Summary
微创技术和简单的实验室设备通过减少对实验动物的手术损伤并允许解剖形态维持来提高脊髓损伤模型的可重复性。该方法是值得的，因为可靠的结果和可重复的程序有助于研究疾病修复的机制。
Abstract
使用微创方法模拟脊髓损伤（SCI）可以最大限度地减少实验动物之间的行为和组织学差异，从而提高实验的可重复性。
这些方法需要满足两个要求：手术解剖路径的清晰性和实验室设备的简单性和便利性。对于操作者来说至关重要的是，清晰的解剖通路提供了微创暴露，避免了在外科手术过程中对实验动物的额外伤害，并使动物在实验过程中保持一致和稳定的解剖形态。
本研究利用一种名为SCI同轴平台的小动物脊髓损伤综合平台，以微创方式暴露T9水平脊髓，利用椎体稳定器稳定和固定小鼠的椎骨，最后采用同轴重力冲击器对小鼠脊髓进行震荡，以接近不同程度的T9脊髓损伤。最后，提供组织学结果供读者参考。
Introduction
创伤性脊髓损伤（SCI）容易使个人遭受严重后果1;然而，目前还没有有效的治疗方法1，2。动物挫伤模型是研究SCI3，4的主要方法之一。
从2004年到2014年4，在407项研究中有289项（71%）将大鼠用作模式生物，在69项研究中将小鼠用作模型生物（16.9%）。事实上，多年来，由于小鼠优于其他模型的优势，特别是基因调控研究的巨大潜力，小鼠实验的比例逐渐增加3，4，5。因此，由于非常重视模型一致性6，因此需要更多兼容的工具才能使用鼠标作为模型进行更多研究。以往研究中报道的常见装置基本上都是基于艾伦的脊髓撞击原理，例如，基本的重量下降撞击器7，8，纽约大学（NYU）/多中心动物脊髓损伤研究（MASCIS）撞击器1，9和无限地平线（IH）撞击器10，11.重量下降冲击器和NYU/MASCIS撞击器具有相同的原理，即瞄准目标脊髓并从不同高度下降固定重量以产生不同的伤害严重程度。IH撞击器根据不同的力产生脊髓损伤。
为了方便在SCI研究中使用小鼠模型并为有效的治疗方法奠定基础，开发了一种集成的小鼠脊髓冲击损伤平台，称为脊髓损伤同轴平台（SCICP）。该平台由四个主要部件组成：（1）动物手术台，专为手术小鼠的合适位置而设计，非常紧凑，提供便利，没有位置限制;（2）两侧有微型牵开器，用于在手术过程中固定椎旁肌肉;（3）在SCI手术前固定椎骨的椎体稳定器（两个椎体稳定器可用于大鼠等较大的动物）;（4）套筒、冲击器尖端、砝码和拉销。这三个部件应组装到可拆卸的 X-Y-Z 臂上。为了精确瞄准，将冲击器尖端放置在脊髓表面，并在撞击器尖端和套筒之间的标记的帮助下将X-Y-Z臂轻轻下降到预期高度。冲击器尖端由 0.12 g 铝合金制成，以避免在手术前因大重量压缩而损坏脊髓。拉销用于将砝码固定在套筒顶部以准备砝码下降（图1）。
在以前的研究中，冲击力划分是根据IH装置的冲击力数据定义的，分别为30 Kdyn，50 Kdyn和70 Kdyn，分别为6，10。在研究过程中，证明了基于SCICP建立的SCI模型的序列度数，可用于各种研究。因此，在正式开始实验之前，使用峰值压力测试装置测试了不同质量的各种重量产生的冲击力。结果选取3只标准化代表性SCI小鼠模型作为3种不同损伤程度，分别分为轻度、中度、重度组6、10，重量释放在同一高度，轻度重量为1.3 g，中度损伤为2.0 g，重度损伤为2.7 g。
作为保证可操作性和准确性的另一种手段，报道了一种新颖的微创手术方法。通过研究正常小鼠的解剖结构，发现了一种定位T12-T13棘间隙的新方法。手术步骤中椎骨定位方法易于掌握且准确，保证了微创手术的精确定位。
希望这种挫伤技术可能有助于脊髓损伤的研究和理解，包括病理生理学理解、管理评估等。
Protocol
注：所有实验均经山东大学奇鲁医学院实验动物伦理与福利委员会批准（批准号：21L60），并根据美国国立卫生研究院出版的《实验动物护理和使用指南》（NIH出版物第85-23号，1996年修订）进行。
1.脊髓损伤同轴平台的机理及力学试验
- 用外科手术台、椎体稳定器和冲击器尖端组装平台（图 1）。
