Minimalt invasive teknikker og en enkel laboratorieanordning forbedrer reproduserbarheten av ryggmargsskademodellen ved å redusere operativ skade på forsøksdyrene og tillate anatomisk morfologivedlikehold. Metoden er verdt fordi pålitelige resultater og reproduserbar prosedyre letter undersøkelser av mekanismene for sykdomsoppreisning.
Bruk av minimalt invasive metoder for å modellere ryggmargsskade (SCI) kan minimere atferdsmessige og histologiske forskjeller mellom eksperimentelle dyr, og dermed forbedre reproduserbarheten av forsøkene.
Disse metodene trenger to krav som skal oppfylles: klarhet i den kirurgiske anatomiske banen og enkelhet og bekvemmelighet av laboratorieenheten. Avgjørende for operatøren er at en klar anatomisk vei gir minimal invasiv eksponering, noe som unngår ytterligere skade på forsøksdyret under de kirurgiske prosedyrene og gjør det mulig for dyret å opprettholde en konsistent og stabil anatomisk morfologi under forsøket.
I denne studien undersøkes bruken av en ny integrert plattform kalt SCI-koaksialplattformen for ryggmargsskade hos små dyr for å eksponere ryggmargen på T9-nivå på en minimal invasiv måte og stabilisere og immobilisere vertebraen til mus ved hjelp av en vertebral stabilisator, og til slutt brukes en koaksial tyngdekraftspåvirkning til å forvirre ryggmargen til mus for å nærme seg forskjellige grader av T9 ryggmargsskade. Til slutt gis histologiske resultater som referanse for leserne.
Traumatisk ryggmargsskade (SCI) predisponerer lett individet for alvorlige konsekvenser1; Likevel er det ingen effektiv behandling i dag 1,2. Dyrekontusjonsmodeller er en av de viktigste metodene for å studere SCI 3,4.
Fra 2004 til 20144 ble rotter brukt som modellorganismer i 289 av 407 studier (71%) og mus i 69 (16,9%). Faktisk har andelen eksperimenter med mus gradvis økt gjennom årene på grunn av deres fordeler i forhold til andre modeller, spesielt det store potensialet for genreguleringsstudier 3,4,5. Derfor er det nødvendig med mer kompatible verktøy for å gjennomføre flere studier ved å bruke musen som modell på grunn av den store betydningen som er knyttet til modellkonsistens6. De vanlige enhetene som er rapportert i tidligere studier, er i utgangspunktet basert på Allens ryggmargspåvirkningsprinsipp, for eksempel den grunnleggende vektdråpepåvirkningen7,8, New York University (NYU) / Multicenter Animal Spinal Cord Injury Studies (MASCIS) impactor1,9, og Infinite Horizon (IH) impactor10,11 . Vektfallspåvirkningen og NYU/MASCIS-støtfangeren deler det samme prinsippet om å sikte mot den målrettede ryggmargen og slippe en fast vekt fra forskjellige høyder for å gjøre forskjellige skadealvorlighetsgrader. IH-impactoren skaper ryggmargsskaden i henhold til forskjellige krefter.
For enkelhets skyld ved bruk av musemodellen i SCI-studier og for å etablere grunnlaget for effektive behandlingsmetoder, utvikles en integrert ryggmargsskadeskadeplattform, kalt ryggmargsskadekoaksialplattformen (SCICP). Plattformen består av fire hovedkomponenter: (1) et dyreoperasjonsbord designet for en passende posisjon for opererte mus, som er svært kompakt og gir bekvemmelighet uten posisjonsbegrensning; (2) en mikro-retractor på begge sider for å holde paravertebrale muskler under drift; (3) en vertebral stabilisator for å holde vertebraen før prosedyren for SCI (to vertebrale stabilisatorer er tilgjengelige for drift på større dyr som rotter); (4) en hylse, en støtfangerspiss, vekter og en trekkpinne. De tre delene skal monteres til en avtagbar X-Y-Z-arm. For presis målretting plasseres en støtfangerspiss på overflaten av ryggmargen, og X-Y-Z-armen går forsiktig ned til forventet høyde ved hjelp av merket mellom støtfangerspissen og hylsen. Støtfangerspissen er laget av en 0,12 g aluminiumslegering for å unngå skade på ryggmargen som tilskrives stor vektkompresjon før prosedyren. Trekkstiften er for å holde vektene på toppen av ermet for å forberede vektfallet (figur 1).
