Summary
Minimal invaziv teknikler ve basit bir laboratuvar cihazı, deney hayvanlarına operatif hasarı azaltarak ve anatomik morfoloji bakımına izin vererek omurilik yaralanması modelinin tekrarlanabilirliğini arttırır. Yöntem değerlidir, çünkü güvenilir sonuçlar ve tekrarlanabilir prosedür, hastalık onarım mekanizmalarının araştırılmasını kolaylaştırır.
Abstract
Omurilik yaralanmasını (SCI) modellemek için minimal invaziv yöntemlerin kullanılması, deney hayvanları arasındaki davranışsal ve histolojik farklılıkları en aza indirebilir ve böylece deneylerin tekrarlanabilirliğini artırabilir.
Bu yöntemlerin yerine getirilmesi için iki gereklilik gerekir: cerrahi anatomik yolun netliği ve laboratuvar cihazının basitliği ve rahatlığı. Operatör için en önemlisi, net bir anatomik yol, cerrahi prosedürler sırasında deney hayvanına ek hasarı önleyen ve hayvanın deney sırasında tutarlı ve istikrarlı bir anatomik morfolojiyi sürdürmesini sağlayan minimal invaziv maruziyet sağlar.
Bu çalışmada, T9 seviyesi omuriliği minimal invaziv bir şekilde ortaya çıkarmak ve bir vertebral stabilizatör kullanarak farelerin omurlarını stabilize etmek ve hareketsiz hale getirmek için küçük hayvanlarda omurilik yaralanması için SCI koaksiyel platform adı verilen yeni bir entegre platformun kullanımı araştırılmıştır ve son olarak, T9 omurilik yaralanmasının farklı derecelerine yaklaşmak için farelerin omuriliğini tartışmak için bir koaksiyel yerçekimi darbecisi kullanılmıştır. Son olarak, histolojik sonuçlar okuyucular için referans olarak verilmiştir.
Introduction
Travmatik omurilik yaralanması (SCI), bireyi ciddi sonuçlara kolayca yatkın halegetirir 1; Bununla birlikte, şu anda etkili bir tedavi yoktur 1,2. Hayvan kontüzyon modelleri, SCI 3,4'ü incelemek için başlıca yöntemlerden biridir.
2004'ten 2014'e kadar 4, sıçanlar407 çalışmanın 289'unda (% 71) model organizmalar ve 69'unda (% 16.9) fareler olarak kullanılmıştır. Gerçekten de, farelerle yapılan deneylerin oranı, diğer modellere göre avantajları, özellikle de gen düzenleme çalışmaları için büyük potansiyelnedeniyle yıllar içinde kademeli olarak artmıştır 3,4,5. Bu nedenle, model tutarlılığına verilen büyük önem nedeniyle fareyi model olarak kullanarak daha fazla çalışma yapmak için daha uyumlu araçlara ihtiyaç duyulmaktadır6. Önceki çalışmalarda bildirilen yaygın cihazlar temel olarak Allen'ın omurilik etkisi ilkesine dayanmaktadır, örneğin, temel ağırlık düşüşü darbecisi7,8, New York Üniversitesi (NYU) / Çok Merkezli Hayvan Omurilik Yaralanması Çalışmaları (MASCIS) darbecisi1,9 ve Sonsuz Ufuk (IH) darbeci10,11 . Ağırlık düşüşü darbecisi ve NYU / MASCIS darbecisi, hedeflenen omuriliği hedefleme ve farklı yaralanma şiddetleri oluşturmak için farklı yüksekliklerden sabit bir ağırlık düşürme prensibini paylaşır. IH darbeci, farklı kuvvetlere göre omurilik yaralanmasını oluşturur.
SCI çalışmalarında fare modelinin kullanılmasında kolaylık sağlamak ve etkili tedavi yöntemlerinin temelini oluşturmak için, omurilik yaralanması koaksiyel platformu (SCICP) adı verilen entegre bir fare omurilik darbe yaralanması platformu geliştirilmiştir. Platform dört ana bileşenden oluşur: (1) çok kompakt olan ve konum kısıtlaması olmaksızın kolaylık sağlayan, çalıştırılan fareler için uygun bir pozisyon için tasarlanmış bir hayvan ameliyat masası; (2) operasyon sırasında paravertebral kasları tutmak için her iki tarafta bir mikro retraktör; (3) SCI prosedüründen önce omurları tutmak için bir vertebral stabilizatör (sıçanlar gibi daha büyük hayvanlar üzerinde çalışmak üzere iki vertebral stabilizatör mevcuttur); (4) bir manşon, bir darbeci ucu, ağırlıklar ve bir çekme pimi. Üç parça çıkarılabilir bir X-Y-Z koluna monte edilmelidir. Hassas hedefleme için, omuriliğin yüzeyine bir darbeci ucu yerleştirilir ve X-Y-Z kolu, darbeci ucu ile manşon arasındaki işaretin yardımıyla yavaşça beklenen yüksekliğe indirilir. Darbeci ucu, işlemden önce büyük ağırlık sıkıştırmasına atfedilen omuriliğin zarar görmesini önlemek için 0,12 g alüminyum alaşımından yapılmıştır. Çekme pimi, ağırlık düşüşünü hazırlamak için ağırlıkları manşonun üstünde tutmak içindir (Şekil 1).
Önceki çalışmalarda, darbe kuvveti bölünmesi, IH cihazının sırasıyla 30 Kdyn, 50 Kdyn ve 70 Kdyn, 6,10 olan darbe kuvveti verilerine göre tanımlanmıştır. Araştırma sürecinde, çeşitli çalışmalarda kullanılabilecek SCICP'ye dayalı olarak SCI modellerinin seri derecelerinin oluşturulduğu kanıtlanmıştır. Bu nedenle, deneye resmi olarak başlamadan önce, farklı kütlelerin çeşitli ağırlıkları tarafından üretilen darbe kuvvetleri, bir pik basınç test cihazı kullanılarak test edildi. Sonuç olarak, sırasıyla 6,10 dereceli hafif, orta ve şiddetli gruplar dahil olmak üzere üç farklı yaralanma derecesi olarak üç standartlaştırılmış temsili SCI fare modeli seçildi ve ağırlıklar aynı yükseklikte, hafif için 1.3 g ağırlık, orta için 2.0 g ve ağır hasar için 2.7 g ile serbest bırakıldı.
