Summary
I denna artikel presenteras en nydesignad 3D-printad insats som en modell för samodling och valideras genom studier av den parakrina intercellulära kommunikationen mellan endotelceller och keratinocyter.
Abstract
De klassiska analyserna av indirekt kommunikation mellan olika celltyper kräver användning av betingade medier. Dessutom är produktionen av konditionerade medier fortfarande tidskrävande och långt ifrån fysiologiska och patologiska tillstånd. Även om ett fåtal modeller av samodling är kommersiellt tillgängliga, är de fortfarande begränsade till specifika analyser och är främst för två typer av celler.
Här används 3D-printade insatser som är kompatibla med många funktionella analyser. Insatsen gör det möjligt att separera en brunn i en 6-hålsplatta i fyra fack. Ett brett utbud av kombinationer kan ställas in. Dessutom är fönster utformade i varje vägg i facken så att potentiell intercellulär kommunikation mellan varje fack är möjlig i odlingsmediet på ett volymberoende sätt. Till exempel kan parakrin intercellulär kommunikation studeras mellan fyra celltyper i monolager, i 3D (sfäroider) eller genom att kombinera båda. Dessutom kan en blandning av olika celltyper sås i samma fack i 2D- eller 3D-format (organoider). Frånvaron av en botten i de 3D-printade insatserna möjliggör de vanliga odlingsförhållandena på plattan, möjlig beläggning på plattan som innehåller insatsen och direkt visualisering genom optisk mikroskopi. De många facken gör det möjligt att samla in olika celltyper oberoende av varandra eller att i varje fack använda olika reagenser för RNA- eller proteinextraktion. I denna studie ges en detaljerad metodik för att använda den nya 3D-printade insatsen som ett samodlingssystem. För att demonstrera flera kapaciteter hos denna flexibla och enkla modell utfördes tidigare publicerade funktionella analyser av cellkommunikation i de nya 3D-printade insatserna och visade sig vara reproducerbara. De 3D-printade insatserna och den konventionella cellodlingen med konditionerade medier ledde till liknande resultat. Sammanfattningsvis är den 3D-printade insatsen en enkel enhet som kan anpassas till många modeller av samkulturer med vidhäftande celltyper.
Introduction
In vivo kommunicerar cellerna med varandra antingen direkt (cellkontakt) eller indirekt (genom utsöndring av molekyler). För att studera cellkommunikation kan olika samodlingsmodeller utvecklas, såsom direkt samodling (de olika celltyperna är i direkt interaktion i samma brunn) och kompartmenterad samkultur (de olika celltyperna är i indirekt interaktion i olika delar av ett odlingssystem)1. Dessutom kan konditionerade medier användas för samodlingssystem, där den indirekta interaktionen möjliggörs av att utsöndrade molekyler som finns i det konditionerade mediet av en effektorcelltyp överförs till en respondercelltyp1.
När det gäller studier av parakrin cellkommunikation ger indirekta samodlingssystem modeller som starkt återspeglar cellinteraktioner in vivo. Indirekta samkultursystem har utvecklats och kommersialiserats, vilket har möjliggjort etablering av indirekta samkulturmodeller 2,3. Tyvärr har de flesta indirekta samkultursystem bara två avdelningar. Andra indirekta samkultursystem tillhandahåller flera avdelningar, men de är mindre skalbara jämfört med det system som rapporteras i detta manuskript. Vissa av dem tillåter inte en klassisk visualisering under mikroskop, och de presenterar ofta specifika applikationsmetoder. I flera studier har den parakrina kommunikationen mellan olika celltyper undersökts med hjälp av den betingade mediemodellen 4,5,6,7. Detta är ett enklare sätt att undersöka jämfört med indirekta samkultursystem eftersom det inte kräver att specifika metoder eller material etableras1. Å andra sidan är beredningen av konditionerade medier tidskrävande och ger endast information om envägscellsignalering (effektor till responder)1.
I denna uppsats föreslås ett nytt, enkelt sätt att undersöka cellkommunikation. Genom att möjliggöra kombination av flera celltyper i direkt eller indirekt interaktion och i 2D- eller 3D-format, ger de tryckta insatserna många fördelar för att enkelt sätta upp samodlingsmodeller. Den 3D-printade insatsen är anpassad för att placeras i brunnarna på 6-brunnsplattor och är cirkulär och gör det möjligt att dela upp brunnen i fyra fack (två stora fack och två små fack; Figur 1A). De 3D-printade insatserna kännetecknas av frånvaron av en botten. Således är cellerna i direkt kontakt med plattan som insatsen är placerad på. Dessutom kan varje fack beläggas oberoende av de andra. Dessutom kan cellens beteende enkelt följas under optiska mikroskop. Närvaron av kommunikationsfönster i varje vägg i insatsen gör det möjligt att vid optimal tidpunkt lägga till ett gemensamt medium för att utföra olika experiment med samkultur. Ett flertal kombinationer av samodling kan utföras för att studera direkt och/eller indirekt kommunikation mellan flera celltyper. Till exempel kan en modell av indirekt samodling mellan fyra olika celltyper i monolager och/eller i 3D (sfäroider) utformas. En kombination av direkta och indirekta samodlingsmodeller kan också utföras genom att blanda olika celltyper i samma fack. Effekten av komplexa strukturer (organoider, vävnadsexplantat, etc.) på olika celltyper kan vara ett annat exempel på modeller som kan göras. Dessutom är de 3D-printade insatserna kompatibla med cellbiologiska funktionella analyser (proliferation, migration, pseudorörsbildning, differentiering, etc.) och med biokemiska tester (extraktion av DNA, RNA, protein, lipider, etc.). Slutligen ger de 3D-printade insatserna ett brett utbud av experimentella scheman av samodlingsmodeller med möjlighet att kombinera samtidigt olika analyser i samma experiment i de olika facken.