I tidligere studier ble slagkraftdeling definert i henhold til IH-enhetens slagkraftdata, som er henholdsvis 30 Kdyn, 50 Kdyn og 70 Kdyn, 6,10. Under forskningsprosessen ble serielle grader av SCI-modeller vist seg å være etablert basert på SCICP, som kan brukes i ulike studier. Derfor, før eksperimentet offisielt startet, ble slagkreftene generert av forskjellige vekter av forskjellige masser testet ved hjelp av en topptrykkstestingsanordning. Som et resultat ble tre standardiserte representative SCI-musemodeller valgt som tre forskjellige grader av skade, inkludert graderte milde, moderate og alvorlige grupper, henholdsvis 6,10, og vektene ble utgitt i samme høyde, med en vekt på 1,3 g for mild, 2,0 g for moderat og 2,7 g for alvorlig skade.
Som et annet middel for å garantere brukbarhet og nøyaktighet, rapporteres en ny og minimal invasiv operativ tilnærming. Gjennom å undersøke anatomien til normale mus, finnes en ny metode for å lokalisere det interspinøse rommet til T12-T13. Metoden for lokalisering av ryggvirvler i operasjonstrinnene er enkel å mestre og nøyaktig, noe som sikrer presis lokalisering for minimalt invasive operasjoner.
Forhåpentligvis kan denne teknikken for kontusjonsskade hjelpe forskning og forståelse av ryggmargsskade, inkludert patofysiologisk forståelse, ledelsesevaluering og så videre.
Gjennom den standardiserte prosedyren kan stabile data oppnås, spesielt i små dyr in vivo eksperimenter, noe som kan minimere avviket fra resultater forårsaket av individuelle forskjeller mellom dyrene. Basert på ovennevnte forhold og praktiske applikasjonsinstrumenter, kan standardiserte, minimalt invasive, nøyaktige og repeterbare SCI-modeller etableres.
På grunn av sin gjennomførbarhet og bekvemmelighet ble tidligere vektdråpepåvirkningen brukt mest3. Impactoren introdusert i denne studien deler det samme prinsippet med Allens modell12. Heldigvis, på grunn av de nøyaktige produksjonsfordelene ved moderne maskineringsteknologi, designet forskerteamet en vektfallspåvirkning med fordelene ved å være enkel å betjene, sterkt stabil og sjelden unøyaktig. En topptrykksdeteksjonsenhet ble brukt til å måle tyngdekraften til forskjellige vekter. Tidligere studier6,10 om Infinite Horizons-nedslagsfeltet rapporterte at et ±5 Kdyn-kraftområde som avviker fra den tiltenkte kraften, aksepteres i 30 Kdyn-, 50 Kdyn- og 70 Kdyn-gruppene, som gir en referanse for den nåværende studien når det gjelder gruppedeling og kontusjonsgradsvalg. I denne forskningen ble den mulige kraften til forskjellige grupper målt på forhånd, og mer nøyaktige data ble oppnådd.
