Summary
Minimalinvasive Techniken und ein einfaches Laborgerät verbessern die Reproduzierbarkeit des Rückenmarksverletzungsmodells, indem sie operative Schäden an den Versuchstieren reduzieren und die Aufrechterhaltung der anatomischen Morphologie ermöglichen. Die Methode lohnt sich, weil die zuverlässigen Ergebnisse und das reproduzierbare Vorgehen die Untersuchung der Mechanismen der Krankheitsheilung erleichtern.
Abstract
Durch den Einsatz minimalinvasiver Methoden zur Modellierung von Rückenmarksverletzungen (SCI) können Verhaltens- und histologische Unterschiede zwischen Versuchstieren minimiert und damit die Reproduzierbarkeit der Experimente verbessert werden.
Diese Methoden müssen zwei Anforderungen erfüllen: Klarheit des chirurgischen anatomischen Weges und Einfachheit und Komfort des Laborgeräts. Entscheidend für den Bediener ist, dass ein klarer anatomischer Pfad eine minimal-invasive Exposition ermöglicht, die eine zusätzliche Schädigung des Versuchstieres während der chirurgischen Eingriffe vermeidet und es dem Tier ermöglicht, während des Experiments eine konsistente und stabile anatomische Morphologie aufrechtzuerhalten.
In dieser Studie wird die Verwendung einer neuartigen integrierten Plattform, der sogenannten SCI-Koaxialplattform für Rückenmarksverletzungen bei Kleintieren, untersucht, um das Rückenmark auf T9-Ebene minimalinvasiv freizulegen und den Wirbel von Mäusen mit einem Wirbelstabilisator zu stabilisieren und zu immobilisieren, und schließlich wird ein koaxialer Schwerkraftimpaktor verwendet, um das Rückenmark von Mäusen zu kontaminieren, um sich verschiedenen Graden von T9-Rückenmarksverletzungen zu nähern. Abschließend werden histologische Ergebnisse als Referenz für die Leser zur Verfügung gestellt.
Introduction
Traumatische Rückenmarksverletzungen (SCI) prädisponieren das Individuum leicht für schwerwiegende Folgen1; Dennoch gibt es derzeit keine wirksame Behandlung 1,2. Tierkontusionsmodelle sind eine der wichtigsten Methoden, um SCI 3,4 zu untersuchen.
Von 2004 bis 2014 4 wurden in 289 von 407 Studien Ratten (71%) und in 69 (16,9%) Mäuse als Modellorganismen verwendet. Tatsächlich hat der Anteil der Experimente mit Mäusen im Laufe der Jahre aufgrund ihrer Vorteile gegenüber anderen Modellen, insbesondere des großen Potenzials fürGenregulationsstudien 3,4,5, allmählich zugenommen. Daher sind kompatiblere Werkzeuge erforderlich, um mehr Studien mit der Maus als Modell durchzuführen, da der Modellkonsistenz große Bedeutung beigemessenwird 6. Die gängigen Geräte, über die in früheren Studien berichtet wurde, basieren im Wesentlichen auf Allens Rückenmark-Aufprallprinzip, zum Beispiel der grundlegende Gewichtsabnahme-Impaktor7,8, der New York University (NYU) / Multicenter Animal Spinal Cord Injury Studies (MASCIS) Impaktor1,9 und der Infinite Horizon (IH) Impaktor 10,11 . Der Weight-Drop-Impaktor und der NYU/MASCIS-Impaktor teilen das gleiche Prinzip, auf das Ziel-Rückenmark zu zielen und ein festes Gewicht aus verschiedenen Höhen fallen zu lassen, um unterschiedliche Verletzungsschwere zu erreichen. Der IH-Impaktor erzeugt die Rückenmarksverletzung nach unterschiedlichen Kräften.
Um die Verwendung des Mausmodells in SCI-Studien zu erleichtern und die Grundlage für wirksame Behandlungsmethoden zu schaffen, wird eine integrierte Plattform für Rückenmarksverletzungen entwickelt, die als Rückenmarksverletzungskoaxialplattform (SCICP) bezeichnet wird. Die Plattform besteht aus vier Hauptkomponenten: (1) einem Tieroperationstisch, der für eine geeignete Position für operierte Mäuse ausgelegt ist, der sehr kompakt ist und Komfort ohne Positionsbeschränkung bietet; (2) ein Mikroretraktor auf beiden Seiten, um die paravertebrale Muskulatur während des Betriebs zu halten; (3) ein Wirbelstabilisator, um den Wirbel vor dem Eingriff der Rückenmarksverletzung zu halten (zwei Wirbelstabilisatoren stehen für Operationen bei größeren Tieren wie Ratten zur Verfügung); (4) eine Hülse, eine Impaktorspitze, Gewichte und ein Zugbolzen. Die drei Teile sollten zu einem abnehmbaren X-Y-Z-Arm zusammengebaut werden. Für ein präzises Zielen wird eine Impaktorspitze auf die Oberfläche des Rückenmarks gelegt, und der X-Y-Z-Arm wird mit Hilfe der Markierung zwischen der Impaktorspitze und der Hülse sanft auf die erwartete Höhe abgesenkt. Die Impaktorspitze besteht aus einer 0,12 g schweren Aluminiumlegierung, um eine Schädigung des Rückenmarks zu vermeiden, die auf eine starke Gewichtskompression vor dem Eingriff zurückzuführen ist. Der Zugstift dient zum Halten der Gewichte auf der Oberseite des Ärmels, um den Gewichtsabfall vorzubereiten (Abbildung 1).