En del av kapaciteten hos de 3D-printade insatserna presenteras för att validera dem som en snabb och lättanvänd samodlingsmodell. I jämförelse med en tidigare publicerad studie utförd på parakrin cellkommunikation visas de 3D-printade inläggens förmåga att vara en värdefull samodlingsmodell. För att bedöma denna punkt jämfördes regleringen av endotelcellsproliferation och migration av keratinocyter mellan det 3D-printade insatssystemet och det klassiska systemet med konditionerade medier. De 3D-printade insatserna gör det möjligt att snabbt uppnå liknande resultat jämfört med det konventionella systemet med konditionerade medier. Faktum är att de 3D-printade insatserna ger en robust modell för att studera cellinteraktioner i båda riktningarna utan att behöva producera konditionerade medier och med möjlighet att parallellt utföra proliferations- och migrationsanalyserna i samma experiment.
Avslutningsvis föreslås i denna artikel en ny och färdig modell för att studera cellkommunikation. De 3D-printade insatserna är kompatibla med alla vidhäftande celltyper och gör det möjligt att utföra många kombinationer av samodling som syftar till att vara närmare in vivo-förhållanden .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: 3D-insatserna (Figur 1A) är kommersiellt anskaffade och skrivs ut med ett fotopolymerharts som är biokompatibelt med cellodling och autoklavering (se materialtabellen). I detta avsnitt beskrivs ett detaljerat protokoll för att upprätta samkulturmodellen med hjälp av insatser (se figur 1B). Några exempel på applikationer ges också.
1. Placering av den steriliserade insatsen i 6-hålsplattorna
- Blanda de två komponenterna som medföljer satsen (se materialtabell), livsmedelskisel (reagens A) och katalysator (reagens B), i förhållandet 10:1 (v/v) enligt tillverkarens instruktioner. (Figur 1Ba). Använd en 70 % etanolsteriliserad spatel för att blanda de två komponenterna.
OBS: Volymen på kiselblandningen som ska beredas beror på antalet insatser som ska fixeras. Ett överskott av katalysator kan resultera i att kiselblandningen stelnar för snabbt. - Applicera insatserna på kiselblandningen med en pincett så att blandningen fördelas homogent vid skärens nedre kant (Figur 1Bb). Placera insatserna i brunnarna på en 6-hålsplatta och tryck försiktigt på insatserna för att säkerställa att insatserna är i nära kontakt med plattan för att undvika läckage av cellodlingsmediet (Figur 1Bc).
- Placera plattan vid 37 °C för att stödja stelningsprocessen av kislet i 1 timme.
OBS: Stelningstiden beror på mängden katalysator som har tillsatts. - Efter stelning, sterilisera plattorna med insatserna genom att sänka ner dem i ett 70 % etanolbad i 30 minuter till 1 timme.
- Häll spriten i pipettering och låt plattan torka (locket öppet) över natten i en cellodlingshuva.
OBS: Alkoholen måste avdunstas helt innan nästa steg utförs för att undvika cellfixering och toxicitet. Den bruksfärdig plattan som innehåller insatserna kan förvaras i flera dagar före användning i torra och sterila förhållanden i rumstemperatur.
2. Beläggningar som poly-L-lysin eller poly-HEMA (valfritt steg)
OBS: Beläggning utförs inte i detta experiment, och stegen tillhandahålls för att informera om möjligheten att belägga skären.
- Bered beläggningslösningen enligt tillverkarens instruktioner.
- Tänk dig en volym på 200-400 μL för de största facken och en volym på 50-100 μL för de minsta facken för beläggningen av insatsen. Tillsätt beläggningslösningen i de enskilda facken.
- Låt beläggningen torka enligt tillverkarens anvisningar under sterila förhållanden.
3. Sådd av cellerna
- Odla keratinocyterna i den yttre rotskidan (KORS) och humana dermala mikrovaskulära endotelceller (HDMEC) enligt tillverkarens rekommendationer. Bered cellsuspensionen när cellerna når sammanflöde.
- Kassera mediet från kolvarna och tillsätt 5 ml trypsin för att lossa cellerna (se materialförteckning).
