Summary
В этой статье недавно разработанный вкладыш, напечатанный на 3D-принтере, представлен в качестве модели совместной культуры и подтвержден путем изучения паракринной межклеточной связи между эндотелиальными клетками и кератиноцитами.
Abstract
Классический анализ непрямой коммуникации между различными типами клеток обуславливает необходимость использования кондиционированных сред. Более того, производство кондиционированных сред остается трудоемким и далеким от физиологических и патологических состояний. Несмотря на то, что несколько моделей кокультивирования коммерчески доступны, они по-прежнему ограничены специфическими анализами и в основном предназначены для двух типов клеток.
Здесь используются напечатанные на 3D-принтере вставки, совместимые с многочисленными функциональными анализами. Вкладыш позволяет разделить одну лунку 6-луночной пластины на четыре отсека. Можно установить широкий спектр комбинаций. Кроме того, в каждой стенке компартментов спроектированы окна таким образом, чтобы потенциальная межклеточная коммуникация между каждым компартментом была возможна в питательной среде в зависимости от объема. Например, паракринная межклеточная коммуникация может быть изучена между четырьмя типами клеток в монослое, в 3D (сфероиды) или путем объединения обоих. Кроме того, в один и тот же отсек можно поместить различные типы клеток в формате 2D или 3D (органоиды). Отсутствие дна во вставках, напечатанных на 3D-принтере, позволяет использовать обычные условия культивирования на пластине, возможное нанесение покрытия на пластину, содержащую вкладыш, и прямую визуализацию с помощью оптической микроскопии. Наличие нескольких компартментов дает возможность собирать различные типы клеток независимо друг от друга или использовать в каждом компартменте разные реагенты для экстракции РНК или белка. В данном исследовании представлена подробная методология использования нового вкладыша, напечатанного на 3D-принтере, в качестве системы совместного культивирования. Чтобы продемонстрировать некоторые возможности этой гибкой и простой модели, ранее опубликованные функциональные тесты клеточной коммуникации были выполнены в новых 3D-печатных вставках и продемонстрировали свою воспроизводимость. Напечатанные на 3D-принтере вставки и традиционная клеточная культура с использованием кондиционированных сред привели к аналогичным результатам. В заключение, напечатанная на 3D-принтере вставка, представляет собой простое устройство, которое может быть адаптировано к многочисленным моделям кокультур с адгезивными типами клеток.
Introduction
In vivo клетки общаются друг с другом либо напрямую (контакт с клетками), либо опосредованно (путем секреции молекул). Для изучения клеточной коммуникации могут быть разработаны различные модели кокультур, такие как прямая кокультура (различные типы клеток находятся в прямом взаимодействии в одном и том же колодце) и компартментализированная кокультура (различные типы клеток находятся в непрямом взаимодействии в разных компартментах культуральной системы)1. Кроме того, кондиционированные среды могут быть использованы для систем совместного культивирования, где непрямое взаимодействие обеспечивается за счет того, что секретируемые молекулы, содержащиеся в кондиционированных средах эффекторного типа клеток, переносятся в клетку-ответчиктипа 1.
В случае исследований паракринной клеточной коммуникации непрямые системы кокультур предоставляют модели, которые в полной мере отражают клеточные взаимодействия in vivo. Были разработаны и коммерциализированы системы косвенного совместного культивирования, позволившие создать модели косвенной кокультуры 2,3. К сожалению, большинство косвенных систем совместного культивирования предусматривают только два отсека. Другие системы косвенного совместного культивирования предусматривают несколько компартментов, но они менее масштабируемы по сравнению с системой, представленной в настоящей рукописи. Некоторые из них не позволяют провести классическую визуализацию под микроскопом, и в них часто представлены специфические методы нанесения. В нескольких исследованиях паракринная связь между различными типами клеток исследуется с помощью моделиусловной среды 4,5,6,7. Это более простой способ исследования по сравнению с системами косвенной совместной культуры, поскольку он не требует установления конкретных методов или материалов1. С другой стороны, приготовление кондиционированных сред занимает много времени и позволяет получить информацию только об односторонней клеточной сигнализации (от эффектора к ответителю)1.
В данной работе предложен новый, простой способ исследования клеточной коммуникации. Позволяя комбинировать несколько типов клеток в прямом или косвенном взаимодействии, а также в 2D или 3D форматах, напечатанные вставки предоставляют множество преимуществ для простой настройки моделей совместного культивирования. Напечатанная на 3D-принтере вставка, адаптированная для установки в лунки 6-луночных планшетов, имеет круглую форму и позволяет разделить лунку на четыре отсека (два больших и два маленьких; Рисунок 1А). Напечатанные на 3D-принтере вставки характеризуются отсутствием дна. Таким образом, ячейки находятся в непосредственном контакте с пластиной, на которую ставится вкладыш. Кроме того, каждый отсек может быть покрыт независимо от других. Кроме того, поведение клеток можно легко проследить под оптическими микроскопами. Наличие коммуникационных окон в каждой стенке вставки позволяет добавлять в оптимальное время общую среду для проведения различных экспериментов по со-культуре. Для изучения прямой и/или косвенной связи между несколькими типами клеток могут быть выполнены многочисленные комбинации кокультивирования. Например, может быть спроектирована модель непрямой кокультуры между четырьмя различными типами клеток в монослое и/или в 3D (сфероиды). Комбинация моделей прямой и непрямой совместной культуры также может быть выполнена путем смешивания различных типов клеток в одном и том же компартменте. Влияние сложных структур (органоидов, тканевых эксплантов и т.д.) на различные типы клеток может быть еще одним примером моделей, которые могут быть созданы. Кроме того, напечатанные на 3D-принтере вкладыши совместимы с функциональными анализами клеточной биологии (пролиферация, миграция, образование псевдотрубок, дифференцировка и т. д.) и биохимическими тестами (выделение ДНК, РНК, белка, липидов и т. д.). Наконец, напечатанные на 3D-принтере вкладыши обеспечивают широкий спектр экспериментальных схем моделей кокультур с возможностью одновременного комбинирования различных анализов в одном эксперименте в разных отсеках.