In früheren Studien wurde die Aufprallkraftverteilung anhand der Aufprallkraftdaten des IH-Geräts definiert, die 30 Kdyn, 50 Kdyn bzw. 70 Kdyn bzw. 6,10 betragen. Während des Forschungsprozesses wurden serielle Grade von SCI-Modellen auf Basis von SCICP nachgewiesen, die in verschiedenen Studien verwendet werden können. Daher wurden vor dem offiziellen Start des Experiments die Aufprallkräfte, die durch verschiedene Gewichte unterschiedlicher Massen erzeugt werden, mit einem Spitzendruckprüfgerät getestet. Als Ergebnis wurden drei standardisierte repräsentative SCI-Mausmodelle als drei verschiedene Verletzungsgrade ausgewählt, einschließlich der abgestuften leichten, mittelschweren und schweren Gruppen 6,10, und die Gewichte wurden auf der gleichen Höhe freigegeben, mit einem Gewicht von 1,3 g für leichte, 2,0 g für mittelschwere und 2,7 g für schwere Schäden.
Als weiteres Mittel zur Gewährleistung der Operabilität und Genauigkeit wird ein neuartiger und minimalinvasiver operativer Ansatz vorgestellt. Durch die Erforschung der Anatomie normaler Mäuse wird eine neue Methode gefunden, um den interspinösen Raum von T12-T13 zu lokalisieren. Die Methode der Wirbelortung in den Operationsschritten ist einfach zu beherrschen und genau, was eine präzise Lokalisierung bei minimalinvasiven Operationen gewährleistet.
Hoffentlich kann diese Technik der Prellungsverletzung die Erforschung und das Verständnis von Rückenmarksverletzungen unterstützen, einschließlich des Verständnisses der Pathophysiologie, der Managementbewertung und so weiter.
Protocol
HINWEIS: Alle Experimente wurden vom Ethik- und Tierschutzausschuss der Shandong University Cheeloo College of Medicine (Zulassungsnummer: 21L60) genehmigt und gemäß dem von den National Institutes of Health veröffentlichten Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren (NIH-Veröffentlichungen Nr. 85-23, überarbeitet 1996) durchgeführt.
1. Mechanismus der koaxialen Plattform für Rückenmarksverletzungen und mechanische Tests
- Montieren Sie die Plattform mit einem chirurgischen Operationstisch, einem Wirbelstabilisator und einer Impaktorspitze (Abbildung 1).
HINWEIS: Halten Sie die Gewichtsabfall- und Auslassschlitze, die verhindern, dass das Gewicht auf Luftströmungen trifft, sauber, da Schmutz auf dem Gewichtsabfall oder der Hülse die Präzision der Plattform beeinträchtigen kann. - Stecken Sie die Spitze, die eine genaue Lokalisierung des Rückenmarks ermöglicht, in die Hülse.
- Wählen Sie die richtigen Massen der Gewichtsabfälle für das Experiment aus, die 1,3 g, 2,0 g und 2,7 g für die leichten, mittelschweren und schweren Gruppen betragen.
- Stecken Sie den Zugstift in die Löcher des Gewichtsabfalls.
- Montieren Sie den Gewichtsabfall an der Oberseite der Hülse mit dem Zugbolzen, der in der Nut des X-Y-Z-Arms angebracht ist, so dass nach Abschluss der Lokalisierung das Gewicht freigegeben wird, um auf die Impaktorspitze zu treffen, wodurch das Rückenmark belastet wird und Veränderungen im Rückenmark unter dem Mikroskop beobachtet werden.
- Stellen Sie den abnehmbaren 0,1-mm-Präzisionsarm X-Y-Z ein, um dem Bediener einen angemessenen Arbeitsraum zu bieten (Abbildung 1D, E).
HINWEIS: Um die Konsistenz der Ergebnisse der Studie zu bestätigen, messen Sie vor Beginn des Experiments die Kraft, die entsteht, wenn das Gewicht in die Hülse fällt, mit einem Spitzendruckerkennungsgerät. Eine Wiederholung der Bestätigung ist für zukünftige Studien nicht notwendig. - Schalten Sie das Gerät ein, platzieren Sie den Metalldruckempfänger unter der Spitze, stellen Sie den Adapter auf Null, lösen Sie den Reißbolzen und zeichnen Sie die tatsächliche Aufprallkraft auf.
2. Lokalisierung und Laminektomie des 9. Brustwirbels (T9)
HINWEIS: Weibliche C57BL/6J-Mäuse im Alter von 9-10 Wochen wurden von der Jinan Pengyue Experimental Animal Company (Jinan, China) gekauft.
- Autoklavieren Sie eine Reihe von chirurgischen Instrumenten für das Experiment und sterilisieren Sie den Operationstisch vor der Operation mit 75% Alkohol.
- Injizieren Sie Buprenorphin zur Analgesie (0,05-2,0 mg/kg, SQ) 30 Minuten vor der Anästhesie bei Verletzungsoperationen. Dann betäuben Sie die Maus mit Isofluran (Induktion: ~ 3% -5%, Erhaltung: ~ 1,5% -2%). Überprüfen Sie, ob das Tier durch die Reflexe des Schwanz- oder Zehenkneifens vollständig betäubt ist. Sobald die Anästhesie wirksam ist, legen Sie die Maus in Bauchlage in einen bestimmten Teil des Operationstisches und beschichten Sie die Hornhaut mit Augensalbe (tragen Sie eine Augensalbe auf die Hornhaut auf, um die Augen während der Operation vor dem Austrocknen zu schützen).
- Rasieren Sie die Haare von der Schwanz- bis zur Rostralfrisur mit einem Elektrorasierer über der thorakolumbalen Wirbelsäule. Sterilisieren Sie die Haut mehrmals in kreisförmigen Bewegungen mit Iodophor für 30 s und gefolgt von 75% Alkohol. Tragen Sie einen sterilen chirurgischen Tuch auf und machen Sie mit Skalpell und Klinge einen Längsschnitt von ca. 1,5 cm auf der Haut von ca. T6 bis T13.
HINWEIS: Palpieren Sie entlang des Rippenrandes bis zur Mittellinie, wo sich der interspinöse Raum T12-T13 befindet. Machen Sie einen 1,5 cm langen Schnitt zum Rostral, und der Schnitt ist ungefähr bündig mit T6-T13-Wirbeln.