- Placera kolven med KORS vid 37 °C med 5 % CO2 i 5 min. Inkubera kolven med HDMEC i 5 minuter vid rumstemperatur.
- Blanda trypsinlösningen som innehåller KORS med 5 ml mesenkymalt stamcellsmedium (MSCM) kompletterat med 5 % fetalt bovint serum (FBS) och tillväxtfaktorer (basalt medium med tillskottskit, se materialförteckning). Blanda trypsinlösningen som innehåller HDMEC med 5 ml endotelcellmedium (ECM) kompletterat med 5 % FBS och tillväxtfaktorer (se materialtabell).
- Överför cellerna till ett 15 ml sterilt koniskt rör. Centrifugera KORS- och HDMEC-suspensionerna vid 200 x g i 5 minuter vid rumstemperatur.
- Kassera supernatanten och suspendera cellerna på nytt i 2 ml av respektive medium.
- Blanda 10 μl av cellsuspensionen med 10 μl trypanblått färgämne (se materialförteckning).
- Tillsätt 10 μL av blandningen i räkneglasets kammare.
- Sätt in räkneglaset i cellräkningssystemet (se materialförteckning) och upptäck cellnumret och livsdugligheten.
- Bered cellsuspensionen i en koncentration av 0,5 x 105 celler/ml i respektive medium.
OBS: Om de olika celltyperna kräver olika tider för vidhäftning och/eller för att nå det ideala sammanflödet, kan cellsådd göras vid olika tidpunkter beroende på celltyperna.
- Fördela 800 μL till 1 ml cellsuspension i de enskilda stora facken och 100-150 μL i de enskilda små facken med en pipett.
- Sådd av KORS vid 1 x 10 5 celler/ml i MSCM kompletterat med5% FBS och tillväxtfaktorer i ett av de stora facken.
- Frö HDMEC i ECM kompletterat med 5% FBS och tillväxtfaktorer vid 2,5 x 103 celler/ml i de små facken och vid 1,25 x 105 celler/ml i det andra stora facket.
OBS: Proliferationsanalysen kan utföras i de små avdelningarna, och migrations- och viabilitetsanalyserna kan utföras i de stora avdelningarna. Koncentrationen av de sådda cellerna har optimerats enligt tillverkarens rekommendationer. Denna koncentration möjliggör god livskraft hos cellerna efter 24-48 timmars inkubation.
- Placera cellodlingsplattan vid 37 °C med 5 % CO2 eller under vanliga förhållanden för att möjliggöra cellvidhäftning och/eller mognad.
OBS: Inkubera cellerna i 24-48 timmar utan att byta media. Vid behov kan fackens medium bytas oberoende av varandra.
4. Genomförande av samkulturen (figur 1Bd)
OBS: Implementeringen av samkulturen motsvarar den tidpunkt då det gemensamma mediet läggs till. Tillägget av ett unikt medium för alla celltyper i de olika facken ger möjlighet till parakrin kommunikation mellan cellerna på grund av närvaron av kommunikationsfönster (ovala hål i väggarna på de 3D-printade insatserna). Följ steg 4.1-4.3 för att implementera samkulturen.
- Töm odlingsmediet på de olika facken i insatserna med en pipett. Vid en 3D-sfäroidcellodling ska mediet kasseras mycket försiktigt.
- Skölj cellerna med 1 ml 37 °C varm PBS i de stora facken och 200 μL 37 °C varm PBS i de små facken. Säkerställ skonsam tvätt för att inte lossna cellerna.
- Tillsätt 3 ml av ett vanligt medium som valts ut för att vara kompatibelt för alla celltyper.
OBS: I denna studie används basal ECM (utan FBS och tillväxtfaktorer). Se till att mediet täcker alla fack (nivå ovanför kommunikationsfönstren [ovala hål i väggarna], som visas i figur 1A). - Placera plattan med samkulturerna vid 37 °C med 5 % CO2 i 24-48 timmar.
5. Cellobservation, räkning och skrapning
- Observera morfologin och räkna cellantalet i de olika facken under experimentet under ett optiskt mikroskop efter 24-48 timmars inkubation.
OBS: Det förväntade antalet celler beror på vilka celltyper som används (storlek, morfologi, etc.) och på fackets storlek. I detta experiment räknas mellan 0,5 x 10 6-1 x 10 6 KORS/ml och mellan 0,25 x 10 6-0,75 x 10 6 HDMEC/ml i de stora facken. - Lossa cellerna med trypsin för cellsuspensionsräkning.
OBS: För cellavskiljningslösningen, överväg en volym på 100-500 μL för de största facken och en volym på 10-50 μL för de minsta facken. - Kontrollera livsdugligheten genom att använda trypanblå färgning (se steg 3.1.6-3.1.8).
6. Sätt in rengöring för återvinning
- Ta bort insatserna från 6-hålsplattan i slutet av experimentet genom en lätt vridning (figur 1Be).
- Ta bort silikonet från insatserna genom att dra av det. Använd vid behov en spatel för att ta bort det återstående silikonet som fastnat på insatsernas väggar (Figur 1Bf).