Представлены некоторые возможности напечатанных на 3D-принтере вставок, чтобы проверить их в качестве быстрой и простой в использовании модели совместной культуры. По сравнению с ранее опубликованным исследованием, проведенным по коммуникации паракринных клеток, продемонстрирована способность напечатанных на 3D-принтере вставок быть ценной моделью кокультуры. Для оценки этого момента было проведено сравнение регуляции пролиферации и миграции эндотелиальных клеток кератиноцитами между напечатанной на 3D-принтере системой вкладышей и классической системой с использованием кондиционированных сред. Напечатанные на 3D-принтере вставки позволяют быстро получать результаты, аналогичные традиционным системам, использующим кондиционированные носители. Действительно, напечатанные на 3D-принтере вставки обеспечивают надежную модель для изучения клеточных взаимодействий в обоих направлениях без необходимости производства кондиционированных сред и с возможностью параллельного выполнения анализов пролиферации и миграции в одном и том же эксперименте.
В заключение в данной работе предлагается новая и готовая к использованию модель для изучения клеточной коммуникации. Совместимые со всеми типами адгезивных клеток, напечатанные на 3D-принтере вставки позволяют выполнять многочисленные комбинации кокультур, которые направлены на то, чтобы быть ближе к условиям in vivo .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: 3D-вставки (Рисунок 1A) приобретаются в промышленных масштабах и печатаются с использованием фотополимерной смолы, биосовместимой с клеточными культурами и автоклавированием (см. Таблицу материалов). В этом разделе описан подробный протокол для создания модели совместной культуры с помощью вставок (см. рис. 1B). Также приведены некоторые примеры приложений.
1. Размещение стерилизованного вкладыша в 6-луночные планшеты
- Смешайте два компонента, входящие в комплект (см. Таблицу материалов), пищевой кремний (реагент А) и катализатор (реагент В), в соотношении 10:1 (v/v) в соответствии с инструкциями производителя. (Рисунок 1Ba). Используйте шпатель, стерилизованную 70% этанолом, чтобы смешать два компонента.
ПРИМЕЧАНИЕ: Объем приготовляемой кремниевой смеси зависит от количества закрепляемых вставок. Избыток катализатора может привести к слишком быстрому затвердеванию кремниевой смеси. - Нанесите вставки на силиконовую смесь пинцетом так, чтобы смесь равномерно распределилась по нижнему краю вставок (рисунок 1Bb). Поместите вставки в лунки 6-луночного планшета и слегка надавите на пластины, чтобы убедиться, что вставки находятся в тесном контакте с планшетом, чтобы избежать утечки среды для клеточной культуры (Рисунок 1Bc).
- Поставьте пластину при температуре 37 °C, чтобы поддержать процесс затвердевания кремния в течение 1 часа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Время затвердевания зависит от количества добавленного катализатора. - После застывания простерилизовать пластины со вкладышами, погрузив их в ванну с 70% этиловым спиртом на срок от 30 мин до 1 ч.
- Выбросьте спирт с помощью пипетки и дайте планшету высохнуть (крышка открыта) в течение ночи в колпаке для клеточных культур.
ПРИМЕЧАНИЕ: Спирт должен быть полностью испарен перед выполнением следующего шага, чтобы избежать фиксации клеток и токсичности. Готовую к использованию пластину, содержащую вкладыши, можно хранить в течение нескольких дней перед использованием в сухом и стерильном состоянии при комнатной температуре.
2. Покрытия, такие как поли-L-лизин или поли-HEMA (дополнительный этап)
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом эксперименте покрытие не выполняется, и приведены шаги, информирующие о возможности нанесения покрытия на пластины.
- Приготовьте раствор для покрытия в соответствии с инструкциями производителя.
- Рассмотрим объем 200-400 мкл для самых больших отсеков и объем 50-100 мкл для самых маленьких отсеков для покрытия вставки. Добавьте раствор для покрытия в отдельные отсеки.
- Дайте покрытию высохнуть в соответствии с указаниями производителя в стерильных условиях.
3. Засев клеток
- Культивирование кератиноцитов наружной оболочки корня (KORS) и дермальных микрососудистых эндотелиальных клеток человека (HDMEC) в соответствии с рекомендациями производителя. Приготовьте клеточную суспензию, как только клетки достигнут слияния.
