Summary
I dette papir præsenteres en nydesignet 3D-printet indsats som en model for co-kultur og valideres gennem undersøgelsen af den parakrin intercellulære kommunikation mellem endotelceller og keratinocytter.
Abstract
De klassiske analyser af indirekte kommunikation mellem forskellige celletyper nødvendiggør brug af konditionerede medier. Desuden forbliver produktionen af konditionerede medier tidskrævende og langt fra fysiologiske og patologiske tilstande. Selv om nogle få modeller af co-kultur er kommercielt tilgængelige, forbliver de begrænset til specifikke assays og er for det meste for to typer celler.
Her anvendes 3D-printede skær, der er kompatible med adskillige funktionelle assays. Indsatsen tillader adskillelse af en brønd i en 6-brøndplade i fire rum. En bred vifte af kombinationer kan indstilles. Desuden er vinduer designet i hver væg i rummene, så potentiel intercellulær kommunikation mellem hvert rum er mulig i kulturmediet på en volumenafhængig måde. For eksempel kan parakrin intercellulær kommunikation studeres mellem fire celletyper i monolag, i 3D (sfæroider) eller ved at kombinere begge. Derudover kan en blanding af forskellige celletyper podes i samme rum i 2D- eller 3D-format (organoider). Fraværet af en bund i de 3D-printede skær tillader de sædvanlige dyrkningsforhold på pladen, mulig belægning på pladen, der indeholder indsatsen, og direkte visualisering ved optisk mikroskopi. De mange rum giver mulighed for at indsamle forskellige celletyper uafhængigt eller i hvert rum anvende forskellige reagenser til RNA- eller proteinekstraktion. I denne undersøgelse gives en detaljeret metode til at bruge det nye 3D-printede skær som et samkultursystem. For at demonstrere flere kapaciteter i denne fleksible og enkle model blev tidligere offentliggjorte funktionelle assays af cellekommunikation udført i de nye 3D-printede indsatser og blev demonstreret at være reproducerbare. De 3D-printede indsatser og den konventionelle cellekultur ved hjælp af konditionerede medier førte til lignende resultater. Afslutningsvis er den 3D-printede indsats en simpel enhed, der kan tilpasses adskillige modeller af cokulturer med klæbende celletyper.
Introduction
In vivo kommunikerer celler med hinanden enten direkte (cellekontakt) eller indirekte (ved udskillelse af molekyler). For at studere cellekommunikation kan der udvikles forskellige samkulturmodeller, såsom direkte samkultur (de forskellige celletyper er i direkte interaktion i samme brønd) og opdelt samkultur (de forskellige celletyper er i indirekte interaktion i forskellige rum i et kultursystem)1. Desuden kan konditionerede medier anvendes til samkultursystemer, hvor den indirekte interaktion muliggøres af udskillede molekyler indeholdt i det konditionerede medie af en effektorcelletype, der overføres til en respondercelletype1.
I tilfælde af parakrin cellekommunikationsundersøgelser giver indirekte samkultursystemer modeller, der stærkt afspejler celleinteraktioner in vivo. Indirekte samkultursystemer er blevet udviklet og kommercialiseret, hvilket muliggør etablering af indirekte samkulturmodeller 2,3. Desværre giver de fleste indirekte samkultursystemer kun to rum. Andre indirekte samkultursystemer giver flere rum, men de er mindre skalerbare sammenlignet med det system, der er rapporteret i dette manuskript. Nogle af dem tillader ikke en klassisk visualisering under et mikroskop, og de præsenterer ofte specifikke applikationsmetoder. I flere undersøgelser undersøges den parakrinkommunikation mellem forskellige celletyper ved hjælp af den konditionerede mediemodel 4,5,6,7. Dette er en lettere måde at undersøge sammenlignet med indirekte samkultursystemer, fordi det ikke kræver, at der fastlægges specifikke metoder eller materialer1. På den anden side er forberedelsen af konditionerede medier tidskrævende og giver kun information om envejs cellesignalering (effektor til responder)1.
I dette papir foreslås en ny, enkel måde at undersøge cellekommunikation på. Ved at tillade kombinationen af flere celletyper i direkte eller indirekte interaktion og i 2D- eller 3D-formater giver de trykte skær adskillige fordele ved let at oprette samkulturmodeller. Den 3D-printede indsats er tilpasset til at blive placeret i brøndene på 6-brøndsplader og er cirkulær og tillader adskillelse af brønden i fire rum (to store rum og to små rum; Figur 1A). De 3D-printede skær er kendetegnet ved fraværet af en bund. Således er cellerne i direkte kontakt med pladen, hvorpå indsatsen er placeret. Derudover kan hvert rum belægges uafhængigt af de andre. Desuden kan celleadfærden let følges under optiske mikroskoper. Tilstedeværelsen af kommunikationsvinduer i hver væg af indsatsen tillader tilsætning på det optimale tidspunkt af et fælles medium til at udføre forskellige eksperimenter med samkultur. Talrige kombinationer af co-kultur kan udføres for at studere direkte og / eller indirekte kommunikation mellem flere celletyper. For eksempel kan der designes en model af indirekte samkultur mellem fire forskellige celletyper i monolag og/eller i 3D (sfæroider). En kombination af direkte og indirekte samkulturmodeller kan også udføres ved at blande forskellige celletyper i samme rum. Effekten af komplekse strukturer (organoider, vævseksplantat osv.) på forskellige celletyper kunne være et andet eksempel på modeller, der kan laves. Desuden er de 3D-printede indsatser kompatible med cellebiologiske funktionelle assays (proliferation, migration, pseudorørdannelse, differentiering osv.) og med biokemiske tests (ekstraktion af DNA, RNA, protein, lipider osv.). Endelig giver de 3D-printede skær en bred vifte af eksperimentelle skemaer af samkulturmodeller med mulighed for at kombinere samtidigt forskellige assays i det samme eksperiment i de forskellige rum.