- Tvätta insatserna med konventionella cellodlingsrengöringsmedel och rengöringsmedel (example finns i materialtabellen).
- Sterilisera insatserna för framtida användning i en autoklav (fast cykel, 121 °C i 20 minuter) eller genom att sänka ner dem i ett 70 % etanolbad i 1 timme.
OBS: Från detta steg beskrivs två exempel på möjliga analyser (spridnings- och migrationsanalyser) med hjälp av de 3D-utskrivna insatserna (figur 1Bd).
7. Cellproliferationsanalys - WST-1-analys
- Följ steg 1-3.1 för att odla cellerna.
OBS: Följ stegen i detta avsnitt för att implementera samodlingssystemet för att undersöka effekten av KORS-sekretomet på HDMEC-proliferationen. KORS-celler används för att jämföra data som publicerats tidigare8.- Sådd av KORS vid 1 x 10 5 celler/ml i mesenkymalt stamcellsmedium (MSCM) kompletterat med5% FBS och tillväxtfaktorer i de stora facken.
- Placera cellodlingsplattan vid 37 °C med 5 % CO2 i 24 timmar.
- Sådd av HDMEC:erna i endotelcellsmedium (ECM) kompletterat med 5 % FBS och tillväxtfaktorer vid 2,5 x 103 celler/ml i de små facken.
- Placera cellodlingsplattan vid 37 °C med 5 % CO2 i 24-48 timmar.
- Kassera mediet från alla fack och implementera samodlingssystemet genom tillsats av 3 ml icke-tillskotterat basalt ECM (gemensamt cellodlingsmedium för alla fack i de 3D-printade insatserna).
- Späd WST-1 i det vanliga EC M-cellodlingsmediet (slutlig spädning 1:10) för att bereda WST-1-lösningen.
ANM.: För volymen WST-1-lösning, förbered minst 500 μL extra lösning för blindprovet. - Kassera cellodlingsmediet från insatsen genom pipettering.
- Tillsätt WST-1-lösningen till de valda facken (150 μL för de små facken och 600 μL för de stora facken). Placera plattan vid 37 °C med 5 % CO2.
- Efter den optimala cellinkubationstiden på 30 minuter överförs 100 μl av inkubationsmediet från varje tillstånd till en 96-hålsplatta.
- Bedöm den kolorimetriska reaktionen med hjälp av en mikroplattläsare mellan 420 nm och 480 nm.
- Sätt plattan på mikroplattläsaren och klicka på knappen redigera ett nytt protokoll.
- Välj den specifika typ av 96-hålars platta (se materialtabell) som används och våglängden på 450 nm.
- Klicka på knappen starta mätningen.
8. Cellmigrationsanalys - anordning med två migrationskammare
- Följ steg 1-3.1 för att odla cellerna.
OBS: Följ stegen i detta avsnitt för att implementera samodlingssystemet för att undersöka effekten av KORS-sekretomet på HDMEC-proliferation.- Sådd av KORS vid 1 x 10 5 celler/ml i MSCM kompletterat med5% FBS och tillväxtfaktorer i ett av de stora facken.
- Placera cellodlingsplattan vid 37 °C med 5 % CO2 i 24 timmar.
- Sätt in de två migreringskamrarna i det andra stora facket med insatser.
- Sådd av HDMEC i ECM kompletterat med 5 % FBS och tillväxtfaktorer vid 7 x 105 celler/brunn i de två migrationskamrarna.
- Placera cellodlingsplattan vid 37 °C med 5 % CO2 i 24 timmar.
- Kassera mediet och de två migrationskamrarna efter 24 timmar eller vid en optimal tidpunkt beroende på vilken celltyp som migrerar. Implementera samodlingssystemet genom tillsats av 3 ml icke-tillskottsbelagd basal ECM.
OBS: Fortsätt försiktigt så att cellerna inte lossnar. Om cellerna verkligen är känsliga för avlossning inducerad av tillsats av gemensamt medium, dra av de två migrationskamrarna efter tillsatsen av det gemensamma mediet.
- Observera och ta en bild av ytan som täcks av cellerna vid olika tidpunkter under ett faskontrastmikroskop vid 10x förstoring.
OBS: Bilderna är tagna med faskontrastmikroskop (se materialförteckning). Bilderna sparas i ett USB-minne och analyseras sedan av programvarans sårläkningsverktyg (se Materialförteckning). - Mät den otäckta ytan med hjälp av klassisk kvantitativ analysprogramvara.
- Öppna bilden i programmet och aktivera sårläkningsverktyget som finns i makrolistan.
- Klicka på m-knappen för att mäta den otäckta ytan på migreringsbilden.
- Den otäckta ytan beräknas enligt följande formel:
Täckningsgrad = ([medelarea utan celler vid T0 − area utan celler vid tidpunkt T]/medelarea utan celler vid T0) × 100.
