Summary
इस पेपर में, एक नए डिज़ाइन किए गए 3 डी-मुद्रित सम्मिलित को सह-संस्कृति के मॉडल के रूप में प्रस्तुत किया जाता है और एंडोथेलियल कोशिकाओं और केराटिनोसाइट्स के बीच पैराक्रिन इंटरसेलुलर संचार के अध्ययन के माध्यम से मान्य किया जाता है।
Abstract
विभिन्न सेल प्रकारों के बीच अप्रत्यक्ष संचार के शास्त्रीय विश्लेषण के लिए वातानुकूलित मीडिया के उपयोग की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, वातानुकूलित मीडिया का उत्पादन समय लेने वाला और शारीरिक और रोग संबंधी स्थितियों से दूर रहता है। यद्यपि सह-संस्कृति के कुछ मॉडल व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं, वे विशिष्ट परखों तक ही सीमित रहते हैं और ज्यादातर दो प्रकार की कोशिकाओं के लिए होते हैं।
यहां, 3 डी-मुद्रित आवेषण का उपयोग किया जाता है जो कई कार्यात्मक परखों के साथ संगत हैं। सम्मिलित करने से 6-वेल प्लेट के एक कुएं को चार डिब्बों में अलग करने की अनुमति मिलती है। संयोजनों की एक विस्तृत श्रृंखला सेट की जा सकती है। इसके अलावा, डिब्बों की प्रत्येक दीवार में खिड़कियां डिज़ाइन की जाती हैं ताकि प्रत्येक डिब्बे के बीच संभावित अंतरकोशिकीय संचार संस्कृति माध्यम में मात्रा-निर्भर तरीके से संभव हो। उदाहरण के लिए, पैराक्रिन इंटरसेलुलर संचार का अध्ययन मोनोलेयर में चार सेल प्रकारों के बीच, 3 डी (स्फेरॉइड) में, या दोनों के संयोजन से किया जा सकता है। इसके अलावा, विभिन्न सेल प्रकारों के मिश्रण को 2 डी या 3 डी (ऑर्गेनोइड्स) प्रारूप में एक ही डिब्बे में बीज दिया जा सकता है। 3 डी-मुद्रित आवेषण में एक तल की अनुपस्थिति प्लेट पर सामान्य संस्कृति की स्थिति, सम्मिलित प्लेट पर संभावित कोटिंग और ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी द्वारा प्रत्यक्ष विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देती है। कई डिब्बे स्वतंत्र रूप से विभिन्न सेल प्रकारों को इकट्ठा करने या प्रत्येक डिब्बे में, आरएनए या प्रोटीन निष्कर्षण के लिए अलग-अलग अभिकर्मकों का उपयोग करने की संभावना प्रदान करते हैं। इस अध्ययन में, सह-संस्कृति प्रणाली के रूप में नए 3 डी-मुद्रित सम्मिलित का उपयोग करने के लिए एक विस्तृत पद्धति प्रदान की जाती है। इस लचीले और सरल मॉडल की कई क्षमताओं को प्रदर्शित करने के लिए, सेल संचार के पहले प्रकाशित कार्यात्मक परख नए 3 डी-मुद्रित आवेषण में किए गए थे और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य होने का प्रदर्शन किया गया था। 3 डी-मुद्रित आवेषण और वातानुकूलित मीडिया का उपयोग करके पारंपरिक सेल संस्कृति ने समान परिणाम दिए। अंत में, 3 डी-मुद्रित सम्मिलित एक सरल उपकरण है जिसे अनुयायी सेल प्रकारों के साथ सह-संस्कृतियों के कई मॉडलों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
Introduction
विवो में, कोशिकाएं एक दूसरे के साथ या तो प्रत्यक्ष (सेल संपर्क) या अप्रत्यक्ष रूप से (अणुओं के स्राव द्वारा) संवाद करती हैं। सेल संचार का अध्ययन करने के लिए, विभिन्न सह-संस्कृति मॉडल विकसित किए जा सकते हैं, जैसे कि प्रत्यक्ष सह-संस्कृति (विभिन्न सेल प्रकार एक ही कुएं में प्रत्यक्ष बातचीत में हैं) और कंपार्टमेंटल सह-संस्कृति (विभिन्न सेल प्रकार एक संस्कृति प्रणाली के विभिन्न डिब्बों में अप्रत्यक्ष बातचीत में हैं)1। इसके अलावा, वातानुकूलित मीडिया का उपयोग सह-संस्कृति प्रणालियों के लिए किया जा सकता है, जहां अप्रत्यक्ष बातचीत एक प्रभावक सेल प्रकार के वातानुकूलित मीडिया में निहित स्रावित अणुओं द्वारा सक्षम होती है जिसे उत्तरदाता सेल टाइप1 में स्थानांतरित किया जाता है।
पैराक्रिन सेल संचार अध्ययन के मामले में, अप्रत्यक्ष सह-संस्कृति प्रणाली मॉडल प्रदान करती है जो विवो में सेल इंटरैक्शन को दृढ़ता से दर्शाती है। अप्रत्यक्ष सह-संस्कृति प्रणालियों को विकसित और व्यावसायीकरण किया गया है, जिससे अप्रत्यक्ष सह-संस्कृति मॉडल 2,3 की स्थापना की अनुमति मिलती है। दुर्भाग्य से, अधिकांश अप्रत्यक्ष सह-संस्कृति प्रणालियां केवल दो डिब्बे प्रदान करती हैं। अन्य अप्रत्यक्ष सह-संस्कृति प्रणालियां कई डिब्बे प्रदान करती हैं, लेकिन वे वर्तमान पांडुलिपि में रिपोर्ट की गई प्रणाली की तुलना में कम स्केलेबल हैं। उनमें से कुछ एक माइक्रोस्कोप के तहत शास्त्रीय विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति नहीं देते हैं, और वे अक्सर विशिष्ट अनुप्रयोग विधियों को प्रस्तुत करते हैं। कई अध्ययनों में, विभिन्न सेल प्रकारों के बीच पैराक्रिन संचार की जांच वातानुकूलित मीडिया मॉडल 4,5,6,7 द्वारा की जाती है। यह अप्रत्यक्ष सह-संस्कृति प्रणालियों की तुलना में जांच का एक आसान तरीका है क्योंकिइसे स्थापित करने के लिए विशिष्ट तरीकों या सामग्रियों की आवश्यकता नहीं है। दूसरी ओर, वातानुकूलित मीडिया की तैयारी समय लेने वाली है और केवल एक-तरफ़ा सेल सिग्नलिंग (उत्तरदाता को प्रभावक) 1 पर जानकारी प्रदान करती है।
