Summary
في هذه الورقة ، يتم تقديم ملحق مطبوع 3D مصمم حديثا كنموذج للثقافة المشتركة ويتم التحقق من صحته من خلال دراسة الاتصال بين الخلايا بين الخلايا البطانية والخلايا الكيراتينية.
Abstract
تتطلب التحليلات الكلاسيكية للاتصال غير المباشر بين أنواع الخلايا المختلفة استخدام وسائط مشروطة. علاوة على ذلك ، لا يزال إنتاج الوسائط المكيفة يستغرق وقتا طويلا وبعيدا عن الظروف الفسيولوجية والمرضية. على الرغم من توفر عدد قليل من نماذج الاستزراع المشترك تجاريا ، إلا أنها تظل مقتصرة على فحوصات محددة وهي في الغالب لنوعين من الخلايا.
هنا ، يتم استخدام إدخالات مطبوعة 3D متوافقة مع العديد من المقايسات الوظيفية. يسمح الملحق بفصل بئر واحد من لوحة 6 آبار إلى أربع مقصورات. يمكن تعيين مجموعة واسعة من المجموعات. علاوة على ذلك ، تم تصميم النوافذ في كل جدار من المقصورات بحيث يكون الاتصال المحتمل بين الخلايا بين كل حجرة ممكنا في وسط الاستزراع بطريقة تعتمد على الحجم. على سبيل المثال ، يمكن دراسة الاتصال بين الخلايا paracrine بين أربعة أنواع من الخلايا في طبقة واحدة ، في 3D (كروية) ، أو عن طريق الجمع بين الاثنين معا. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن زرع مزيج من أنواع الخلايا المختلفة في نفس الحجرة بتنسيق 2D أو 3D (عضويات). يسمح عدم وجود قاع في الإدخالات المطبوعة 3D بظروف الثقافة المعتادة على اللوحة ، والطلاء المحتمل على اللوحة التي تحتوي على الإدراج ، والتصور المباشر بواسطة الفحص المجهري الضوئي. توفر المقصورات المتعددة إمكانية جمع أنواع مختلفة من الخلايا بشكل مستقل أو استخدام ، في كل حجرة ، كواشف مختلفة لاستخراج الحمض النووي الريبي أو البروتين. في هذه الدراسة ، يتم توفير منهجية مفصلة لاستخدام إدراج 3D المطبوع الجديد كنظام ثقافة مشتركة. لإثبات العديد من قدرات هذا النموذج المرن والبسيط ، تم إجراء فحوصات وظيفية منشورة مسبقا للاتصال الخلوي في إدخالات 3D المطبوعة الجديدة وثبت أنها قابلة للتكرار. أدت الإدخالات المطبوعة 3D وثقافة الخلية التقليدية باستخدام الوسائط المكيفة إلى نتائج مماثلة. في الختام ، فإن الإدراج المطبوع 3D هو جهاز بسيط يمكن تكييفه مع العديد من نماذج الثقافات المشتركة مع أنواع الخلايا الملتصقة.
Introduction
في الجسم الحي ، تتواصل الخلايا مع بعضها البعض إما بشكل مباشر (اتصال الخلية) أو بشكل غير مباشر (عن طريق إفراز الجزيئات). لدراسة التواصل الخلوي ، يمكن تطوير نماذج مختلفة للثقافة المشتركة ، مثل الثقافة المشتركة المباشرة (أنواع الخلايا المختلفة في تفاعل مباشر في نفس البئر) والثقافة المشتركة المجزأة (أنواع الخلايا المختلفة في تفاعل غير مباشر في أجزاء مختلفة من نظام الاستزراع) 1. علاوة على ذلك ، يمكن استخدام الوسائط المشروطة لأنظمة الاستزراع المشترك ، حيث يتم تمكين التفاعل غير المباشر بواسطة جزيئات مفرزة موجودة في الوسائط المشروطة لنوع خلية مستجيبة يتم نقلها إلى نوع خلية مستجيبةمن النوع 1.