- Выбросьте среду из колб и добавьте 5 мл трипсина, чтобы отделить клетки (см. Таблицу материалов).
- Поместите колбу с KORS при температуре 37 °C с 5% CO2 на 5 минут. Инкубируйте колбу с HDMEC в течение 5 минут при комнатной температуре.
- Раствор трипсина, содержащий KORS, смешать с 5 мл среды мезенхимальных стволовых клеток (МСКМ) с добавлением 5% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и факторов роста (базальная среда с набором добавок, см. таблицу материалов). Раствор трипсина, содержащий HDMEC, смешивают с 5 мл эндотелиальной клеточной среды (ECM) с добавлением 5% FBS и факторов роста (см. таблицу материалов).
- Переложите клетки в стерильную коническую пробирку объемом 15 мл. Центрифугируйте суспензии KORS и HDMEC при 200 x g в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клетки в 2 мл соответствующей среды.
- Смешайте 10 мкл клеточной суспензии с 10 мкл трипанового синего красителя (см. таблицу материалов).
- Добавьте 10 мкл смеси в камеру счетного предметного стекла.
- Вставьте ползунок для подсчета клеток в систему подсчета клеток (см. Таблицу материалов) и определите номер ячейки и жизнеспособность.
- Приготовьте клеточную суспензию в концентрации 0,5 x 105 клеток/мл в соответствующей среде.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если для разных типов клеток требуется разное время адгезии и/или для достижения идеального слияния, посев клеток может быть выполнен в разные моменты времени в зависимости от типа клеток.
- Распределите пипеткой от 800 мкл до 1 мл клеточной суспензии в отдельные большие отсеки и 100-150 мкл в отдельные малые отсеки.
- Засейте KORS в дозе 1 x 10 5 клеток/мл в MSCM с добавлением5% FBS и факторов роста в одном из больших отсеков.
- Семенной HDMEC в ECM с добавлением 5% FBS и факторов роста в дозе 2,5 x 103 клеток/мл в малых компартментах и 1,25 x 105 клеток/мл в другом большом компартменте.
ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ пролиферации может быть выполнен в малых компартментах, а анализ миграции и жизнеспособности может быть выполнен в больших компартментах. Концентрация засеянных клеток была оптимизирована в соответствии с рекомендациями производителя. Такая концентрация обеспечивает хорошую жизнеспособность клеток через 24-48 ч инкубации.
- Поместите планшет для клеточной культуры при температуре 37 °C с 5%CO2 или в обычных условиях, чтобы обеспечить адгезию и/или созревание клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ: Инкубируйте клетки в течение 24-48 ч без смены среды. При необходимости среда отсеков может быть изменена независимо.
4. Реализация совместной культуры ( Рисунок 1Bd)
ПРИМЕЧАНИЕ: Реализация совместной культуры соответствует времени, когда добавляется общая среда. Добавление уникальной среды для всех типов клеток в различных компартментах обеспечивает возможность паракринной связи между клетками благодаря наличию коммуникационных окон (яйцевидных отверстий в стенках 3D-печатных вставок). Чтобы внедрить совместную культуру, выполните шаги 4.1-4.3.
- Опорожните питательные среды из различных отсеков вкладышей с помощью пипетки. В случае культуры 3D-сфероидных клеток очень осторожно утилизируйте среду.
- Промойте ячейки 1 мл теплого PBS с температурой 37 °C в больших отсеках и 200 мкл теплого PBS с температурой 37 °C в маленьких отсеках. Обеспечьте бережную стирку, чтобы не отсоединить клетки.
- Добавьте 3 мл общей среды, подобранной так, чтобы она была совместима со всеми типами клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ: В данном исследовании используется базальный ECM (без FBS и факторов роста). Убедитесь, что среда покрывает все отсеки (уровень над коммуникационными окнами [яйцевидные отверстия в стенах], как показано на рисунке 1А). - Поместите планшет с кокультурами при температуре 37 °C с 5% CO2 на 24-48 ч.
5. Наблюдение за клетками, подсчет и выскабливание
- Наблюдайте за морфологией и подсчитывайте количество клеток различных компартментов во время эксперимента под оптическим микроскопом через 24-48 ч инкубации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ожидаемое количество ячеек зависит от используемых типов клеток (размер, морфология и т.д.) и от размера отсека. В этом эксперименте в больших отсеках подсчитывают от 0,5 x 10 6-1 x10 6 KORS/мл и от 0,25 x 10 6-0,75 x 10 6 HDMECs/мл. - Отделите клетки с помощью трипсина для подсчета клеточной суспензии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для решения для отделения клеток рассмотрите объем 100-500 мкл для самых больших компартментов и объем 10-50 мкл для самых маленьких компартментов. - Проверьте жизнеспособность с помощью окрашивания трипановым синим (см. шаги 3.1.6-3.1.8).
6. Очистка вставок для вторичной переработки
- Снимите вкладыши с 6-луночной пластины в конце эксперимента, слегка покрутив (Рисунок 1Be).