इस पेपर में, सेल संचार की जांच का एक नया, सरल तरीका प्रस्तावित है। प्रत्यक्ष या अप्रत्यक्ष बातचीत में और 2 डी या 3 डी प्रारूपों में कई सेल प्रकारों के संयोजन की अनुमति देते हुए, मुद्रित प्रविष्टियां सह-संस्कृति मॉडल को आसानी से स्थापित करने के लिए कई फायदे पेश करती हैं। 6-वेल प्लेटों के कुओं में रखने के लिए अनुकूलित, 3 डी-मुद्रित सम्मिलित गोलाकार है और कुएं को चार डिब्बों (दो बड़े डिब्बे और दो छोटे डिब्बे) में अलग करने की अनुमति देता है; चित्रा 1 ए)। 3 डी-मुद्रित आवेषण को नीचे की अनुपस्थिति की विशेषता है। इस प्रकार, कोशिकाएं उस प्लेट के सीधे संपर्क में होती हैं जिस पर सम्मिलित किया जाता है। इसके अलावा, प्रत्येक डिब्बे को दूसरों से स्वतंत्र रूप से लेपित किया जा सकता है। इसके अलावा, ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के तहत सेल व्यवहार का आसानी से पालन किया जा सकता है। सम्मिलित की प्रत्येक दीवार में संचार खिड़कियों की उपस्थिति सह-संस्कृति के विभिन्न प्रयोगों को करने के लिए एक सामान्य माध्यम के इष्टतम समय पर अतिरिक्त की अनुमति देती है। कई सेल प्रकारों के बीच प्रत्यक्ष और / या अप्रत्यक्ष संचार का अध्ययन करने के लिए सह-संस्कृति के कई संयोजन किए जा सकते हैं। उदाहरण के लिए, मोनोलेयर और / या 3 डी (स्फेरॉइड) में चार अलग-अलग सेल प्रकारों के बीच अप्रत्यक्ष सह-संस्कृति का एक मॉडल डिजाइन किया जा सकता है। एक ही डिब्बे में विभिन्न सेल प्रकारों को मिलाकर प्रत्यक्ष और अप्रत्यक्ष सह-संस्कृति मॉडल का एक संयोजन भी किया जा सकता है। विभिन्न सेल प्रकारों पर जटिल संरचनाओं (ऑर्गेनोइड्स, ऊतक खोज, आदि) का प्रभाव उन मॉडलों का एक और उदाहरण हो सकता है जिन्हें बनाया जा सकता है। इसके अलावा, 3 डी-मुद्रित आवेषण सेल जीव विज्ञान कार्यात्मक परख (प्रसार, प्रवासन, स्यूडोट्यूब गठन, भेदभाव, आदि) और जैव रसायन परीक्षणों (डीएनए, आरएनए, प्रोटीन, लिपिड, आदि के निष्कर्षण) के साथ संगत हैं। अंत में, 3 डी-मुद्रित आवेषण सह-संस्कृति मॉडल की प्रयोगात्मक योजनाओं की एक विस्तृत श्रृंखला प्रदान करते हैं, जिसमें विभिन्न डिब्बों में एक ही प्रयोग में एक साथ अलग-अलग परखों को संयोजित करने की संभावना होती है।
3 डी-मुद्रित आवेषण की कुछ क्षमताओं को एक तेज़ और उपयोग में आसान सह-संस्कृति मॉडल के रूप में मान्य करने के लिए प्रस्तुत किया जाता है। पैराक्रिन सेल संचार पर किए गए पहले प्रकाशित अध्ययन की तुलना में, 3 डी-मुद्रित प्रविष्टियों की एक मूल्यवान सह-संस्कृति मॉडल होने की क्षमता का प्रदर्शन किया जाता है। इस बिंदु का आकलन करने के लिए, केराटिनोसाइट्स द्वारा एंडोथेलियल सेल प्रसार और प्रवासन के विनियमन की तुलना 3 डी-मुद्रित सम्मिलित प्रणाली और वातानुकूलित मीडिया का उपयोग करके शास्त्रीय प्रणाली के बीच की गई थी। 3 डी-मुद्रित आवेषण वातानुकूलित मीडिया का उपयोग करके पारंपरिक प्रणाली की तुलना में तेजी से समान परिणाम प्राप्त करने की अनुमति देते हैं। दरअसल, 3 डी-मुद्रित आवेषण वातानुकूलित मीडिया का उत्पादन करने की आवश्यकता के बिना और एक ही प्रयोग में प्रसार और प्रवासन परख के समानांतर प्रदर्शन करने की संभावना के बिना दोनों दिशाओं में सेल इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए एक मजबूत मॉडल प्रदान करते हैं।
निष्कर्ष निकालने के लिए, इस पेपर में, सेल संचार का अध्ययन करने के लिए एक नया और उपयोग के लिए तैयार मॉडल प्रस्तावित है। सभी अनुयायी सेल प्रकारों के साथ संगत, 3 डी-मुद्रित आवेषण सह-संस्कृति के कई संयोजनों को करने की अनुमति देते हैं जिनका उद्देश्य विवो स्थितियों में करीब होना है।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
नोट: 3 डी इंसर्ट (चित्रा 1 ए) व्यावसायिक रूप से खरीदे जाते हैं और एक फोटोपॉलिमर राल का उपयोग करके मुद्रित किए जाते हैं जो सेल कल्चर और ऑटोक्लेविंग के साथ जैव-संगत है ( सामग्री की तालिका देखें)। इस खंड में, सम्मिलित द्वारा सह-संस्कृति मॉडल स्थापित करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है ( चित्रा 1 बी देखें)। अनुप्रयोगों के कुछ उदाहरण भी प्रदान किए गए हैं।
1. 6-वेल प्लेटों में निष्फल सम्मिलित डालने का प्लेसमेंट।
- किट में प्रदान किए गए दो घटकों ( सामग्री की तालिका देखें), खाद्य सिलिकॉन (अभिकर्मक ए) और उत्प्रेरक (अभिकर्मक बी), निर्माता के निर्देशों के अनुसार 10: 1 (वी / वी) के अनुपात में मिलाएं। (चित्र 1बीए)। दो घटकों को मिलाने के लिए 70% इथेनॉल स्टरलाइज्ड स्पैटुला का उपयोग करें।
नोट: तैयार किए जाने वाले सिलिकॉन मिश्रण की मात्रा तय की जाने वाली आवेषण की संख्या पर निर्भर करती है। उत्प्रेरक की अधिकता के परिणामस्वरूप सिलिकॉन मिश्रण बहुत तेजी से जम सकता है। - चिमटी के साथ सिलिकॉन मिश्रण पर आवेषण लागू करें ताकि मिश्रण को आवेषण के निचले किनारे पर सजातीय रूप से वितरित किया जा सके (चित्रा 1बीबी)। आवेषण को 6-वेल प्लेट के कुओं में रखें और यह सुनिश्चित करने के लिए कि सेल कल्चर माध्यम के किसी भी रिसाव से बचने के लिए इंसर्ट प्लेट के साथ निकट संपर्क में हैं (चित्रा 1बीसी)।
- 1 घंटे के लिए सिलिकॉन की ठोसकरण प्रक्रिया का समर्थन करने के लिए प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
नोट: ठोसकरण का समय उत्प्रेरक की मात्रा पर निर्भर करता है जिसे जोड़ा गया है। - जमने के बाद, प्लेटों को 30 मिनट से 1 घंटे के लिए 70% इथेनॉल स्नान में डुबोकर इंसर्ट के साथ निष्फल करें।
- पाइपटिंग द्वारा शराब को त्याग दें और प्लेट को सेल कल्चर हुड में रात भर सूखने दें (ढक्कन खुला)।
नोट: सेल निर्धारण और विषाक्तता से बचने के लिए अगले चरण को करने से पहले शराब को पूरी तरह से वाष्पित किया जाना चाहिए। आवेषण युक्त रेडी-टू-यूज़ प्लेट को कमरे के तापमान पर शुष्क और बाँझ परिस्थितियों में उपयोग करने से पहले कई दिनों तक संग्रहीत किया जा सकता है।
2. पॉली-एल-लाइसिन, या पॉली-हेमा (वैकल्पिक चरण) जैसे कोटिंग्स
नोट: इस प्रयोग में कोटिंग नहीं की जाती है, और आवेषण को कोटिंग की संभावना के बारे में सूचित करने के लिए चरण प्रदान किए जाते हैं।