في حالة دراسات اتصالات الخلايا الباراكرين ، توفر أنظمة الزراعة المشتركة غير المباشرة نماذج تعكس بقوة تفاعلات الخلايا في الجسم الحي. تم تطوير أنظمة الثقافة المشتركة غير المباشرة وتسويقها ، مما يسمح بإنشاء نماذج الثقافة المشتركةغير المباشرة 2,3. لسوء الحظ ، توفر معظم أنظمة الثقافة المشتركة غير المباشرة جزأين فقط. توفر أنظمة الثقافة المشتركة غير المباشرة الأخرى مقصورات متعددة ، لكنها أقل قابلية للتطوير مقارنة بالنظام المذكور في هذه المخطوطة. بعضها لا يسمح بالتصور الكلاسيكي تحت المجهر ، وغالبا ما يقدمون طرق تطبيق محددة. في العديد من الدراسات ، يتم فحص اتصال paracrine بين أنواع الخلايا المختلفة بواسطة نموذج الوسائط المشروطة4،5،6،7. هذه طريقة أسهل للتحقيق مقارنة بأنظمة الثقافة المشتركة غير المباشرة لأنها لا تتطلب طرقا أو مواد محددة ليتم إنشاؤها1. من ناحية أخرى ، فإن إعداد الوسائط المكيفة يستغرق وقتا طويلا ويوفر معلومات فقط عن إشارات الخلية أحادية الاتجاه (المستجيب إلى المستجيب)1.
في هذه الورقة ، تم اقتراح طريقة جديدة وبسيطة للتحقيق في اتصال الخلية. السماح بالجمع بين عدة أنواع من الخلايا في التفاعل المباشر أو غير المباشر وفي تنسيقات 2D أو 3D ، تقدم الإدخالات المطبوعة العديد من المزايا لإعداد نماذج الثقافة المشتركة بسهولة. تم تكييفها ليتم وضعها في آبار 6 ألواح من 6 آبار ، والملحق المطبوع 3D دائري ويسمح بفصل البئر إلى أربع حجرات (مقصورتان كبيرتان ومقصورتان صغيرتان. الشكل 1 أ). تتميز الإدخالات المطبوعة 3D بعدم وجود قاع. وبالتالي ، فإن الخلايا على اتصال مباشر مع اللوحة التي يتم وضع الإدخال عليها. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن طلاء كل حجرة بشكل مستقل عن الآخرين. علاوة على ذلك ، يمكن متابعة سلوك الخلية بسهولة تحت المجاهر الضوئية. يسمح وجود نوافذ اتصال في كل جدار من الإدراج بإضافة ، في الوقت الأمثل ، وسيط مشترك لإجراء تجارب مختلفة للثقافة المشتركة. يمكن إجراء مجموعات عديدة من الثقافة المشتركة لدراسة الاتصال المباشر و / أو غير المباشر بين عدة أنواع من الخلايا. على سبيل المثال ، يمكن تصميم نموذج للثقافة المشتركة غير المباشرة بين أربعة أنواع مختلفة من الخلايا في طبقة واحدة و / أو في 3D (كروية). يمكن أيضا إجراء مجموعة من نماذج الاستزراع المشترك المباشرة وغير المباشرة عن طريق خلط أنواع مختلفة من الخلايا في نفس الحجرة. يمكن أن يكون تأثير الهياكل المعقدة (المواد العضوية ، وزرع الأنسجة ، وما إلى ذلك) على أنواع الخلايا المختلفة مثالا آخر على النماذج التي يمكن صنعها. علاوة على ذلك ، فإن الإدخالات المطبوعة 3D متوافقة مع المقايسات الوظيفية لبيولوجيا الخلية (الانتشار ، الهجرة ، تكوين الأنبوب الكاذب ، التمايز ، إلخ) ومع اختبارات الكيمياء الحيوية (استخراج الحمض النووي ، الحمض النووي الريبي ، البروتين ، الدهون ، إلخ). أخيرا ، توفر الإدخالات المطبوعة 3D مجموعة واسعة من المخططات التجريبية لنماذج الثقافة المشتركة مع إمكانية الجمع بين المقايسات المختلفة في وقت واحد في نفس التجربة في المقصورات المختلفة.