- Rasieren Sie die Haare von der Schwanz- bis zur Rostralfrisur mit einem Elektrorasierer über der thorakolumbalen Wirbelsäule. Sterilisieren Sie die Haut mehrmals in kreisförmigen Bewegungen mit Iodophor für 30 s und gefolgt von 75% Alkohol. Tragen Sie einen sterilen chirurgischen Tuch auf und machen Sie mit Skalpell und Klinge einen Längsschnitt von ca. 1,5 cm auf der Haut von ca. T6 bis T13.
- Untersuchen Sie die 13. Rippe auf einer Seite des knöchernen Anteils unter dem Operationsmikroskop. Erforschen Sie den Dornfortsatz in der Mittellinie, indem Sie leicht den Bereich des costovertebralen Winkels und dann in Richtung Rostral berühren, um den interspinösen Raum des T12-T13 zu lokalisieren. Erkunden Sie den interspinösen Raum des T9-T10 vom Raum des T12-T13 bis zur rostralen Seite. (Abbildung 2A, 3A)
- Zerlegen Sie den paraspinalen Muskel entlang des Dornfortsatzes des T9 bis zu den vorderen und hinteren Facettengelenken beider Seiten mit einer Mikroschere (Abbildung 3B). Ziehen Sie die paraspinale Muskulatur mit Mikroretraktoren zurück und reinigen Sie das Weichgewebe an der Lamina und im interspinösen Raum des T8-T9 und T9-T10 mit einer Mikroschere.
- Führen Sie eine T9-Laminektomie durch, klemmen Sie den Dornfortsatz von T9 mit einer mikrochirurgischen Pinzette, heben Sie ihn leicht an, führen Sie die Mikroschere parallel entlang der rechten dorsolateralen Seite der Lamina ein, um eine Schädigung des Rückenmarks zu vermeiden, und schneiden Sie die Lamina mit einer Mikroschere ab. Wiederholen Sie dies auf der linken Seite, und das Rückenmark kann freigelegt werden (Abbildung 2B, 3C).
- Bevor Sie den Wirbel fixieren, lösen Sie den Universalarm und klemmen Sie langsam die 9. bis 10. Facettengelenke auf beiden Seiten des Wirbels mit der Mikromückenzange des Wirbelstabilisators ein. Ziehen Sie die Schrauben an der Mikromückenzange an, und der Wirbel wird so stabilisiert. Stellen Sie das Rückenmark auf die horizontale Ebene ein, ziehen Sie den universellen Arm an, und der Wirbel wird fixiert (Abbildung 3D).
3. T9 Prellungsverletzung
- Sobald das Rückenmark auf T9-Ebene freigelegt und der Wirbel fixiert ist, zielen Sie mit der Spitze in der Hülse unter dem Operationsmikroskop auf das Rückenmark (Abbildung 3E).
- Überprüfen Sie, ob die Oberfläche der Spitze parallel zum Rückenmark von den hinteren und lateralen Aspekten des Rückenmarks ist, da es leicht ist, die Beziehung zwischen dem Rückenmark und der Spitze unter dem Mikroskop zu beobachten, und dass der Operationstisch leicht gedreht werden kann.
- Überprüfen Sie, ob die Oberfläche der Spitze parallel zu den bilateralen Rändern der verschonten Lamina ist, bevor die Spitze nach der Laminektomie mit dem Rückenmark in Kontakt kommt, da es sich um eine natürliche Bezugsebene parallel zum Rückenmark handelt.
- Nachdem Sie den Zwischenraum des T12-T13 lokalisiert haben, senken Sie die Hülse ab, bis das Ende des Impaktors mit der Markierung auf dem Beobachtungsfenster übereinstimmt und die angegebene Höhe von 22 mm erreicht ist. Ziehen Sie den Zugstift heraus, um das Gewicht freizugeben (1,3 g, 2,0 g oder 2,7 g je nach Gruppe, wobei jede Gruppe 3 Mäuse enthält und jede Gruppe eine Maus für jeden Zeitpunkt hat).
HINWEIS: Das Rückenmark sollte parallel zum Boden und senkrecht zur Spitze verlaufen. Bewegen Sie den OP-Tisch, um das mikroskopische Gesichtsfeld zu gewährleisten, da der Tisch sehr kompakt ist. - Entfernen Sie den Impaktor, wenn die Prellung abgeschlossen ist, und beobachten Sie den Grad der Rückenmarksverletzung unter dem Operationsmikroskop. In der milden Gruppe ist eine hellrote Farbveränderung zu sehen, während in der moderaten Gruppe die Verletzungsstelle in 3-4 s dunkelrot ist und möglicherweise Eminenz beobachtet werden kann. In der schweren Gruppe können die dunkelroten Manifestationen sofort auftreten, und eine offensichtliche Eminenz in der Dura manifestiert sich, aber die Dura ist immer noch in einer konsistenten Form (Abbildung 3F).
- Vernähen Sie die oberflächlichen Faszien und die Haut mit Nähten (nicht resorbierbare Polypropylen-Naht, Größe: 6-0).
- Nach Abschluss der Naht sterilisieren Sie den Operationsbereich, legen Sie die Maus auf ein temperaturgesteuertes Pad, bis das volle Bewusstsein wiederhergestellt ist, und setzen Sie die Maus dann in die Mauskäfige.
4. Tierpflege
- Legen Sie das Tier zur Erholung auf das Heizkissen und beobachten Sie die Bewegung beider Hinterbeine.
HINWEIS: Tiere, die sich einer Operation unterzogen haben, sollten nicht in Begleitung anderer Tiere zurückgegeben werden, bis sie sich vollständig erholt haben. - Legen Sie eine Hochwasserdiät auf den Käfigboden, damit die Tiere das Futter leicht erreichen können. Alternativ können Sie einen Käfig mit einem niedrigeren Fütterungstisch verwenden.
- Entleeren Sie die Blasen der Mäuse zweimal täglich nach der Operation, da es für die mittelschweren und schweren Verletzungsgruppen schwierig ist, die Blasenfunktion wiederherzustellen. Injizieren Sie Buprenorphin gegen Analgesie (0,05-2,0 mg / kg, SQ) 8-12 h / Tag für 3 Tage.