İşlevselliği ve doğruluğu garanti etmenin bir başka yolu olarak, yeni ve minimal invaziv bir operatif yaklaşım bildirilmiştir. Normal farelerin anatomisini araştırarak, T12-T13'ün interspinöz alanını bulmak için yeni bir yöntem bulundu. Operasyon adımlarında omur konumlandırma yönteminin ustalaşması kolay ve doğrudur, bu da minimal invaziv operasyonlar için hassas konumlandırma sağlar.
Umarım, bu kontüzyon yaralanması tekniği, patofizyolojinin anlaşılması, yönetim değerlendirmesi vb. dahil olmak üzere omurilik yaralanmasının araştırılmasına ve anlaşılmasına yardımcı olabilir.
Protocol
NOT: Tüm deneyler Shandong Üniversitesi Cheeloo Tıp Fakültesi Laboratuvar Hayvanları Etik ve Refah Komitesi tarafından onaylanmıştır (onay numarası: 21L60) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından yayınlanan Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na göre gerçekleştirilmiştir (NIH Yayınları No. 85-23, revize edilmiş 1996).
1. Omurilik yaralanması koaksiyel platformunun mekanizması ve mekanik testler
- Platformu cerrahi ameliyat masası, vertebral stabilizatör ve darbeci ucu ile birleştirin (Şekil 1).
NOT: Ağırlığın hava akımlarıyla karşılaşmasını önleyen ağırlık düşüşünü ve egzoz yuvalarını temiz tutun, çünkü ağırlık düşüşü veya manşon üzerindeki herhangi bir kir platformun hassasiyetini etkileyebilir. - Doğru omurilik yerleşimini sağlayan ucu manşonun içine yerleştirin.
- Deney için ağırlık düşüşlerinin uygun kütlelerini seçin, bunlar sırasıyla hafif, orta ve şiddetli gruplar için 1.3 g, 2.0 g ve 2.7 g'dır.
- Çekme pimini ağırlık düşüşünün deliklerine takın.
- Ağırlık düşüşünü, X-Y-Z kolundaki oluğa takılı çekme pimi ile manşonun tepesine monte edin, böylece konumlandırma tamamlandıktan sonra, ağırlık darbeci ucuna çarpacak şekilde serbest bırakılır, sonuç olarak omuriliğe devam eder ve omurilikteki değişiklikler mikroskop altında gözlenir.
- Çıkarılabilir 0,1 mm hassasiyetli X-Y-Z kolunu, operatörün yeterli çalışma alanı sağlaması için rahatlığı için ayarlayın (Şekil 1D, E).
NOT: Etüdün sonuçlarının tutarlılığını doğrulamak için, deney başlamadan önce, bir pik basınç algılama cihazı kullanarak ağırlık manşonun içine düştüğünde oluşan kuvveti ölçün. Gelecekteki çalışmalar için onayın tekrarlanması gerekli değildir. - Cihazı açın, metal basınç reseptörünü ucun altına yerleştirin, adaptörü sıfırlayın, çekme pimini serbest bırakın ve gerçek darbe kuvvetini kaydedin.
2. 9. torasik vertebranın (T9) lokalizasyonu ve laminektomisi
NOT: 9-10 haftalık dişi C57BL/6J fareler Jinan Pengyue Experimental Animal Company'den (Jinan, Çin) satın alınmıştır.
- Deney için bir dizi cerrahi aleti otoklav yapın ve ameliyattan önce ameliyat masasını% 75 alkol ile sterilize edin.
- Yaralanma operasyonları için anesteziden 30 dakika önce analjezi için buprenorfin (0.05-2.0 mg / kg, SQ) enjekte edin. Ardından, fareyi izofluran ile uyuşturun (indüksiyon: ~% 3 -% 5, bakım: ~% 1.5 -% 2). Hayvanın kuyruk veya ayak parmağı sıkışma refleksleriyle tamamen uyuşturulup uyuşturulmadığını kontrol edin. Anestezi yürürlüğe girdikten sonra, fareyi ameliyat masasının belirlenmiş bir bölümüne yüzüstü bir pozisyonda koyun ve korneayı oftalmik merhem ile kaplayın (ameliyat sırasında gözleri kurumaya karşı korumak için kornealara oftalmik merhem uygulayın).
- Saçları kaudalden rostral'a torakolomber omurga üzerinde elektrikli tıraş makinesi ile tıraş edin. Cildi 30 s boyunca iyodofor ile dairesel bir hareketle birkaç kez sterilize edin ve% 75 alkol alın. Steril bir cerrahi örtü uygulayın ve bir neşter ve bıçakla yaklaşık T6'dan T13'e kadar cilt üzerinde yaklaşık 1,5 cm'lik uzunlamasına bir kesi yapın.
NOT: Kostal kenar boşluğu boyunca T12-T13 interspinöz boşluğunun bulunduğu orta hatta kadar palpe yapın. Rostral'a 1,5 cm'lik bir kesi yapın ve kesi yaklaşık olarak T6-T13 omurları ile aynı hizadadır.
- Saçları kaudalden rostral'a torakolomber omurga üzerinde elektrikli tıraş makinesi ile tıraş edin. Cildi 30 s boyunca iyodofor ile dairesel bir hareketle birkaç kez sterilize edin ve% 75 alkol alın. Steril bir cerrahi örtü uygulayın ve bir neşter ve bıçakla yaklaşık T6'dan T13'e kadar cilt üzerinde yaklaşık 1,5 cm'lik uzunlamasına bir kesi yapın.