Nogle kapaciteter af de 3D-printede skær præsenteres for at validere dem som en hurtig og brugervenlig samkulturmodel. I sammenligning med et tidligere publiceret studie af parakrin cellekommunikation demonstreres de 3D-printede inserters evne til at være en værdifuld samkulturmodel. For at vurdere dette punkt blev reguleringen af endotelcelleproliferation og migration af keratinocytter sammenlignet mellem det 3D-printede indsatssystem og det klassiske system ved hjælp af konditionerede medier. De 3D-printede skær giver mulighed for hurtigt at opnå lignende resultater sammenlignet med det konventionelle system ved hjælp af konditionerede medier. Faktisk giver de 3D-printede indsatser en robust model til at studere celleinteraktioner i begge retninger uden behov for at producere konditionerede medier og med mulighed for parallelt at udføre sprednings- og migrationsassays i samme eksperiment.
Afslutningsvis foreslås i dette papir en ny og klar til brug model til undersøgelse af cellekommunikation. De 3D-printede indsatser er kompatible med alle klæbende celletyper og giver mulighed for at udføre adskillige kombinationer af samkultur, der sigter mod at være tættere på in vivo-forhold .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: 3D-indsatserne (figur 1A) er kommercielt indkøbt og udskrives ved hjælp af en fotopolymerharpiks, der er biokompatibel med cellekultur og autoklavering (se materialetabellen). I dette afsnit beskrives en detaljeret protokol til etablering af samkulturmodellen ved hjælp af inserts (se figur 1B). Der gives også nogle eksempler på applikationer.
1. Placering af den steriliserede indsats i 6-brøndpladerne
- Bland de to komponenter, der leveres i sættet (se materialetabellen), fødevaresilicium (reagens A) og katalysator (reagens B) i et forhold på 10: 1 (v / v) i henhold til producentens anvisninger. (Figur 1Ba). Brug en 70% ethanolsteriliseret spatel til at blande de to komponenter.
BEMÆRK: Volumenet af siliciumblandingen, der skal fremstilles, afhænger af antallet af skær, der skal fastgøres. Et overskud af katalysator kan resultere i, at siliciumblandingen størkner for hurtigt. - Skærene påføres siliciumblandingen med pincetten, så blandingen fordeles homogent ved skærets nederste kant (figur 1Bb). Skærene anbringes i hullerne på en plade med 6 huller, og skærene trykkes let på for at sikre, at indsatserne er i tæt kontakt med pladen for at undgå lækage af cellekulturmediet (figur 1Bc).
- Pladen anbringes ved 37 °C for at understøtte siliciummets størkningsproces i 1 time.
BEMÆRK: Tidspunktet for størkning afhænger af mængden af katalysator, der er tilsat. - Efter størkning steriliseres pladerne med indsatserne ved at nedsænke dem i et 70% ethanolbad i 30 minutter til 1 time.
- Kassér alkoholen ved pipettering, og lad pladen tørre (låget åbent) natten over i en cellekulturhætte.
BEMÆRK: Alkoholen skal være helt fordampet, før du udfører det næste trin for at undgå cellefiksering og toksicitet. Den brugsklare plade, der indeholder indsatserne, kan opbevares i flere dage før brug under tørre og sterile forhold ved stuetemperatur.
2. Belægninger såsom poly-L-lysin eller poly-HEMA (valgfrit trin)
BEMÆRK: Belægning udføres ikke i dette eksperiment, og trinene er angivet for at informere om muligheden for belægning af skærene.
- Forbered belægningsopløsningen i henhold til producentens anvisninger.
- Overvej et volumen på 200-400 μL for de største rum og et volumen på 50-100 μL for de mindste rum til belægning af indsatsen. Tilføj belægningsopløsningen til de enkelte rum.
- Lad belægningen tørre som angivet af producenten under sterile forhold.
3. Såning af cellerne
- Keratinocytterne i den ydre rodkappe (KORS) og humane dermale mikrovaskulære endotelceller (HDMEC'er) dyrkes som anbefalet af producenten. Forbered cellesuspensionen, når cellerne når sammenløb.
- Kassér substratet fra kolberne, og tilsæt 5 ml trypsin for at løsne cellerne (se materialetabel).