- निर्माता के निर्देशों के अनुसार कोटिंग समाधान तैयार करें।
- इंसर्ट की कोटिंग के लिए सबसे बड़े डिब्बों के लिए 200-400 μL की मात्रा और सबसे छोटे डिब्बों के लिए 50-100 μL की मात्रा पर विचार करें। अलग-अलग डिब्बों में कोटिंग समाधान जोड़ें।
- बाँझ परिस्थितियों में निर्माता द्वारा बताए गए अनुसार कोटिंग को सूखने दें।
3. कोशिकाओं का बीजारोपण
- निर्माता द्वारा अनुशंसित बाहरी रूट शीथ (केओआरएस) और मानव त्वचीय माइक्रोवस्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं (एचडीएमईसी) के केराटिनोसाइट्स को कल्चर करें। कोशिकाओं के कंफ्लुएंसी तक पहुंचने के बाद सेल सस्पेंशन तैयार करें।
- फ्लास्क से माध्यम को छोड़ दें और कोशिकाओं को अलग करने के लिए ट्रिप्सिन के 5 एमएल जोड़ें ( सामग्री की तालिका देखें)।
- 5 मिनट के लिए 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर कोआरएस युक्त फ्लास्क रखें। कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए एचडीएमईसी युक्त फ्लास्क को इनक्यूबेट करें।
- 5 एमएल मेसेनकाइमल स्टेम सेल माध्यम (एमएससीएम) के साथ कोआरएस युक्त ट्रिप्सिन समाधान को 5% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) और विकास कारकों (पूरक किट के साथ बेसल माध्यम, सामग्री की तालिका देखें) के साथ मिलाएं। एचडीएमईसी युक्त ट्रिप्सिन समाधान को 5% एफबीएस और विकास कारकों के साथ पूरक एंडोथेलियल सेल माध्यम (ईसीएम) के 5 एमएल के साथ मिलाएं ( सामग्री की तालिका देखें)।
- कोशिकाओं को बाँझ शंक्वाकार ट्यूब के 15 एमएल में स्थानांतरित करें। कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 200 x g पर KORS और HDMEC निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करें।
- सतह पर तैरनेवाला को छोड़ दें और संबंधित माध्यम के 2 एमएल में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
- सेल सस्पेंशन के 10 μL को ट्राइपैन ब्लू डाई के 10 μL के साथ मिलाएं ( सामग्री की तालिका देखें)।
- गिनती स्लाइड के कक्ष में मिश्रण के 10 μL जोड़ें।
- सेल काउंटिंग सिस्टम में गिनती स्लाइड डालें ( सामग्री की तालिका देखें) और सेल नंबर और व्यवहार्यता का पता लगाएं।
- संबंधित माध्यम में 0.5 x 105 कोशिकाओं / एमएल की एकाग्रता पर सेल निलंबन तैयार करें।
नोट: यदि विभिन्न सेल प्रकारों को पालन के अलग-अलग समय की आवश्यकता होती है और / या आदर्श संयोजन तक पहुंचने के लिए, सेल सीडिंग को सेल प्रकारों के अनुसार अलग-अलग समय बिंदुओं पर बनाया जा सकता है।
- सेल निलंबन के 800 μL से 1 mL को अलग-अलग बड़े डिब्बों में और 100-150 μL को एक पिपेट के साथ अलग-अलग छोटे डिब्बों में वितरित करें।
- एमएससीएम में 1 x 10 5 कोशिकाओं / एमएल पर कोआरएस को बीज दें, जो बड़े डिब्बों में से एक में5% एफबीएस और विकास कारकों के साथ पूरक है।
- ईसीएम में बीज एचडीएमईसी छोटे डिब्बों में 2.5 x 103 कोशिकाओं / एमएल पर 5% एफबीएस और विकास कारकों केसाथ पूरक है और दूसरे बड़े डिब्बे में 1.25 x 105 सेल / एमएल पर है।
नोट: प्रसार परख छोटे डिब्बों में किया जा सकता है, और बड़े डिब्बों में माइग्रेशन और व्यवहार्यता परख की जा सकती है। बीज वाली कोशिकाओं की एकाग्रता को निर्माता की सिफारिशों के अनुसार अनुकूलित किया गया है। यह एकाग्रता 24-48 घंटे की इनक्यूबेशन के बाद कोशिकाओं की अच्छी व्यवहार्यता की अनुमति देती है।
- सेल आसंजन और / या परिपक्वता की अनुमति देने के लिए सेल कल्चर प्लेट को 5% सीओ2 के साथ या सामान्य परिस्थितियों में 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
नोट: मीडिया को बदले बिना 24-48 घंटे के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें। यदि आवश्यक हो, तो डिब्बों का माध्यम स्वतंत्र रूप से बदला जा सकता है।
4. सह-संस्कृति का कार्यान्वयन (चित्रा 1 बीडी)
नोट: सह-संस्कृति का कार्यान्वयन उस समय से मेल खाता है जब सामान्य माध्यम जोड़ा जाता है। विभिन्न डिब्बों में सभी सेल प्रकारों के लिए एक अद्वितीय माध्यम के अलावा संचार खिड़कियों (3 डी-मुद्रित आवेषण की दीवारों में ओवॉइड छेद) की उपस्थिति के कारण कोशिकाओं के बीच पैराक्रिन संचार की संभावना प्रदान करता है। सह-संस्कृति को लागू करने के लिए, चरण 4.1-4.3 का पालन करें।
- एक पिपेट का उपयोग करके आवेषण के विभिन्न डिब्बों के संस्कृति मीडिया को खाली करें। 3 डी स्फेरॉइड सेल संस्कृति के मामले में, माध्यम को बहुत धीरे से छोड़ दें।
- बड़े डिब्बों में 37 डिग्री सेल्सियस गर्म पीबीएस के 1 एमएल और छोटे डिब्बों में 37 डिग्री सेल्सियस गर्म पीबीएस के 200 μL के साथ कोशिकाओं को कुल्ला करें। कोशिकाओं को अलग न करने के लिए कोमल धुलाई सुनिश्चित करें।
- सभी सेल प्रकारों के लिए संगत होने के लिए चयनित एक सामान्य माध्यम के 3 एमएल जोड़ें।
नोट: इस अध्ययन में, बेसल ईसीएम (एफबीएस और विकास कारकों के बिना) का उपयोग किया जाता है। सुनिश्चित करें कि माध्यम सभी डिब्बों को कवर करता है (संचार खिड़कियों के ऊपर का स्तर [दीवारों में ओवॉइड छेद], जैसा कि चित्र 1 ए में दिखाया गया है)। - सह-संस्कृतियों वाली प्लेट को 24-48 घंटे के लिए 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
5. सेल अवलोकन, गिनती और स्क्रैपिंग
- आकृति विज्ञान का निरीक्षण करें और 24-48 घंटे की इनक्यूबेशन के बाद ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के तहत प्रयोग के दौरान विभिन्न डिब्बों की कोशिका संख्या की गणना करें।