注意：保持砝码下降和排气槽清洁，以防止砝码遇到气流，因为砝码下降或套筒上的任何污垢都可能影响平台的精度。 - 将可以准确定位脊髓的尖端放入袖子中。
- 为实验选择适当的体重下降质量，轻度、中度和重度组分别为 1.3 g、2.0 g 和 2.7 g。
- 将拉销插入砝码下降的孔中。
- 将重压下降到套筒顶部，将拉销安装在 X-Y-Z 臂的凹槽中，以便一旦定位完成，重量就会释放以撞击撞击器尖端，从而震动脊髓，并在显微镜下观察脊髓的变化。
- 为方便操作员，调整可拆卸的 0.1 mm 精密 X-Y-Z 臂，以提供足够的工作空间（图 1D、E）。
注意：为了确认研究结果的一致性，在实验开始之前，使用峰值压力检测装置测量将重量落入套筒内时产生的力。未来的研究不需要重复确认。 - 打开设备，将金属压力接收器放在尖端下方，将适配器归零，松开拉销，并记录实际冲击力。
2.第9胸椎定位和椎板切除术（T9）
注：9-10周龄的雌性C57BL / 6J小鼠购自济南鹏跃实验动物公司（中国济南）。
- 高压灭菌一套用于实验的手术器械，并在手术前用75%的酒精对手术台进行消毒。
- 麻醉前30分钟注射丁丙诺啡镇痛（0.05-2.0mg / kg，SQ），用于损伤手术。然后，用异氟醚麻醉小鼠（诱导：~3%-5%，维持：~1.5%-2%）。检查动物是否被尾巴或脚趾捏的反射完全麻醉。麻醉生效后，将鼠标置于手术台指定部位的俯卧位置，并在角膜上涂上眼药膏（在角膜上涂抹眼药膏以保护眼睛在手术过程中不干燥）。
- 用胸腰椎上的电动剃须刀剃除从尾部到嘴部的头发。用碘伏对皮肤进行打圈消毒数次30秒，然后用75%的酒精消毒。应用无菌手术单，并用手术刀和刀片在大约T6至T13的皮肤上做一个约1.5厘米的纵向切口。
注意：沿肋缘触诊至中线，T12-T13棘间隙位于中线。在嘴部切开1.5厘米的切口，切口与T6-T13椎骨大致齐平。
- 用胸腰椎上的电动剃须刀剃除从尾部到嘴部的头发。用碘伏对皮肤进行打圈消毒数次30秒，然后用75%的酒精消毒。应用无菌手术单，并用手术刀和刀片在大约T6至T13的皮肤上做一个约1.5厘米的纵向切口。
- 在手术显微镜下从骨部分探索一侧的第 13 根肋骨。通过轻轻触摸肋脊角区域，然后朝向喙部以定位 T12-T13 的棘间隙，探索中线的棘突。探索T9-T10从T12-T13的空间到耳廓侧的棘间空间。（图2A、3A）
- 用微型剪刀将椎旁肌肉沿着T9的棘突解剖到两侧的前小关节和后关节（图3B）。用微型牵开器收回椎旁肌肉，并用微型剪刀清洁叶片上的软组织以及T8-T9和T9-T10的棘突间隙。
- 进行T9椎板切除术，用显微手术钳夹住T9的棘突，将其稍微抬起，将微型剪刀沿椎板右侧背外侧平行插入，避免损伤脊髓，并用微型剪刀切断叶片。在左侧重复，脊髓可以暴露（图2B，3C）。
- 在固定椎骨之前，松开万向臂，并用椎体稳定器的微型蚊钳缓慢夹住椎骨两侧的第9至10小面关节。拧紧微型蚊钳上的螺钉，从而稳定椎骨。将脊髓调整到水平面，收紧万向臂，固定椎骨（图3D）。
3.T9挫伤
- 一旦T9水平脊髓暴露并且椎骨固定，通过操作显微镜下的袖子内的尖端瞄准脊髓（图3E）。
- 检查尖端的表面是否从脊髓的后侧和侧面平行于脊髓，因为在显微镜下很容易观察到脊髓和尖端之间的关系，并且手术台可以很容易地转动。
- 在椎板切除术后尖端与脊髓接触之前，检查尖端表面是否平行于备用薄片的双侧边界，因为它是平行于脊髓的自然参考平面。
- 定位T12-T13的棘间隙后，降低套筒，直到撞击器的末端与观察窗上的标记一致并达到22毫米的指定高度。拉出拉针以释放重量（根据组1.3g，2.0g或2.7g，每组包括3只小鼠，每组每个时间点有一只鼠标）。
注意：脊髓应平行于地面并垂直于尖端;移动手术台以确保微观视野，因为手术台非常紧凑。 - 挫伤完成后取下撞击器，在手术显微镜下观察SCI的程度。在轻度组中，可以看到浅红色改变，而在中度组中，损伤部位在3-4秒内表现出深红色，并且可能观察到突出。在重度组中，暗红色表现可能立即出现，硬脑膜明显突出，但硬脑膜仍呈一致形状（图3F）。