- Ameliyat mikroskobu altında kemikli kısımdan bir taraftaki 13. kaburgayı keşfedin. T12-T13'ün interspinöz alanını bulmak için kostovertebral açının alanına hafifçe dokunarak ve ardından rostral'a doğru hafifçe dokunarak orta hattaki dikenli süreci keşfedin. T9-T10'un interspinöz uzayını T12-T13'ün alanından rostral tarafa kadar keşfedin. (Şekil 2A, 3A)
- Paraspinal kası T9'un dikenli süreci boyunca mikro makasla her iki tarafın ön ve arka faset eklemlerine diseke edin (Şekil 3B). Paraspinal kasları mikro retraktörlerle geri çekin ve lamina üzerindeki ve T8-T9 ve T9-T10'un interspinöz boşluğundaki yumuşak dokuyu mikro makasla temizleyin.
- T9 laminektomi yapın, T9'un dikenli işlemini mikrocerrahi forsepslerle sıkıştırın, hafifçe yukarı kaldırın, mikro makası laminanın sağ dorsolateral tarafına paralel olarak yerleştirin, omuriliğe zarar gelmesini önleyin ve laminayı mikro makasla kesin. Sol tarafta tekrarlayın ve omurilik açığa çıkabilir (Şekil 2B, 3C).
- Omurları sabitlemeden önce, evrensel kolu gevşetin ve omurların her iki tarafındaki 9. ila 10. faset eklemlerini, vertebral stabilizatörün mikro sivrisinek forsepsleriyle yavaşça sıkıştırın. Mikro sivrisinek forsepsleri üzerindeki vidaları sıkın ve böylece omur stabilize edilir. Omuriliği yatay düzleme ayarlayın, evrensel kolu sıkın ve omur sabitlenir (Şekil 3D).
3. T9 kontüzyon yaralanması
- T9 seviyesi omurilik açığa çıktıktan ve omur sabitlendikten sonra, ameliyat mikroskobik altında manşonun içindeki uçtan omuriliğe nişan alın (Şekil 3E).
- Ucun yüzeyinin omuriliğe paralel olup olmadığını omuriliğin arka ve yan yönlerinden kontrol edin, çünkü mikroskop altında omurilik ve uç arasındaki ilişkiyi gözlemlemek kolaydır ve ameliyat masası kolayca döndürülebilir.
- Omuriliğe paralel doğal bir referans düzlemi olduğu için laminektomi sonrası uç omurilikle temas etmeden önce ucun yüzeyinin ayrılmış laminanın bilateral sınırlarına paralel olup olmadığını kontrol edin.
- T12-T13'ün interspinöz boşluğunu bulduktan sonra, darbecinin ucu gözlem penceresindeki işaretle tutarlı olana ve belirtilen 22 mm yüksekliğe ulaşılana kadar manşonu indirin. Ağırlığı serbest bırakmak için çekme pimini dışarı çekin (gruba göre 1,3 g, 2,0 g veya 2,7 g, her grup 3 fare içerir ve her grubun her zaman noktası için bir faresi vardır).
NOT: Omurilik yere paralel ve uca dik olmalıdır; Mikroskobik görme alanını sağlamak için ameliyat masasını hareket ettirin, çünkü masa çok kompakttır. - Kontüzyon yapıldığında darbeciyi çıkarın ve ameliyat mikroskobu altında SCI derecesini gözlemleyin. Hafif grupta, açık kırmızı bir renk değişikliği görülebilirken, orta grupta, yaralanma bölgesi 3-4 s'de koyu kırmızı sergiler ve muhtemelen eminlik gözlenebilir. Şiddetli grupta, koyu kırmızı belirtiler hemen ortaya çıkabilir ve dura'da belirgin bir üstünlük ortaya çıkar, ancak dura hala tutarlı bir şekildedir (Şekil 3F).
- Yüzeysel fasyayı ve cildi sütürlerle (polipropilen emilemeyen sütür, boyut: 6-0) dikiş.
- Dikişi tamamladıktan sonra, cerrahi alanı sterilize edin, fareyi tam bilinçlilik geri yüklenene kadar sıcaklık kontrollü bir pedin üzerine yerleştirin ve ardından fareyi fare kafeslerine koyun.
4. Hayvan bakımı
- İyileşme için hayvanı ısıtma yastığına yerleştirin ve her iki arka bacağın hareketini gözlemleyin.
NOT: Ameliyat geçiren hayvanlar, tamamen iyileşene kadar diğer hayvanların yanına iade edilmemelidir. - Kafes zeminine yüksek su diyeti koyun, böylece hayvanlar yiyeceğe kolayca ulaşabilir. Alternatif olarak, daha düşük besleme masasına sahip bir kafes kullanın.
- Ameliyattan sonra farelerin mesanelerini günde iki kez boşaltın, çünkü orta ve şiddetli yaralanma gruplarının mesane fonksiyonunu iyileştirmesi zordur. Analjezi için buprenorfin enjekte edin (0.05-2.0 mg / kg, SQ) 3 gün boyunca 8-12 saat / gün.
5. Transkardiyal perfüzyon, boyama ve immün boyama
- Yaralanmadan sonraki 1., 28. ve 56. günlerde, her grubun bir faresini sırasıyla perfüzyonla feda edin.
- Fareleri aşırı anestezi sonrası 60 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ve 20 mL% 4 paraformaldehit (% 4-6 izofluran) ile perfüze edin.
- Omurgayı, lezyon merkezinden sırasıyla rostral ve kaudal olarak 1 cm uzanan mikro makasla toplayın.
- Fazla kasları rezeke edin, aletlerin 5.1.4 adımında tutması için sağlam omurga segmentlerini kısmi kaburgalarla ayırın ve 24 saat boyunca% 4 paraformaldehit içine batırın.
- Kaburgaları fiksasyon için hemostatik forseps ile kelepçeleyin ve rezeke edilen laminaya ve omuriliğin lezyon merkezindeki renk değişikliğine göre mikroskop altında lezyon merkezini tanımlayın.
- Tüm laminaları ve eklem işlemlerini kaudalden mikro makasla rezeke edin.
- Sinir köklerini mikro makasla kesin ve omuriliği çıkarın.
- Lezyon merkezinden mikro makasla sırasıyla kaudal ve rostral olarak uzanan omuriliğin 0.5 cm'sini toplayın.
