Login processing...

JoVE Journal
Cancer Research

This content is Free Access.

JoVE Journal Cancer Research

Engineering onkogen heterozygot gain-of-function mutationer i humane hæmatopoietiske stamceller og stamceller

CAM-Delam Assay to Score Metastatic Properties by Quantifying Delamination and Invasion Capacity of Cancer Cells

Journal (Cancer Research)

CAM-Delam Assay to Score Metastatic Properties by Quantifying Delamination and Invasion Capacity of Cancer Cells

Longitudinal Intravital Imaging Through Clear Silicone Windows

Journal (Cancer Research)

Longitudinal Intravital Imaging Through Clear Silicone Windows

Click here for the English version

Engineering onkogen heterozygot gain-of-function mutationer i humane hæmatopoietiske stamceller og stamceller

Article DOI: 10.3791/64558-v

March 10th, 2023 •

Tommaso Sconocchia¹, Johannes Foßelteder¹, Thomas Köhnke², Ravindra Majeti², Andreas Reinisch^1,3

¹Division of Hematology, Department of Internal Medicine, Medical University of Graz, ²Division of Hematology, Stanford Cancer Institute, Stanford Institute for Stem Cell Biology and Regenerative Medicine, Stanford University School of Medicine, ³Department of Blood Group Serology and Transfusion Medicine, Medical University of Graz

Chapters

Summary
Automatic Translation

English (Original)
العربية (Arabic)
中文 (Chinese)
dansk (Danish)
Nederlands (Dutch)
français (French)
Deutsch (German)
עברית (Hebrew)
हिंदी (Hindi)
italiano (Italian)
日本語 (Japanese)
한국어 (Korean)
norsk (Norwegian)
português (Portugese)
русский (Russian)
español (Spanish)
svenska (Swedish)
Türkçe (Turkish)

March 10th, 2023

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

Nye strategier til trofast modellering af somatiske mutationer i hæmatopoietiske stam- og stamceller (HSPC'er) er nødvendige for bedre at studere hæmatopoietisk stamcellebiologi og hæmatologiske maligniteter. Her beskrives en protokol til modellering af heterozygote gain-of-function-mutationer i HSPC'er ved at kombinere brugen af CRISPR/Cas9 og dual rAAV donortransduktion.

Transcript

Denne metode muliggør præcis modellering af tilbagevendende leukemogene gain-of-function-mutationer i primære humane hæmatopoietiske stam- og stamceller og derved undersøge rollen i leukæmisk transformation. Den største fordel ved denne teknik er, at den CRISPR-Cas9-baserede mutationsteknik kombineres med introduktionen af en fluorescerende reporter. Dette muliggør entydigt identifikation, berigelse og sporing af rene heterozygott muterede cellepopulationer.

Demonstration af proceduren vil være Tommaso Sconocchia, en postdoktoral forsker fra mit laboratorium. Til at begynde med skal du designe single guide RNA ved hjælp af online Benchling designværktøjet ved at vælge plus create-indstillingen. Klik derefter på DNA-sekvens"efterfulgt af importer DNA-sekvenser"og importer fra databaser"mulighed.

Indtast derefter det ønskede gen og vælg menneske"som arten. Klik på søgningen, og vælg den korrekte import af udskrifter. Vælg det interesseområde, hvor dobbeltstrengsbruddet skal introduceres.

Vælg derefter indstillingen CRISPR i højre side af skærmen efterfulgt af design- og analyseguider. Vælg derefter enkelt guide"mens du holder guidelængden til 20 basepar og PAM-sekvens til redigering med SP-Cas9. Vælg en guide med en høj on-target score og en høj off-target score og bestil single guide RNA som et kemisk modificeret syntetisk single guide RNA fra en kommerciel leverandør.

For at designe HDR-skabelonen skal du importere den genomiske sekvens og kodningssekvensen til software til molekylær kloning. Fra den genomiske sekvensfil skal du designe venstre homologiarm ved ideelt set at vælge 400 basepar på de fem primære ende af dobbeltstrengsbruddene og indsætte denne sekvens i en ny fil. Fra den genomiske sekvensfil skal du designe splejsningsacceptorsekvensen ved at vælge de sidste 150 basepar af den målrettede intron og indsætte den efter venstre homologiarm.