يتم تقديم بعض قدرات الإدخالات المطبوعة 3D للتحقق من صحتها كنموذج ثقافة مشتركة سريع وسهل الاستخدام. بالمقارنة مع دراسة نشرت سابقا أجريت على اتصالات الخلايا paracrine ، تم إثبات قدرة إدراج 3D المطبوعة لتكون نموذجا قيمة للثقافة المشتركة. لتقييم هذه النقطة ، تمت مقارنة تنظيم تكاثر الخلايا البطانية والهجرة بواسطة الخلايا الكيراتينية بين نظام الإدراج المطبوع 3D والنظام الكلاسيكي باستخدام الوسائط المشروطة. تسمح الإدخالات المطبوعة 3D بالحصول على نتائج مماثلة بسرعة مقارنة بالنظام التقليدي باستخدام الوسائط المكيفة. في الواقع ، توفر الإدخالات المطبوعة 3D نموذجا قويا لدراسة تفاعلات الخلايا في كلا الاتجاهين دون الحاجة إلى إنتاج وسائط مشروطة ومع إمكانية إجراء فحوصات الانتشار والهجرة بالتوازي في نفس التجربة.
في الختام ، في هذه الورقة ، يقترح نموذج جديد وجاهز للاستخدام لدراسة اتصال الخلية. متوافقة مع جميع أنواع الخلايا الملتصقة ، تسمح الإدخالات المطبوعة 3D بأداء مجموعات عديدة من الثقافة المشتركة التي تهدف إلى أن تكون أقرب إلى ظروف الجسم الحي .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: يتم شراء إدخالات 3D (الشكل 1A) تجاريا ويتم طباعتها باستخدام راتنج فوتوبوليمر متوافق حيويا مع زراعة الخلايا والتعقيم (انظر جدول المواد). في هذا القسم ، يتم وصف بروتوكول مفصل لإنشاء نموذج الثقافة المشتركة عن طريق الإدراج (انظر الشكل 1 ب). كما يتم توفير بعض الأمثلة على التطبيقات.
1. وضع الملحق المعقم في ألواح 6 آبار
- امزج المكونين المقدمين في المجموعة (انظر جدول المواد) ، سيليكون الطعام (الكاشف أ) والمحفز (الكاشف ب) ، بنسبة 10: 1 (v / v) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. (الشكل 1 ب). استخدم ملعقة معقمة من الإيثانول بنسبة 70٪ لخلط المكونين.
ملاحظة: يعتمد حجم خليط السيليكون المراد تحضيره على عدد الإدخالات المراد تثبيتها. يمكن أن يؤدي وجود فائض من المحفز إلى تصلب خليط السيليكون بسرعة كبيرة. - ضع الحشوات على مزيج السيليكون بملاقط بحيث يتم توزيع الخليط بشكل متجانس على الحافة السفلية للإدخالات (الشكل 1Bb). ضع الحشوات في آبار لوحة ذات 6 آبار واضغط برفق على الحشوات للتأكد من أن الحشوات على اتصال وثيق باللوحة لتجنب أي تسرب لوسط زراعة الخلايا (الشكل 1 بج).
- ضع اللوحة عند 37 درجة مئوية لدعم عملية تصلب السيليكون لمدة 1 ساعة.
ملاحظة: يعتمد وقت التصلب على كمية المحفز الذي تمت إضافته. - بعد التصلب ، قم بتعقيم الألواح بالحشوات عن طريق غمرها في حمام إيثانول بنسبة 70٪ لمدة 30 دقيقة إلى 1 ساعة.
- تخلص من الكحول عن طريق السحب واترك الطبق يجف (الغطاء مفتوحا) طوال الليل في غطاء زراعة الخلايا.
ملاحظة: يجب تبخير الكحول بالكامل قبل تنفيذ الخطوة التالية لتجنب تثبيت الخلية والسمية. يمكن تخزين اللوحة الجاهزة للاستخدام التي تحتوي على الحشوات لعدة أيام قبل استخدامها في ظروف جافة ومعقمة في درجة حرارة الغرفة.