- Kolben med KORS anbringes ved 37 °C med 5% CO2 i 5 min. Kolben med HDMEC'erne inkuberes i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Bland trypsinopløsningen indeholdende KORS med 5 ml mesenkymt stamcellemedium (MSCM) suppleret med 5% føtalt bovint serum (FBS) og vækstfaktorer (basalmedium med tilskudssæt, se materialetabel). Bland trypsinopløsningen indeholdende HDMEC'erne med 5 ml endotelcellemedium (ECM) suppleret med 5% FBS og vækstfaktorer (se materialetabel).
- Overfør cellerne til et 15 ml sterilt konisk rør. KORS- og HDMEC-suspensionerne centrifugeres ved 200 x g i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Supernatanten kasseres, og cellerne resuspenderes i 2 ml af det pågældende substrat.
- 10 μL af cellesuspensionen blandes med 10 μL trypanblåt farvestof (se materialetabel).
- Der tilsættes 10 μL af blandingen i tælleglassets kammer.
- Indsæt tællediaset i celletællingssystemet (se materialetabellen), og registrer cellenummeret og levedygtigheden.
- Cellesuspensionen fremstilles i en koncentration på 0,5 x 105 celler/ml i det respektive medium.
BEMÆRK: Hvis de forskellige celletyper kræver forskellige tidspunkter for vedhæftning og / eller for at nå den ideelle sammenløb, kan cellesåningen foretages på forskellige tidspunkter i henhold til celletyperne.
- 800 μL til 1 ml af cellesuspensionen fordeles i de enkelte store rum og 100-150 μL i de enkelte små rum med en pipette.
- Seed KORS ved 1 x 10 5 celler/ml i MSCM suppleret med5% FBS og vækstfaktorer i et af de store rum.
- Seed HDMEC i ECM suppleret med 5% FBS og vækstfaktorer ved 2,5 x 103 celler/ml i de små rum og ved 1,25 x 105 celler/ml i det andet store rum.
BEMÆRK: Proliferationsanalysen kan udføres i de små rum, og migrations- og levedygtighedsanalyserne kan udføres i de store rum. Koncentrationen af de frøede celler er optimeret i henhold til producentens anbefalinger. Denne koncentration muliggør god levedygtighed af cellerne efter 24-48 timers inkubation.
- Cellekulturpladen anbringes ved 37 °C med 5 % CO2 eller under de sædvanlige betingelser for at muliggøre cellevedhæftning og/eller modning.
BEMÆRK: Inkuber cellerne i 24-48 timer uden at ændre mediet. Om nødvendigt kan rummets medium ændres uafhængigt.
4. Gennemførelse af samkulturen (figur 1Bd)
BEMÆRK: Implementeringen af samkulturen svarer til det tidspunkt, hvor det fælles medium tilføjes. Tilføjelsen af et unikt medium til alle celletyperne i de forskellige rum giver mulighed for parakrin kommunikation mellem cellerne på grund af tilstedeværelsen af kommunikationsvinduer (ovoide huller i væggene i de 3D-printede indsatser). Følg trin 4.1-4.3 for at implementere samkulturen.
- Tøm kulturmediet i indsatsens forskellige rum ved hjælp af en pipette. I tilfælde af en 3D-sfærisk cellekultur kasseres mediet meget forsigtigt.
- Cellerne skylles med 1 ml 37 °C varm PBS i de store rum og 200 μL 37 °C varm PBS i de små rum. Sørg for skånsom vask for ikke at løsne cellerne.
- Tilføj 3 ml af et fælles medie, der er valgt til at være kompatibelt for alle celletyper.
BEMÆRK: I denne undersøgelse anvendes den basale ECM (uden FBS og vækstfaktorer). Sørg for, at mediet dækker alle rum (niveau over kommunikationsvinduerne [ægformede huller i væggene], som vist i figur 1A). - Pladen med samkulturerne anbringes ved 37 °C med 5% CO2 i 24-48 timer.
5. Celleobservation, tælling og skrabning
- Overhold morfologien og tæl cellenummeret på de forskellige rum under eksperimentet under et optisk mikroskop efter 24-48 timers inkubation.
BEMÆRK: Det forventede antal celler afhænger af de anvendte celletyper (størrelse, morfologi osv.) og af rumstørrelsen. I dette eksperiment tælles mellem 0,5 x 10 6-1 x 10 6 KORS / ml og mellem 0,25 x 10 6-0,75 x 10 6 HDMEC / ml i de store rum. - Fjern cellerne ved hjælp af trypsin til tælling af cellesuspension.
BEMÆRK: For cellefrigørelsesopløsningen skal du overveje et volumen på 100-500 μL for de største rum og et volumen på 10-50 μL for de mindste rum. - Kontroller levedygtigheden ved hjælp af trypanblå farvning (se trin 3.1.6-3.1.8).
6. Indsæt rengøring til genbrug
- Fjern skærene fra 6-brøndspladen i slutningen af eksperimentet med en let drejning (figur 1Be).
- Fjern siliciummet fra indsatserne ved at trække det af. Brug om nødvendigt en spatel til at fjerne det resterende silicium, der sidder fast på skærets vægge (figur 1Bf).