- Omuriliği 48 saat boyunca 4 ° C'de% 30 sakkaroza koyun.
- Histolojik inceleme tipine göre dondurulduktan sonra dokuları 6 μm kalınlığında kesitler halinde kesin.
- Hematoksilin ve eozin (H & E) boyama işlemini gerçekleştirin.
- Bölümleri oda sıcaklığına yeniden ısıtın ve 6 μm kalınlığındaki kesitleri yaklaşık 15 dakika boyunca %4 formaldehit içinde bekletin, ardından artık OCT'yi gidermek için 1 dakika boyunca 1 dakika boyunca 1x PBS'ye dört kez batırın.
- Bölümleri 90 sn hematoksilin ile sabitleyin ve çift damıtılmış su ile durulayın.
- Ardından, bölümleri 3 dakika boyunca akan suyla yıkayın.
- 4 dakika boyunca eozin ile lekeleyin ve fazla eozini durulamak için iki kez 30 sn için% 95 alkole batırın.
- Son olarak, 30 saniye boyunca gradyan alkol (% 95 alkol ve% 50 alkol) ile art arda dehidrate edin ve 2 dakika boyunca şeffaflık için ksilen'e batırın. Ardından, numuneleri reçine jeli ile kapatın (koronal düzlem bölümü: Şekil 4; sagital düzlem bölümü: Şekil 5).
- İmmünofloresan boyama yapın.
- Bölümleri oda sıcaklığına yeniden ısıtın ve 6 μm kalınlığındaki bölümleri yaklaşık 2 dakika boyunca% 4 formaldehit içinde bekletin.
- Bölümleri TBST'de üç kez 5 dakika yıkayın.
- Bloke edici çözelti (PBS'de% 10 keçi normal serumu) ile bölümleri inkübe edin ve immünoglobulinin spesifik olmayan bağlanmasını engellemek için 1 saat boyunca bloke edin.
- Omurilik bölümlerini gece boyunca 4 ° C'de hem fare anti-glia fibriler asidik protein (GFAP, reaktif astrositler için bir belirteç), poliklonal antikor (1:600) hem de tavşan anti-NF200 antikoru (1:2000), 0.4 mL bloke edici çözeltide nörofilament için bir belirteç ile inkübe edin.
- Bölümleri PBS ile durulayın ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca Keçi anti-tavşan Alexa 594-konjuge IgG (1:1.000) ve keçi anti-fare Alexa 488-konjuge IgG (1:1,000) sekonder antikorları ile 0,4 mL bloke çözeltisi ekleyin.
- Floresan mikroskopla sırasıyla 594 nm ve 488 nm dalga boylarında otomatik panoramik tarama ile 10x'te görüntü çekin (Şekil 6).
- Floresan mikroskobu açın, slaytı mikroskop aşamasına getirin, floresan kanalına geçin, doku üzerinde üç ila dört nokta konumlandırmak için konumlandırma tuşunu kullanın ve çekimi tamamlamak için odaklanın. Çekimi bitirdikten sonra, farklı kanalların görüntülerini istediğiniz formatta kaydedin ve ardından birleştirilmiş görüntüyü kaydedin.
Representative Results
Cihazın hassasiyetini test etmek için, üç farklı ağırlık kütlesinin aynı yükseklikten yaptığı kuvvet, bir pik basınç test cihazı kullanılarak ölçülmüştür. Yirmi dört test farklı ağırlık gruplarıyla gerçekleştirilmiştir ve (ortalama ± SD) 1.3 g ağırlıklar için 0.323 N ± 0.02 N, 2.0 g ağırlıklar için 0.543 N ± 0.15 N ve 2.7g ağırlıklar için 0.723 N ± 0.26 N ile sonuçlanmıştır (Şekil 7). Önceki çalışmalar, kontüzyon yoğunluklarını ölçmek için birim olarak dyne (dyn) veya Kilodyne (Kdyn) benimsemiştir. Önceki çalışmalarla daha iyi karşılaştırma için, Newton (N) ve dyne/Kilodyne arasındaki dönüşümler listelenmiştir (1 N = 1 kg × 1 m / s 2 = 1 × 10 3 g × 1 × 100 cm / s2 = 1 × 105 dyn; 0.323 N = 32.3 Kdyn; 0.543 N = 54.3 Kdyn; 0.723 N = 72.3 Kdyn).
Tablo 1 ve Şekil 4'te hafif, orta ve şiddetli grupların koronal kesitlerdeki lezyonlarının verileri görülmektedir. Şekil 4'ten yola çıkarak, yaralanma sonrası 28. günde, hafif, orta ve şiddetli gruplarda ayırt edilebilir gri ve beyaz cevher sınırlarının sürekliliği art arda azalmış, skar dokusu alanı büyümüş ve lezyon merkezinin kesitinde artan bir oran oluşmuştur. Tüm deney gruplarında normal gruba göre belirgin morfolojik farklılıklar vardı. Bu, deney gruplarında yaralanma derecelerinin bölünmesinin rasyonelliğini kanıtladı.
Tablo 2 ve Şekil 5 , sagital kesitlerde yaralanma sonrası 1. ve 56. günlerde omuriliğin yaralanmasını tanımlamaktadır. Yaralanma sonrası 1. günde lezyon alanının hafif ve şiddetli gruplardan giderek arttığı görülebilir. Bu arada, omuriliğin her iki tarafındaki beyaz cevherin sürekliliği, interstisyel ödemin özellikleri olan gözlemlenebilir küçük yuvarlak vakuollerle hafif grupta daha iyiydi. Orta grupta, beyaz cevher zayıf süreklilik gösterdi ve ventral beyaz cevherin yapısı sıralanmadı. Şiddetli grupta, ventral beyaz madde daha şiddetli bozulma sergiledi ve boşluğun geniş bir alanı yaralanmanın merkezinde ortaya çıktı. Ek olarak, çevreleyen doku kırmızı kan hücrelerinin belirgin bir şekilde doldurulduğunu gösterdi ve merkezi kanalın yakınındaki kırmızı kan hücreleri şeritler halinde toplandı. Yaralanmadan sonraki 56. günde, alanı yaralanmanın şiddetine göre artan üç grubun yaralanma merkezinde skar oluşumu gözlendi.