नोट: कोशिकाओं की अपेक्षित संख्या उपयोग किए जाने वाले सेल प्रकारों (आकार, आकृति विज्ञान, आदि) और डिब्बे के आकार पर निर्भर करती है। इस प्रयोग में, 0.5 x 10 6-1x 10 6 KORS/mL और 0.25 x 10 6-0.75 x 10 6 HDMECs/mL के बीच बड़े डिब्बों में गिना जाता है। - सेल निलंबन गिनती के लिए ट्रिप्सिन का उपयोग करके कोशिकाओं को अलग करें।
नोट: सेल डिटेचमेंट समाधान के लिए, सबसे बड़े डिब्बों के लिए 100-500 μL की मात्रा और सबसे छोटे डिब्बों के लिए 10-50 μL की मात्रा पर विचार करें। - ट्राइपैन ब्लू स्टेनिंग का उपयोग करके व्यवहार्यता की जांच करें (चरण 3.1.6-3.1.8 देखें)।
6. रीसाइक्लिंग के लिए सफाई डालें
- प्रयोग के अंत में 6-वेल प्लेट से आवेषण को थोड़ा मोड़ (चित्रा 1 बी) द्वारा हटा दें।
- इसे खींचकर इंसर्ट से सिलिकॉन निकालें। यदि आवश्यक हो, तो आवेषण की दीवारों से चिपके शेष सिलिकॉन को हटाने के लिए स्पैटुला का उपयोग करें (चित्रा 1बीएफ)।
- पारंपरिक सेल कल्चर डिटर्जेंट और सफाई सामग्री के साथ आवेषण धोएं (उदाहरण सामग्री की तालिका में प्रदान किया गया है)।
- एक आटोक्लेव (ठोस चक्र, 20 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस) में भविष्य के उपयोग के लिए आवेषण को निष्फल करें या उन्हें 1 घंटे के लिए 70% इथेनॉल स्नान में डुबोकर रखें।
नोट: इस चरण से, 3 डी-मुद्रित आवेषण (चित्रा 1 बीडी) का उपयोग करके संभावित परख (प्रसार और प्रवासन परख) के दो उदाहरण वर्णित हैं।
7. सेल प्रसार परख - डब्ल्यूएसटी -1 परख
- कोशिकाओं को कल्चर करने के लिए चरण 1-3.1 का पालन करें।
नोट: एचडीएमईसी प्रसार पर कोआरएस स्राव के प्रभाव की जांच करने के लिए सह-संस्कृति प्रणाली को लागू करने के लिए इस खंड में दिए गए चरण का पालन करें। KORS कक्षों का उपयोग पहले प्रकाशित डेटा की तुलना करने के लिए किया जाताहै।- मेसेनकाइमल स्टेम सेल माध्यम (एमएससीएम) में 1 x 10 5 कोशिकाओं / एमएल पर कोआरएस को बीज दें, जो बड़े डिब्बों में5% एफबीएस और विकास कारकों के साथ पूरक है।
- सेल कल्चर प्लेट को 24 घंटे के लिए 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
- एंडोथेलियल सेल माध्यम (ईसीएम) में एचडीएमईसी को छोटे डिब्बों में 5% एफबीएस और 2.5 x 103 कोशिकाओं / एमएल पर विकास कारकों के साथ पूरक किया जाता है।
- सेल कल्चर प्लेट को 24-48 घंटे के लिए 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
- सभी डिब्बों से मीडिया को त्याग दें और गैर-पूरक बेसल ईसीएम (3 डी-मुद्रित आवेषण के सभी डिब्बों के लिए सामान्य सेल संस्कृति माध्यम) के 3 एमएल को जोड़कर सह-संस्कृति प्रणाली को लागू करें।
- डब्ल्यूएसटी -1 समाधान तैयार करने के लिए ईसीएमकॉमन सेल कल्चर माध्यम (1: 10 अंतिम कमजोर पड़ने) में डब्ल्यूएसटी -1 को पतला करें।
नोट: WST-1 समाधान की मात्रा के लिए, रिक्त स्थान के लिए कम से कम 500 μL अतिरिक्त समाधान तैयार करें। - पाइपिंग द्वारा सम्मिलित करने से सेल कल्चर माध्यम को हटा दें।
- चयनित डिब्बों में WST-1 समाधान जोड़ें (छोटे डिब्बों के लिए 150 μL और बड़े डिब्बों के लिए 600 μL)। प्लेट को 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
- इष्टतम 30 मिनट सेल इनक्यूबेशन समय के बाद, 96-वेल प्लेट पर प्रत्येक स्थिति से इनक्यूबेशन माध्यम के 100 μL स्थानांतरित करें।
- 420 एनएम और 480 एनएम के बीच एक माइक्रोप्लेट रीडर का उपयोग करके वर्णमिति प्रतिक्रिया का आकलन करें।
- प्लेट को माइक्रोप्लेट रीडर पर रखें और एक नया प्रोटोकॉल संपादित करें बटन पर क्लिक करें।
- उपयोग की जाने वाली 96-वेल प्लेट के विशिष्ट प्रकार ( सामग्री की तालिका देखें) और 450 एनएम की तरंग दैर्ध्य का चयन करें।
- प्रारंभ माप बटन पर क्लिक करें।
8. सेल माइग्रेशन परख - दो माइग्रेशन चैंबर डिवाइस
- कोशिकाओं को कल्चर करने के लिए चरण 1-3.1 का पालन करें।
नोट: एचडीएमईसी प्रसार पर कोर्स स्राव के प्रभाव की जांच करने के लिए सह-संस्कृति प्रणाली को लागू करने के लिए इस खंड में दिए चरणों का पालन करें।- एमएससीएम में 1 x 10 5 कोशिकाओं / एमएल पर कोआरएस को बीज दें, जो बड़े डिब्बों में से एक में5% एफबीएस और विकास कारकों के साथ पूरक है।
- सेल कल्चर प्लेट को 24 घंटे के लिए 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
- दो माइग्रेशन कक्ष डिवाइस को आवेषण के दूसरे बड़े डिब्बे में रखें।
- ईसीएम में एचडीएमईसी को 5% एफबीएस और दो माइग्रेशन चैंबर डिवाइस के 7 x 105 सेल / वेल पर विकास कारकों के साथ पूरक किया जाता है।
- सेल कल्चर प्लेट को 24 घंटे के लिए 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
- मीडिया और दो माइग्रेशन चैम्बर डिवाइस को 24 घंटे के बाद या माइग्रेट करने वाले सेल प्रकार के अनुसार इष्टतम समय पर छोड़ दें। गैर-पूरक बेसल ईसीएम के 3 एमएल के अतिरिक्त सह-संस्कृति प्रणाली को लागू करें।
नोट: कोशिकाओं को अलग नहीं करने के लिए सावधानीपूर्वक आगे बढ़ें। यदि कोशिकाएं वास्तव में सामान्य माध्यम के जुड़ने से प्रेरित अलगाव के प्रति संवेदनशील हैं, तो सामान्य माध्यम को जोड़ने के बाद दो माइग्रेशन चैंबर डिवाइस को खींचें।
- 10x आवर्धन पर चरण-कंट्रास्ट माइक्रोस्कोप के तहत अलग-अलग समय बिंदुओं पर कोशिकाओं द्वारा कवर की गई सतह का निरीक्षण करें और एक तस्वीर लें।
नोट: चित्र एक चरण-कंट्रास्ट माइक्रोस्कोप के साथ लिए गए हैं ( सामग्री की तालिका देखें)। चित्रों को एक यूएसबी कुंजी में सहेजा जाता है और फिर सॉफ्टवेयर के घाव भरने वाले उपकरण प्लगइन द्वारा विश्लेषण किया जाता है ( सामग्री की तालिका देखें)। - शास्त्रीय मात्रात्मक विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके खुली सतह को मापें।