Fra kodningssekvensfilen skal du vælge det cDNA, der er af interesse. Codon optimerer cDNA'et og indsætter det efter splejsningsacceptorsekvensen. Efter det relevante cDNA indsættes et polyadenyleringssignal med tre primtal efter en promotorsekvens for det fluorescerende protein.

Indsæt derefter sekvensen for det fluorescerende protein og et andet, men anderledes polyadenyleringssignal. Fra den genomiske sekvensfil skal du designe den højre homologiarm ved ideelt at vælge 400 basepar på den tre primære ende af dobbeltstrengsbruddene og indsætte sekvensen efter den anden polyadenylering. Opret derefter en kopi af hele skabelonen og rediger cDNA'et af interesse, så det indeholder sekvensen af den ønskede mutation.

Udskift det fluorescerende protein med et andet fluorescerende protein. Konstruer og klon HDR-skabelonerne i AAV-udtryksvektoren. Til rekombinant AAV6-tilberedning tilberedes 10 150 millimeter skåle, der hver indeholder 11 millioner HECK293T i 20 ml DMEM suppleret med 10% FBS, 1% penicillin streptomycin og 25 millimolære HEPES.

Placer derefter opvasken i inkubatoren ved 37 grader Celsius, 5% kuldioxid, i 24 timer. Efter omhyggelig kassering af det gamle medium skal du udskifte det med 20 ml antibiotikafri DMEM suppleret med 10% FBS, 25 millimolære HEPES og et millimolært natriumbutyrat. Forbered derefter to 15 ml rør mærket rør et og to.

For at rør en tilsættes fem milliliter reduceret serummedium, 60 mikrogram rekombinant AAV6-muteret HDR-plasmid og 220 mikrogram PDGM6-hjælperplasmid. Til rør to, tilsættes fem ml reduceret serummedium og 1120 mikroliter en milligram pr. milliliter polyethylenaminopløsning. Efter tilsætning af indholdet af rør to til rør et, hvirvel i 30 sekunder og inkuberes derefter i 15 minutter ved stuetemperatur.

Tilsæt forsigtigt dråbevis 1,1 ml af opløsningen til hver skål og fordel ved at hvirvle forsigtigt. Placer opvasken i inkubatoren ved 37 grader Celsius, 5% kuldioxid, i 48 timer. Derefter tilsættes 250 mikroliter 0,5 molær EDTA til hver skål og anbringes i inkubatoren i 10 minutter.

Høst cellerne ved at vaske dem af fadet og overfør til et 500 ml centrifugerør. Der centrifugeres ved 2000 G i 10 minutter ved fire grader Celsius, og supernatanten kasseres. Løsn pelleten ved hvirvelstrøm, og ekstraher virussen ved hjælp af et AAV-rensningssæt.

Efter aliquoting af den rensede virus opbevares den ved minus 80 grader Celsius. Efter optøning af CD34-positive hæmatopoietiske stam- og stamceller overføres cellerne til 10 ml forvarmet RPMI suppleret med 1% penicillin streptomycin. Der centrifugeres ved 350 G ved stuetemperatur i 10 minutter.

Suspender cellerne i hæmatopoietisk stam- og stamcelleretention medium til en koncentration på 250.000 celler pr. milliliter og inkuber ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid i 72 timer. Høst derefter cellerne i et 15 ml rør. Tæl og kontroller cellelevedygtigheden ved prøvepanblå udelukkelse.

For at forberede ribocucleoproteinkomplekset tilsættes 15 mikrogram Cas9 og otte mikrogram enkeltguide-RNA i et 1,5 milliliter rør og inkuberes ved 25 grader Celsius i 10 minutter i en varmeblok. Mens ribonukleoproteinkomplekset inkuberes, centrifugeres cellerne ved 350 G i fem minutter, og supernatanten kasseres. Efter suspension af cellerne i 100 mikroliter nukleofektionsopløsning blandes cellerne med ribonukleoproteinkomplekset og overføres til kuvetten.