OBS: De 3D-printade insatserna är helt anpassade till de flesta tekniker inom cellbiologi (t.ex. pseudorörsbildningsanalys, 3D-kulturer) och för biokemiska experiment (t.ex. extraktion av DNA, RNA, protein).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I detta arbete beskrevs ett optimerat samkultursystem för att erhålla robusta, tillförlitliga och signifikanta data jämförbara med klassiska metoder genom användning av betingade medier. De 3D-printade insatserna efterliknar mikromiljöförhållandena in vivo hos olika celltyper i interaktion genom att övervinna svårigheterna och den tidskrävande produktionen av konditionerade medier uppströms i experimenten. En tidigare publicerad studie har genomförts på nytt för att analysera de indirekta interaktionerna mellan två celltyper som finns i hårsäckar: humana mikrovaskulära endotelceller (HDMEC) och humana keratinocyter i den yttre rotskidan (KORS)8. Här demonstrerades reproducerbarheten av de resultat som erhölls genom att använda de 3D-printade insatserna jämfört med den klassiska metoden med konditionerade medier för att undersöka indirekta interaktioner mellan HDMEC och KORS. De cellodlingsbetingelser som tidigare beskrivits i studie8 var desamma som i detta arbete. De anpassades med hänsyn till dimensionerna på de 3D-printade insatserna (se protokollet). Först och främst var fenotypen och cellviabiliteten jämförbara mellan de två betingelserna (konditionerade medier kontra .3D-printade insatser) för alla celltyper (Figur 2). Faktum är att 90 % viabilitet observerades i brunnarna i 6-hålsplattorna (figur 2A och tabell 1), och 91 % observerades i de 3D-printade insatserna (figur 2B och tabell 1) för KORS. Livsdugligheten för HDMEC var 85 % i brunnarna i 6-hålsplattan (figur 2C och tabell 2) jämfört med 86 % i de 3D-printade insatserna (figur 2D och tabell 2). Uppgifterna för cellviabilitet beräknades av den automatiska cellräknaren (Materialförteckning) enligt följande: antalet livskraftiga celler dividerat med det totala antalet celler (döda + livsdugliga celler). Medelvärdena erhölls genom att beräkna den procentuella viabiliteten som erhölls i sex oberoende experiment där två replikat utfördes (se tabell 1 och tabell 2).
Dessa resultat indikerade att den 3D-printade insatsen inte förändrade cellens beteende eller livsduglighet jämfört med vanlig odling på 6-hålsplattor. Därför validerades de 3D-printade insatserna som en ny modell för samkultur.
Tidigare demonstrerade parametrar8 för indirekt cellkommunikation analyserades. För alla experiment realiserades den 3D-printade insert-co-culture-implementeringen enligt protokollen i enlighet med de klassiska odlingsförhållandena (se tidigare arbete8).
Först utvärderades den indirekta cellkommunikationen mellan KORS och HDMEC i de 3D-printade insatserna genom att analysera cellproliferationen och jämföras med den klassiska metoden med konditionerade medier (Figur 3). I närvaro av KORS i insatserna (+ KORS) ökade HDMEC-proliferationen signifikant med 1,5 gånger efter 24 timmar och med 3,1 gånger efter 48 timmar jämfört med kontrollbetingelsen utan KORS (kontroll) (figur 3A). Dessa resultat överensstämde med de som erhölls genom experiment med betingade medier (figur 3B). Faktum är att KORSCM visade sig signifikant öka HDMEC-proliferationen med 1,5 gånger efter 24 timmar och med 2,1 gånger efter 48 timmar.
Den 3D-printade co-culture-modellen testades för att bestämma effekten av KORS på HDMEC-migrering. Denna effekt har tidigare visats i det klassiska samkultursystemet med betingade medier8 (Figur 4). I kontrollbetingelsen utan KORS (Control) migrerade HDMEC och täckte cirka 44 % av sårområdet efter 24 timmar (Figur 4A). I närvaro av KORS (+ KORS) observerades en stark och signifikant ökning av HDMEC-migrationen. Faktum är att sårläkningens kinetik visade att 43 %, 67 % och 99 % av sårytan täcktes av HDMEC efter 3 timmar, 12 timmar respektive 24 timmar. Dessa resultat överensstämde med de som erhållits tidigare8, där KORSCM visade sig öka HDMEC-migrationen på ett liknande sätt (figur 4B).