- सॉफ़्टवेयर पर छवि खोलें और मैक्रो सूची में उपलब्ध घाव भरने के उपकरण को सक्रिय करें।
- माइग्रेशन छवि की खुली सतह को मापने के लिए एम बटन पर क्लिक करें।
- खुली सतह की गणना निम्नलिखित सूत्र के अनुसार की जाती है:
कवरेज का प्रतिशत = ([T0 पर कोशिकाओं के बिना औसत क्षेत्र - समय T पर कोशिकाओं के बिना क्षेत्र]/T0 पर कोशिकाओं के बिना औसत क्षेत्र) × 100।
नोट: 3 डी-मुद्रित आवेषण पूरी तरह से सेल जीव विज्ञान की अधिकांश तकनीकों (जैसे स्यूडोट्यूब गठन परख, 3 डी संस्कृतियों) और जैव रसायन प्रयोगों (जैसे डीएनए, आरएनए, प्रोटीन के निष्कर्षण) के लिए अनुकूलित हैं।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
वर्तमान कार्य में, वातानुकूलित मीडिया के उपयोग के माध्यम से शास्त्रीय तरीकों की तुलना में मजबूत, विश्वसनीय और महत्वपूर्ण डेटा प्राप्त करने के लिए एक अनुकूलित सह-संस्कृति प्रणाली का वर्णन किया गया था। 3 डी-मुद्रित इंसर्ट प्रयोगों में कठिनाइयों और वातानुकूलित मीडिया के समय लेने वाले उत्पादन पर काबू पाकर बातचीत में विभिन्न सेल प्रकारों की इनविवो माइक्रोएन्वायरमेंट स्थितियों की नकल करते हैं। बालों के रोम में मौजूद दो सेल प्रकारों के बीच अप्रत्यक्ष बातचीत का विश्लेषण करने के लिए पहले प्रकाशित एक अध्ययन को फिर से आयोजित किया गया है: मानव माइक्रोवस्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाएं (एचडीएमईसी) और बाहरी रूट शीथ (केओआरएस) के मानव केराटिनोसाइट्स। यहां, एचडीएमईसी और केओआरएस के बीच अप्रत्यक्ष बातचीत की जांच करने के लिए वातानुकूलित मीडिया का उपयोग करके शास्त्रीय विधि की तुलना में 3 डी-मुद्रित आवेषण का उपयोग करके प्राप्त परिणामों की प्रजनन क्षमता का प्रदर्शन किया गया था। अध्ययन8 में पहले वर्णित सेल संस्कृति की स्थिति इस वर्तमान कार्य के समान थी। उन्हें 3 डी-मुद्रित आवेषण के आयामों पर विचार करते हुए अनुकूलित किया गया था (प्रोटोकॉल देखें)। सबसे पहले, फेनोटाइप और सेल व्यवहार्यता सभी सेल प्रकारों (चित्रा 2) के लिए दो स्थितियों (वातानुकूलित मीडिया बनाम.3D-मुद्रित प्रविष्टि) के बीच तुलनीय थी। दरअसल, 6-वेल प्लेटों (चित्रा 2 ए और तालिका 1) के कुओं में 90% व्यवहार्यता देखी गई थी, और 91% केओआरएस के लिए 3 डी-मुद्रित आवेषण (चित्रा 2 बी और तालिका 1) में देखा गया था। 6-वेल प्लेट (चित्रा 2 सी और तालिका 2) के कुओं में एचडीएमईसी की व्यवहार्यता 85% थी, जबकि 3 डी-मुद्रित प्रविष्टियों (चित्रा 2 डी और तालिका 2) में 86% थी। सेल व्यवहार्यता के लिए डेटा की गणना स्वचालित सेल काउंटर (सामग्री की तालिका) द्वारा निम्नानुसार की गई थी: कुल कोशिकाओं (मृत + व्यवहार्य कोशिकाओं) की संख्या से विभाजित व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या। औसत डेटा छह स्वतंत्र प्रयोगों में प्राप्त प्रतिशत व्यवहार्यता की गणना करके प्राप्त किया गया था जिसमें दो प्रतिकृतियां की गई थीं (तालिका 1 और तालिका 2 देखें)।
इन परिणामों ने संकेत दिया कि 3 डी-मुद्रित सम्मिलित ने 6-वेल प्लेटों पर सामान्य संस्कृति की तुलना में सेल व्यवहार या व्यवहार्यता को नहीं बदला। इसलिए, 3 डी-मुद्रित प्रविष्टियों को सह-संस्कृति के एक नए मॉडल के रूप में मान्य किया गया था।
अप्रत्यक्ष सेल संचार के पहले प्रदर्शित पैरामीटर8 का विश्लेषण किया गया था। सभी प्रयोगों के लिए, शास्त्रीय संस्कृति स्थितियों के अनुसार प्रोटोकॉल का पालन करते हुए 3 डी-मुद्रित सम्मिलित सह-संस्कृति कार्यान्वयन का एहसास किया गया था (पिछला काम8 देखें)।
सबसे पहले, 3 डी-मुद्रित आवेषण में कोआरएस और एचडीएमईसी के बीच अप्रत्यक्ष सेल संचार का मूल्यांकन सेल प्रसार का विश्लेषण करके और वातानुकूलित मीडिया (चित्रा 3) का उपयोग करके शास्त्रीय विधि की तुलना में किया गया था। प्रविष्टियों (+ कोर्स) में कोआरएस की उपस्थिति में, एचडीएमईसी प्रसार 24 घंटे के बाद 1.5 गुना और 48 घंटे के बाद 3.1 गुना बढ़ गया, जबकि कोर्स (नियंत्रण) के बिना नियंत्रण स्थिति (चित्रा 3 ए)। ये परिणाम वातानुकूलित मीडिया प्रयोगों (चित्रा 3 बी) द्वारा प्राप्त किए गए परिणामों के अनुसार थे। दरअसल, कोर्ससीएम को 24 घंटे के बाद एचडीएमईसी प्रसार में 1.5 गुना और 48 घंटे के बाद 2.1 गुना की वृद्धि करने के लिए दिखाया गया था।
एचडीएमईसी माइग्रेशन पर कोआरएस के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए 3 डी-मुद्रित सम्मिलित सह-संस्कृति मॉडल का परीक्षण किया गया था। यह प्रभाव पहले वातानुकूलित मीडिया8 (चित्रा 4) का उपयोग करके शास्त्रीय सह-संस्कृति प्रणाली में प्रदर्शित किया गया था। KORS (नियंत्रण) के बिना नियंत्रण की स्थिति में, HDMECs पलायन कर गए और 24 घंटे के बाद घाव क्षेत्र के लगभग 44% को कवर किया (चित्रा 4 ए)। KORS (+ KORS) की उपस्थिति में, HDMEC माइग्रेशन में एक मजबूत और महत्वपूर्ण वृद्धि देखी गई। दरअसल, घाव भरने के कैनेटीक्स से पता चला है कि घाव क्षेत्र का 43%, 67%, और 99% क्रमशः 3 घंटे, 12 घंटे और 24 घंटे के बाद एचडीएमईसी द्वारा कवर किया गया था। येपरिणाम पहले प्राप्त किए गए परिणामों के अनुसार थे, जहां केओआरएससीएम को इसी तरह से एचडीएमईसी माइग्रेशन को बढ़ाने के लिए दिखाया गया था (चित्रा 4 बी)।