Når du forsigtigt har banket på kuvetten for at fjerne eventuelle resterende luftbobler, skal du indsætte kuvetten i holderen af transfektionssystemet og elektroporate cellerne. Umiddelbart efter elektroporation tilsættes 400 mikroliter forvarmet hæmatopoietisk stamme og stamfædre celleretentionsmedium uden penicillin streptomycin og overføres cellerne med en fin overførselspipette til en kulturplade indeholdende forvarmet hæmatopoietisk stamme og stamcelleretention medium uden penicillin streptomycin. Overfør derefter pladen til inkubatoren.

Optø hætteglassene med de frosne rekombinante AAV'er på is og transducer cellerne ved at pipettere den optimale mængde af hver rekombinant AAV6 til cellesuspensionen. Efter forsigtigt at have blandet cellesuspensionen med pipetten inkuberes de transducerede celler i seks til otte timer ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid. Efter seks til otte timer samles cellerne i et rør og centrifugeres ved 350 G ved stuetemperatur i fem minutter.

Supernatanten kasseres og erstattes med frisk forvarmet hæmatopoietisk stængel og stamcelleretention suppleret med penicillin streptomycin, og cellerne overføres til en cellekulturplade. Inkuber cellerne i 48 timer ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid. For at flyde sorteres de konstruerede celler, der bærer den heterozygote gain-of-function-mutation, høstes cellerne i et 15 ml rør og centrifugeres ved 350 G ved stuetemperatur i fem minutter som tidligere vist.

Supernatanten fjernes og cellerne suspenderes i en milliliter DPBS indeholdende 0,1 % PSA, og der centrifugeres igen ved 350 G ved stuetemperatur i fem minutter. Efter kassering af supernatanten suspenderes cellerne i et passende volumen DPBS plus 0,1 % BSA afhængigt af cellenummeret som vist tidligere. Overfør cellerne til et sterilt faxrør udstyret med en hætte, og tilsæt syv AAD eller andet levedygtighedsfarvestof til cellesuspensionen for udelukkelse af levende/døde celler.

Sorter de levende celler, der er dobbelt positive for de fluorescerende reporterproteiner, i et opsamlingsrør indeholdende 200 mikroliter hæmatopoietisk stamme- og stamcelleretentionsmedium. Efter centrifugering af de sorterede celler ved 350 G ved stuetemperatur i fem minutter som tidligere demonstreret til en koncentration på 250.000 celler pr. milliliter til yderligere ekspansion i kultur eller brug cellerne direkte til funktionelle assays. To dage efter transvektion med ribonukleoproteinkomplekset og transduktion med de rekombinante AAV6-vira blev cellerne analyseret ved flowcytometri.

Fire hovedpopulationer blev detekteret, herunder celler uden HDR-baseret genomredigering, der hverken udtrykte GFP- eller BFP-cellerne positive kun for GFP med kun vildtypekonstruktionen integreret, celler kun positive for BFP med kun den muterede konstruktion integreret, og GFP og BFP dobbeltpositive celler med både vildtypen og muterede sekvenser integreret. For at validere den vellykkede knock-in af de heterozygote calreticulinmutationer blev PCR udført på genomisk DNA ekstraheret fra celler kun inkuberet med AAV og fra celler inkuberet med ribonukleoproteinet og AAV med den bankede calreticulin vildtype og calreticulin deletionssekvens. Celler blev sorteret baseret på samtidig ekspression af begge fluorescensreportere før DNA-ekstraktion.

Efter gelelektroforese blev individuelle bånd udskåret fra gelen, og DNA blev ekstraheret til efterfølgende Sanger-sekventering. Sekventeringsresultaterne bekræftede den vellykkede sømløse integration af vildtypen og muterede sekvenser i de heterozygote calreticulin-muterede hæmatopoietiske stam- og stamceller. Den vigtigste ting at huske, når du forsøger denne procedure, er omhyggeligt at vælge det bedst ydende single guide RNA, da dette vil bestemme den samlede HDR-effektivitet og derfor hyppigheden af vellykket knock-in af heterozygote mutationer.

Efter denne procedure kan de genetisk manipulerede celler anvendes til funktionelle in vitro- og in vivo-eksperimenter såsom kolonidannende enhedsassays, differentieringsassays og transplantation til immundefekte mus.

X

Simple Hit Counter