Yaralanma sonrası 56. günde omurilik nörofilamentinin bütünlüğü, immünofloresan boyama sonuçlarının analizinden de elde edilebilir (Şekil 6). Şekil ayrıca, üst üste binen yara izi oluşturan astrositlerin her üç yaralanma grubunun merkezinde de görülebildiğini, yaralanma alanının uzunluğunun yaralanmanın şiddeti ile arttığını, yara izi çapının azaldığını göstermektedir. Bu, omurilik çapının azalmasına neden olabilecek skar kontraktürünün varlığını göstermektedir.
Şekil 1: Omurilik yaralanması koaksiyel platformunun bir bütün ve parça sergisi . (A) X-Y-Z kolu ve ameliyat masası ayrılabilir, bu da küçük bir hayvanın omuriliğinin açığa çıktığı ameliyat prosedürü için yeterli alan bırakır. Ameliyat masası, çalışma sırasında serbestçe hareket ettirilebilir, bu da konum sınırlamalarına atfedilen potansiyel çalışma zorluğunu azaltır. Vertebral stabilizatörün gövdesi, esnekliğini artıran yön yardımı için üç eklemli bir evrensel kola sahiptir. (B) Darbeci ucunu manşona takın ve ikincisini X-Y-Z koluna monte edin. Ağırlığın düşmesini önlemek için çekme piminin ucunu ağırlığın deliklerine yerleştirin ve ağırlığı manşona yerleştirin. Parçalar monte edildiğinde, hedeflenen yaralanma alanını mikroskop altında bulun. Daha sonra, X-Y-Z kolunu, darbeci ucunun sonuna kadar indirin, gözlem penceresinin alt seviyesiyle tutarlı olur, bu da birleşik bir kontüzyon yüksekliğine ulaşıldığını gösterir (ağırlık ile darbeci ucu arasındaki yükseklik, düşme başladığında 22 mm'dir). Çekme pimini çekin ve etki yapılacaktır. (C) Yaralanma alanı açığa çıktıktan sonra, vertebral stabilizatörü stabilize etmek için farenin omurgasını ve sıkma cıvatasını kelepçelemek ve sabitlemek için klipsleri kullanın. (D) Ameliyat masasındaki oluklar için önerilen fonksiyonlar. Deney hayvanının, başı yamaçtaki ön, torasik kısma doğru olacak şekilde orta oluğa yerleştirilmesi gerekir. X-Y-Z kolu ameliyat masasından ayrılmıştır. (E) Birleştirilmiş SCICP'nin bir göstergesi. Oklar parçaları gösterir. Uç hedef kontüzyon alanını hedef alırken, kontüzyonu başlatmak için çekme pimini çıkarın ve ağırlık, omuriliği kontrol etmek için darbeci ucuna düşecektir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: T13 kostovertebral vertebra konumlandırma yönteminin görüntüleme grafiği. (A) 13. kaburga ve T13 nispeten sabit anatomik yapılardır. T13 kostovertebral açısı, operatörün dikenli prosese doğru problama yapabileceği ve T12-T13 interspinöz alanını bulabileceği mikroskop altında kolayca tespit edilebilir. Daha sonra, hedef yaralanma omurunu (örneğin, T9) bulmak için rostral tarafa doğru art arda sondalayın. (B) Minimal invaziv 9. torasik laminektomi, komşu vertebral cisimler arasındaki yeterli lamina ve faset eklemlerini koruyabilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Farelerde T9 seviyesi omuriliğin maruz kalması ve kontüzyonu . (A) T13 kostovertebral açısını araştırın. (B) Paraspinal kas, operasyon için yeterli alan açmak için mikro retraktörler tarafından geri çekildiğinde, T9'u açığa çıkarın. (C) T9 laminektomiyi mikro makasla yapın. (D) Omurları vertebral stabilizatörün klipsleri ile stabilize edin. (E) Darbeci ucu ile hedef kontüzyon alanını hedefleyin. (F) Kontüzyon sonrası yaralanma bölgesinde ödem ve tıkanıklık görülür. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Farelerde farklı SCI derecelerinden sonraki 28. günde temsili bölümler (koronal kesitler). (A) Farenin normal torasik omuriliği. Ölçek çubuğu = 500 μm. (B) Hafif grup için, omuriliğin dorsal yönünde, hafif yaralanmalar kaydedilebilirken, korunan beyaz cevherin ve gri cevherin morfolojisi büyük ölçüde korunur. (C) Orta grupta, omurilikte belirgin skar dokusu gözlenir (kırmızı yıldız işareti ile gösterilir). Beyaz madde ve gri madde arasındaki ayırt edici özellikler zar zor ayırt edilebilir. (D) Karşılaştırmalı olarak, şiddetli grubun omuriliği neredeyse orijinal morfolojisini kaybetmiş ve neredeyse skar dokusu ile değiştirilmiştir. Yeşil kesikli çizgi hasar alanını, siyah kesikli çizgi ise gözlemlenebilir gri maddenin sınırını gösterir. Yaralanmanın şiddeti arttıkça, farenin omuriliğinde daha büyük bir lezyon ve daha az korunmuş bir yapı ortaya çıktı ve gri madde sınırı zar zor ayırt edilebildi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Farelerin omuriliğinin yaralanmasından sonraki 1. ve 56. günlerde temsili bölümler (sagital bölümler). (A) Farenin normal torasik