- 用缝合线缝合浅筋膜和皮肤（聚丙烯不可吸收缝合线，尺寸：6-0）。
- 缝合完成后，对手术区域进行消毒，将鼠标放在温控垫上，直到完全恢复意识，然后将鼠标放入小鼠笼中。
4. 动物护理
- 将动物放在加热垫上进行恢复，并观察双后肢的运动。
注意：接受手术的动物在完全康复之前不应返回其他动物的陪伴下。 - 在笼子地板上放高水饮食，以便动物可以轻松接触到食物。或者，使用带有较低喂食台的笼子。
- 手术后每天两次排空小鼠的膀胱，因为中度和重度损伤组难以恢复膀胱功能。注射丁丙诺啡镇痛（0.05-2.0mg / kg，SQ）8-12小时/天，持续3天。
5.经心灌注、染色和免疫染色
- 在损伤后第1天，第28天和第56天，通过灌注分别处死每组的一只小鼠。
- 过度麻醉后，用60mL磷酸盐缓冲盐水（PBS）和20mL4%多聚甲醛（4%-6%异氟醚）灌注小鼠。
- 用微型剪刀收集脊柱，分别从病变中心向嘴部和尾部延伸1厘米。
- 切除多余的肌肉，保留带有部分肋骨的完整脊柱节段，以便在步骤5.1.4中保持仪器，并将其浸泡在4%多聚甲醛中24小时。
- 用止血钳夹住肋骨进行固定，并根据切除的椎板和脊髓病变中心的颜色改变在显微镜下确定病变中心。
- 用尾部的微型剪刀切除所有椎板和关节突。
- 用微型剪刀切断神经根，取出脊髓。
- 用微型剪刀收集0.5厘米的脊髓，分别从病变中心向尾部和喙部延伸。
- 将脊髓置于4°C的30%蔗糖中48小时。
- 冷冻后根据组织学检查类型将组织切成6μm厚的切片。
- 进行苏木精和伊红（H&E）染色。
- 将切片重新加热至室温，并将6μm厚的切片浸泡在4%甲醛中约15分钟，然后在1x PBS中浸泡1分钟四次以除去残留的OCT。
- 用苏木精染色切片90秒，然后用双蒸水冲洗。
- 然后，用流水清洗切片3分钟。
- 用伊红染色4分钟，并在95%酒精中浸泡30秒两次，以冲洗多余的曙红。
- 最后，用梯度酒精（95%酒精和50%酒精一次，依次）脱水30秒，并在二甲苯中浸泡2分钟。然后，用树脂凝胶密封试样（冠状面部分：图 4;矢状面部分： 图5）。
- 进行免疫荧光染色。
- 将切片重新加热至室温，并将6μm厚的切片浸泡在4%甲醛中约2分钟。
- 在TBST中清洗切片5分钟，持续三次。
- 用封闭溶液（PBS中的10%山羊正常血清）孵育切片并封闭1小时以阻止免疫球蛋白的非特异性结合。
- 将脊髓切片在4°C下孵育过夜，同时用小鼠抗胶质纤维酸性蛋白（GFAP，反应性星形胶质细胞的标志物），多克隆抗体（1：600）和兔抗NF200抗体（1：2000），神经丝的标志物在0.4mL封闭溶液中。
- 用PBS冲洗切片，并在室温下加入0.4mL带有山羊抗兔Alexa 594偶联IgG（1：1，000）和山羊抗小鼠Alexa 488偶联IgG（1：1，000）二抗的封闭溶液1小时。
- 用荧光显微镜分别以594 nm和488 nm的波长进行自动全景扫描，以10倍拍摄图像（图6）。
- 打开荧光显微镜，将载玻片放在显微镜载物台上，切换到荧光通道，使用定位键在组织上定位三到四个点，对焦完成拍摄。完成拍摄后，以所需格式保存不同通道的图像，然后保存合并的图像。
Representative Results
为了测试设备的精度，使用峰值压力测试设备测量了从相同高度制成的三种不同质量的砝码的力。对不同砝码组进行了24次测试，结果（平均±标准偏差）1.3 g砝码为0.323 N±0.02 N，2.0 g砝码为0.543 N±0.15 N，2.7g砝码为0.723 N±0.26 N（图7）。以前的研究采用dyne（dyn）或Kilodyne（Kdyn）作为测量挫伤强度的单位。为了更好地与以前的研究进行比较，列出了牛顿（N）和达因/千达因之间的转换（1 N = 1 kg × 1 m/s 2 = 1 × 103 g × 1 × 100 cm/s2 = 1 × 105 dyn; 0.323 N = 32.3 Kdyn; 0.543 N = 54.3 Kdyn; 0.723 N = 72.3 Kdyn）。