चित्र 1: 3D-मुद्रित सम्मिलित सह-संस्कृति के कार्यान्वयन को दर्शाने वाला वर्कफ़्लो सफाई से लेकर सम्मिलित करने के पुनर्चक्रण तक. (A) 3D-मुद्रित सम्मिलित प्रविष्टि का एक प्रतिनिधि चित्र. (बी) इस पांडुलिपि में प्रस्तुत परख ों का एक प्रतिनिधि उदाहरण सचित्र है। ध्यान दें कि 3 डी-मुद्रित आवेषण के अन्य डिब्बों में रखे गए दो माइग्रेशन कक्ष डिवाइस का उपयोग करके दूसरे डिब्बे में किए गए माइग्रेशन परख के समानांतर 3 डी-मुद्रित इंसर्ट के एक डिब्बे में एक प्रसार परख बनाई जा सकती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2: कोआरएस और एचडीएमईसी व्यवहार्यता। (ए, बी) कोआरएस आकृति विज्ञान (10x) (ए) में 6-वेल प्लेट का एक कुआं और (बी) 3 डी-मुद्रित सम्मिलित में। (C, D) एचडीएमईसी आकृति विज्ञान (10x) (C) में 6-वेल प्लेट का एक कुआं और (D) 3D-मुद्रित सम्मिलित में। स्केल बार: 200 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 3: एचडीएमईसी प्रसार पर कोआरएस का प्रभाव। (A) HDMEC प्रसार को 3D-मुद्रित सम्मिलित में WST-1 डाई का उपयोग करके वर्णमिति परख द्वारा मापा गया था, जो KORS (नियंत्रण = CTRL) की अनुपस्थिति में या 24 घंटे या 48 घंटे के लिए KORS (+ KORS) की उपस्थिति में मापा गया था। 24 घंटे या 48 घंटे के लिए। परिणामों को एसईएम ± औसत के रूप में व्यक्त किया जाता है, एन = 8 प्रतिकृति, और दो स्वतंत्र प्रयोग किए गए थे। *p < 0.05, ***p < 0.001, ***p < 0.0001, और *****p < 0.00001. कोर्स को एफबीएस और विकास कारकों के बिना ईसीएम में इनक्यूबेट किया गया था। 48 घंटे के बाद, इस वातानुकूलित माध्यम को प्रयोगों के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर एकत्र और संग्रहीत किया गया था। इस आंकड़े को 8 से संशोधित किया गया है और अनुमति के साथ पुन: प्रस्तुत किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 4: एचडीएमईसी माइग्रेशन पर कोआरएस का प्रभाव। (ए) 3 डी-मुद्रित सम्मिलित में एचडीएमईसी का माइग्रेशन कोआरएस (नियंत्रण = सीटीआरएल) की अनुपस्थिति में या कोआरएस (+ केओआरएस) की उपस्थिति में वसूली के प्रतिशत के रूप में दिखाया और परिमाणित किया जाता है। (ख)ईसीएम अथवा केओआरएससीएम में एचडीएमईसी के प्रवास को वसूली के प्रतिशत के रूप में दर्शाया और परिमाणित किया जाता है। परिणामों को एसईएम, एन = 3 प्रतिकृति ± औसत के रूप में व्यक्त किया जाता है, और प्रति प्रतिकृति तीन क्षेत्रों का विश्लेषण किया गया था, दो स्वतंत्र प्रयोग किए गए थे। ** p<0.01, *****p<0.00001. स्केल बार: 200 μm. कोर्स को एफबीएस और विकास कारकों के बिना ईसीएम में इनक्यूबेट किया गया था। 48 घंटे के बाद, इस वातानुकूलित माध्यम को प्रयोगों के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर एकत्र और संग्रहीत किया गया था। इस आंकड़े को 8 से संशोधित किया गया है और अनुमति के साथ पुन: प्रस्तुत किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
| गिनती 1 | गिनती 2 | औसत | कुल माध्य | ||
| 6-वेल प्लेट | 1 दोहराएँ | 95% | 84% | 90% | 90% |
| प्रतिकृति 2 | 90% | 88% | 89% | ||
| प्रतिकृति 3 | 85% | 89% | 87% | ||
| प्रतिकृति 4 | 97% | 89% | 93% | ||
| प्रतिकृति 5 | 88% | 94% | 91% | ||
| प्रतिकृति 6 | 86% | 92% | 89% | ||
| 3 डी मुद्रित सम्मिलित करें | 1 दोहराएँ | 92% | 89% | 91% | 91% |
| प्रतिकृति 2 | 91% | 80% | 86% | ||
| प्रतिकृति 3 | 93% | 92% | 93% | ||
| प्रतिकृति 4 | 94% | 98% | 96% | ||
| प्रतिकृति 5 | 88% | 86% | 87% | ||
| प्रतिकृति 6 | 93% | 97% | 95% |
तालिका 1: कोआरएस व्यवहार्यता माप। कोआरएस व्यवहार्यता को 6-वेल प्लेट के एक कुएं में और ट्राइपैन ब्लू स्टेनिंग और स्वचालित गिनती का उपयोग करके 3 डी-मुद्रित सम्मिलित में मापा गया था।
| गिनती 1 | गिनती 2 | औसत | कुल माध्य | ||
| 6-वेल प्लेट | 1 दोहराएँ | 90% | 88% | 89% | 85% |
| प्रतिकृति 2 | 79% | 78% | 79% | ||
| प्रतिकृति 3 | 71% | 75% | 73% | ||
| प्रतिकृति 4 | 86% | 82% | 84% | ||
| प्रतिकृति 5 | 91% | 88% | 90% | ||
| प्रतिकृति 6 | 99% | 94% | 97% | ||
| 3 डी मुद्रित सम्मिलित करें | 1 दोहराएँ | 99% | 86% | 93% | 86% |
| प्रतिकृति 2 | 80% | 75% | 78% | ||
| प्रतिकृति 3 | 79% | 80% | 80% | ||
| प्रतिकृति 4 | 98% | 85% | 92% | ||
| प्रतिकृति 5 | 85% | 78% | 82% | ||
| प्रतिकृति 6 | 89% | 93% | 91% |
तालिका 2: एचडीएमईसी व्यवहार्यता माप। एचडीएमईसी व्यवहार्यता को 6-वेल प्लेट के कुएं में और ट्राइपैन ब्लू स्टेनिंग और स्वचालित गिनती का उपयोग करके 3 डी-मुद्रित सम्मिलित में मापा गया था।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
अप्रत्यक्ष सेल संचार की जांच आमतौर पर वातानुकूलित मीडिया या सह-संस्कृति प्रणाली उपकरणों का उपयोग करके की जाती है। वातानुकूलित मीडिया तैयारी प्रयोगों में अपस्ट्रीम समय लेने वाली है, और यह विधि एक तरफा प्रभाव विश्लेषण तक ही सीमित है। कॉलिन-पियरे एट अल द्वारा पिछला अध्ययन।वातानुकूलित मीडिया का उपयोग करके दो सेल प्रकारों (एचडीएमईसी और केओआरएस) के बीच अप्रत्यक्ष सेल संचार पर आयोजित किया गया था। इस पिछले अध्ययन के आंकड़ों ने एचडीएमईसी प्रसार पर कोआरएस वातानुकूलित मीडिया के प्रभाव और एचडीएमईसी माइग्रेशन, स्यूडोट्यूब गठन और जीपीसी 1 अभिव्यक्ति8 पर कोआरएस वातानुकूलित मीडिया के प्रभाव का प्रदर्शन किया। वर्तमान अध्ययन में, अप्रत्यक्ष सेल संचार की जांच करने का एक सरल और तेज़ तरीका वर्णित है। वास्तव में, 3 डी-मुद्रित आवेषण प्रयोगात्मक डिजाइन और सेल संस्कृति के कई संयोजनों में लचीलेपन की अनुमति देते हैं। सह-संस्कृतियों के लिए एक मॉडल के रूप में इन 3 डी-मुद्रित आवेषणों को मान्य करने के लिए, सेल प्रसार और सेल माइग्रेशन का विश्लेषण किया गया और वातानुकूलित मीडिया8 का उपयोग करके पिछले अध्ययन की तुलना की गई। दोनों अध्ययनों में, घाव भरने की परख को दो माइग्रेशन चैंबर डिवाइस (कल्चर-इंसर्ट 2 वेल इन μ-डिश 35 मिमी) का उपयोग करके किया गया था, जिसे कुएं में रखा गया था या जिसमें सम्मिलित नहीं था। यह माइग्रेशन टेस्ट डिवाइस 9,10 स्क्रैच परख11,12 से इस तथ्य से भिन्न है कि दीवार द्वारा छोड़े गए पदचिह्न (घाव का अनुकरण करते हुए) दो कक्षों को सीमांकित करते हैं। इसलिए, यह अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है। वर्तमान अध्ययन के परिणामों ने वातानुकूलित मीडिया प्रयोगों की तुलना में एक समान निष्कर्ष निकाला है। 