omuriliği. (B) B1-B3, hafif, orta ve şiddetli gruplarda yaralanmadan sonraki 1. günde sırasıyla omuriliği temsil eder. Hasar arttıkça lezyon merkezinde daha geniş bir alanın bozulduğu veya sıvılaştığı görülebilir. Ventral omurilikteki beyaz cevherin devamlılığı, farklı yaralanma yoğunluklarına bağlı olarak farklılık göstermiştir. B1, ventral omurilikteki beyaz cevherin hafif ödem ile daha iyi sürekliliğe sahip olduğunu gösterir. B2, ventral omurilikteki beyaz cevherin daha zayıf devamlılığını ve daha şiddetli ödemi gösterir. B3 SCI'nin merkezindeki doku neredeyse tüm sürekliliğini kaybetmiştir ve yaralanmanın merkezi dışındaki alanda geniş ödem vardır. (C) C1-C3, hafif, orta ve şiddetli gruplarda yaralanmadan sonraki 56. günde sırasıyla omuriliği temsil eder. Farklı gruplar arasında yaralanma merkezinde farklı derecelerde skar kontraktürü ortaya çıktı ve yaralanma alanının çapında anlamlı bir fark vardı. Ölçek çubuğu = 500 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Farelerde omuriliğin yaralanmasından sonraki 56. günde temsili bölümler (sagital bölümler). (A) Hafif grubun temsili bölümü. NF200 nörofilamenti gösterirken, GFAP astrositleri gösterir. Lezyon merkez üssünde üst üste binen astrositler gözlenirken, omuriliğin ventral kısmındaki nörofilament iyi bir süreklilik içindedir. (B) Ilımlı grubun temsili bölümü. Üst üste binen astrositlere ek olarak iki skar merkezi (kırmızı yıldızlarla gösterilir) gözlemlenebilirken, ventral yöndeki nörofilament sürekliliğe sahiptir. (C) Şiddetli grubun, geniş bir lezyon aralığı ve masif skar oluşturan astrositlerle temsil edilen bölümü. Belirgin bir skar merkezi gözlenmez ve nörofilamentin sürekliliği zayıftır. Ölçek çubuğu = 500 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: Aynı yükseklikten ancak farklı ağırlıklarla üretilen kuvvet. Deneyden önce, aynı yükseklikten salınan farklı ağırlık kütleleri tarafından üretilen kuvvet, bir pik basınç algılama cihazı kullanılarak tespit edildi. Her grup 24 tespiti tamamladıktan sonra, vurucu kuvvetin referansı için daha güvenilir yerçekimi verileri elde edildi. Veriler SPSS19.0 istatistik yazılımı kullanılarak analiz edilmiştir. Veriler her grupta ortalama ± SD, n = 24 olarak sunulmaktadır. Daha fazla grup arasındaki karşılaştırmalar, farklılıkları test etmek için kullanılan tek yönlü bir varyans analizine (ANOVA) dayanıyordu; p < 0.05 istatistiksel olarak anlamlı bulundu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| 28 dpi | |||
| Grup | GMR (%) | WMR (%) | DR (%) |
| Normal | 35.44 | 64.57 | 0 |
| Hafif | 11.59 | 64.88 | 23.53 |
| Ilımlı | 0 | 41.14 | 58.86 |
| Şiddetli | 0 | 0 | 100 |
Tablo 1: Beyaz cevher, gri cevher ve yaralanma sonrası 28. günde hasar oranı. Kısaltmalar: dpi = yaralanma sonrası günler, DA = hasarlı alan; GMR = gri madde oranı; WMR = beyaz madde oranı; DR = hasarlı oran.
| Grup | 1dpi DA (μm2) | 56dpi DA (μm2) |
| Normal | 0 | 0 |
| Hafif | 2391250 | 666091 |
| Ilımlı | 4383381 | 1263191 |
| Şiddetli | 5118833 | 1943962 |
Tablo 2: Yaralanma sonrası 1. ve 56. günlerde sagital kesitlerdeki lezyon arasındaki karşılaştırmalar.
Discussion
Standartlaştırılmış prosedür sayesinde, özellikle hayvanlar arasındaki bireysel farklılıkların neden olduğu sonuçların sapmasını en aza indirgeyebilen küçük hayvan in vivo deneylerinde kararlı veriler elde edilebilir. Yukarıdaki koşullara ve uygun uygulama cihazlarına dayanarak, standartlaştırılmış, minimal invaziv, doğru ve tekrarlanabilir SCI modelleri oluşturulabilir.
Uygulanabilirliği ve rahatlığı nedeniyle, daha önce, ağırlık düşüşü darbecisi çoğunlukla3 olarak kullanılmıştır. Bu çalışmada tanıtılan darbeci, Allen'ın model12'si ile aynı prensibi paylaşıyor. Neyse ki, modern işleme teknolojisinin doğru üretim avantajları nedeniyle, araştırma ekibi kullanımı kolay, güçlü bir şekilde kararlı ve nadiren yanlış olmasının avantajlarına sahip bir ağırlık düşüşü darbecisi tasarladı. Farklı ağırlıkların yerçekimini ölçmek için bir pik basınç algılama cihazı kullanıldı. Infinite Horizons darbecisi ile ilgili önceki çalışmalar6,10, 30 Kdyn, 50 Kdyn ve 70 Kdyn gruplarında amaçlanan kuvvetten sapan ±5 Kdyn kuvvet aralığının kabul edildiğini bildirmiştir ve bu da grup bölünmesi ve kontüzyon derecesi seçimi açısından bu çalışma için bir referans sağlamaktadır. Bu araştırmada, farklı grupların olası kuvveti önceden ölçülmüş ve daha doğru veriler elde edilmiştir.