5. Transkardiale Perfusion, Färbung und Immunfärbung
- Am 1., 28. und 56. Tag nach der Verletzung opfern Sie jeweils eine Maus jeder Gruppe durch Perfusion.
- Perfundierten Sie die Mäuse mit 60 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und 20 ml 4% Paraformaldehyd nach übermäßiger Anästhesie (4% -6% Isofluran).
- Sammeln Sie die Wirbelsäule mit einer Mikroschere, die sich rostral bzw. kaudal 1 cm vom Läsionszentrum erstreckt.
- Sezieren Sie die überschüssigen Muskeln, reservieren Sie intakte Wirbelsäulensegmente mit Teilrippen für Instrumente, die in Schritt 5.1.4 gehalten werden können, und weichen Sie sie 24 Stunden lang in 4% Paraformaldehyd ein.
- Klemmen Sie die Rippen zur Fixierung mit einer hämostatischen Pinzette und definieren Sie das Läsionszentrum unter dem Mikroskop entsprechend der resezierten Lamina und der Farbveränderung im Läsionszentrum des Rückenmarks.
- Schneiden Sie alle Laminae und Gelenkfortsätze mit einer Mikroschere aus dem Schwanz.
- Schneiden Sie die Nervenwurzeln mit einer Mikroschere ab und nehmen Sie das Rückenmark heraus.
- Sammeln Sie 0,5 cm des Rückenmarks, das sich kaudal bzw. rostral vom Läsionszentrum aus erstreckt, mit einer Mikroschere.
- Das Rückenmark wird 48 h lang bei 4 °C in 30%ige Saccharose eingelegt.
- Schneiden Sie die Gewebe nach dem Einfrieren je nach histologischem Untersuchungstyp in 6 μm dicke Abschnitte.
- Führen Sie eine Hämatoxylin- und Eosin-Färbung (H & E) durch.
- Erwärmen Sie die Abschnitte erneut auf Raumtemperatur und weichen Sie die 6 μm dicken Abschnitte in 4% Formaldehyd für ca. 15 min ein, gefolgt von 1x PBS für 1 min viermal, um Rest-OCT zu entfernen.
- Färben Sie die Abschnitte 90 s lang mit Hämatoxylin und spülen Sie sie mit doppelt destilliertem Wasser ab.
- Dann waschen Sie die Abschnitte mit fließendem Wasser für 3 min.
- 4 min mit Eosin einfärben und zweimal 30 s in 95% Alkohol einweichen, um überschüssiges Eosin abzuspülen.
- Zum Schluss mit Gradientenalkohol (95% Alkohol und 50% Alkohol einmal, nacheinander) für 30 s dehydrieren und 2 min in Xylol einweichen. Anschließend verschließen Sie die Proben mit Harzgel (koronaler Ebenenschnitt: Abbildung 4; sagittaler Ebenenschnitt: Abbildung 5).
- Führen Sie eine Immunfluoreszenzfärbung durch.
- Erwärmen Sie die Abschnitte erneut auf Raumtemperatur und weichen Sie die 6 μm dicken Abschnitte in 4% Formaldehyd für ca. 2 min ein.
- Waschen Sie die Abschnitte in TBST für 5 min für dreimal.
- Inkubieren Sie die Schnitte mit Blockierlösung (10% normales Ziegenserum in PBS) und blockieren Sie für 1 h, um die unspezifische Bindung von Immunglobulin zu blockieren.
- Inkubieren Sie die Rückenmarksabschnitte über Nacht bei 4 °C mit dem sauren sauren Protein der Maus (GFAP, ein Marker für reaktive Astrozyten), dem polyklonalen Antikörper (1:600) und dem Kaninchen-Anti-NF200-Antikörper (1:2000), einem Marker für Neurofilamente in 0,4 ml Blocklösung.
- Spülen Sie die Abschnitte mit PBS und fügen Sie 0,4 ml Blockierungslösung mit Ziegen-Anti-Kaninchen-Alexa 594-konjugiertem IgG (1:1.000) und Ziegen-Anti-Maus-Alexa 488-konjugierten IgG-Sekundärantikörpern (1:1.000) für 1 h bei Raumtemperatur hinzu.
- Nehmen Sie Bilder mit einem Fluoreszenzmikroskop in 10-facher Geschwindigkeit durch automatische Panoramaabtastung bei Wellenlängen von 594 nm bzw. 488 nm auf (Abbildung 6).
- Schalten Sie das Fluoreszenzmikroskop ein, legen Sie den Objektträger auf den Mikroskoptisch, wechseln Sie in den Fluoreszenzkanal, verwenden Sie die Positionierungstaste, um drei bis vier Punkte auf dem Gewebe zu positionieren, und fokussieren Sie, um die Aufnahme abzuschließen. Speichern Sie nach Abschluss der Aufnahme die Bilder der verschiedenen Kanäle im gewünschten Format und speichern Sie dann das zusammengeführte Bild.
Representative Results
Um die Präzision des Gerätes zu testen, wurde die Kraft, die drei verschiedene Gewichtsmassen aus der gleichen Höhe erzeugten, mit einem Spitzendruckprüfgerät gemessen. Vierundzwanzig Versuche wurden mit unterschiedlichen Gewichtsgruppen durchgeführt, was zu (mittleren ± SD) 0,323 N ± 0,02 N für 1,3 g Gewichte, 0,543 N ± 0,15 N für 2,0 g Gewichte und 0,723 N ± 0,26 N für 2,7 g Gewichte ergab (Abbildung 7). Frühere Studien verwendeten Dyn (Dyn) oder Kilodyn (Kdyn) als Einheiten, um die Kontusionsintensitäten zu messen. Zum besseren Vergleich mit früheren Studien werden die Umrechnungen zwischen Newton (N) und Dyn/Kilodyn aufgelistet (1 N = 1 kg × 1 m/s 2 = 1 × 10 3 g × 1 × 100 cm/s2 = 1 × 105 dyn; 0,323 N = 32,3 Kdyn; 0,543 N = 54,3 Kdyn; 0,723 N = 72,3 Kdyn).
