatt BBB-modell i en hypoxikammare för OGD. - När sammanflödet har uppnåtts, kassera odlingsmediet och tillsätt 2 ml förvärmt glukosfritt medium (för OGD) eller normalt medium (för kontroller) innehållande 2 μl 1 mM Hoechst 33342 (slutlig koncentration 0,2 μM) och 0,5 μl 5 mM stamlösning av det refererade Image-iT-gröna hypoxireagenset (slutlig koncentration 1 μM). Efter OGD-behandling, byt ut mediet med bildoptimerat medium i alla rätter.
- Utför fluorescensavbildning av levande celler med GFP-filtret och konfokalmikroskopinkubatorn i toppstadiet enligt beskrivningen tidigare14,15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att undersöka effekterna av astrocyter och pericyter på barriärfunktionen hos HBMEC konstruerade vi BBB-modellen för trippelcellodling på cellodlingsinsatser (figur 1A) tillsammans med HBMEC-monokultur och två dubbla samodlingsmodeller som kontroller (figur 1B). Dubbla samkulturkontroller inkluderade en kontaktfri samkultur av HBMEC med HA och kontaktsamkultur av HBMEC med HBVP. Efter 6 dagar i samkultur utsattes alla experimentella inställningar för OGD i 4 timmar. Barriärintegriteten hos endotelmonolagret i de angivna BBB-konfigurationerna bedömdes genom bestämning av TEER före och efter OGD, samt efter 24 timmars reoxygenering (figur 1C). Under 4 timmar orsakade OGD en signifikant minskning av TEER-värdena endast i HBMEC-monokultur och samkulturmodellen med HBMEC och HBVP. Dessa minskade nivåer nådde baslinjenivåerna efter 24 timmars reoxygenering. Ingen effekt av OGD på samodlingsmodellen med HBMEC och HA pekade på astrocyternas skyddande roll mot ischemiska tillstånd in vitro.
Även om det inte fanns någon skillnad i baslinje-TEER mellan trippel- och HBMEC/HBVP-modeller med dubbel samkultur, var TEER-värdena i trippelsamkulturmodellen signifikant högre än i de dubbla samkulturkontrollerna eller monokulturkontrollen omedelbart efter OGD, vilket tyder på att integration av HA och HBVP i trippel-BBB-modellen spelar en avgörande roll för att upprätthålla BBB-funktionell integritet under patologiska förhållanden (figur 1C ). Vi undersökte också permeabiliteten hos liten (20 kDa) och stor (70 kDa) molekylmassa FITC-dextrans över endotelmonolagret i den utvecklade trippelkulturmodellen. Den paracellulära permeabiliteten hos endotelmonolager till 20 kDa molekylmassa FITC-dextran ökade drastiskt i HBMEC-monokultur och i mindre utsträckning i samodlingsmodellen med HBMEC och HBVP jämfört med normoxiska kontroller (figur 1D). Dessutom var 20 kDa FITC-dextranpermeabilitetsnivåer de lägsta i den tredubbla BBB-modellen bland alla modeller under normoxiska och OGD-förhållanden. Inga förändringar observerades i 70 kDa FITC-dextranflöde över endotelmonolager i någon av modellerna (figur 1E). Dessa data tyder på att ischemisk-hypoxisk skada inte var så allvarlig att orsaka förändringar i paracellulär permeabilitet för stora molekyler såsom plasmaproteiner.