Hayvan modeli deneylerinde cihazdan daha kritik olanı, fare anatomisinin anlaşılması ve kullanılmasıdır. Anatomiyi iyi kullanmak, prosedürleri minimal invaziv hale getirebilir. Minimal invaziv cerrahi, deney hayvanının fonksiyonel durumunun stabilitesini ve sonraki fare iyileşmesinin tutarlılığını doğrudan etkiler. Önceki çalışmalar, SCI modellerinin minimal invaziv kurulumunun vertebral yapının stabilitesini arttırdığını ve sıçanlarda iyileşme sırasında spinal instabilitenin neden olduğu ek hasarı önlediğini göstermiştir1. Minimal invaziv cerrahinin öncülü, doğal anatomik yapıların makul kullanımıdır. Bu nedenle, omurilik segmentlerinin hızlı ve hassas bir şekilde yerleştirilmesi, farelerin anatomik yapısına uygun olarak yapılmalıdır. Bildirildiği gibi, görüntüleme yöntemi vertebrayı bulmak için kullanıldı13. Yüksek doğruluğa sahip olmasına rağmen, gerçek deneysel operasyon sürecinde, konumlandırma için görüntüleme yönteminin uygunsuz çalışma, uzun çalışma süresi, karmaşık ekipman edinimi ve yüksek ekipman doğruluğu gereksinimleri gibi dezavantajları vardır. McDonough ve ark., T7'yi kürek kemiği14'ün alt açılarından bulmayı tarif ederken, fareler bir yalan secdesinde hareket ederken, bahsedilen aşağı açıların arka açılar olması gerekiyordu. Dahası, T7'yi bulmak için alt skapular uçları kullanmak, fareler için uygun olmayan insan anatomisi15'teki belirli bir pozisyon için bir konumlandırma yöntemidir. Son olarak, Mikro-BT verileri, kürek kemiğinin arka açılarının, farenin doğal veya spesifik vücut pozisyonunda olup olmadığına bakılmaksızın T7 ile aynı hizada olmadığı hipotezini de doğruladı. McDonough ve ark.14 ayrıca fare kemerli olduğunda sırtın en yüksek noktasını bulmaktan ve en yüksek noktayı T12 olarak tanımlamaktan bahsetti. Karşılaştırmalı olarak, bu araştırmada, T9, farenin duruşuyla ilişkili olmayan veya etkilenmeyen T12-T13 interspinöz uzayın yardımıyla yerleştirilmiştir. Ayrıca bu yöntemle hedef omurlar kolayca yerleştirilebilir ve ameliyat edilebilir. Kişi mikroskop altında 13. kaburgayı araştırmalı, kostovertebral açının alanına hafifçe dokunmalı, dikenli sürece doğru bir çizgi çizmeli ve ardından T12-T13'ün dikenli süreçleri arasındaki boşluğu kafaya doğru araştırmalıdır. Araştırma ekibi, 12 farenin T9'unu bulmak için T12-T13 interspinöz alanını kullandı. Son olarak, 12 dişi C57BL / 6J fare, T9 lokalizasyonu ve laminektomiden sonra Mikro-BT taraması yapıldı. Mikro-BT taramasının sonucu, 12 farenin hepsinde çıkarılan laminaların T9 olduğunu gösterdi. Micro-CT'nin sonuçları, tüm T9'un doğru bir şekilde yerleştirildiğini ve doğruluğun kürek kemiği konumlandırma yönteminden önemli ölçüde daha yüksek olduğunu göstermiştir. Bu yöntem bize yaralanma modelinin tutarlılığına katkıda bulunan hızlı ve doğru bir yer bulma yolu sağlar.
Mevcut protokolün minimal invazivliği temel olarak üç açıdan telaffuz edilmektedir. İlk olarak, bulunduktan sonra, T9 seviyesindeki paraspinal kaslar, T8 veya T10 seviyelerindeki kaslara zarar vermeden, sadece mikro retraktörler tarafından geri çekilir. Ayrıca, laminanın mikro retraktörler tarafından maruz kalması görme alanına müdahale etmez. İkincisi, çoğunlukla laminektomiden kaynaklanan, cancellous kemikten kan çıkışına neden olabilen kan kaybı, operasyon prosedüründe çok düşüktür, neredeyse 2 mm x 2 mm x 3 mm üçgen pamuk parçasını lekeleme hacminden daha fazla değildir. Üçüncü olarak, laminektomi büyük ölçüde ihtiyaç duyulan alanla sınırlı olarak yapıldı, laminanın lateral kısmının sürekliliği korundu ve vertebra instabilitesini büyük ölçüde azalttı. Önceki protokoller16,17 ile karşılaştırıldığında, mevcut protokol gereksiz hasarları çok daha az azaltmaktadır.
Farklı SCI derecelerini değerlendirmek için, histopatolojideki tüm gruplar arasındaki sonuçlar, önceki çalışmaların 9,11,18'i göstermiş olduğu sonuçlarla karşılaştırılmıştır. Bu sonuçlar, farklı yaralanma dereceleri ve farklı dönemlerdeki değişikliklerin gözlemsel bir çalışmasını tamamlamak için yeterlidir. HE ve immünofloresan, SCI'nin şiddetindeki artışlarla birlikte, omurilik dokusunda daha anormal morfolojinin ortaya çıktığını ve hasar derecesindeki artışın da omuriliğin yapısal bozukluğunun derecesinde bir artışa yol açtığını göstermiştir. Doku morfolojisi gözlemi açısından bakıldığında, bu çalışmadaki her deney grubundaki doku morfolojisi değişikliklerinin derecesi ve düzenliliği önceki çalışmalarla oldukça tutarlıdır.
Mevcut histolojik test sonuçlarına göre, farklı derecelerde travmatik SKY'den sonra çeşitli göstergelerde açık değişiklikler belirtilmekte ve bu da bu çalışmada kurulan modelin güvenilirliğini daha da doğrulamaktadır.
Teknik doğru ve etkili olsa da, yöntemler için potansiyel sınırlamalar olabilir. Laminektomi ile ilgili olarak, operatör omuriliğin yanlışlıkla hasar görmesini önlemek için mikroskop altındaki operasyonlar konusunda yetenekli olmalıdır. Ayrıca, tüm platformun kurulumu mekanik yapılara dayanmaktadır ve operatör için otomize edilmiş ekipmana kıyasla daha yüksek bir talep oluşturmaktadır. Gerçekten de, bahsedilen tüm problemler, operasyonun tekrarlanan eğitimi ile iyileştirilebilir.
Minimal invaziv ve standartlaştırılmış modellemenin, sonuçların daha tekdüze, stabil ve tekrarlanabilir hale getirilmesinde, çeşitli tedavi planlarının etkinliğinin doğru bir şekilde değerlendirilmesinde ve travmatik SCI için araştırma planının optimize edilmesinde yararlı olduğu görülebilir.
Disclosures
Profesör Shiqing Feng, omurilik yaralanması koaksiyel platformunun mülkiyetine sahiptir.