表1 和 图4 显示了冠状切片上轻度、中度和重度组的病变数据。 从图4看，损伤后第28天，轻、中、重度组可区分灰质和白质边界的连续性依次下降，瘢痕组织面积增大，病灶中心横截面比例增加。与正常组相比，各试验组的形态学差异均明显。这证明了试验组损伤度划分的合理性。
表2 和 图5 描述了矢状切片损伤后第1天和第56天的脊髓损伤情况。可见，损伤后第1天病变面积由轻组向重度组逐渐增大。同时，轻度组脊髓两侧白质连续性较好，可观察到小圆液泡，这是间质性水肿的特征。在中度组中，白质表现出较差的连续性，腹侧白质的结构没有顺序。在严重组中，腹侧白质表现出更严重的破坏，损伤中心出现大面积的腔。此外，周围组织显示明显的红细胞填充，中央管附近的红细胞聚集成条状。损伤后第56天，3组损伤中心均观察到瘢痕形成，面积随损伤严重程度增加。
损伤后第56天脊髓神经丝的完整性也可以从免疫荧光染色结果的分析中得出（图6）。该图还显示，在所有三组损伤的中心都可以看到重叠的瘢痕形成星形胶质细胞，损伤区域的长度随着损伤的严重程度而增加，而疤痕直径减小。这表明存在瘢痕挛缩，这可能导致脊髓直径减小。
图1：脊髓损伤同轴平台的整体和部分展示 。 （A）X-Y-Z臂和手术台可以分开，为小动物脊髓暴露的操作过程留出足够的空间。手术台在操作过程中可以自由移动，减少了由于位置限制而导致的潜在操作困难。椎体稳定器的主体有一个用于方向辅助的三关节万向臂，这增加了其灵活性。（B）将冲击器尖端放入套筒中，然后将后者组装到X-Y-Z臂中。将拉销的尖端放入砝码的孔中以防止砝码掉落，然后将砝码放入套筒中。组装好零件后，在显微镜下定位目标损伤区域。然后，降低X-Y-Z臂，直到撞击器尖端的末端与观察窗的下部水平一致，这表明已经达到了统一的挫伤高度（下落开始时重量与撞击器尖端之间的高度为22毫米）。拉动拉销，冲击就完成了。（C）受伤部位暴露后，用夹子夹住固定鼠标的脊柱和拧紧螺栓，以稳定椎体稳定器。（D）手术台上凹槽的推荐功能。实验动物应该放在中间凹槽中，头部朝向斜坡上的前部胸部。X-Y-Z 臂与手术台分离。（五）组装好的SCICP的展示。箭头表示零件。尖端对准目标挫伤区域，要开始挫伤，拉出拉销，重物会落到撞击器尖端以震荡脊髓。 请点击此处查看此图的大图。
图2：T13肋椎定位方法的成像图 。 （A）第13肋骨和T13是相对恒定的解剖结构。T13肋脊角可以在显微镜下轻松检测，操作员可以从显微镜下探向棘突并找到T12-T13棘突间隙。然后，依次向喙侧探查以找到目标损伤椎骨（例如，T9）。（B）微创第9胸椎板切除术可以保留相邻椎体之间的充分椎板和小关节。 请点击此处查看此图的大图。
图3：小鼠T9水平脊髓的暴露和挫伤 。 （A）探测T13肋脊角。（B）用微型牵开器回缩椎旁肌，为手术腾出足够的空间，露出T9。（C）用微型剪刀进行T9椎板切除术。（D）用椎体稳定器的夹子稳定椎骨。（E）用撞击器尖端瞄准目标挫伤区域。（F）挫伤后损伤部位出现水肿和充血。 请点击此处查看此图的大图。
图4：小鼠不同程度SCI后第28天的代表性切片（冠状切片）。 （A）小鼠的正常胸脊髓。比例尺 = 500 μm。 （B）对于轻度组，脊髓背侧可观察到轻微损伤，而保留的白质和灰质的形态基本保留。（C）对于中度组，在脊髓中观察到明显的疤痕组织（用红色星号表示）。白质和灰质之间的区别特征几乎无法区分。（四）相对而言，重症组的脊髓几乎失去了原有形态，几乎被瘢痕组织所取代。绿色虚线表示损坏区域，黑色虚线表示可观测灰质的边界。随着损伤严重程度的增加，小鼠的脊髓中出现了较大的病变和较少的保留结构，灰质的边界几乎无法区分。 请点击此处查看此图的大图。