2. الطلاءات مثل بولي-L-ليسين ، أو بولي-HEMA (خطوة اختيارية)
ملاحظة: لا يتم إجراء الطلاء في هذه التجربة ، ويتم توفير الخطوات للإبلاغ عن إمكانية طلاء الإدخالات.
- تحضير محلول الطلاء وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
- ضع في اعتبارك حجم 200-400 ميكرولتر لأكبر المقصورات وحجم 50-100 ميكرولتر لأصغر المقصورات لطلاء الإدخال. أضف محلول الطلاء إلى المقصورات الفردية.
- دع الطلاء يجف كما هو موضح من قبل الشركة المصنعة في ظل ظروف معقمة.
3. بذر الخلايا
- استزرع الخلايا الكيراتينية لغمد الجذر الخارجي (KORS) والخلايا البطانية الوعائية الدقيقة الجلدية البشرية (HDMECs) على النحو الموصى به من قبل الشركة المصنعة. قم بإعداد تعليق الخلية بمجرد وصول الخلايا إلى نقطة التقاء.
- تخلص من الوسط من القوارير وأضف 5 مل من التربسين لفصل الخلايا (انظر جدول المواد).
- ضع القارورة التي تحتوي على KORS على درجة حرارة 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 لمدة 5 دقائق. احتضان القارورة التي تحتوي على HDMECs لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- امزج محلول التربسين الذي يحتوي على KORS مع 5 مل من وسط الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCM) المكمل بمصل بقري جنيني بنسبة 5٪ (FBS) وعوامل النمو (وسط قاعدي مع مجموعة مكملات ، انظر جدول المواد). امزج محلول التربسين الذي يحتوي على HDMECs مع 5 مل من وسط الخلايا البطانية (ECM) المكمل ب 5٪ FBS وعوامل النمو (انظر جدول المواد).
- نقل الخلايا إلى 15 مل من أنبوب مخروطي معقم. أجهزة الطرد المركزي KORS و HDMEC تعليق في 200 × غرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في 2 مل من الوسط المعني.
- امزج 10 ميكرولتر من معلق الخلية مع 10 ميكرولتر من صبغة تريبان الزرقاء (انظر جدول المواد).
- أضف 10 ميكرولتر من المزيج إلى حجرة شريحة العد.
- أدخل شريحة العد في نظام عد الخلايا (انظر جدول المواد) واكتشف رقم الخلية وصلاحيتها.
- تحضير معلق الخلية بتركيز 0.5 × 105 خلايا / مل في الوسط المعني.
ملاحظة: إذا كانت أنواع الخلايا المختلفة تتطلب أوقاتا مختلفة من الالتزام و / أو للوصول إلى التقاء مثالي ، فيمكن إجراء بذر الخلية في نقاط زمنية مختلفة وفقا لأنواع الخلايا.
- قم بتوزيع 800 ميكرولتر إلى 1 مل من تعليق الخلية في المقصورات الكبيرة الفردية و 100-150 ميكرولتر في المقصورات الصغيرة الفردية باستخدام ماصة.
- قم بزرع KORS عند 1 × 10 5 خلايا / مل في MSCM مع استكمال5٪ FBS وعوامل النمو في إحدى المقصورات الكبيرة.
- البذور HDMEC في ECM تستكمل مع 5٪ FBS وعوامل النمو في 2.5 × 103 خلايا / مل في المقصورات الصغيرة وعند 1.25 × 105 خلايا / مل في الحجرة الكبيرة الأخرى.
ملاحظة: يمكن إجراء اختبار الانتشار في المقصورات الصغيرة ، ويمكن إجراء فحوصات الترحيل والجدوى في المقصورات الكبيرة. تم تحسين تركيز الخلايا المصنفة وفقا لتوصيات الشركة المصنعة. يسمح هذا التركيز بصلاحية جيدة للخلايا بعد 24-48 ساعة من الحضانة.
- ضع لوحة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 أو في ظل الظروف المعتادة للسماح بالتصاق الخلية و / أو نضجها.
ملاحظة: احتضان الخلايا لمدة 24-48 ساعة دون تغيير الوسائط. إذا لزم الأمر ، يمكن تغيير وسيط المقصورات بشكل مستقل.