Figur 1: Effekter av syre-glukosbrist på transendotelial elektrisk resistans och endotelpermeabilitet i humana primära mono-, co- och trippelkultur BBB-modeller. (A) Schematisk tidslinje för inställningen av BBB-modellen för trippel primärcellsodling. (B) Schematiska representationer av konfigurationerna för in vitro-statiska humana primära cellbaserade BBB-modeller. En monokulturmodell innehåller HBMEC sådd på den apikala sidan av det väl insatta porösa membranet. En beröringsfri samkultur innehåller HBMEC sådd på den övre ytan av brunnsinsatsstödet och HA sådd i botten av odlingsbrunnen. En kontaktsamodlingsmodell inkluderar HBVP sådd på den nedre ytan av brunnsinsatsstödet med HBMEC på den övre ytan. För trippelkulturmodellen seedas HBMEC på stödets övre yta med HBVP sådd på den nedre ytan och HA sådd på botten av odlingsbrunnarna. (C) Förändringar i TEER övervakas omedelbart före OGD, efter 4 timmars OGD och efter 24 timmars reoxygenering. Data representerade som medelvärde ± SEM (n = 5-6). P < 0,0001 jämfört med mono- och samkulturmodeller (tvåvägs ANOVA). (D) Paracellulär permeabilitet till 20 kDa FITC-dextran över endotelmonolager mättes efter 4 timmars OGD. (E) Paracellulär permeabilitet till 70 kDa FITC-dextran över endotelmonolager mättes efter 4 timmars OGD. Data representerade som medelvärde ± SD (n = 5-6). *P < 0,05. P < 0,0001 (tvåvägs ANOVA). Förkortningar: OGD = syre-glukosbrist; TEER = transendotelialt elektriskt motstånd; HBMEC = mänskliga hjärnans mikrovaskulära endotelceller; HA = mänskliga astrocyter; HBVP = humana hjärnan vaskulära pericyter; FITC-dextran = dextran konjugerad till fluoresceinisotiocyanat; Arb. enheter = godtyckliga enheter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
För att verifiera OGD-inducerad hypoxisk skada odlades HBMEC, HA och HBVP i brunnarna i 35 mm glasbottenskålar och laddades med hypoxireagenset, vars fluorescerande signal ökade med reducerade syrenivåer. Alla primära mänskliga typer som exponerades för OGD uppvisade stark grön fluorescens, vilket bevisar att de avbildade levande cellerna var hypoxiska (figur 2). Efter att ha uppskattat effekterna av att ha olika perivaskulära celltyper (astrocyter och pericyter), eller deras kombination i BBB-modellen på barriäregenskaperna efter ett OGD-protokoll, drog vi slutsatsen att trippelmodellen var överlägsen de andra testade BBB-modellerna.
Figur 2: Levande färgning av hypoxiska primära mänskliga hjärnmikrovaskulära endotelceller, humana astrocyter och humana hjärnvaskulära pericyter efter 4 timmars syre-glukosbrist. OGD-exponeringar utfördes på alla primära celler (HBMEC, HA och HBVP) med användning av ett hypoxireagens och glukosfritt medium i 4 timmar. Resultat från fyra oberoende experiment visas. Kulturer avbildades med 20x förstoring. Skalstänger = 100 μm. Förkortningar: OGD = syre-glukosbrist; HBMEC = mänskliga hjärnans mikrovaskulära endotelceller; HA = mänskliga astrocyter; HBVP = humana hjärnan vaskulära pericyter; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I detta protokoll beskriver vi en metod för att sätta upp en tillförlitlig trippel endotelcell-pericyt-astrocytkultur BBB-modell för att studera BBB-dysfunktion vid inställning av ischemisk stroke in vitro. Med tanke på att pericyter är närmaste grannar till endotelceller in vivo, är HBVP pläterade på undersidan av brunnsinsatserna i denna modell16. Även om denna konfiguration saknar den direkta cell-till-cell-kommunikationen mellan astrocyter och endotelceller, möjliggör detta arrangemang indirekt cell-till-cell-kommunikation mellan celltyper via utsöndrade lösliga faktorer. Närvaron av astrocyter och pericyter i detta system förbättrar kraftigt HBMEC-integriteten, vilket begränsar monoskiktets paracellulära permeabilitet till små spårämnen. Dessutom har astrocyter och pericyter en skyddande effekt på HBMEC vid OGD-förhållanden.
I det utvecklade protokollet optimerade vi cellförhållandet (1:1:1) och odlingsmedieblandningen för det basolaterala facket. Den tredubbla BBB-modellen visade nästan 2,5 gånger högre TEER-värden (239 ± 9 Ω ·cm 2) än kontrollen HBMEC-monokultur (112 ± 11 Ω ·cm2) efter 6 dagars samodling, den tid som krävs för korrekt HBMEC-monolagerbildning17,18. TEER-värdena som uppnås i denna trippelmodell är jämförbara med dem i den andra tidigare beskrivna trippelmodellen, där HA var i kontakt med HBMEC och HBVP såddes på botten av plattbrunnarna19. I den andra humana primära cellens trippelodlingsmodell med samma cellkonfiguration och OGD-exponeringstid var TEER-värdena vid baslinjen betydligt lägre än i detta arbete och nådde inte standardnivåerna (100 Ω · cm2) 20. Användningen av 6-brunnsfickor med större fack gjorde det möjligt för oss att minska medelbytesfrekvensen för att undvika störningar i ämnesutbytet mellan cellpopulationerna.