Figur 1: Arbetsflöde som visar implementeringen av den 3D-printade insatsens samkultur från rengöring till återvinning av insatsen. (A) En representativ bild av den 3D-printade insatsen. (B) Ett representativt exempel på de analyser som presenteras i detta manuskript illustreras. Observera att en proliferationsanalys kan göras i ett fack i den 3D-printade insatsen parallellt med en migrationsanalys som utförs i det andra facket med hjälp av en anordning med två migrationskammare som placeras i de andra facken i de 3D-printade insatserna. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: KORS och HDMEC:s livskraft. (A,B) KORS-morfologi (10x) i (A) en brunn med en 6-hålars platta och (B) i en 3D-printad insats. (C,D) HDMEC-morfologi (10x) i (C) en brunn med 6-hålsplatta och (D) i en 3D-printad insats. Skalstapel: 200 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Effekt av KORS på HDMEC-proliferation. (A) HDMEC-proliferation mättes med kolorimetrisk analys med WST-1-färgämne i den 3D-printade insatsen i frånvaro av KORS (kontroll = CTRL) eller i närvaro av KORS (+ KORS) i 24 timmar eller 48 timmar. (B) HDMEC-proliferation mättes med kolorimetrisk analys med WST-1-färgämne i närvaro av ECM basalcellsodlingsmedium eller KORSCM i 24 timmar eller 48 timmar. Resultaten uttrycks som medelvärde ± SEM, n = 8 replikat, och två oberoende experiment utfördes. *p < 0,05, ***p < 0,001, ****p < 0,0001 och *****p < 0,00001. KORS inkuberades i ECM utan FBS och tillväxtfaktorer. Efter 48 timmar samlades detta konditionerade medium in och lagrades vid −80 °C för experimenten. Denna siffra har ändrats från 8 och återges med tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Effekt av KORS på HDMEC-migration . (A) Migrationen av HDMEC i den 3D-printade insatsen i frånvaro av KORS (kontroll = CTRL) eller i närvaro av KORS (+ KORS) visas och kvantifieras som den procentuella återhämtningen. B) Migrationen av HDMEC i ECM - eller KORSCM visas och kvantifieras som den procentuella återhämtningen. Resultaten uttrycks som medelvärdet ± SEM, n=3 replikat, och tre fält analyserades per replikat, två oberoende experiment utfördes. **p<0,01, *****p<0,00001. Skalstreck: 200 μm. KORS inkuberades i ECM utan FBS och tillväxtfaktorer. Efter 48 timmar samlades detta konditionerade medium in och förvarades vid -80 °C för experimenten. Denna siffra har ändrats från 8 och återges med tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Räkna 1 | Räkning 2 | Betyda | Totalt medelvärde | ||
| Tallrik med 6 brunnar | Replikera 1 | 95% | 84% | 90% | 90% |
| Replikera 2 | 90% | 88% | 89% | ||
| Replikera 3 | 85% | 89% | 87% | ||
| Replikera 4 | 97% | 89% | 93% | ||
| Replikera 5 | 88% | 94% | 91% | ||
| Replikera 6 | 86% | 92% | 89% | ||
| 3D-printad insats | Replikera 1 | 92% | 89% | 91% | 91% |
| Replikera 2 | 91% | 80% | 86% | ||
| Replikera 3 | 93% | 92% | 93% | ||
| Replikera 4 | 94% | 98% | 96% | ||
| Replikera 5 | 88% | 86% | 87% | ||
| Replikera 6 | 93% | 97% | 95% |
Tabell 1: Mätning av KORS lönsamhet. KORS-viabiliteten mättes i en brunn med 6 brunnar och i en 3D-printad insats med hjälp av trypanblå färgning och automatisk räkning.
| Räkna 1 | Räkning 2 | Betyda | Totalt medelvärde | ||
| Tallrik med 6 brunnar | Replikera 1 | 90% | 88% | 89% | 85% |
| Replikera 2 | 79% | 78% | 79% | ||
| Replikera 3 | 71% | 75% | 73% | ||
| Replikera 4 | 86% | 82% | 84% | ||
| Replikera 5 | 91% | 88% | 90% | ||
| Replikera 6 | 99% | 94% | 97% | ||
| 3D-printad insats | Replikera 1 | 99% | 86% | 93% | 86% |
| Replikera 2 | 80% | 75% | 78% | ||
| Replikera 3 | 79% | 80% | 80% | ||
| Replikera 4 | 98% | 85% | 92% | ||
| Replikera 5 | 85% | 78% | 82% | ||
| Replikera 6 | 89% | 93% | 91% |
Tabell 2: Mätning av HDMEC:s viabilitet. HDMEC-viabiliteten mättes i en brunn med en 6-hålsplatta och i en 3D-printad insats med hjälp av trypanblå färgning och automatisk räkning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Indirekt cellkommunikation undersöks vanligen med hjälp av betingade medier eller samodlingssystem. Konditionerad medieberedning är tidskrävande uppströms i experimenten, och denna metod är begränsad till ensidiga effektanalyser. Den tidigare studien av Colin-Pierre et al.8 med hjälp av konditionerade medier utfördes på den indirekta cellkommunikationen mellan två celltyper (HDMEC och KORS). Data från denna tidigare studie visade effekten av KORS-konditionerade medier på HDMEC-proliferation och effekten av KORS-konditionerade medier på HDMEC-migration, pseudorörsbildning och GPC1-uttryck8. I föreliggande studie beskrivs ett enklare och snabbare sätt att undersöka indirekt cellkommunikation. Faktum är att 3D-printade insatser möjliggör flexibilitet i experimentell design och flera kombinationer av cellodling. För att validera dessa 3D-printade insatser som en modell för samkulturer analyserades cellproliferation och cellmigration och jämfördes med den tidigare studien med konditionerade medier8. I båda studierna utfördes sårläkningsanalysen med hjälp av en anordning med två migrationskammare (Culture-Insert 2 Well in μ-Dish 35 mm) som placerades i den brunn som innehöll eller inte innehöll insatsen. Denna migreringstestanordning9,10 skiljer sig från scratch-analyser11,12 genom att fotavtrycket som lämnas av väggen (som simulerar såret) som avgränsar de två kamrarna är konstant. Därför är det mycket reproducerbart. Resultaten av den aktuella studien har lett till en liknande slutsats i jämförelse med betingade medieexperiment. De 3D-printade insatserna förändrar inte cellens beteende och är anpassade för att skapa oberoende fackbeläggningar som främjar cellvidhäftning. Men de 3D-printade insatserna gör det också möjligt att göra en beläggning med poly-HEMA, till exempel för att inducera låg vidhäftning för odlingen av sfäroiden/organoiden. Indirekt kommunikation mellan HDMEC och KORS undersöktes här som ett exempel på de många applikationer som de 3D-printade insatserna ger.