- Снимите силикон со вставок, потянув за него. При необходимости с помощью шпателя удалите остатки силикона, прилипшие к стенкам вставок (рисунок 1Bf).
- Промойте вкладыши обычными моющими средствами для клеточных культур и чистящими средствами (пример приведен в таблице материалов).
- Стерилизуйте вкладыши для дальнейшего использования в автоклаве (твердый цикл, 121 °C в течение 20 минут) или погрузив их в ванну с 70% этанолом на 1 час.
ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе описываются два примера возможных анализов (анализы пролиферации и миграции) с использованием напечатанных на 3D-принтере вставок (рис. 1Bd).
7. Анализ пролиферации клеток - WST-1
- Выполните шаги 1-3.1 для культивирования клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните шаги, описанные в этом разделе, чтобы внедрить систему кокультивирования, чтобы исследовать влияние секретома KORS на пролиферацию HDMEC. Ячейки KORS используются для сравнения данных, опубликованных ранее8.- Высевают KORS в дозе 1 x 10 5 клеток/мл в среду мезенхимальных стволовых клеток (МСКМ) с добавлением5% FBS и факторов роста в больших компартментах.
- Поместите планшет для клеточной культуры при температуре 37 °C с 5%CO2 на 24 часа.
- Высевают HDMEC в эндотелиальную клеточную среду (ECM) с добавлением 5% FBS и факторов роста в дозе 2,5 x 103 клеток/мл в небольших компартментах.
- Поместите планшет с клеточной культурой при температуре 37 °C с 5% CO2 на 24-48 ч.
- Выбросьте среду из всех отсеков и внедрите систему кокультивирования, добавив 3 мл недополненного базального ECM (общая среда для клеточных культур для всех отсеков вкладышей, напечатанных на 3D-принтере).
- Разводят WST-1 в общей клеточной культуре ECM (окончательное разведение 1:10) для приготовления раствора WST-1.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для объема раствора WST-1 приготовьте не менее 500 мкл дополнительного раствора для заготовки. - Выбросьте питательную среду из вкладыша с помощью пипетирования.
- Добавьте раствор WST-1 в выбранные отсеки (150 мкл для маленьких отсеков и 600 мкл для больших). Поставьте пластину при температуре 37 °C с 5% CO2.
- По истечении оптимального 30-минутного времени инкубации клеток перенесите 100 мкл инкубационной среды из каждого состояния на 96-луночный планшет.
- Оцените колориметрическую реакцию с помощью микропланшетного ридера в диапазоне от 420 нм до 480 нм.
- Наденьте пластину на микропланшет считывателя и нажмите на кнопку редактирования нового протокола.
- Выберите конкретный тип используемой 96-луночной пластины (см. Таблицу материалов) и длину волны 450 нм.
- Нажмите на кнопку начать измерение.
8. Анализ миграции клеток - устройство с двумя миграционными камерами
- Выполните шаги 1-3.1 для культивирования клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните шаги, описанные в этом разделе, чтобы внедрить систему кокультивирования, чтобы исследовать влияние секретома KORS на пролиферацию HDMEC.- Засейте KORS в дозе 1 x 10 5 клеток/мл в MSCM с добавлением5% FBS и факторов роста в одном из больших отсеков.
- Поместите планшет для клеточной культуры при температуре 37 °C с 5%CO2 на 24 часа.
- Поместите устройство с двумя миграционными камерами в другой большой отсек вкладышей.
- Засейте HDMEC в ECM , добавив 5% FBS и факторы роста в 7 x 105 клеток/лунку устройства с двумя миграционными камерами.
- Поместите планшет для клеточной культуры при температуре 37 °C с 5%CO2 на 24 часа.
- Утилизируйте носитель и устройство с двумя миграционными камерами через 24 часа или в оптимальное время в зависимости от типа мигрируемой ячейки. Реализуйте систему кокультивирования, добавив 3 мл недополненного базальногоEC M.
ПРИМЕЧАНИЕ: Действуйте осторожно, чтобы не отсоединить ячейки. Если клетки действительно чувствительны к отслоению, вызванному добавлением общей среды, снимите устройство с двумя миграционными камерами после добавления общей среды.
- Понаблюдайте и сделайте снимок поверхности, покрытой клетками в разные моменты времени, под фазово-контрастным микроскопом при 10-кратном увеличении.
ПРИМЕЧАНИЕ: Снимки сделаны с помощью фазово-контрастного микроскопа (см. Таблицу материалов). Снимки сохраняются на USB-накопителе, а затем анализируются с помощью плагина инструмента для заживления ран программного обеспечения (см. Таблицу материалов). - Измерьте непокрытую поверхность с помощью классического программного обеспечения для количественного анализа.
- Откройте изображение в программе и активируйте инструмент для заживления ран, доступный в списке макросов.
- Нажмите на кнопку m , чтобы измерить непокрытую поверхность изображения миграции.
- Непокрытая поверхность рассчитывается по следующей формуле:
Процент покрытия = ([средняя площадь без ячеек в момент T0 − средняя площадь без ячеек в момент времени T]/средняя площадь без ячеек в момент T0) × 100.