Tabelle 1 und Abbildung 4 zeigen Daten der Läsionen der leichten, mittelschweren und schweren Gruppen auf koronalen Abschnitten. Abbildung 4 nach zu urteilen, nahm am 28. Tag nach der Verletzung die Kontinuität der unterscheidbaren Grenzen der grauen und weißen Substanz in den leichten, mittelschweren und schweren Gruppen sukzessive ab, wobei der Bereich des Narbengewebes größer wurde und ein zunehmender Anteil am Querschnitt des Läsionszentrums bestand. Es gab offensichtliche morphologische Unterschiede in allen Versuchsgruppen im Vergleich zur Normalgruppe. Dies bewies die Rationalität der Aufteilung der Verletzungsgrade in den Versuchsgruppen.
Tabelle 2 und Abbildung 5 beschreiben die Verletzung des Rückenmarks am 1. und 56. Tag nach der Verletzung an sagittalen Abschnitten. Es ist ersichtlich, dass der Bereich der Läsion am 1. Tag nach der Verletzung von den leichten bis zu schweren Gruppen allmählich signifikant zunahm. In der Zwischenzeit war die Kontinuität der weißen Substanz auf beiden Seiten des Rückenmarks in der milden Gruppe besser, mit beobachtbaren kleinen runden Vakuolen, die die Merkmale von interstitiellen Ödemen sind. In der moderaten Gruppe zeigte die weiße Substanz eine schlechte Kontinuität und die Struktur der ventralen weißen Substanz war nicht geordnet. In der schweren Gruppe zeigte die ventrale weiße Substanz eine stärkere Störung, und ein großer Bereich der Höhle erschien in der Mitte der Verletzung. Darüber hinaus zeigte das umgebende Gewebe eine offensichtliche Füllung der roten Blutkörperchen, und die roten Blutkörperchen in der Nähe des zentralen Kanals sammelten sich in Streifen. Am 56. Tag nach der Verletzung wurde eine Narbenbildung im Verletzungszentrum der drei Gruppen beobachtet, deren Fläche mit der Schwere der Verletzung zunahm.
Die Integrität des Rückenmarksneurofilaments am 56. Tag nach der Verletzung kann auch aus der Analyse der Ergebnisse der Immunfluoreszenzfärbung abgeleitet werden (Abbildung 6). Die Abbildung zeigt auch, dass überlappende narbenbildende Astrozyten in der Mitte aller drei Gruppen von Verletzungen sichtbar waren, wobei die Länge des Verletzungsbereichs mit der Schwere der Verletzung zunahm, während der Narbendurchmesser abnahm. Dies deutet auf das Vorhandensein einer Narbenkontraktur hin, die zu einer Abnahme des Rückenmarksdurchmessers führen kann.
Abbildung 1: Eine ganze Ausstellung und Teile der koaxialen Plattform für Rückenmarksverletzungen . (A) Der X-Y-Z-Arm und der Operationstisch können getrennt werden, so dass ausreichend Platz für den Operationsvorgang bleibt, bei dem das Rückenmark eines kleinen Tieres freigelegt wird. Der Operationstisch kann während des Betriebs frei bewegt werden, wodurch mögliche Bedienungsschwierigkeiten, die auf Positionsbeschränkungen zurückzuführen sind, reduziert werden. Der Körper des Wirbelstabilisators verfügt über einen dreigelenkigen Universalarm zur Richtungsunterstützung, der seine Flexibilität erhöht. (B) Setzen Sie die Impaktorspitze in die Hülse ein und montieren Sie diese in den X-Y-Z-Arm. Stecken Sie die Spitze des Zugbolzens in die Löcher des Gewichts, um zu verhindern, dass das Gewicht herunterfällt, und legen Sie das Gewicht in die Hülse. Wenn die Teile zusammengebaut sind, lokalisieren Sie den gezielten Verletzungsbereich unter dem Mikroskop. Senken Sie dann den X-Y-Z-Arm, bis das Ende der Impaktorspitze mit der unteren Ebene des Beobachtungsfensters übereinstimmt, was anzeigt, dass eine einheitliche Prellungshöhe erreicht wurde (die Höhe zwischen dem Gewicht und der Impaktorspitze beträgt 22 mm, wenn der Sturz beginnt). Ziehen Sie den Zugstift, und der Aufprall ist erledigt. (C) Nachdem der verletzte Bereich freigelegt wurde, verwenden Sie die Clips, um die Wirbelsäule der Maus und den Anzugsbolzen zu klemmen und zu fixieren, um den Wirbelstabilisator zu stabilisieren. (D) Empfohlene Funktionen für Rillen auf dem Operationstisch. Das Versuchstier soll in die mittlere Rille gesetzt werden, mit dem Kopf in Richtung des vorderen Brustkorbs am Hang. Der X-Y-Z-Arm ist vom OP-Tisch getrennt. (E) Anzeige des zusammengebauten SCICP. Pfeile kennzeichnen die Teile. Wenn die Spitze auf den Zielkontusionsbereich zielt, um die Prellung zu starten, ziehen Sie den Zugstift heraus, und das Gewicht fällt auf die Impaktorspitze, um das Rückenmark zu konstruieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Ein bildgebendes Diagramm der T13-Methode zur Lokalisierung der Costovertebra-Wirbel . (A) Die 13. Rippe und T13 sind relativ konstante anatomische Strukturen. Der T13-Costovertebralenwinkel kann leicht unter dem Mikroskop erkannt werden, von dem aus der Bediener in Richtung des Dornfortsatzes sondieren und den T12-T13-Zwischenraum finden kann. Untersuchen Sie dann nacheinander die rostrale Seite, um den Zielverletzungswirbel (z. B. T9) zu finden. (B) Eine minimal-invasive 9. thorakale Laminektomie kann ausreichende Lamellen und Facettengelenke zwischen benachbarten Wirbelkörpern erhalten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Exposition und Kontusion des Rückenmarks auf T9-Ebene bei Mäusen . (A) Untersuchen Sie den T13-Costovertebralenwinkel. (B) Legen Sie den T9 frei, während der paraspinale Muskel durch Mikroretraktoren eingezogen ist, um ausreichend