Denna nya enhet, som är tillämplig på vidhäftande celltyper som kräver eller inte kräver en specifik beläggning, ger betydande tidsbesparing för etableringen av samodlingsmodellen. Faktum är att de fyra facken i de 3D-printade insatserna möjliggör odling av flera celltyper i monolager eller i 3D (aggregat eller sfäroider) i samma brunn med olika kombinationer. Till exempel kan indirekt kommunikation av fyra celltyper i monolager, i 3D (sfäroider) eller en kombination av båda analyseras. Under experimenten odlades sfäroider i de 3D-printade insatserna med hjälp av en poly-HEMA-beläggning (data visas inte). Sfäroiderna bestod av celler som såddes i 3D på grund av den låga bindningsplattan och överfördes efter 48 timmar till den 3D-printade insatsen för analys. Efter flera dagars odling observerades tillväxten av sfäroiderna. Dessa resultat visar att den 3D-printade insatsen kan användas för att följa 3D-celltillväxt efter överföring av sfäroiderna på samma sätt som i en odlingsplatta13,14. Dessutom kan en blandning av olika celltyper sättas ihop i samma fack i 2D eller 3D (organoider) för att studera både direkt och indirekt cellkommunikation. Faktum är att det breda utbudet av modularitet som erbjuds av de 3D-printade insatserna kännetecknar detta innovativa cellodlingssystem. Dessutom gör närvaron av kommunikationsfönstren det möjligt att använda i ett gemensamt medium för alla celltyper vid en vald tidpunkt utan hjälp av konditionerade medier. Denna teknik är således inte tillämplig på celler som odlats i suspension. Väggarna som separerar de fyra facken gör det möjligt att så, skörda och analysera varje celltyp oberoende av de andra. Flera tillämpningar kan göras, såsom pseudorörsbildningsanalyser och proliferation, migration, DNA, RNA, protein och andra analyser. De 3D-printade insatserna ger också möjlighet att analysera effekten av till exempel molekyler eller extracellulära vesiklar. Det faktum att dessa insatser tillverkades genom 3D-utskrift ger dessutom många möjligheter till facklayout och många funktionella analyser.
Det kritiska steget med den 3D-printade insatstätningen i plattan måste dock övervägas noggrant. En homogen uppdelning av kislet är avgörande för att säkerställa tätning och för att förhindra läckage av cellodlingsmedium eller celler från ett fack till ett annat. För att undvika problem bör man se till att kislet täcker den del av de 3D-printade insatserna som kommer i kontakt med plattan. Innan man sår cellerna bör man kontrollera att de är korrekt förseglade genom att tillsätta cellodlingsmedium i ett fack och observera frånvaron av medieläckage i de andra facken. Torktiden för kisel efter inkubationen i 70 % etanolbadet är också ett kritiskt steg. Faktum är att de återstående spåren av alkohol kan leda till cellfixering och toxicitet. För att undvika problem måste torktiden respekteras.
Sammanfattningsvis är de 3D-printade insatserna kompatibla med de flesta vidhäftande celltyper för odling i 2D eller 3D och möjliggör många experimentmetoder. De kan anpassas för många samkulturstudier och kan ge ett nytt verktyg för att undersöka indirekt cellkommunikation. De 3D-printade insatserna är modulerbara, flexibla, skalbara och kan användas för att designa experimentella modeller för studier av fysiopatologier som cancerologi, immunologi eller angiogenes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna redovisar inga konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Studien genomfördes i samarbete med BASF Beauty Care Solutions. Charlie Colin-Pierre är en BASF/CNRS-finansierad doktorand.