ПРИМЕЧАНИЕ: Напечатанные на 3D-принтере вкладыши полностью адаптированы к большинству методов клеточной биологии (таких как анализ образования псевдотрубок, 3D-культуры) и для биохимических экспериментов (таких как экстракция ДНК, РНК, белка).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В настоящей работе была описана оптимизированная система кокультур для получения устойчивых, надежных и значимых данных, сопоставимых с классическими методами, за счет использования условных сред. Напечатанные на 3D-принтере вставки имитируют условия микроокружения in vivo различных типов клеток при взаимодействии, преодолевая трудности и трудоемкое производство кондиционированных сред перед экспериментами. Ранее опубликованное исследование было проведено повторно для анализа косвенных взаимодействий между двумя типами клеток, присутствующих в волосяных фолликулах: микрососудистыми эндотелиальными клетками человека (HDMEC) и человеческими кератиноцитами наружной оболочки корня (KORS)8. Продемонстрирована воспроизводимость результатов, полученных при использовании 3D-печатных вставок, по сравнению с классическим методом исследования косвенных взаимодействий между HDMEC и KORS с использованием кондиционированных сред. Условия культивирования клеток, ранее описанные в исследовании8, были такими же, как и в настоящей работе. Они были адаптированы с учетом размеров напечатанных на 3D-принтере вставок (см. протокол). Прежде всего, фенотип и жизнеспособность клеток были сопоставимы между двумя условиями (кондиционированные среды против .3D-печатных вкладышей) для всех типов клеток (рис. 2). Действительно, 90% жизнеспособности наблюдалось в лунках 6-луночных планшетов (рис. 2А и табл. 1), а в напечатанных на 3D-принтере вставках (рис. 2Б и табл. 1) для KORS. Жизнеспособность HDMEC составила 85% в лунках 6-луночной пластины (рис. 2C и табл. 2) по сравнению с 86% в напечатанных на 3D-принтере пластинах (рис. 2D и табл. 2). Данные о жизнеспособности клеток рассчитывались автоматическим счетчиком клеток (Таблица материалов) следующим образом: количество жизнеспособных клеток, деленное на общее количество клеток (мертвые + жизнеспособные клетки). Средние данные были получены путем расчета процента жизнеспособности, полученного в шести независимых экспериментах, в которых было выполнено два повторения (см. табл. 1 и табл. 2).
Эти результаты показали, что напечатанная на 3D-принтере вставка не изменила поведение или жизнеспособность клетки по сравнению с обычной культурой на 6-луночных планшетах. Таким образом, напечатанные на 3D-принтере вставки были признаны новой моделью совместной культуры.
Проанализированы ранее продемонстрированныепараметры 8 непрямой клеточной коммуникации. Для всех экспериментов внедрение сокультуры вкладыша, напечатанного на 3D-принтере, осуществлялось по протоколам в соответствии с классическими условиями культивирования (см. предыдущую работу8).
Во-первых, были оценены непрямые клеточные коммуникации между KORS и HDMEC во вставках, напечатанных на 3D-принтере, путем анализа пролиферации клеток и сравнения с классическим методом с использованием кондиционированных сред (рис. 3). В присутствии KORS во вставках (+ KORS) пролиферация HDMEC достоверно увеличивалась в 1,5 раза через 24 ч и в 3,1 раза через 48 ч по сравнению с контрольным состоянием без KORS (Control) (рис. 3А). Эти результаты согласовывались с результатами, полученными в экспериментах с условными средами (рис. 3Б). Действительно, было показано, что KORSCM значительно увеличивает пролиферацию HDMEC в 1,5 раза через 24 ч и в 2,1 раза через 48 ч.
Напечатанная на 3D-принтере модель совместной культуры вкладышей была протестирована для определения влияния KORS на миграцию HDMEC. Ранее этот эффект был продемонстрирован в классической системе кокультуры с использованием условных сред8 (рис. 4). В контрольном состоянии без KORS (Control) HDMEC мигрировали и покрывали примерно 44% площади раны через 24 ч (рис. 4A). В присутствии KORS (+ KORS) наблюдался сильный и значительный рост миграции HDMEC. Действительно, кинетика заживления раны показала, что 43%, 67% и 99% площади раны были покрыты HDMEC через 3 ч, 12 ч и 24 ч соответственно. Эти результаты согласуются с результатами, полученными ранее8, где было показано, что KORSCM аналогичным образом увеличивает миграцию HDMEC (рис. 4B).