图5：小鼠脊髓损伤后第1天和第56天的代表性切片（矢状切片）。 （A）小鼠的正常胸椎脊髓。（B）B1-B3分别代表轻度，中度和重度组受伤后第1天的脊髓。可以看出，随着损伤的增加，病变中心有更大的区域被破坏或液化。腹侧脊髓白质的连续性因损伤强度不同而不同。B1 显示腹侧脊髓中的白质与轻微水肿具有更好的连续性。B2显示腹侧脊髓白质的连续性较差，水肿较严重。B3 SCI中心的组织几乎失去了所有的连续性，并且在损伤中心以外的区域存在广泛的水肿。（C）C1-C3分别代表轻度，中度和重度组损伤后第56天的脊髓。不同组间损伤中心出现不同程度的瘢痕挛缩，损伤区域直径差异显著。比例尺 = 500 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图6：小鼠脊髓损伤后第56天的代表性切片（矢状切片）。 （A）轻度组的代表部分。NF200表示神经丝，而GFAP表示星形胶质细胞。在病变震中观察到重叠的星形胶质细胞，而脊髓腹侧部分的神经丝具有良好的连续性。（二）温和派的代表部分。除了重叠的星形胶质细胞外，还可以观察到两个瘢痕中心（用红色星号表示），而腹侧的神经丝具有连续性。（C）重症组的代表切片，病变范围大，形成大量瘢痕星形胶质细胞。未观察到明显的瘢痕中心，神经丝的连续性差。比例尺= 500 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图 7：从相同高度但重量不同的力产生的力。 在实验之前，使用峰值压力检测装置检测从同一高度释放的不同质量的重量所产生的力。每组完成24次探测后，获得更可靠的重力数据，作为打击力的参考。使用统计软件SPSS19.0对数据进行分析。数据以平均值表示±标准偏差，每组n = 24。更多组之间的比较基于用于检验差异的单因素方差分析（ANOVA）; p < 0.05被认为具有统计学意义。 请点击此处查看此图的大图。
| 28 分频 | |||
| 群 | 全民教育全球监测率 （%） | WMR （%） | 容积率 （%） |
| 正常 | 35.44 | 64.57 | 0 |
| 轻微 | 11.59 | 64.88 | 23.53 |
| 温和 | 0 | 41.14 | 58.86 |
| 严重 | 0 | 0 | 100 |
表1：受伤后第28天的白质、灰质和损伤率。 缩写：dpi = 受伤后天数，DA = 受损区域;GMR = 灰质率;WMR = 白质率;DR = 损坏率。
| 群 | 1dpi DA （μm2） | 56dpi DA （μm2） |
| 正常 | 0 | 0 |
| 轻微 | 2391250 | 666091 |
| 温和 | 4383381 | 1263191 |
| 严重 | 5118833 | 1943962 |
表2：损伤后第1天和第56天矢状切片病变之间的比较。
Discussion
通过标准化的程序，可以获得稳定的数据，特别是在小动物 体内 实验中，可以最大限度地减少动物之间个体差异造成的结果偏差。基于上述条件和便捷的应用仪器，可以建立标准化、微创、准确、可重复的SCI模型。
由于其实用性和便利性，以前，落重冲击器大多使用3.本研究中引入的撞击器与艾伦的模型12具有相同的原理。幸运的是，由于现代加工技术的精确制造优势，研究团队设计了一种重量下降冲击器，具有易于操作、稳定性强、很少不准确的优点。采用峰值压力检测装置测量不同砝码的重力。先前关于无限地平线撞击器的研究6，10报道了30 Kdyn，50 Kdyn和70 Kdyn组中偏离预期力的±5 Kdyn范围，这为本研究的群体划分和挫伤程度选择提供了参考。本研究提前测量了不同群体的可能力，获得了更准确的数据。