4. تنفيذ الثقافة المشتركة (الشكل 1Bd)
ملاحظة: يتوافق تنفيذ الثقافة المشتركة مع الوقت الذي تتم فيه إضافة الوسيط المشترك. توفر إضافة وسيط فريد لجميع أنواع الخلايا في المقصورات المختلفة إمكانية الاتصال بين الخلايا بسبب وجود نوافذ اتصال (ثقوب بيضاوية في جدران الإدخالات المطبوعة 3D). لتنفيذ الثقافة المشتركة ، اتبع الخطوات 4.1-4.3.
- أفرغ وسائط الاستزراع للمقصورات المختلفة للإدخالات باستخدام ماصة. في حالة وجود ثقافة خلية كروية 3D ، تجاهل الوسيلة بلطف شديد.
- شطف الخلايا مع 1 مل من 37 درجة مئوية PBS دافئة في المقصورات الكبيرة و 200 ميكرولتر من 37 درجة مئوية PBS دافئة في المقصورات الصغيرة. تأكد من الغسيل اللطيف لعدم فصل الخلايا.
- أضف 3 مل من وسط شائع محدد ليكون متوافقا مع جميع أنواع الخلايا.
ملاحظة: في هذه الدراسة ، يتم استخدام ECM القاعدي (بدون FBS وعوامل النمو). تأكد من أن الوسيط يغطي جميع المقصورات (المستوى فوق نوافذ الاتصال [ثقوب بيضاوية في الجدران] ، كما هو موضح في الشكل 1 أ). - ضع اللوحة التي تحتوي على المزارع المشتركة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 لمدة 24-48 ساعة.
5. مراقبة الخلايا والعد والكشط
- مراقبة التشكل وحساب عدد الخلايا من المقصورات المختلفة أثناء التجربة تحت المجهر الضوئي بعد 24-48 ساعة من الحضانة.
ملاحظة: يعتمد العدد المتوقع للخلايا على أنواع الخلايا المستخدمة (الحجم ، التشكل ، إلخ) وعلى حجم المقصورة. في هذه التجربة ، يتم حساب ما بين 0.5 × 10 6-1 × 10 6 KORS / مل وبين 0.25 × 10 6-0.75 × 10 6 HDMECs / mL في المقصورات الكبيرة. - افصل الخلايا باستخدام التربسين لحساب معلق الخلية.
ملاحظة: بالنسبة لمحلول انفصال الخلايا ، ضع في اعتبارك حجم 100-500 ميكرولتر لأكبر المقصورات وحجم 10-50 ميكرولتر لأصغر المقصورات. - تحقق من الصلاحية باستخدام تلطيخ التريبان الأزرق (انظر الخطوات 3.1.6-3.1.8).
6. إدراج التنظيف لإعادة التدوير
- قم بإزالة الإدخالات من اللوحة المكونة من 6 آبار في نهاية التجربة عن طريق تحريف طفيف (الشكل 1Be).
- قم بإزالة السيليكون من الحشوات عن طريق سحبه. إذا لزم الأمر ، استخدم ملعقة لإزالة السيليكون المتبقي العالق على جدران الإدخالات (الشكل 1Bf).
- اغسل الحشوات بمنظفات زراعة الخلايا التقليدية ومواد التنظيف (المثال الوارد في جدول المواد).
- تعقيم الحشوات لاستخدامها في المستقبل في الأوتوكلاف (دورة صلبة ، 121 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة) أو عن طريق غمرها في حمام الإيثانول بنسبة 70٪ لمدة 1 ساعة.
ملاحظة: من هذه الخطوة ، يتم وصف مثالين للمقايسات المحتملة (مقايسات الانتشار والهجرة) باستخدام الإدخالات المطبوعة ثلاثية الأبعاد (الشكل 1Bd).
7. مقايسة تكاثر الخلايا - مقايسة WST-1
- اتبع الخطوات 1-3.1 لزراعة الخلايا.