OGD-experiment utfördes med användning av en förseglad hypoxiinkubatorkammare innehållande en anaerob gasblandning (95% kväve och 5% koldioxid). En av de främsta fördelarna med detta protokoll är att svårighetsgraden av den ischemiska skadan enkelt kan anpassas till specifika behov genom att variera längden på OGD-perioden. Efter att ha utvärderat TEER- och dextranpermeabiliteten äventyrade 4 h OGD inte BBB-integriteten i den konstruerade trippelmodellen. För att studera ischemisk stroke in vitro måste därför längre exponering för OGD tillämpas för att inducera BBB-nedbrytning. Live-cell imaging, som tillhandahålls i protokollet, möjliggör realtidsövervakning av olika celltyper och verifiering av OGD-skada, vilket utgör en fördel i många studier.
I detta protokoll valdes 0,4 μm polyesterbrunninsatser som grund för denna trippel BBB-modell. Ett polyestermembran anses vara den bästa insatstypen för cellvisualisering i fluorescensavbildningsapplikationer, vilket ger ett utmärkt tillfälle att visualisera modifieringar av täta korsningsproteiner och transportörer om det behövs. Medan den valda lilla pordiametern skapar en låg permeabilitet för små hydrofila molekyler över endotelmonolager, begränsar den också den potentiella tillämpningen av den nuvarande trippel BBB-modellen för transendotelialmigrationsanalyser, där 3 μm eller 8 μm porstorlekar krävs.
Slutligen kan en annan begränsning av denna modell relateras till bristen på skjuvspänning, vilket har visat sig främja bildandet av täta korsningar i dynamiska trippel BBB in vitro-system 21. Sammanfattningsvis representerar den etablerade robusta och fysiologiskt relevanta trippelodlings-BBB-modellen, bestående av primära mänskliga celler, ett värdefullt verktyg för läkemedelsscreening och studier av BBB-dysfunktion associerad med ischemisk stroke.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alla författare avslöjade att det inte finns några intressekonflikter.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Institutes of Health (NIH) bidrag MH128022, MH122235, MH072567, MH122235, HL126559, DA044579, DA039576, DA040537, DA050528 och DA047157.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 mm Transwell with 0.4 µm Pore Polyester Membrane Insert | Corning | 3450 | |
| 35 mm Glass Bottom Dishes | MatTek Life Sciences (FISHERSCI) | P35GC-1.5-14-C | |
| Astrocyte Medium | Science Cell | 1801 | |
| Attachment Factor | Cell Systems (Fisher Scientific) | 4Z0-201 | |
| BD 60 mL Syringe | BD | 309653 | |
| BrainPhys Imaging Optimized Medium | STEMCELL Technologies | 5791 | |
| Complete Classic Medium With Serum and CultureBoost | 4Z0-500 | Cell Systems | |
| Corning 50 mL PP Centrifuge Tubes (Conical Bottom with CentriStar Cap | VWR | 430829 | |
| Corning 75cm² U-Shaped Canted Neck Not Treated Cell Culture Flask | Corning | 431464U | |
| Corning CellBIND 96-well Flat Clear Bottom Black Polystyrene Microplates | Corning | 3340 | |
| Countes Cell Counting Chamber Slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | ZGEXSCCOUNTESS2FL | |
| Decon CiDehol 70 Isopropyl Alcohol Solution | Fisher Scientific | 04-355-71 | |
| Disposable Petri Dishes | VWR | 25384-088 | |
| DMEM Medium (No glucose, No glutamine, No phenol red) | ThermoFisher | A14430-01 | Glucose-free medium |
| DPBS (No Calcium, No Magnesium) | ThermoFisher | 14190250 | |
| EBM Endothelial Cell Growth Basal Medium, Phenol Red Free, 500 mL | Lonza | CC-3129 | |
| EVOM2 Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter with STX2 electrodes | World Precison Instruments | NC9792051 | Epithelial voltohmmeter |
| Fluorescein isothiocyanate–dextran (wt 20,000) | Millipore Sigma | FD20-250MG | |
| Fluorescein isothiocyanate–dextran (wt 70,000) | Millipore Sigma | FD70S-250MG | |
| Fluorview FV3000 Confocal Microscope | Olympus | FV3000 | |
| Gas Tank (95% N2, 5% CO2) | Airgas | X02NI95C2003071 | |
| HBSS (No calcium, No magnesium, no phenol red) | Thermofisher | 14025092 | |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate - 10 mg/mL Solution in Water | ThermoFisher | H3570 | |
| Human Astrocytes | Science Cell | 1800 | |
| Human Brain Vascular Pericytes | Science Cell | 1200 | |
| Hypoxia Incubator Chamber | STEMCELL Technologies | 27310 | |
| Image-iT Green Hypoxia Reagent | ThermoFisher | I14834 | |
| Pericyte Medium | Science Cell | 1201 | |
| Primary Human Brain Microvascular Endothelial Cells | ACBRI 376 | Cell Systems | |
| Rocking Platform Shaker, Double | VWR | 10860-658 | |
| Single Flow Meter | STEMCELL Technologies | 27311 | |
| SpectraMax iD3 Microplate Reader | Molecular Devices | 75886-128 | |
| Syringe Filter, 25 mm, 0.22 μm, PVDF, Sterile | NEST Scientific | 380121 | |
| TPP Mutli-well Plates (6 wells) | MidSci | TP92406 | |
| TPP Tissue Culture Flasks T-75 Flasks | MidSci | TP90075 | Flasks with activated surface for cell adhesion |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | ThermoFisher | 25200056 | |
| UltraPure Distilled Water | Invitrogen (Life Technologies) | 10977-015 | |
| Uno Stage Top Incubator- | Oko Lab | UNO-T-H-CO2-TTL |
References
- Mozaffarian, D., et al. Heart disease and stroke statistics-2016 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 133 (94), 38 (2016).