在动物模型实验中，比该设备更关键的是对小鼠解剖学的理解和利用。充分利用解剖学可以使手术微创。微创手术直接影响实验动物功能状态的稳定性和后续小鼠恢复的一致性。先前的研究表明，SCI模型的微创建立增加了大鼠恢复过程中椎体结构的稳定性，并避免了脊柱不稳定造成的额外损害1。微创手术的前提是合理利用自然解剖结构。因此，应根据小鼠的解剖结构进行脊髓节段的快速精确定位。据报道，成像方法用于查找椎骨13。定位成像方法虽然精度高，但在实际实验操作过程中，成像定位方法存在操作不便、操作时间长、设备采集复杂、设备精度要求高等缺点。McDonough等人描述了通过肩胛骨14的下角定位T7，而小鼠则以谎言俯伏的方式起作用，因此提到的下角应该是后角。而且，使用下肩胛尖找到T7是人体解剖学15中特定位置的定位方法，不适合小鼠。最后，Micro-CT数据还验证了假设，即无论小鼠处于自然还是特定身体位置，肩胛骨的后角都不会与T7齐平。McDonough等人14 还提到在鼠标拱起时定位背部的最高点，并将最高点定义为T12。相比之下，在本研究中，T9是在T12-T13棘间隙的帮助下定位的，该空间既不与鼠标的姿势相关，也不受其影响。此外，使用这种方法，可以轻松定位和操作目标椎骨。应在显微镜下探测第13根肋骨，轻轻触摸脊椎角区域，朝棘突画一条线，然后朝头部探测T12-T13棘突之间的空间。研究小组使用T12-T13棘突间隙定位了12只小鼠的T9。最后，12只雌性C57BL / 6J小鼠在T9定位和椎板切除术后进行了Micro-CT扫描。显微CT扫描结果表明，所有12只小鼠的去除层为T9。Micro-CT结果表明，所有T9均定位准确，精度明显高于肩胛骨定位方法。这种方法为我们提供了一种快速准确的定位方法，这有助于损伤模型的一致性。
本议定书的最小侵入性主要表现在三个方面。首先，定位后，T9水平的椎旁肌肉仅由微型牵开器回缩，而不会损伤T8或T10水平的肌肉。此外，微牵开器对叶片的暴露不会干扰视野。其次，失血量主要来自椎板切除术，可能导致松质骨流血，在手术过程中非常低，几乎不超过染色2毫米×2毫米×3毫米三角形棉花的体积。第三，最大限度地将椎板切除术限制在所需区域，保持椎板外侧的连续性，大大减轻椎骨的不稳定性。与以前的协议16，17相比，目前的协议减少了许多不必要的损害。
为了评估不同程度的SCI，将组织病理学中所有组之间的结果与先前的研究已经显示的结果进行了比较9，11，18。这些结果足以完成对不同时期不同程度的损伤和变化的观察性研究。HE和免疫荧光显示，随着SCI严重程度的增加，脊髓组织中出现更多的异常形态，损伤程度的增加也导致脊髓结构紊乱程度的增加。从组织形态学观察来看，本研究各实验组组织形态变化的程度和规律性与以往研究高度一致。
根据目前的组织学检查结果，不同程度的创伤性SCI后各指标有明显变化，进一步证实了本研究建立的模型的可靠性。
尽管该技术准确有效，但这些方法可能存在潜在的局限性。关于椎板切除术，操作人员应熟练掌握显微镜下的操作，以防止误打误撞脊髓。此外，整个平台的设置基于机械结构，与自动化设备相比，对操作员提出了更高的要求。事实上，所有提到的问题都可以通过反复的操作培训来改善。
可见，微创标准化建模有利于使结果更加统一、稳定、可重复，准确评价各种治疗方案的疗效，优化创伤性SCI的研究方案。
Disclosures
冯世清教授拥有脊髓损伤同轴平台的所有权。
Acknowledgments
这项工作得到了国家自然科学国家重点计划（81930070）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% fixative solution | Solarbio | P1110 | 4% |
| Anti-Neurofilament heavy polypeptide antibody | abcam | ab8135 | Dilution ratio (1: 2000) |
| Eosin Staining Solution (water soluble) | biosharp | BL727B | |
| Ethanol | Fuyu Reagent | 64-17-5 | |
| Fluorescent microscope | KEYENCE | BZ-X800 | |
| Frozen Slicer | leica | CM3050 S | |