- Vask indsatserne med konventionelle cellekulturvaskemidler og rengøringsmidler (eksempel i materialetabellen).
- Skærene steriliseres til fremtidig brug i en autoklave (fast cyklus, 121 °C i 20 min) eller ved at nedsænke dem i et 70% ethanolbad i 1 time.
BEMÆRK: Fra dette trin beskrives to eksempler på mulige assays (proliferation and migration assays) ved hjælp af de 3D-printede skær (figur 1Bd).
7. Celleproliferationsanalyse - WST-1-analyse
- Følg trin 1-3.1 for at dyrke cellerne.
BEMÆRK: Følg trinnet i dette afsnit for at implementere samkultursystemet for at undersøge effekten af KORS-sekretomet på HDMEC-spredning. KORS-celler bruges til at sammenligne de data, der er offentliggjort tidligere8.- Frø KORS ved 1 x 10 5 celler/ml i mesenkymt stamcellemedium (MSCM) suppleret med5% FBS og vækstfaktorer i de store rum.
- Cellekulturpladen anbringes ved 37 °C med 5 % CO2 i 24 timer.
- HDMEC'erne sås i endotelcellemedium (ECM) suppleret med 5% FBS og vækstfaktorer ved 2,5 x 103 celler/ml i de små rum.
- Cellekulturpladen anbringes ved 37 °C med 5% CO2 i 24-48 timer.
- Kassér mediet fra alle rummene, og implementer samkultursystemet ved tilsætning af 3 ml ikke-suppleret basal ECM (fælles cellekulturmedium for alle rum i de 3D-printede indsatser).
- Der fortyndes WST-1 i det fælles cellekulturmedium ECM (1:10 endelig fortynding) for at fremstille WST-1-opløsningen.
BEMÆRK: For mængden af WST-1-opløsning fremstilles mindst 500 μL ekstra opløsning til blindprøven. - Kassér cellekulturmediet fra indsatsen ved pipettering.
- Tilføj WST-1-opløsningen til de valgte rum (150 μL for de små rum og 600 μL for de store rum). Pladen anbringes ved 37 °C med 5% CO2.
- Efter den optimale 30 minutters celleinkubationstid overføres 100 μL af inkubationsmediet fra hver tilstand på en plade med 96 huller.
- Den kolorimetriske reaktion vurderes ved hjælp af en mikropladelæser mellem 420 nm og 480 nm.
- Sæt pladen på mikropladelæseren, og klik på knappen rediger en ny protokol.
- Vælg den specifikke type 96-brøndplade (se tabel over materialer), der anvendes, og bølgelængden på 450 nm.
- Klik på knappen start måling.
8. Cellemigrationsanalyse - to migrationskamre enhed
- Følg trin 1-3.1 for at dyrke cellerne.
BEMÆRK: Følg trinene i dette afsnit for at implementere samkultursystemet for at undersøge effekten af KORS-sekretomet på HDMEC-spredning.- Seed KORS ved 1 x 10 5 celler/ml i MSCM suppleret med5% FBS og vækstfaktorer i et af de store rum.
- Cellekulturpladen anbringes ved 37 °C med 5 % CO2 i 24 timer.
- Sæt enheden med to migrationskamre i det andet store rum med indsatser.
- HDMEC'erne i ECM tilsættes 5% FBS og vækstfaktorer ved 7 x 105 celler/hul i anordningen med to migrationskamre.
- Cellekulturpladen anbringes ved 37 °C med 5 % CO2 i 24 timer.
- Kassér mediet og enheden med de to overførselskamre efter 24 timer eller på et optimalt tidspunkt afhængigt af den celletype, der overføres. Implementere samkultursystemet ved tilsætning af 3 ml ikke-suppleret basal ECM.
BEMÆRK: Fortsæt forsigtigt for ikke at løsne cellerne. Hvis cellerne virkelig er følsomme over for løsrivelse induceret ved tilsætning af fælles medium, skal du trække de to migrationskamre af efter tilsætning af det fælles medium.
- Observer og tag et billede af overfladen dækket af cellerne på forskellige tidspunkter under et fasekontrastmikroskop ved 10x forstørrelse.
BEMÆRK: Billederne er taget med et fasekontrastmikroskop (se Materialetabel). Billederne gemmes i en USB-nøgle og analyseres derefter af softwarens sårhelingsværktøjs plugin (se materialetabel). - Mål den afdækkede overflade ved hjælp af klassisk kvantitativ analysesoftware.
- Åbn billedet på softwaren, og aktiver sårhelingsværktøjet, der er tilgængeligt i makrolisten.
- Klik på knappen m for at måle den afdækkede overflade af migreringsbilledet.
- Den afdækkede overflade beregnes efter følgende formel:
Procentdel af dækning = ([gennemsnitligt areal uden celler ved T0 − areal uden celler på tidspunktet T]/middelareal uden celler ved T0) × 100.