Рисунок 1: Рабочий процесс, показывающий реализацию культуры 3D-печатной вставки от очистки до переработки вставки . (A) Репрезентативное изображение вкладыша, напечатанного на 3D-принтере. (В) Проиллюстрирован репрезентативный пример анализов, представленных в данной рукописи. Обратите внимание, что анализ на пролиферацию может быть выполнен в одном отсеке вкладыша, напечатанного на 3D-принтере, параллельно с анализом миграции, выполняемым в другом отсеке с использованием устройства с двумя миграционными камерами, размещенного в других отсеках вкладышей, напечатанных на 3D-принтере. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Жизнеспособность KORS и HDMEC. (A,B) Морфология KORS (10x) в (A) лунке 6-луночной пластины и (B) во вставке, напечатанной на 3D-принтере. (С,Д) Морфология HDMEC (10x) в (C) лунке с 6-луночной пластиной и (D) во вставке, напечатанной на 3D-принтере. Масштабная линейка: 200 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Влияние KORS на пролиферацию HDMEC. (A) Пролиферацию HDMEC измеряли с помощью колориметрического анализа с использованием красителя WST-1 во вставке, напечатанной на 3D-принтере, в отсутствие KORS (control = CTRL) или в присутствии KORS (+ KORS) в течение 24 ч или 48 ч. (B) Пролиферацию HDMEC измеряли колориметрическим анализом с использованием красителя WST-1 в присутствии среды для культуры базальных клеток ECM или KORSCM в течение 24 ч или 48 ч. Результаты выражены в виде среднего ± SEM, n = 8 повторений, и было проведено два независимых эксперимента. *p < 0,05, ***p < 0,001, ****p < 0,0001 и *****p < 0,00001. KORS инкубировали в ECM без FBS и факторов роста. Через 48 ч эту кондиционированную среду собирали и хранили при температуре −80 °C для экспериментов. Эта цифра изменена с 8 и воспроизведена с разрешения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Влияние KORS на миграцию HDMEC. (A) Миграция HDMEC во вставке, напечатанной на 3D-принтере, в отсутствие KORS (control = CTRL) или в присутствии KORS (+ KORS) показана и количественно выражена в процентах восстановления. (B) Миграция HDMEC в ECM или KORSCM показана и количественно выражена в процентах восстановления. Полученные результаты выражены в виде среднего ± SEM, n=3 репликации, при этом на одну репликацию было проанализировано три поля, проведено два независимых эксперимента. **p<0.01, *****p<0.00001. Масштабная линейка: 200 мкм. KORS инкубировали в ECM без FBS и факторов роста. Через 48 ч эту кондиционированную среду собирали и хранили при -80 °C для экспериментов. Эта цифра изменена с 8 и воспроизведена с разрешения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
| Количество 1 | Количество 2 | Значить | Итого среднее | ||
| 6-луночный планшет | Репликация 1 | 95% | 84% | 90% | 90% |
| Репликация 2 | 90% | 88% | 89% | ||
| Репликация 3 | 85% | 89% | 87% | ||
| Репликация 4 | 97% | 89% | 93% | ||
| Репликация 5 | 88% | 94% | 91% | ||
| Репликация 6 | 86% | 92% | 89% | ||
| Вкладыш, напечатанный на 3D-принтере | Репликация 1 | 92% | 89% | 91% | 91% |
| Репликация 2 | 91% | 80% | 86% | ||
| Репликация 3 | 93% | 92% | 93% | ||
| Репликация 4 | 94% | 98% | 96% | ||
| Репликация 5 | 88% | 86% | 87% | ||
| Репликация 6 | 93% | 97% | 95% |
Таблица 1: Измерение жизнеспособности KORS. Жизнеспособность KORS измеряли в лунке 6-луночного планшета и во вставке, напечатанной на 3D-принтере, с использованием окрашивания трипановым синим и автоматического подсчета.
| Количество 1 | Количество 2 | Значить | Итого среднее | ||
| 6-луночный планшет | Репликация 1 | 90% | 88% | 89% | 85% |
| Репликация 2 | 79% | 78% | 79% | ||
| Репликация 3 | 71% | 75% | 73% | ||
| Репликация 4 | 86% | 82% | 84% | ||
| Репликация 5 | 91% | 88% | 90% | ||
| Репликация 6 | 99% | 94% | 97% | ||
| Вкладыш, напечатанный на 3D-принтере | Репликация 1 | 99% | 86% | 93% | 86% |
| Репликация 2 | 80% | 75% | 78% | ||
| Репликация 3 | 79% | 80% | 80% | ||
| Репликация 4 | 98% | 85% | 92% | ||
| Репликация 5 | 85% | 78% | 82% | ||
| Репликация 6 | 89% | 93% | 91% |
Таблица 2: Измерение жизнеспособности HDMEC. Жизнеспособность HDMEC измеряли в лунке 6-луночного планшета и во вставке, напечатанной на 3D-принтере, с использованием окрашивания трипановым синим и автоматического подсчета.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Непрямая клеточная коммуникация обычно исследуется с использованием кондиционированных сред или устройств для совместной культивации. Подготовка условной среды занимает много времени на начальном этапе экспериментов, и этот метод ограничен односторонним анализом эффектов. Предыдущее исследование Colin-Pierre et al.8 С использованием кондиционированных сред была проведена непрямая клеточная коммуникация между двумя типами клеток (HDMEC и KORS). Данные предыдущего исследования продемонстрировали влияние кондиционированных сред KORS на пролиферацию HDMEC и влияние кондиционированных сред KORS на миграцию HDMEC, образование псевдотрубок и экспрессию GPC18. В настоящем исследовании описан более простой и быстрый способ изучения непрямой клеточной коммуникации. Фактически, напечатанные на 3D-принтере вставки обеспечивают гибкость в дизайне экспериментов и различных комбинациях клеточных культур. Чтобы валидировать эти напечатанные на 3D-принтере вставки в качестве модели для кокультур, пролиферация и миграция клеток были проанализированы и сравнены с предыдущим исследованием с использованием кондиционированных сред8. В обоих исследованиях анализ заживления ран проводили с помощью устройства с двумя миграционными камерами (Culture-Insert 2 Well in μ-Dish 35 мм), помещенных в лунку, содержащую или не содержащую вкладыш. Этот прибор для испытания миграции9,10 отличается от тестов с нуля11,12 тем, что след, оставленный стенкой (имитирующей рану), разделяющей две камеры, постоянен. Поэтому он обладает высокой воспроизводимостью. Результаты настоящего исследования привели к аналогичному выводу по сравнению с экспериментами на условных носителях. Напечатанные на 3D-принтере вставки не изменяют поведение клетки и адаптированы для создания независимых покрытий компартментов, способствующих адгезии клеток. Тем не менее, вставки, напечатанные на 3D-принтере, также позволяют создавать покрытие из поли-HEMA, например, для обеспечения низкого прикрепления культуры сфероида/органоида. Непрямая связь между HDMEC и KORS была исследована в качестве примера многочисленных применений, обеспечиваемых напечатанными на 3D-принтере вставками.