Acknowledgments
Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Devlet Anahtar Programı (81930070) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% fixative solution | Solarbio | P1110 | 4% |
| Anti-Neurofilament heavy polypeptide antibody | abcam | ab8135 | Dilution ratio (1: 2000) |
| Eosin Staining Solution (water soluble) | biosharp | BL727B | |
| Ethanol | Fuyu Reagent | 64-17-5 | |
| Fluorescent microscope | KEYENCE | BZ-X800 | |
| Frozen Slicer | leica | CM3050 S | |
| GFAP (GA5) Mouse mAb | Cell Signaling TECHNOLOGY | #3670 | Dilution ratio (1: 600) |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | ThermoFisher SCIENTIFIC | A32723TR | Dilution ratio (1: 1000) |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 594 | ThermoFisher SCIENTIFIC | A32740 | Dilution ratio (1: 1000) |
| Hematoxylin Staining Solution | biosharp | BL702A | |
| Mice | Jinan Pengyue Experimental AnimalCompany | C57BL/6J | |
| Microsurgery apparatus | Shandong ULT Biotechnology Co., Ltd | All the surgey instruments are custom-made | Ophthalmic scissors, micro mosquito forceps, microsurgery forceps, micro scissors |
| Normal sheep serum for blocking (working solution) | Zhong Shan Jin Qiao | ZLI-9022 | working solution |
| O.C.T. Compound | SAKURA | 4583 | |
| PBS (phosphate buffered solution) | Solarbio | P1020 | pH 7.2-7.4 |
| RWD Laboratory inhalation anesthetic station | RWD Life Science Co., Ltd | R550 | |
| Small animal in vivo microCT imaging system | PerkinElmer | Quantum GX2 | |
| Spinal cord injury coaxial platform | Shandong ULT Biotechnology Co., Ltd | Custom-made(Feng's standard) | (https://shop43957633.m.youzan.com/wscgoods/detail/367x5ovgn69q18g?banner_id=f.81386274~goods.7~1~ b0yRFKOq&alg_id=0&slg=tagGood List-default%2COpBottom%2Cuuid %2CabTraceId&components_style_ layout=1&reft=1659409105184&sp m=g.930111970_f.81386274&alias =367x5ovgn69q18g&from_uuid=136 2cc46-ffe0-6886-2c65-01903dbacbb a&sf=qq_sm&is_share=1&shopAuto Enter=1&share_cmpt=native_ wechat&is_silence_auth=1) |
| Surgery microscope | Zumax Medical Co., Ltd. | zumax, OMS2355 | |
| TBST (Tris Buffered Saline+Tween) | Solarbio | T1082 | Dilution ratio (1: 19) |
| Xylene | Fuyu Reagent | 1330-20-7 |
References
- Duan, H., et al. A novel, minimally invasive technique to establish the animal model of spinal cord injury. Annals of Translational Medicine. 9 (10), 881 (2021).
- Piao, M. S., Lee, J. -K., Jang, J. -W., Kim, S. -H., Kim, H. -S. A mouse model of photochemically induced spinal cord injury. Journal of Korean Neurosurgical Society. 46 (5), 479-483 (2009).
- Sharif-Alhoseini, M., et al. Animal models of spinal cord injury: A systematic review. Spinal Cord. 55 (8), 714-721 (2017).
- Zhang, N., Fang, M., Chen, H., Gou, F., Ding, M. Evaluation of spinal cord injury animal models. Neural Regeneration Research. 9 (22), 2008-2012 (2014).
- Borges, P. A., et al. Standardization of a spinal cord lesion model and neurologic evaluation using mice. Clinics. 73, 293 (2018).
- Ghasemlou, N., Kerr, B. J., David, S. Tissue displacement and impact force are important contributors to outcome after spinal cord contusion injury. Experimental Neurology. 196 (1), 9-17 (2005).
- Siddall, P., Xu, C. L., Cousins, M. Allodynia following traumatic spinal cord injury in the rat. Neuroreport. 6 (9), 1241-1244 (1995).
- Ford, J. C., et al. MRI characterization of diffusion coefficients in a rat spinal cord injury model. Magnetic Resonance in Medicine. 31 (5), 488-494 (1994).
- Basso, D. M., Beattie, M. S., Bresnahan, J. C. Graded histological and locomotor outcomes after spinal cord contusion using the NYU weight-drop device versus transection. Experimental Neurology. 139 (2), 244-256 (1996).
- Nishi, R. A., et al. Behavioral, histological, and ex vivo magnetic resonance imaging assessment of graded contusion spinal cord injury in mice. Journal of Neurotrauma. 24 (4), 674-689 (2007).
- Ma, M., Basso, D. M., Walters, P., Stokes, B. T., Jakeman, L. B. Behavioral and histological outcomes following graded spinal cord contusion injury in the C57Bl/6 mouse. Experimental Neurology. 169 (2), 239-254 (2001).
- Allen, A. R. Surgery of experimental lesion of spinal cord equivalent to crush injury of fracture dislocation of spinal column. The Journal of the American Medical Association. (11), 878-880 (1911).
- Kuhn, P. L., Wrathall, J. R. A mouse model of graded contusive spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 15 (2), 125-140 (1998).
- McDonough, A., Monterrubio, A., Ariza, J., Martinez-Cerdeno, V. Calibrated forceps model of spinal cord compression injury. Journal of Visualized Experiments. (98), e52318 (2015).
- Ernst, M. J., Rast, F. M., Bauer, C. M., Marcar, V. L., Kool, J. Determination of thoracic and lumbar spinal processes by their percentage position between C7 and the PSIS level. BMC Research Notes. 6, 58 (2013).
- Wu, X., et al. A tissue displacement-based contusive spinal cord injury model in mice. Journal of Visualized Experiments. (124), e54988 (2017).
- Bhalala, O. G., Pan, L., North, H., McGuire, T., Kessler, J. A. Generation of mouse spinal cord injury. Bio-protocol. 3 (17), 886 (2013).
- Shinozaki, M., et al. Novel concept of motor functional analysis for spinal cord injury in adult mice. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 157458 (2010).