Platz für den Betrieb zu schaffen. (C) Führen Sie eine T9-Laminektomie mit einer Mikroschere durch. (D) Stabilisieren Sie den Wirbel mit den Clips des Wirbelstabilisators. (E) Mit der Schlagkörperspitze auf den Zielbereich der Kontusion zielen. (F) Ödeme und Stauungen werden im Verletzungsbereich nach einer Prellung festgestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Repräsentative Schnitte am 28. Tag nach unterschiedlich schwerem Auftreten von Rückenmarksverletzung bei Mäusen (koronale Schnitte). (A) Normales thorakales Rückenmark der Maus. Maßstabsbalken = 500 μm. (B) Bei der milden Gruppe kann eine leichte Verletzung im dorsalen Bereich des Rückenmarks festgestellt werden, während die Morphologie der verschonten weißen Substanz und der grauen Substanz im Wesentlichen erhalten bleibt. (C) Bei der mittelschweren Gruppe wird offensichtliches Narbengewebe im Rückenmark beobachtet (gekennzeichnet durch das rote Sternchen). Die Unterscheidungsmerkmale zwischen weißer und grauer Substanz sind kaum zu unterscheiden. (D) Im Vergleich dazu hat das Rückenmark der schweren Gruppe fast seine ursprüngliche Morphologie verloren und ist fast durch Narbengewebe ersetzt worden. Die grüne gestrichelte Linie zeigt den Schadensbereich an, und die schwarze gestrichelte Linie zeigt die Grenze der beobachtbaren grauen Substanz an. Als die Schwere der Verletzung zunahm, erschien eine größere Läsion und eine weniger verschonte Struktur im Rückenmark der Maus, wobei der Rand der grauen Substanz kaum zu unterscheiden war. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Repräsentative Schnitte am 1. und 56. Tag nach Verletzung des Rückenmarks von Mäusen (sagittale Schnitte). (A) Normales thorakales Rückenmark der Maus. (B) B1-B3 repräsentieren jeweils das Rückenmark am 1. Tag nach der Verletzung in den leichten, mittelschweren und schweren Gruppen. Es ist zu sehen, dass mit zunehmender Schädigung ein größerer Bereich im Läsionszentrum gestört oder verflüssigt wurde. Die Kontinuität der weißen Substanz im ventralen Rückenmark unterschied sich aufgrund unterschiedlicher Verletzungsintensitäten. B1 zeigt, dass die weiße Substanz im ventralen Rückenmark eine bessere Kontinuität mit leichten Ödemen aufweist. B2 zeigt eine schlechtere Kontinuität der weißen Substanz im ventralen Rückenmark und ein schwereres Ödem. Das Gewebe in der Mitte der B3-Rückenmarksverletzung hat fast die gesamte Kontinuität verloren, und es gibt ausgedehnte Ödeme im Bereich außerhalb des Zentrums der Verletzung. (C) C1-C3 repräsentieren das Rückenmark am 56. Tag nach der Verletzung in den leichten, mittelschweren und schweren Gruppen. Unterschiedliche Grade der Narbenkontraktur manifestierten sich im Verletzungszentrum zwischen verschiedenen Gruppen, und es gab einen signifikanten Unterschied im Durchmesser des Verletzungsbereichs. Maßstabsbalken = 500 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 6: Repräsentative Schnitte am 56. Tag nach Verletzung des Rückenmarks bei Mäusen (sagittale Schnitte). (A) Repräsentativer Abschnitt der milden Gruppe. NF200 zeigt das Neurofilament an, während GFAP Astrozyten anzeigt. Überlappende Astrozyten werden im Epizentrum der Läsion beobachtet, während das Neurofilament im ventralen Teil des Rückenmarks in guter Kontinuität ist. (B) Repräsentativer Teil der gemäßigten Fraktion. Neben überlappenden Astrozyten können zwei Narbenzentren beobachtet werden (gekennzeichnet durch rote Sternchen), während das Neurofilament im ventralen Aspekt Kontinuität aufweist. (C) Repräsentativer Abschnitt der schweren Gruppe mit einem großen Läsionsbereich und massiven narbenbildenden Astrozyten. Es wird kein offensichtliches Narbenzentrum beobachtet, und das Neurofilament hat eine schlechte Kontinuität. Maßstabsbalken= 500 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 7: Kraft, die aus gleicher Höhe, aber mit unterschiedlichen Gewichten erzeugt wird. Vor dem Experiment wurde die Kraft, die durch verschiedene Massen von Gewichten erzeugt wird, die aus der gleichen Höhe freigesetzt werden, mit einem Spitzendruckmessgerät erfasst. Nachdem jede Gruppe 24 Detektionen abgeschlossen hatte, wurden zuverlässigere Schwerkraftdaten für die Referenz der Schlagkraft erhalten. Die Daten wurden mit der Statistiksoftware SPSS19.0 ausgewertet. Die Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt, n = 24 in jeder Gruppe. Vergleiche zwischen mehreren Gruppen basierten auf einer einseitigen Varianzanalyse (ANOVA), die zum Testen der Unterschiede verwendet wurde. p < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| 28 dpi | |||
| Gruppe | GMR (%) | WMR (%) | DZ (%) |
| Normal | 35.44 | 64.57 | 0 |
| Leicht | 11.59 | 64.88 | 23.53 |
| Mäßig | 0 | 41.14 | 58.86 |
| Schwer | 0 | 0 | 100 |
Tabelle 1: Rate der weißen Substanz, der grauen Substanz und der Schäden am 28. Tag nach der Verletzung. Abkürzungen: dpi = Tage nach der Verletzung, DA = beschädigte Stelle; GMR = Rate der grauen Substanz; WMR = Rate der weißen Substanz; DR = Schadensrate.
| Gruppe | 1 dpi DA (μm2) | 56 dpi DA (μm2) |
| Normal | 0 | 0 |
| Leicht | 2391250 | 666091 |
| Mäßig | 4383381 | 1263191 |
| Schwer | 5118833 | 1943962 |
Tabelle 2: Vergleiche zwischen der Läsion auf sagittalen Abschnitten am 1. und 56. Tag nach der Verletzung.