Mer kritisk enn enheten i dyremodellforsøk er forståelsen og bruken av museanatomi. Å gjøre god bruk av anatomi kan gjøre prosedyrer minimalt invasive. Minimal invasiv kirurgi påvirker direkte stabiliteten til det eksperimentelle dyrets funksjonelle tilstand og konsistensen av etterfølgende musegjenoppretting. Tidligere studier har vist at minimal invasiv etablering av SCI-modeller øker stabiliteten i vertebralstrukturen og unngår ytterligere skade forårsaket av spinal ustabilitet under gjenoppretting hos rotter1. Forutsetningen for minimal invasiv kirurgi er rimelig bruk av naturlige anatomiske strukturer. Derfor bør den raske og presise lokaliseringen av ryggmargssegmenter gjøres i samsvar med musens anatomiske struktur. Som rapportert ble bildemetoden brukt til å finne vertebra13. Selv om den har høy nøyaktighet, i den faktiske eksperimentelle operasjonsprosessen, har bildemetoden for lokalisering ulempene med ubeleilig drift, lang driftstid, kompleks utstyrsinnsamling og høye krav til utstyrsnøyaktighet. McDonough og medarbeidere beskrev å lokalisere T7 gjennom de nedre vinklene til scapulas14, mens mus virker i en løgn nedbrutt, så de nevnte underordnede vinklene skal være bakre vinkler. Videre er bruk av de nedre scapular tipsene for å finne T7 en lokaliseringsmetode for en bestemt posisjon i menneskelig anatomi15, som ikke er egnet for mus. Til slutt validerte mikro-CT-data også hypotesen om at de bakre vinklene til scapulae ikke er flush med T7 uavhengig av om musen er i sin naturlige eller spesifikke kroppsposisjon. McDonough et al.14 nevnte også å finne det høyeste punktet på ryggen når musen er buet og definere det høyeste punktet som T12. Til sammenligning, i den foreliggende forskningen, ligger T9 ved hjelp av T12-T13 interspinøst rom, som verken er forbundet med eller påvirket av musens holdning. Dessuten, med denne metoden, kan målvirvelen lett lokaliseres og opereres på. Man bør sonde den 13. ribben under mikroskopet, forsiktig berøre området av costovertebral vinkelen, tegne en linje mot den spinøse prosessen, og deretter sonde mellomrommet mellom de spinøse prosessene til T12-T13 mot hodet. Forskningsgruppen brukte T12-T13 interspinous plass for å finne T9 av 12 mus. Til slutt hadde 12 kvinnelige C57BL / 6J-mus en mikro-CT-skanning etter T9-plasseringen og laminektomi. Resultatet av Micro-CT-skanningen indikerte at den fjernede laminae i alle 12 musene var T9. Resultatene av Micro-CT viste at alle T9 var nøyaktig plassert, og nøyaktigheten var betydelig høyere enn scapula-lokaliseringsmetoden. Denne metoden gir oss en rask og nøyaktig måte å lokalisere på, noe som bidrar til konsistensen av skademodellen.
Den nåværende protokollens minimale invasivitet uttales hovedsakelig i tre aspekter. For det første, etter lokalisering, blir de paraspinale musklene på T9-nivået bare trukket tilbake av mikroretraktorer, uten å skade musklene på T8- eller T10-nivåene. Dessuten forstyrrer eksponeringen av lamina av mikroretraktorene ikke synsfeltet. For det andre er blodtap, som hovedsakelig er fra laminektomi, noe som kan føre til blodutstrømning fra det avstivende beinet, svært lavt i operasjonsprosedyren, nesten ikke mer enn volumet for å flekke et 2 mm x 2 mm x 3 mm trekantet stykke bomull. For det tredje ble laminektomi utført begrenset til det nødvendige området i størst grad, opprettholde kontinuitet i den laterale delen av lamina og sterkt dempe vertebra ustabilitet. Sammenlignet med tidligere protokoller16,17, reduserer den nåværende protokollen mye unødvendig skade.
For å evaluere de ulike grader av SCI ble resultatene mellom alle grupper i histopatologi sammenlignet med hva tidligere studier allerede har vist 9,11,18. Disse resultatene er tilstrekkelige til å fullføre en observasjonsstudie av ulike grader av skade og endringer i ulike perioder. HE og immunfluorescens viste at med økning i alvorlighetsgraden av SCI oppstod mer unormal morfologi i ryggmargsvevet, og økningen i graden av skade førte også til en økning i graden av strukturell lidelse i ryggmargen. Fra perspektivet til vevsmorfologiobservasjon er graden og regelmessigheten av vevsmorfologiendringer i hver eksperimentell gruppe i denne studien svært konsistent med tidligere studier.