BEMÆRK: De 3D-printede indsatser er fuldstændig tilpasset de fleste teknikker inden for cellebiologi (såsom pseudorørdannelsesassay, 3D-kulturer) og til biokemiske eksperimenter (såsom ekstraktion af DNA, RNA, protein).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I dette arbejde blev der beskrevet et optimeret samkultursystem for at opnå robuste, pålidelige og signifikante data, der kan sammenlignes med klassiske metoder ved brug af konditionerede medier. De 3D-printede skær efterligner in vivo-mikromiljøforholdene for forskellige celletyper i interaktion ved at overvinde vanskelighederne og den tidskrævende produktion af konditionerede medier opstrøms i eksperimenterne. En tidligere offentliggjort undersøgelse er blevet regennemført for at analysere de indirekte interaktioner mellem to celletyper, der findes i hårsækkene: humane mikrovaskulære endotelceller (HDMEC'er) og humane keratinocytter i den ydre rodkappe (KORS)8. Her blev reproducerbarheden af resultaterne opnået ved anvendelse af de 3D-printede skær sammenlignet med den klassiske metode ved hjælp af konditionerede medier til at undersøge indirekte interaktioner mellem HDMEC'er og KORS demonstreret. De cellekulturbetingelser, der tidligere er beskrevet i undersøgelsen8, var de samme som i dette arbejde. De blev tilpasset under hensyntagen til dimensionerne på de 3D-printede skær (se protokollen). Først og fremmest var fænotypen og cellelevedygtigheden sammenlignelige mellem de to betingelser (konditionerede medier vs.3D-trykte indsatser) for alle celletyper (figur 2). Faktisk blev 90% levedygtighed observeret i brøndene i 6-brøndpladerne (figur 2A og tabel 1), og 91% blev observeret i de 3D-printede indsatser (figur 2B og tabel 1) for KORS. HDMEC'ernes levedygtighed var 85 % i brøndene på 6-brøndpladen (figur 2C og tabel 2) mod 86 % i de 3D-printede indsatser (figur 2D og tabel 2). Dataene for cellelevedygtighed blev beregnet af den automatiserede celletæller (materialetabel) som følger: antallet af levedygtige celler divideret med antallet af samlede celler (døde + levedygtige celler). De gennemsnitlige data blev opnået ved at beregne levedygtighedsprocenten opnået i seks uafhængige forsøg, hvor to replikater blev udført (se tabel 1 og tabel 2).
Disse resultater indikerede, at den 3D-printede indsats ikke ændrede celleadfærden eller levedygtigheden sammenlignet med sædvanlig kultur på 6-brøndplader. Derfor blev de 3D-printede skær valideret som en ny model for samkultur.
Tidligere demonstrerede parametre8 for indirekte cellekommunikation blev analyseret. For alle eksperimenterne blev implementeringen af 3D-printet skærsamkultur realiseret efter protokollerne i overensstemmelse med de klassiske kulturforhold (se tidligere arbejde8).
Først blev den indirekte cellekommunikation mellem KORS og HDMEC'er i de 3D-printede indsatser vurderet ved at analysere celleproliferation og sammenlignet med den klassiske metode ved hjælp af konditionerede medier (figur 3). I nærvær af KORS i indsatserne (+ KORS) steg HDMEC-proliferation signifikant med 1,5 gange efter 24 timer og med 3,1 gange efter 48 timer sammenlignet med kontroltilstanden uden KORS (kontrol) (figur 3A). Disse resultater var i overensstemmelse med dem, der blev opnået ved betingede medieeksperimenter (figur 3B). Faktisk viste KORSCM sig at øge HDMEC-spredningen betydeligt med 1,5 gange efter 24 timer og med 2,1 gange efter 48 timer.
Den 3D-printede skær-samkulturmodel blev testet for at bestemme effekten af KORS på HDMEC-migration. Denne effekt blev tidligere påvist i det klassiske samkultursystem ved hjælp af konditionerede medier8 (figur 4). I kontroltilstanden uden KORS (kontrol) migrerede HDMEC'er og dækkede ca. 44% af sårområdet efter 24 timer (figur 4A). I nærvær af KORS (+ KORS) blev der observeret en stærk og signifikant stigning i HDMEC-migration. Faktisk viste sårhelingens kinetik, at 43%, 67% og 99% af sårområdet var dækket af HDMEC'er efter henholdsvis 3 timer, 12 timer og 24 timer. Disse resultater var i overensstemmelse med de tidligere opnåede8, hvor KORSCM viste sig at øge HDMEC-migrationen på en lignende måde (figur 4B).