Discussion
Durch das standardisierte Verfahren können insbesondere in Kleintierversuchen stabile Daten gewonnen werden, die die Abweichung der Ergebnisse durch individuelle Unterschiede zwischen den Tieren minimieren können. Basierend auf den oben genannten Bedingungen und geeigneten Anwendungsinstrumenten können standardisierte, minimal-invasive, genaue und wiederholbare SCI-Modelle erstellt werden.
Aufgrund seiner Praktikabilität und Bequemlichkeit wurde bisher meist der Gewichtsverlust-Impaktor verwendet3. Der in dieser Studie vorgestellte Impaktor teilt das gleiche Prinzip wie Allens Modell12. Glücklicherweise entwarf das Forschungsteam aufgrund der präzisen Fertigungsvorteile der modernen Bearbeitungstechnologie einen Gewichtsabfall-Impaktor mit den Vorteilen, dass er einfach zu bedienen, stark stabil und selten ungenau ist. Ein Spitzendruckmessgerät wurde verwendet, um die Schwerkraft verschiedener Gewichte zu messen. Frühere Studien6,10 über den Infinite Horizons-Impaktor berichteten, dass ein von der beabsichtigten Kraft abweichender Kraftbereich von ±5 Kdyn in den Gruppen 30 Kdyn, 50 Kdyn und 70 Kdyn akzeptiert wird, was eine Referenz für die vorliegende Studie in Bezug auf die Gruppenteilung und die Auswahl des Kontusionsgrades darstellt. In der vorliegenden Forschung wurde die mögliche Kraft verschiedener Gruppen im Voraus gemessen und genauere Daten erhalten.
Wichtiger als das Gerät im Tiermodellversuch ist das Verständnis und die Nutzung der Anatomie der Maus. Durch die gute Nutzung der Anatomie können Eingriffe minimal-invasiv durchgeführt werden. Die minimal-invasive Chirurgie wirkt sich direkt auf die Stabilität des Funktionszustandes des Versuchstieres und die Konsistenz der anschließenden Erholung der Maus aus. Frühere Studien haben gezeigt, dass die minimal-invasive Etablierung von SCI-Modellen die Stabilität der Wirbelstruktur erhöht und zusätzliche Schäden durch Wirbelsäuleninstabilität während der Genesung bei Ratten vermeidet1. Die Prämisse der minimal-invasiven Chirurgie ist die sinnvolle Nutzung natürlicher anatomischer Strukturen. Daher sollte die schnelle und präzise Lokalisierung von Rückenmarkssegmenten in Übereinstimmung mit der anatomischen Struktur von Mäusen erfolgen. Wie berichtet, wurde das bildgebende Verfahren verwendet, um den Wirbel13 zu finden. Obwohl es eine hohe Genauigkeit aufweist, hat das bildgebende Verfahren zur Lokalisierung im eigentlichen experimentellen Betriebsprozess die Nachteile einer unbequemen Bedienung, einer langen Betriebszeit, einer komplexen Gerätebeschaffung und hoher Anforderungen an die Gerätegenauigkeit. McDonough et al. beschrieben, dass das T7 durch die unteren Winkel der Schulterblätter14 lokalisiert wird, während Mäuse in einer Liege auf dem Boden liegen, so dass die genannten unteren Winkel hintere Winkel sein sollen. Darüber hinaus ist die Verwendung der unteren Schulterblattspitzen zum Auffinden des T7 eine Ortungsmethode für eine bestimmte Position in der menschlichen Anatomie15, die für Mäuse nicht geeignet ist. Schließlich bestätigten die Mikro-CT-Daten auch die Hypothese, dass die hinteren Winkel der Schulterblätter nicht bündig mit T7 sind, unabhängig davon, ob sich die Maus in ihrer natürlichen oder spezifischen Körperposition befindet. McDonough et al.14 erwähnten auch, den höchsten Punkt des Rückens zu lokalisieren, wenn die Maus gewölbt ist, und den höchsten Punkt als T12 zu definieren. Im Vergleich dazu wird das T9 in der vorliegenden Forschung mit Hilfe des interspinösen Raums T12-T13 lokalisiert, der weder mit der Haltung der Maus verbunden ist noch von ihr beeinflusst wird. Außerdem kann mit dieser Methode der Zielwirbel leicht lokalisiert und operiert werden. Man sollte die 13. Rippe unter dem Mikroskop untersuchen, sanft den Bereich des Costovertebralenwinkels berühren, eine Linie in Richtung des Dornfortsatzes ziehen und dann den Raum zwischen den Dornfortsätzen des T12-T13 in Richtung des Kopfes untersuchen. Das Forschungsteam nutzte den interspinösen Raum T12-T13, um das T9 von 12 Mäusen zu lokalisieren. Schließlich hatten 12 weibliche C57BL / 6J-Mäuse einen Mikro-CT-Scan nach der T9-Lokalisation und Laminektomie. Das Ergebnis des Mikro-CT-Scans zeigte, dass die entfernten Laminae bei allen 12 Mäusen T9 waren. Die Ergebnisse der Mikro-CT zeigten, dass alle T9 genau lokalisiert wurden und die Genauigkeit signifikant höher war als bei der Schulterblattlokalisierungsmethode. Diese Methode bietet uns eine schnelle und genaue Möglichkeit zur Lokalisierung, was zur Konsistenz des Verletzungsmodells beiträgt.