3 डी-मुद्रित आवेषण सेल व्यवहार को नहीं बदलते हैं और सेल पालन को बढ़ावा देने वाले स्वतंत्र कम्पार्टमेंट कोटिंग्स बनाने के लिए अनुकूलित होते हैं। हालांकि, 3 डी-मुद्रित इंसर्ट पॉली-हेमा के साथ एक कोटिंग बनाने की भी अनुमति देते हैं, उदाहरण के लिए, स्फेरॉइड / ऑर्गेनॉइड की संस्कृति के लिए कम लगाव को प्रेरित करने के लिए। एचडीएमईसी और कोआरएस के बीच अप्रत्यक्ष संचार की जांच यहां 3 डी-मुद्रित आवेषण द्वारा आपूर्ति किए गए कई अनुप्रयोगों के उदाहरण के रूप में की गई थी।
अनुयायी सेल प्रकारों पर लागू होता है जिन्हें एक विशिष्ट कोटिंग की आवश्यकता होती है या नहीं, यह नया उपकरण सह-संस्कृति मॉडल की स्थापना के लिए महत्वपूर्ण समय की बचत प्रदान करता है। दरअसल, 3 डी-मुद्रित इंसर्ट के चार डिब्बे मोनोलेयर में या 3 डी (समुच्चय या स्फेरॉइड) में विभिन्न संयोजनों के साथ एक ही तरह से कई सेल प्रकारों की संस्कृति की अनुमति देते हैं। उदाहरण के लिए, मोनोलेयर में चार सेल प्रकारों के अप्रत्यक्ष संचार, 3 डी (स्फेरॉइड) में, या दोनों के संयोजन का विश्लेषण किया जा सकता है। प्रयोगों के दौरान, पॉली-हेमा कोटिंग (डेटा नहीं दिखाया गया) का उपयोग करके 3 डी-मुद्रित आवेषण में स्फेरॉइड को सुसंस्कृत किया गया था। स्फेरॉइड में कम अटैचमेंट बाइंडिंग प्लेट के कारण 3 डी में बीज वाली कोशिकाएं शामिल थीं और विश्लेषण के लिए 48 घंटे के बाद 3 डी-मुद्रित इंसर्ट में स्थानांतरित कर दी गईं। संस्कृति के कई दिनों के बाद, स्फेरॉइड की वृद्धि देखी गई। इन परिणामों से पता चलता है कि 3 डी-मुद्रित सम्मिलित का उपयोग स्फेरॉइड के हस्तांतरण के बाद 3 डी सेल वृद्धि का पालन करने के लिए उसी तरह किया जा सकता है जैसे कि कल्चर प्लेट13,14 में। इसके अलावा, प्रत्यक्ष और अप्रत्यक्ष सेल संचार दोनों का अध्ययन करने के लिए विभिन्न सेल प्रकारों के मिश्रण को 2 डी या 3 डी (ऑर्गेनोइड्स) में एक ही डिब्बे में एक साथ रखा जा सकता है। दरअसल, 3 डी-मुद्रित आवेषण द्वारा पेश की गई मॉड्यूलरिटी की विस्तृत श्रृंखला इस अभिनव सेल सह-संस्कृति प्रणाली की विशेषता है। इसके अलावा, संचार खिड़कियों की उपस्थिति वातानुकूलित मीडिया की सहायता के बिना चयनित समय पर सभी सेल प्रकारों के लिए एक सामान्य माध्यम में उपयोग करने की अनुमति देती है। इस प्रकार, यह तकनीक निलंबन में सुसंस्कृत कोशिकाओं पर लागू नहीं होती है। चार डिब्बों को अलग करने वाली दीवारें प्रत्येक सेल प्रकार को दूसरों से स्वतंत्र रूप से बोने, कटाई और विश्लेषण करने की अनुमति देती हैं। कई अनुप्रयोग किए जा सकते हैं, जैसे कि स्यूडोट्यूब गठन परख और प्रसार, प्रवासन, डीएनए, आरएनए, प्रोटीन और अन्य विश्लेषण। उदाहरण के लिए, 3 डी-मुद्रित आवेषण अणुओं या बाह्य पुटिकाओं के प्रभाव का विश्लेषण करने की संभावना भी प्रदान करते हैं। इसके अलावा, तथ्य यह है कि ये आवेषण 3 डी प्रिंटिंग द्वारा किए गए थे, कम्पार्टमेंट लेआउट और कई कार्यात्मक परख के लिए कई संभावनाएं प्रदान करता है।
हालांकि, प्लेट में 3 डी-मुद्रित सम्मिलित सीलिंग के महत्वपूर्ण चरण पर सावधानीपूर्वक विचार किया जाना चाहिए। दरअसल, सिलिकॉन का एक समरूप पुनर्विभाजन सीलिंग सुनिश्चित करने और सेल कल्चर माध्यम या कोशिकाओं के रिसाव को एक डिब्बे से दूसरे डिब्बे में रोकने के लिए महत्वपूर्ण है। किसी भी समस्या से बचने के लिए, किसी को यह सुनिश्चित करना चाहिए कि सिलिकॉन 3 डी-मुद्रित आवेषण के हिस्से को कवर करता है जो प्लेट के संपर्क में होगा। कोशिकाओं को बोने से पहले, एक डिब्बे में सेल कल्चर माध्यम जोड़कर और अन्य डिब्बों में मध्यम रिसाव की अनुपस्थिति को देखकर सही सीलिंग की जांच करनी चाहिए। 70% इथेनॉल स्नान में इनक्यूबेशन के बाद सिलिकॉन का सुखाने का समय भी एक महत्वपूर्ण कदम है। दरअसल, शराब के शेष निशान सेल निर्धारण और विषाक्तता का कारण बन सकते हैं। किसी भी समस्या से बचने के लिए, सुखाने के समय का सम्मान किया जाना चाहिए।
निष्कर्ष निकालने के लिए, 3 डी-मुद्रित आवेषण 2 डी या 3 डी में संस्कृति के लिए सबसे अनुयायी सेल प्रकारों के साथ संगत हैं और प्रयोग के कई तरीकों की अनुमति देते हैं। उन्हें कई सह-संस्कृति अध्ययनों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है और अप्रत्यक्ष सेल संचार की जांच के लिए एक नया उपकरण प्रदान कर सकता है। 3 डी-मुद्रित आवेषण मॉड्यूलेबल, लचीले, स्केलेबल हैं, और इसका उपयोग फिजियो-पैथोलॉजी जैसे कैंसर, इम्यूनोलॉजी या एंजियोजेनेसिस के अध्ययन के लिए प्रयोगात्मक मॉडल डिजाइन करने के लिए किया जा सकता है।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
लेखक ों ने कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की घोषणा नहीं की है।
Acknowledgments
यह अध्ययन बीएएसएफ ब्यूटी केयर सॉल्यूशंस के सहयोग से किया गया था। सुश्री चार्ली कॉलिन-पियरे एक बीएएसएफ / सीएनआरएस-वित्त पोषित पीएचडी फेलो हैं।