- Yousufuddin, M., Young, N.
- Donkor, E. S. Stroke in the 21st century: a snapshot of the burden, epidemiology, and quality of life. Stroke Research and Treatment. , 3238165 (2018).
- Kadry, H., Noorani, B., Cucullo, L. A blood-brain barrier overview on structure, function, impairment, and biomarkers of integrity. Fluids and Barriers of the CNS. 17 (1), 69 (2020).
- Brown, L. S., et al. Pericytes and neurovascular function in the healthy and diseased brain. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 282 (2019).
- Cabezas, R., et al. Astrocytic modulation of blood brain barrier: perspectives on Parkinson's disease. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 211 (2014).
- Abdullahi, W., Tripathi, D., Ronaldson, P. T. Blood-brain barrier dysfunction in ischemic stroke: targeting tight junctions and transporters for vascular protection. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 315 (3), 343-356 (2018).
- Candelario-Jalil, E., Dijkhuizen, R. M., Magnus, T. Neuroinflammation, stroke, blood-brain barrier dysfunction, and imaging modalities. Stroke. 53 (5), 1473-1486 (2022).
- He, Y., Yao, Y., Tsirka, S. E., Cao, Y.
- Thomsen, L. B., Burkhart, A., Moos, T. A triple culture model of the blood-brain barrier using porcine brain endothelial cells, astrocytes and pericytes. PLoS One. 10 (8), 0134765 (2015).
- Song, Y., Cai, X., Du, D., Dutta, P., Lin, Y. Comparison of blood-brain barrier models for in vitro biological analysis: one cell type vs three cell types. ACS Applied Bio Materials. 2 (3), 1050-1055 (2019).
- Xu, L., et al. Silver nanoparticles induce tight junction disruption and astrocyte neurotoxicity in a rat blood-brain barrier primary triple coculture model. International Journal of Nanomedicine. 10, 6105-6118 (2015).
- Appelt-Menzel, A. Establishment of a human blood-brain barrier co-culture model mimicking the neurovascular unit using induced pluri- and multipotent stem cells. Stem Cell Reports. 8 (4), 894-906 (2017).
- Zhang, Y., et al. Rational construction of a reversible arylazo-based NIR probe for cycling hypoxia imaging in vivo. Nature Communications. 12 (1), 2772 (2021).
- Palacio-Castañeda, V., Kooijman, L., Venzac, B., Verdurmen, W. P. R., Le Gac, S. Metabolic switching of tumor cells under hypoxic conditions in a tumor-on-a-chip model. Micromachines. 11 (4), 382 (2020).
- Ramsauer, M., Krause, D., Dermietzel, R. Angiogenesis of the blood-brain barrier in vitro and the function of cerebral pericytes. FASEB Journal. 16 (10), 1274-1276 (2002).
- Lyck, R., et al. ALCAM (CD166) is involved in extravasation of monocytes rather than T cells across the blood-brain barrier. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 37 (8), 2894-2909 (2017).
- Rizzi, E., et al. A triple culture cell system modeling the human blood-brain barrier. Journal of Visualized Experiments. (177), (2021).
- Kumar, S., Shaw, L., Lawrence, C., Lea, R., Alder, J. P50: Developing a physiologically relevant blood brain barrier model for the study of drug disposition in glioma. Neuro-Oncology. 16 (6), (2014).
- Stone, N. L., England, T. J., O'Sullivan, S. E. A novel transwell blood brain barrier model using primary human cells. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 230 (2019).
- Al Ahmad, A., Taboada, C. B., Gassmann, M., Ogunshola, O. O. Astrocytes and pericytes differentially modulate blood-brain barrier characteristics during development and hypoxic insult. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 31 (2), 693-705 (2011).