Die minimale Invasivität des vorliegenden Protokolls ist vor allem in drei Aspekten ausgeprägt. Erstens werden die paraspinalen Muskeln auf der T9-Ebene nach der Lokalisierung nur durch Mikroretraktoren zurückgezogen, ohne die Muskeln auf der T8- oder T10-Ebene zu schädigen. Außerdem stört die Exposition der Lamina durch die Mikroretraktoren das Gesichtsfeld nicht. Zweitens ist der Blutverlust, der hauptsächlich auf eine Laminektomie zurückzuführen ist, die einen Blutabfluss aus dem spongiösen Knochen verursachen kann, im Operationsverfahren sehr gering, fast nicht mehr als das Volumen, um ein dreieckiges Stück Baumwolle von 2 mm x 2 mm x 3 mm zu färben. Drittens wurde die Laminektomie so weit wie möglich auf den benötigten Bereich beschränkt, wobei die Kontinuität des lateralen Teils der Lamina aufrechterhalten und die Wirbelinstabilität stark abgeschwächt wurde. Im Vergleich zu früheren Protokollen16,17 reduziert das vorliegende Protokoll viel unnötigen Schaden.
Um die unterschiedlichen Grade der Rückenmarksverletzung zu bewerten, wurden die Ergebnisse zwischen allen Gruppen in der Histopathologie mit dem verglichen, was frühere Studien bereits gezeigt haben 9,11,18. Diese Ergebnisse reichen aus, um eine Beobachtungsstudie zu unterschiedlichen Verletzungsgraden und Veränderungen in verschiedenen Zeiträumen durchzuführen. HE und Immunfluoreszenz zeigten, dass mit zunehmender Schwere der Rückenmarksverletzung mehr abnorme Morphologie im Rückenmarksgewebe auftrat, und die Zunahme des Grades der Schädigung führte auch zu einer Zunahme des Grades der strukturellen Störung des Rückenmarks. Aus der Perspektive der Gewebemorphologiebeobachtung stimmen der Grad und die Regelmäßigkeit der Veränderungen der Gewebemorphologie in jeder Versuchsgruppe in dieser Studie in hohem Maße mit früheren Studien überein.
Nach den aktuellen histologischen Testergebnissen sind deutliche Veränderungen verschiedener Indikatoren nach unterschiedlich starken traumatischen Querschnittlähmungen indiziert, was die Zuverlässigkeit des in dieser Studie etablierten Modells weiter bestätigt.
So genau und effektiv die Technik auch ist, es könnten potenzielle Einschränkungen für die Methoden bestehen. In Bezug auf die Laminektomie sollte der Bediener mit Operationen unter dem Mikroskop vertraut sein, um zu verhindern, dass das Rückenmark versehentlich beschädigt wird. Auch der Aufbau der gesamten Plattform basiert auf mechanischen Strukturen, was im Vergleich zu automatisierten Geräten eine höhere Anforderung an den Bediener stellt. In der Tat können alle genannten Probleme durch wiederholtes Training der Operation verbessert werden.
Es ist ersichtlich, dass eine minimalinvasive und standardisierte Modellierung von Vorteil ist, um die Ergebnisse einheitlicher, stabiler und wiederholbarer zu machen, die Wirksamkeit verschiedener Behandlungspläne genau zu bewerten und den Forschungsplan für traumatische Rückenmarksverletzungen zu optimieren.
Disclosures
Professor Shiqing Feng ist Eigentümer der koaxialen Plattform für Rückenmarksverletzungen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch das State Key Program of National Natural Science of China (81930070) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% fixative solution | Solarbio | P1110 | 4% |
| Anti-Neurofilament heavy polypeptide antibody | abcam | ab8135 | Dilution ratio (1: 2000) |
| Eosin Staining Solution (water soluble) | biosharp | BL727B | |
| Ethanol | Fuyu Reagent | 64-17-5 | |
| Fluorescent microscope | KEYENCE | BZ-X800 | |
| Frozen Slicer | leica | CM3050 S | |
| GFAP (GA5) Mouse mAb | Cell Signaling TECHNOLOGY | #3670 | Dilution ratio (1: 600) |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | ThermoFisher SCIENTIFIC | A32723TR | Dilution ratio (1: 1000) |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 594 | ThermoFisher SCIENTIFIC | A32740 | Dilution ratio (1: 1000) |
| Hematoxylin Staining Solution | biosharp | BL702A | |
| Mice | Jinan Pengyue Experimental AnimalCompany | C57BL/6J | |
| Microsurgery apparatus | Shandong ULT Biotechnology Co., Ltd | All the surgey instruments are custom-made | Ophthalmic scissors, micro mosquito forceps, microsurgery forceps, micro scissors |
| Normal sheep serum for blocking (working solution) | Zhong Shan Jin Qiao | ZLI-9022 | working solution |
| O.C.T. Compound | SAKURA | 4583 | |
| PBS (phosphate buffered solution) | Solarbio | P1020 | pH 7.2-7.4 |
| RWD Laboratory inhalation anesthetic station | RWD Life Science Co., Ltd | R550 | |
| Small animal in vivo microCT imaging system | PerkinElmer | Quantum GX2 | |
| Spinal cord injury coaxial platform | Shandong ULT Biotechnology Co., Ltd | Custom-made(Feng's standard) | (https://shop43957633.m.youzan.com/wscgoods/detail/367x5ovgn69q18g?banner_id=f.81386274~goods.7~1~ b0yRFKOq&alg_id=0&slg=tagGood List-default%2COpBottom%2Cuuid %2CabTraceId&components_style_ layout=1&reft=1659409105184&sp m=g.930111970_f.81386274&alias =367x5ovgn69q18g&from_uuid=136 2cc46-ffe0-6886-2c65-01903dbacbb a&sf=qq_sm&is_share=1&shopAuto Enter=1&share_cmpt=native_ wechat&is_silence_auth=1) |
| Surgery microscope | Zumax Medical Co., Ltd. | zumax, OMS2355 | |
| TBST (Tris Buffered Saline+Tween) | Solarbio | T1082 | Dilution ratio (1: 19) |
| Xylene | Fuyu Reagent | 1330-20-7 |
References
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