हम 3 डी-मुद्रित आवेषण की अवधारणा के लिए श्री मेहदी सेलामी को धन्यवाद देना चाहते हैं।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Autoclave | Getinge | APHP | Solid cycle, 121 °C for 20 min |
| Biomed Clear | Formlabs | RS-F2-BMCL-01 | Impression performed by 3D-Morphoz company (Reims, France) |
| Cell culture detergents | Tounett | A18590/0116 | |
| Cell Proliferation Reagent WST-1 | Roche | 11,64,48,07,001 | |
| Counting slide | NanoEnTek | EVE-050 | |
| Culture-Insert 2 Well in μ-Dish 35 mm | Ibidi | 80206 | two-migration chambers device. |
| Endothelial cell medium | ScienCell | 1001 | Basal medium +/- 25 mL of fetal bovine serum (FBS, 0025), 5 mL of endothelial cell growth supplement (ECGS, 1052), and 5 mL of penicillin/streptomycin solution (P/S, 0503). |
| EVE Automated cell counter | NanoEnTek | NESCT-EVE-001E | |
| EVOS XL Core | Fisher Scientific | AMEX1200 | 10x of magnification |
| Food silicon reagent and catalyst kit | Artificina | RTV 3428 A and B | (10:1) |
| FORM 3B printer | Formlabs | PKG-F3B-WSVC-DSP-BASIC | Impression performed by 3D-Morphoz company |
| Human Dermal Microvascular Endothelial Cells (HDMEC) | ScienCell | 2000 | |
| Keratinocytes of Outer Root Sheath (KORS ) | ScienCell | 2420 | |
| Macro Wound Healing Tool Software | ImageJ | Software used for the measurement of the uncovered surface (for migration assays) | |
| Mesenchymal stem cell medium | ScienCell | 7501 | Basal medium +/-25 mL of fetal bovine serum (FBS, 0025), 5 mL of mesenchymal stem cell growth supplement (MSCGS, 7552), and 5 mL of penicillin/streptomycin solution (P/S, 0503) |
| Microplate reader SPECTRO star NANO | BMG Labtech | BMG LABTECH software | |
| PBS | Promocell | C-40232 | Without Ca2+ / Mg2+ |
| Trypan Blue Stain | NanoEnTek | EBT-001 | |
| Trypsin / EDTA | Promocell | C-41020 | Incubation of KORS at 37 °C with 5% CO2 for 5 min. Incubation of HDMECs for 5 min at room temperature |
| 96-well plate Nunclon Delta Surface | Thermoscientific | 167008 |
References
- Regier, M. C., Alarid, E. T., Beebe, D. J. Progress towards understanding heterotypic interactions in multi-culture models of breast cancer. Integrative Biology. 8 (6), 684-692 (2016).
- Doğan, A., Demirci, S., Apdik, H., Apdik, E. A., Şahin, F. Mesenchymal stem cell isolation from pulp tissue and co-culture with cancer cells to study their interactions. Journal of Visualized Experiments. (143), e58825 (2019).
- Lin, J., et al. Long non-coding RNA UBE2CP3 enhances HCC cell secretion of VEGFA and promotes angiogenesis by activating ERK1/2/HIF-1α/VEGFA signalling in hepatocellular carcinoma. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 37 (1), 113 (2018).
- Soares, N. L., et al. Carbon monoxide modulation of microglia-neuron communication: Anti-neuroinflammatory and neurotrophic role. Molecular Neurobiology. 59 (2), 872-889 (2022).
- Al Halawani, A., Abdulkhalek, L., Mithieux, S. M., Weiss, A. S. Tropoelastin promotes the formation of dense, interconnected endothelial networks. Biomolecules. 11 (9), 1318 (2021).
- Mercatali, L., et al. Development of a human preclinical model of osteoclastogenesis from peripheral blood monocytes co-cultured with breast cancer cell lines. Journal of Visualized Experiments. (127), e56311 (2017).
- Orona, N. S., Astort, F., Maglione, G. A., Yakisich, J. S., Tasat, D. R. Direct and indirect effect of air particles exposure induce Nrf2-dependent cardiomyocyte cellular response in vitro. Cardiovascular Toxicology. 19 (6), 575-587 (2019).
- Colin-Pierre, C., et al. The glypican-1/HGF/C-met and glypican-1/VEGF/VEGFR2 ternary complexes regulate hair follicle angiogenesis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 781172 (2021).
- Toubal, A., et al. The NC1 domain of type XIX collagen inhibits melanoma cell migration. European Journal of Dermatology. 20 (6), 712-718 (2010).
- Wu, A. -L., et al. Role of growth factors and internal limiting membrane constituents in müller cell migration. Experimental Eye Research. 202, 108352 (2021).
- Oudart, J. -B., et al. Plasmin releases the anti-tumor peptide from the NC1 domain of collagen XIX. Oncotarget. 6 (6), 3656-3668 (2015).
- Martinotti, S., Ranzato, E.
- Cattin, S., Ramont, L., Rüegg, C. Characterization and in vivo validation of a three-dimensional multi-cellular culture model to study heterotypic interactions in colorectal cancer cell growth, invasion and metastasis. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 97 (2018).
- Ma, Y. N., et al. Three-dimensional spheroid culture of adipose stromal vascular cells for studying adipogenesis in beef cattle. Animal. 12 (10), 2123-2129 (2018).