Figur 1: Arbejdsproces, der viser implementeringen af 3D-printet skærsamkultur fra rengøring til genanvendelse af indsatsen . (A) Et repræsentativt billede af det 3D-printede skær. (B) Et repræsentativt eksempel på de analyser, der præsenteres i dette manuskript, er illustreret. Bemærk, at der kan foretages et proliferationsassay i det ene rum i det 3D-printede skær parallelt med et migrationsassay udført i det andet rum ved hjælp af en anordning med to migrationskamre, der er placeret i de andre rum i de 3D-printede skær. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: KORS og HDMEC levedygtighed. (A,B) KORS-morfologi (10x) i (A) en brønd med en 6-brøndsplade og (B) i en 3D-printet indsats. (C,D) HDMEC-morfologi (10x) i (C) en brønd med 6-brøndsplade og (D) i en 3D-printet indsats. Skalabjælke: 200 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Effekt af KORS på HDMEC-spredning. (A) HDMEC-proliferation blev målt ved kolorimetrisk assay ved anvendelse af WST-1-farvestof i det 3D-printede skær i fravær af KORS (kontrol = CTRL) eller i tilstedeværelse af KORS (+ KORS) i 24 timer eller 48 timer. (B) HDMEC-proliferation blev målt ved kolorimetrisk assay under anvendelse af WST-1-farvestof under tilstedeværelse af ECM basalcellekulturmedium eller KORSCM i 24 timer eller 48 timer. Resultaterne udtrykkes som gennemsnit ± SEM, n = 8 replikater, og to uafhængige eksperimenter blev udført. *p < 0,05, ***p < 0,001, ****p < 0,0001 og *****p < 0,00001. KORS blev inkuberet i ECM uden FBS og vækstfaktorer. Efter 48 timer blev dette konditionerede substrat opsamlet og opbevaret ved -80 °C til forsøgene. Dette tal er ændret fra 8 og gengivet med tilladelse. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Effekt af KORS på HDMEC-migration. (A) Migrationen af HDMEC i det 3D-printede skær i fravær af KORS (kontrol = CTRL) eller i nærværelse af KORS (+ KORS) vises og kvantificeres som genvindingsprocenten. (B) Migrationen af HDMEC i ECM eller KORSCM vises og kvantificeres som genfindelsesprocenten. Resultaterne udtrykkes som gennemsnittet ± SEM, n = 3 replikater, og tre felter blev analyseret pr. Replikat, to uafhængige eksperimenter blev udført. **p<0,01, *****p<0,00001. Skala bar: 200 μm. KORS blev inkuberet i ECM uden FBS og vækstfaktorer. Efter 48 timer blev dette konditionerede substrat opsamlet og opbevaret ved -80 °C til forsøgene. Dette tal er ændret fra 8 og gengivet med tilladelse. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Antal 1 | Antal 2 | Betyde | Samlet gennemsnit | ||
| 6-brønds plade | Repliker 1 | 95% | 84% | 90% | 90% |
| Repliker 2 | 90% | 88% | 89% | ||
| Repliker 3 | 85% | 89% | 87% | ||
| Repliker 4 | 97% | 89% | 93% | ||
| Repliker 5 | 88% | 94% | 91% | ||
| Repliker 6 | 86% | 92% | 89% | ||
| 3D-printet indsats | Repliker 1 | 92% | 89% | 91% | 91% |
| Repliker 2 | 91% | 80% | 86% | ||
| Repliker 3 | 93% | 92% | 93% | ||
| Repliker 4 | 94% | 98% | 96% | ||
| Repliker 5 | 88% | 86% | 87% | ||
| Repliker 6 | 93% | 97% | 95% |
Tabel 1: Måling af KORS' levedygtighed. KORS-levedygtigheden blev målt i en brønd på en 6-brøndsplade og i en 3D-printet indsats ved hjælp af trypanblå farvning og automatisk tælling.
| Antal 1 | Antal 2 | Betyde | Samlet gennemsnit | ||
| 6-brønds plade | Repliker 1 | 90% | 88% | 89% | 85% |
| Repliker 2 | 79% | 78% | 79% | ||
| Repliker 3 | 71% | 75% | 73% | ||
| Repliker 4 | 86% | 82% | 84% | ||
| Repliker 5 | 91% | 88% | 90% | ||
| Repliker 6 | 99% | 94% | 97% | ||
| 3D-printet indsats | Repliker 1 | 99% | 86% | 93% | 86% |
| Repliker 2 | 80% | 75% | 78% | ||
| Repliker 3 | 79% | 80% | 80% | ||
| Repliker 4 | 98% | 85% | 92% | ||
| Repliker 5 | 85% | 78% | 82% | ||
| Repliker 6 | 89% | 93% | 91% |
Tabel 2: Måling af HDMEC-levedygtighed. HDMEC-levedygtigheden blev målt i en brønd på en 6-brøndsplade og i en 3D-printet indsats ved hjælp af trypanblå farvning og automatisk tælling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Indirekte cellekommunikation undersøges almindeligvis ved hjælp af konditionerede medier eller co-kultursystemenheder. Konditioneret medieforberedelse er tidskrævende opstrøms i forsøgene, og denne metode er begrænset til ensidige effektanalyser. Den tidligere undersøgelse af Colin-Pierre et al.8 ved hjælp af konditionerede medier blev udført på den indirekte cellekommunikation mellem to celletyper (HDMEC'er og KORS). Dataene fra denne tidligere undersøgelse viste effekten af KORS-konditionerede medier på HDMEC-spredning og effekten af KORS-konditionerede medier på HDMEC-migration, pseudorørdannelse og GPC1-ekspression8. I dette studie beskrives en enklere og hurtigere måde at undersøge indirekte cellekommunikation på. Faktisk giver 3D-printede indsatser fleksibilitet i eksperimentelt design og flere kombinationer af cellekultur. For at validere disse 3D-printede indsatser som model for samkulturer blev celleproliferation og cellemigration analyseret og sammenlignet med den tidligere undersøgelse ved hjælp af konditionerede medier8. I begge undersøgelser blev sårhelingsanalysen udført ved hjælp af en anordning med to migrationskamre (kulturindsats 2 brønd i μ-skål 35 mm) anbragt i brønden, der indeholder eller ikke indeholder indsatsen. Denne migrationstestenhed9,10 adskiller sig fra scratch-assays11,12 ved, at fodaftrykket efterladt af væggen (simulering af såret), der afgrænser de to kamre, er konstant. Derfor er det meget reproducerbart. Resultaterne af denne undersøgelse har ført til en lignende konklusion i sammenligning med betingede medieeksperimenter. De 3D-printede indsatser ændrer ikke celleadfærden og er tilpasset til at fremstille uafhængige rumbelægninger, der fremmer cellevedhæftning. De 3D-printede skær giver dog også mulighed for at lave en belægning med poly-HEMA, for eksempel for at inducere lav vedhæftning til kulturen af sfæroiden / organoiden. Indirekte kommunikation mellem HDMEC'er og KORS blev her undersøgt som et eksempel på de mange applikationer, der leveres af de 3D-printede skær.