Это новое устройство, применимое к адгезивным типам клеток, которые требуют или не требуют специального покрытия, обеспечивает значительную экономию времени на создание модели совместной культуры. Действительно, четыре отсека напечатанных на 3D-принтере вкладышей позволяют культивировать несколько типов клеток в монослое или в 3D (агрегаты или сфероиды) в одной лунке с различными комбинациями. Например, можно проанализировать косвенную связь четырех типов клеток в монослое, в 3D (сфероиды) или их комбинацию. В ходе экспериментов сфероиды культивировались во вставках, напечатанных на 3D-принтере, с использованием покрытия poly-HEMA (данные не показаны). Сфероиды состояли из клеток, засеянных в 3D из-за низкой соединительной пластины и перенесенных через 48 ч на 3D-печатную вставку для анализа. Через несколько дней культивирования наблюдался рост сфероидов. Эти результаты показывают, что напечатанная на 3D-принтере вставка может быть использована для отслеживания роста 3D-клеток после переноса сфероидов так же, как и в культуральном планшете13,14. Более того, смесь различных типов клеток может быть собрана вместе в одном и том же отсеке в 2D или 3D (органоиды) для изучения как прямой, так и непрямой клеточной коммуникации. Действительно, широкий диапазон модульности, предлагаемый 3D-печатными вкладышами, характеризует эту инновационную систему кокультивирования клеток. Кроме того, наличие коммуникационных окон позволяет использовать в общей среде для всех типов клеток в выбранное время без помощи кондиционированных сред. Таким образом, этот метод не применим к клеткам, культивируемым в суспензии. Стенки, разделяющие четыре отсека, позволяют производить посев, сбор урожая и анализ каждого типа клеток независимо от других. Может быть сделано несколько применений, таких как анализ образования псевдотрубок и пролиферации, миграции, анализа ДНК, РНК, белка и других анализов. Напечатанные на 3D-принтере вставки также дают возможность, например, анализировать влияние молекул или внеклеточных везикул. Более того, тот факт, что эти вставки были изготовлены с помощью 3D-печати, предоставляет многочисленные возможности для компоновки отсеков и многочисленных функциональных анализов.
Тем не менее, необходимо тщательно продумать критический этап герметизации пластины, напечатанной на 3D-принтере. Действительно, гомогенный передел кремния имеет решающее значение для обеспечения герметизации и предотвращения утечки среды клеточной культуры или клеток из одного отсека в другой. Чтобы избежать каких-либо проблем, следует убедиться, что силикон покрывает ту часть напечатанных на 3D-принтере вставок, которая будет соприкасаться с пластиной. Перед посевом клеток следует проверить правильность герметизации, добавив питательную среду в один отсек и наблюдая за отсутствием утечки среды в других отсеках. Время высыхания кремния после инкубации в ванне с 70% этанолом также является критическим этапом. Действительно, оставшиеся следы алкоголя могут привести к фиксации клеток и токсичности. Чтобы избежать каких-либо проблем, необходимо соблюдать время высыхания.
В заключение, напечатанные на 3D-принтере, вставки совместимы с большинством адгезивных типов клеток для культуры в 2D или 3D и позволяют проводить многочисленные эксперименты. Они могут быть адаптированы для многочисленных исследований с использованием кокультур и могут стать новым инструментом для изучения непрямой клеточной коммуникации. Напечатанные на 3D-принтере вставки являются модульными, гибкими, масштабируемыми и могут использоваться для создания экспериментальных моделей для изучения физиологических патологий, таких как ракология, иммунология или ангиогенез.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Это исследование было проведено в сотрудничестве с BASF Beauty Care Solutions. Г-жа Чарли Колин-Пьер (Charlie Colin-Pierre) является докторантом BASF/CNRS.