| GFAP (GA5) Mouse mAb | Cell Signaling TECHNOLOGY | #3670 | Dilution ratio (1: 600) |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | ThermoFisher SCIENTIFIC | A32723TR | Dilution ratio (1: 1000) |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 594 | ThermoFisher SCIENTIFIC | A32740 | Dilution ratio (1: 1000) |
| Hematoxylin Staining Solution | biosharp | BL702A | |
| Mice | Jinan Pengyue Experimental AnimalCompany | C57BL/6J | |
| Microsurgery apparatus | Shandong ULT Biotechnology Co., Ltd | All the surgey instruments are custom-made | Ophthalmic scissors, micro mosquito forceps, microsurgery forceps, micro scissors |
| Normal sheep serum for blocking (working solution) | Zhong Shan Jin Qiao | ZLI-9022 | working solution |
| O.C.T. Compound | SAKURA | 4583 | |
| PBS (phosphate buffered solution) | Solarbio | P1020 | pH 7.2-7.4 |
| RWD Laboratory inhalation anesthetic station | RWD Life Science Co., Ltd | R550 | |
| Small animal in vivo microCT imaging system | PerkinElmer | Quantum GX2 | |
| Spinal cord injury coaxial platform | Shandong ULT Biotechnology Co., Ltd | Custom-made(Feng's standard) | (https://shop43957633.m.youzan.com/wscgoods/detail/367x5ovgn69q18g?banner_id=f.81386274~goods.7~1~ b0yRFKOq&alg_id=0&slg=tagGood List-default%2COpBottom%2Cuuid %2CabTraceId&components_style_ layout=1&reft=1659409105184&sp m=g.930111970_f.81386274&alias =367x5ovgn69q18g&from_uuid=136 2cc46-ffe0-6886-2c65-01903dbacbb a&sf=qq_sm&is_share=1&shopAuto Enter=1&share_cmpt=native_ wechat&is_silence_auth=1) |
| Surgery microscope | Zumax Medical Co., Ltd. | zumax, OMS2355 | |
| TBST (Tris Buffered Saline+Tween) | Solarbio | T1082 | Dilution ratio (1: 19) |
| Xylene | Fuyu Reagent | 1330-20-7 |
References
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