Denne nye enhed, der kan anvendes til klæbende celletyper, der kræver eller ikke kræver en bestemt belægning, giver betydelige tidsbesparelser til etablering af samkulturmodellen. Faktisk tillader de fire rum i de 3D-printede indsatser dyrkning af flere celletyper i monolag eller i 3D (aggregater eller sfæroider) i samme brønd med forskellige kombinationer. For eksempel kan den indirekte kommunikation af fire celletyper i monolag, i 3D (sfæroider) eller en kombination af begge analyseres. Under forsøgene blev sfæroider dyrket i de 3D-printede indsatser ved hjælp af en poly-HEMA-belægning (data ikke vist). Sfæroiderne bestod af celler, der var podet i 3D på grund af den lave fastgørelsesbindingsplade og overført efter 48 timer til det 3D-printede skær til analyser. Efter flere dages kultur blev væksten af sfæroiderne observeret. Disse resultater viser, at det 3D-printede skær kan bruges til at følge 3D-cellevækst efter overførsel af sfæroider på samme måde som i en dyrkningsplade13,14. Desuden kan en blanding af forskellige celletyper sættes sammen i samme rum i 2D eller 3D (organoider) for at studere både direkte og indirekte cellekommunikation. Faktisk karakteriserer den brede vifte af modularitet, der tilbydes af de 3D-printede skær, dette innovative cellesamkultursystem. Derudover giver tilstedeværelsen af kommunikationsvinduerne mulighed for at bruge i et fælles medium til alle celletyper på et valgt tidspunkt uden hjælp fra konditionerede medier. Denne teknik er således ikke anvendelig på celler dyrket i suspension. Væggene, der adskiller de fire rum, giver mulighed for såning, høst og analyse af hver celletype uafhængigt af de andre. Flere anvendelser kunne foretages, såsom pseudorørdannelsesassays og proliferation, migration, DNA, RNA, protein og andre analyser. De 3D-printede skær giver også mulighed for at analysere effekten af f.eks. molekyler eller ekstracellulære vesikler. Desuden giver det faktum, at disse skær blev fremstillet ved 3D-udskrivning, adskillige muligheder for rumlayout og adskillige funktionelle assays.
Det kritiske trin i den 3D-printede skærforsegling i pladen skal dog overvejes nøje. Faktisk er en homogen omfordeling af silicium afgørende for at sikre forsegling og for at forhindre lækage af cellekulturmedium eller celler fra et rum til et andet. For at undgå problemer skal man sørge for, at siliciumet dækker den del af de 3D-printede indsatser, der vil være i kontakt med pladen. Før podning af cellerne skal man kontrollere for korrekt forsegling ved at tilføje cellekulturmedium til et rum og observere fraværet af medium lækage i de andre rum. Siliciumets tørretid efter inkubationen i 70% ethanolbadet er også et kritisk trin. Faktisk kan de resterende spor af alkohol føre til cellefiksering og toksicitet. For at undgå problemer skal tørretiden respekteres.
Afslutningsvis er de 3D-printede indsatser kompatible med de fleste klæbende celletyper til kultur i 2D eller 3D og giver mulighed for adskillige eksperimenteringsmetoder. De kan tilpasses til talrige samkulturstudier og kan give et nyt værktøj til at undersøge indirekte cellekommunikation. De 3D-printede skær er modulable, fleksible, skalerbare og kan bruges til at designe eksperimentelle modeller til studier af fysiopatologier som cancerologi, immunologi eller angiogenese.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev foretaget i samarbejde med BASF Beauty Care Solutions. Charlie Colin-Pierre er en BASF / CNRS-finansieret ph.d.-stipendiat.