I henhold til gjeldende histologiske testresultater indikeres klare endringer i ulike indikatorer etter ulike grader av traumatisk SCI, noe som ytterligere bekrefter påliteligheten til modellen etablert i denne studien.
Nøyaktig og effektiv selv om teknikken er, kan potensielle begrensninger eksistere for metodene. Når det gjelder laminektomi, bør operatøren være dyktig med operasjoner under mikroskopet for å forhindre at ryggmargen blir skadet ved en feiltakelse. Oppsettet av hele plattformen er også basert på mekaniske strukturer, noe som setter en høyere etterspørsel etter operatøren sammenlignet med automatisert utstyr. Faktisk kan alle de nevnte problemene forbedres ved gjentatt trening av operasjonen.
Det kan sees at minimalt invasiv og standardisert modellering er gunstig for å gjøre resultatene mer ensartede, stabile og repeterbare, evaluere effekten av ulike behandlingsplaner nøyaktig og optimalisere forskningsplanen for traumatisk SCI.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av State Key Program of National Natural Science of China (81930070).
4% fixative solution | Solarbio | P1110 | 4% |
Anti-Neurofilament heavy polypeptide antibody | abcam | ab8135 | Dilution ratio (1: 2000) |
Eosin Staining Solution (water soluble) | biosharp | BL727B | |
Ethanol | Fuyu Reagent | 64-17-5 | |
Fluorescent microscope | KEYENCE | BZ-X800 | |
Frozen Slicer | leica | CM3050 S | |
GFAP (GA5) Mouse mAb | Cell Signaling TECHNOLOGY | #3670 | Dilution ratio (1: 600) |
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | ThermoFisher SCIENTIFIC | A32723TR | Dilution ratio (1: 1000) |
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 594 | ThermoFisher SCIENTIFIC | A32740 | Dilution ratio (1: 1000) |
Hematoxylin Staining Solution | biosharp | BL702A | |
Mice | Jinan Pengyue Experimental AnimalCompany | C57BL/6J | |
Microsurgery apparatus | Shandong ULT Biotechnology Co., Ltd | All the surgey instruments are custom-made | Ophthalmic scissors, micro mosquito forceps, microsurgery forceps, micro scissors |
Normal sheep serum for blocking (working solution) | Zhong Shan Jin Qiao | ZLI-9022 | working solution |
O.C.T. Compound | SAKURA | 4583 | |
PBS (phosphate buffered solution) | Solarbio | P1020 | pH 7.2-7.4 |
RWD Laboratory inhalation anesthetic station | RWD Life Science Co., Ltd | R550 | |
Small animal in vivo microCT imaging system | PerkinElmer | Quantum GX2 | |
Spinal cord injury coaxial platform | Shandong ULT Biotechnology Co., Ltd | Custom-made(Feng's standard) | (https://shop43957633.m.youzan.com/wscgoods/detail/367x5ovgn69q18g?banner_id=f.81386274~goods.7~1~ b0yRFKOq&alg_id=0&slg=tagGood List-default%2COpBottom%2Cuuid %2CabTraceId&components_style_ layout=1&reft=1659409105184&sp m=g.930111970_f.81386274&alias =367x5ovgn69q18g&from_uuid=136 2cc46-ffe0-6886-2c65-01903dbacbb a&sf=qq_sm&is_share=1&shopAuto Enter=1&share_cmpt=native_ wechat&is_silence_auth=1) |
Surgery microscope | Zumax Medical Co., Ltd. | zumax, OMS2355 | |
TBST (Tris Buffered Saline+Tween) | Solarbio | T1082 | Dilution ratio (1: 19) |
Xylene | Fuyu Reagent | 1330-20-7 |