Vi vill tacka Mehdi Sellami för idén till de 3D-printade insatserna.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Autoclave | Getinge | APHP | Solid cycle, 121 °C for 20 min |
| Biomed Clear | Formlabs | RS-F2-BMCL-01 | Impression performed by 3D-Morphoz company (Reims, France) |
| Cell culture detergents | Tounett | A18590/0116 | |
| Cell Proliferation Reagent WST-1 | Roche | 11,64,48,07,001 | |
| Counting slide | NanoEnTek | EVE-050 | |
| Culture-Insert 2 Well in μ-Dish 35 mm | Ibidi | 80206 | two-migration chambers device. |
| Endothelial cell medium | ScienCell | 1001 | Basal medium +/- 25 mL of fetal bovine serum (FBS, 0025), 5 mL of endothelial cell growth supplement (ECGS, 1052), and 5 mL of penicillin/streptomycin solution (P/S, 0503). |
| EVE Automated cell counter | NanoEnTek | NESCT-EVE-001E | |
| EVOS XL Core | Fisher Scientific | AMEX1200 | 10x of magnification |
| Food silicon reagent and catalyst kit | Artificina | RTV 3428 A and B | (10:1) |
| FORM 3B printer | Formlabs | PKG-F3B-WSVC-DSP-BASIC | Impression performed by 3D-Morphoz company |
| Human Dermal Microvascular Endothelial Cells (HDMEC) | ScienCell | 2000 | |
| Keratinocytes of Outer Root Sheath (KORS ) | ScienCell | 2420 | |
| Macro Wound Healing Tool Software | ImageJ | Software used for the measurement of the uncovered surface (for migration assays) | |
| Mesenchymal stem cell medium | ScienCell | 7501 | Basal medium +/-25 mL of fetal bovine serum (FBS, 0025), 5 mL of mesenchymal stem cell growth supplement (MSCGS, 7552), and 5 mL of penicillin/streptomycin solution (P/S, 0503) |
| Microplate reader SPECTRO star NANO | BMG Labtech | BMG LABTECH software | |
| PBS | Promocell | C-40232 | Without Ca2+ / Mg2+ |
| Trypan Blue Stain | NanoEnTek | EBT-001 | |
| Trypsin / EDTA | Promocell | C-41020 | Incubation of KORS at 37 °C with 5% CO2 for 5 min. Incubation of HDMECs for 5 min at room temperature |
| 96-well plate Nunclon Delta Surface | Thermoscientific | 167008 |
References
- Regier, M. C., Alarid, E. T., Beebe, D. J. Progress towards understanding heterotypic interactions in multi-culture models of breast cancer. Integrative Biology. 8 (6), 684-692 (2016).
- Doğan, A., Demirci, S., Apdik, H., Apdik, E. A., Şahin, F. Mesenchymal stem cell isolation from pulp tissue and co-culture with cancer cells to study their interactions. Journal of Visualized Experiments. (143), e58825 (2019).
- Lin, J., et al. Long non-coding RNA UBE2CP3 enhances HCC cell secretion of VEGFA and promotes angiogenesis by activating ERK1/2/HIF-1α/VEGFA signalling in hepatocellular carcinoma. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 37 (1), 113 (2018).
- Soares, N. L., et al. Carbon monoxide modulation of microglia-neuron communication: Anti-neuroinflammatory and neurotrophic role. Molecular Neurobiology. 59 (2), 872-889 (2022).
- Al Halawani, A., Abdulkhalek, L., Mithieux, S. M., Weiss, A. S. Tropoelastin promotes the formation of dense, interconnected endothelial networks. Biomolecules. 11 (9), 1318 (2021).
- Mercatali, L., et al. Development of a human preclinical model of osteoclastogenesis from peripheral blood monocytes co-cultured with breast cancer cell lines. Journal of Visualized Experiments. (127), e56311 (2017).
- Orona, N. S., Astort, F., Maglione, G. A., Yakisich, J. S., Tasat, D. R. Direct and indirect effect of air particles exposure induce Nrf2-dependent cardiomyocyte cellular response in vitro. Cardiovascular Toxicology. 19 (6), 575-587 (2019).
- Colin-Pierre, C., et al. The glypican-1/HGF/C-met and glypican-1/VEGF/VEGFR2 ternary complexes regulate hair follicle angiogenesis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 781172 (2021).
- Toubal, A., et al. The NC1 domain of type XIX collagen inhibits melanoma cell migration. European Journal of Dermatology. 20 (6), 712-718 (2010).
- Wu, A. -L., et al. Role of growth factors and internal limiting membrane constituents in müller cell migration. Experimental Eye Research. 202, 108352 (2021).
- Oudart, J. -B., et al. Plasmin releases the anti-tumor peptide from the NC1 domain of collagen XIX. Oncotarget. 6 (6), 3656-3668 (2015).
- Martinotti, S., Ranzato, E.
- Cattin, S., Ramont, L., Rüegg, C. Characterization and in vivo validation of a three-dimensional multi-cellular culture model to study heterotypic interactions in colorectal cancer cell growth, invasion and metastasis. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 97 (2018).
- Ma, Y. N., et al. Three-dimensional spheroid culture of adipose stromal vascular cells for studying adipogenesis in beef cattle. Animal. 12 (10), 2123-2129 (2018).