Vi vil gerne takke Mr. Mehdi Sellami for udformningen af de 3D-printede skær.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Autoclave | Getinge | APHP | Solid cycle, 121 °C for 20 min |
| Biomed Clear | Formlabs | RS-F2-BMCL-01 | Impression performed by 3D-Morphoz company (Reims, France) |
| Cell culture detergents | Tounett | A18590/0116 | |
| Cell Proliferation Reagent WST-1 | Roche | 11,64,48,07,001 | |
| Counting slide | NanoEnTek | EVE-050 | |
| Culture-Insert 2 Well in μ-Dish 35 mm | Ibidi | 80206 | two-migration chambers device. |
| Endothelial cell medium | ScienCell | 1001 | Basal medium +/- 25 mL of fetal bovine serum (FBS, 0025), 5 mL of endothelial cell growth supplement (ECGS, 1052), and 5 mL of penicillin/streptomycin solution (P/S, 0503). |
| EVE Automated cell counter | NanoEnTek | NESCT-EVE-001E | |
| EVOS XL Core | Fisher Scientific | AMEX1200 | 10x of magnification |
| Food silicon reagent and catalyst kit | Artificina | RTV 3428 A and B | (10:1) |
| FORM 3B printer | Formlabs | PKG-F3B-WSVC-DSP-BASIC | Impression performed by 3D-Morphoz company |
| Human Dermal Microvascular Endothelial Cells (HDMEC) | ScienCell | 2000 | |
| Keratinocytes of Outer Root Sheath (KORS ) | ScienCell | 2420 | |
| Macro Wound Healing Tool Software | ImageJ | Software used for the measurement of the uncovered surface (for migration assays) | |
| Mesenchymal stem cell medium | ScienCell | 7501 | Basal medium +/-25 mL of fetal bovine serum (FBS, 0025), 5 mL of mesenchymal stem cell growth supplement (MSCGS, 7552), and 5 mL of penicillin/streptomycin solution (P/S, 0503) |
| Microplate reader SPECTRO star NANO | BMG Labtech | BMG LABTECH software | |
| PBS | Promocell | C-40232 | Without Ca2+ / Mg2+ |
| Trypan Blue Stain | NanoEnTek | EBT-001 | |
| Trypsin / EDTA | Promocell | C-41020 | Incubation of KORS at 37 °C with 5% CO2 for 5 min. Incubation of HDMECs for 5 min at room temperature |
| 96-well plate Nunclon Delta Surface | Thermoscientific | 167008 |
References
- Regier, M. C., Alarid, E. T., Beebe, D. J. Progress towards understanding heterotypic interactions in multi-culture models of breast cancer. Integrative Biology. 8 (6), 684-692 (2016).
- Doğan, A., Demirci, S., Apdik, H., Apdik, E. A., Şahin, F. Mesenchymal stem cell isolation from pulp tissue and co-culture with cancer cells to study their interactions. Journal of Visualized Experiments. (143), e58825 (2019).
- Lin, J., et al. Long non-coding RNA UBE2CP3 enhances HCC cell secretion of VEGFA and promotes angiogenesis by activating ERK1/2/HIF-1α/VEGFA signalling in hepatocellular carcinoma. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 37 (1), 113 (2018).
- Soares, N. L., et al. Carbon monoxide modulation of microglia-neuron communication: Anti-neuroinflammatory and neurotrophic role. Molecular Neurobiology. 59 (2), 872-889 (2022).
- Al Halawani, A., Abdulkhalek, L., Mithieux, S. M., Weiss, A. S. Tropoelastin promotes the formation of dense, interconnected endothelial networks. Biomolecules. 11 (9), 1318 (2021).
- Mercatali, L., et al. Development of a human preclinical model of osteoclastogenesis from peripheral blood monocytes co-cultured with breast cancer cell lines. Journal of Visualized Experiments. (127), e56311 (2017).
- Orona, N. S., Astort, F., Maglione, G. A., Yakisich, J. S., Tasat, D. R. Direct and indirect effect of air particles exposure induce Nrf2-dependent cardiomyocyte cellular response in vitro. Cardiovascular Toxicology. 19 (6), 575-587 (2019).
- Colin-Pierre, C., et al. The glypican-1/HGF/C-met and glypican-1/VEGF/VEGFR2 ternary complexes regulate hair follicle angiogenesis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 781172 (2021).
- Toubal, A., et al. The NC1 domain of type XIX collagen inhibits melanoma cell migration. European Journal of Dermatology. 20 (6), 712-718 (2010).
- Wu, A. -L., et al. Role of growth factors and internal limiting membrane constituents in müller cell migration. Experimental Eye Research. 202, 108352 (2021).
- Oudart, J. -B., et al. Plasmin releases the anti-tumor peptide from the NC1 domain of collagen XIX. Oncotarget. 6 (6), 3656-3668 (2015).
- Martinotti, S., Ranzato, E.
- Cattin, S., Ramont, L., Rüegg, C. Characterization and in vivo validation of a three-dimensional multi-cellular culture model to study heterotypic interactions in colorectal cancer cell growth, invasion and metastasis. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 97 (2018).
- Ma, Y. N., et al. Three-dimensional spheroid culture of adipose stromal vascular cells for studying adipogenesis in beef cattle. Animal. 12 (10), 2123-2129 (2018).