Мы хотели бы поблагодарить г-на Мехди Селлами за концепцию вставок, напечатанных на 3D-принтере.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Autoclave | Getinge | APHP | Solid cycle, 121 °C for 20 min |
| Biomed Clear | Formlabs | RS-F2-BMCL-01 | Impression performed by 3D-Morphoz company (Reims, France) |
| Cell culture detergents | Tounett | A18590/0116 | |
| Cell Proliferation Reagent WST-1 | Roche | 11,64,48,07,001 | |
| Counting slide | NanoEnTek | EVE-050 | |
| Culture-Insert 2 Well in μ-Dish 35 mm | Ibidi | 80206 | two-migration chambers device. |
| Endothelial cell medium | ScienCell | 1001 | Basal medium +/- 25 mL of fetal bovine serum (FBS, 0025), 5 mL of endothelial cell growth supplement (ECGS, 1052), and 5 mL of penicillin/streptomycin solution (P/S, 0503). |
| EVE Automated cell counter | NanoEnTek | NESCT-EVE-001E | |
| EVOS XL Core | Fisher Scientific | AMEX1200 | 10x of magnification |
| Food silicon reagent and catalyst kit | Artificina | RTV 3428 A and B | (10:1) |
| FORM 3B printer | Formlabs | PKG-F3B-WSVC-DSP-BASIC | Impression performed by 3D-Morphoz company |
| Human Dermal Microvascular Endothelial Cells (HDMEC) | ScienCell | 2000 | |
| Keratinocytes of Outer Root Sheath (KORS ) | ScienCell | 2420 | |
| Macro Wound Healing Tool Software | ImageJ | Software used for the measurement of the uncovered surface (for migration assays) | |
| Mesenchymal stem cell medium | ScienCell | 7501 | Basal medium +/-25 mL of fetal bovine serum (FBS, 0025), 5 mL of mesenchymal stem cell growth supplement (MSCGS, 7552), and 5 mL of penicillin/streptomycin solution (P/S, 0503) |
| Microplate reader SPECTRO star NANO | BMG Labtech | BMG LABTECH software | |
| PBS | Promocell | C-40232 | Without Ca2+ / Mg2+ |
| Trypan Blue Stain | NanoEnTek | EBT-001 | |
| Trypsin / EDTA | Promocell | C-41020 | Incubation of KORS at 37 °C with 5% CO2 for 5 min. Incubation of HDMECs for 5 min at room temperature |
| 96-well plate Nunclon Delta Surface | Thermoscientific | 167008 |
References
- Regier, M. C., Alarid, E. T., Beebe, D. J. Progress towards understanding heterotypic interactions in multi-culture models of breast cancer. Integrative Biology. 8 (6), 684-692 (2016).
- Doğan, A., Demirci, S., Apdik, H., Apdik, E. A., Şahin, F. Mesenchymal stem cell isolation from pulp tissue and co-culture with cancer cells to study their interactions. Journal of Visualized Experiments. (143), e58825 (2019).
- Lin, J., et al. Long non-coding RNA UBE2CP3 enhances HCC cell secretion of VEGFA and promotes angiogenesis by activating ERK1/2/HIF-1α/VEGFA signalling in hepatocellular carcinoma. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 37 (1), 113 (2018).
- Soares, N. L., et al. Carbon monoxide modulation of microglia-neuron communication: Anti-neuroinflammatory and neurotrophic role. Molecular Neurobiology. 59 (2), 872-889 (2022).
- Al Halawani, A., Abdulkhalek, L., Mithieux, S. M., Weiss, A. S. Tropoelastin promotes the formation of dense, interconnected endothelial networks. Biomolecules. 11 (9), 1318 (2021).
- Mercatali, L., et al. Development of a human preclinical model of osteoclastogenesis from peripheral blood monocytes co-cultured with breast cancer cell lines. Journal of Visualized Experiments. (127), e56311 (2017).
- Orona, N. S., Astort, F., Maglione, G. A., Yakisich, J. S., Tasat, D. R. Direct and indirect effect of air particles exposure induce Nrf2-dependent cardiomyocyte cellular response in vitro. Cardiovascular Toxicology. 19 (6), 575-587 (2019).
- Colin-Pierre, C., et al. The glypican-1/HGF/C-met and glypican-1/VEGF/VEGFR2 ternary complexes regulate hair follicle angiogenesis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 781172 (2021).
- Toubal, A., et al. The NC1 domain of type XIX collagen inhibits melanoma cell migration. European Journal of Dermatology. 20 (6), 712-718 (2010).
- Wu, A. -L., et al. Role of growth factors and internal limiting membrane constituents in müller cell migration. Experimental Eye Research. 202, 108352 (2021).
- Oudart, J. -B., et al. Plasmin releases the anti-tumor peptide from the NC1 domain of collagen XIX. Oncotarget. 6 (6), 3656-3668 (2015).
- Martinotti, S., Ranzato, E.
- Cattin, S., Ramont, L., Rüegg, C. Characterization and in vivo validation of a three-dimensional multi-cellular culture model to study heterotypic interactions in colorectal cancer cell growth, invasion and metastasis. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 97 (2018).
- Ma, Y. N., et al. Three-dimensional spheroid culture of adipose stromal vascular cells for studying adipogenesis in beef cattle. Animal. 12 (10), 2123-2129 (2018).