ملاحظة: اتبع الخطوة الواردة في هذا الفرع لتنفيذ نظام الاستزراع المشترك من أجل التحقيق في تأثير إفراز KORS على انتشار HDMEC. تستخدم خلايا KORS لمقارنة البيانات المنشورة سابقا8.- قم بزرع KORS عند 1 × 105 خلايا / مل في وسط الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCM) مع 5٪ FBS وعوامل النمو في المقصورات الكبيرة.
- ضع لوحة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 لمدة 24 ساعة.
- قم بزرع HDMECs في وسط الخلية البطانية (ECM) مع استكمال 5٪ FBS وعوامل النمو عند 2.5 × 103 خلايا / مل في المقصورات الصغيرة.
- ضع صفيحة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 لمدة 24-48 ساعة.
- تخلص من الوسائط من جميع المقصورات وقم بتنفيذ نظام الاستزراع المشترك بإضافة 3 مل من ECM القاعدي غير المكمل (وسط زراعة الخلايا المشترك لجميع مقصورات الإدخالات المطبوعة ثلاثية الأبعاد).
- قم بتخفيف WST-1 في وسط زراعة الخلايا الشائعة ECM (التخفيف النهائي 1:10) لتحضير محلول WST-1.
ملاحظة: بالنسبة لحجم محلول WST-1 ، قم بإعداد 500 ميكرولتر على الأقل من المحلول الإضافي للفراغ. - تخلص من وسط زراعة الخلايا من الإدخال عن طريق الماصة.
- أضف حل WST-1 إلى المقصورات المحددة (150 ميكرولتر للمقصورات الصغيرة و 600 ميكرولتر للمقصورات الكبيرة). ضع اللوحة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.
- بعد وقت حضانة الخلية الأمثل البالغ 30 دقيقة ، انقل 100 ميكرولتر من وسط الحضانة من كل حالة على لوحة 96 بئرا.
- قم بتقييم التفاعل اللوني باستخدام قارئ الصفائح الدقيقة بين 420 نانومتر و 480 نانومتر.
- ضع اللوحة على قارئ microplate وانقر على زر تحرير بروتوكول جديد.
- حدد النوع المحدد للوحة 96 بئرا (انظر جدول المواد) المستخدمة والطول الموجي 450 نانومتر.
- انقر على زر بدء القياس.
8. مقايسة هجرة الخلايا - جهازان لغرف الهجرة
- اتبع الخطوات 1-3.1 لزراعة الخلايا.
ملاحظة: اتبع الخطوات الواردة في هذا الفرع لتنفيذ نظام الاستزراع المشترك من أجل التحقيق في تأثير الذخيرة السرية لنظام كورس على انتشار HDMEC.- قم بزرع KORS عند 1 × 10 5 خلايا / مل في MSCM مع استكمال5٪ FBS وعوامل النمو في إحدى المقصورات الكبيرة.
- ضع لوحة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 لمدة 24 ساعة.
- ضع جهاز غرفتي الترحيل في الحجرة الكبيرة الأخرى من الإدراجات.
- قم بزرع HDMECs في ECM المكملة ب 5٪ FBS وعوامل النمو عند 7 × 105 خلايا / بئر لجهاز غرفتي الهجرة.
- ضع لوحة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 لمدة 24 ساعة.
- تخلص من الوسائط وجهاز غرفتي الترحيل بعد 24 ساعة أو في الوقت الأمثل وفقا لنوع الخلية التي يتم ترحيلها. تنفيذ نظام الاستزراع المشترك بإضافة 3 مل من ECM القاعدي غير المكمل
ملاحظة: تابع بعناية لعدم فصل الخلايا. إذا كانت الخلايا حساسة حقا للانفصال الناجم عن إضافة وسيط مشترك ، فقم بسحب جهاز غرفتي الهجرة بعد إضافة الوسط المشترك.
- راقب والتقط صورة للسطح الذي تغطيه الخلايا في نقاط زمنية مختلفة تحت مجهر تباين الطور عند تكبير 10x.
ملاحظة: يتم التقاط الصور باستخدام مجهر تباين الطور (انظر جدول المواد). يتم حفظ الصور في مفتاح USB ثم تحليلها بواسطة المكون الإضافي لأداة التئام الجروح للبرنامج (انظر جدول المواد). - قياس السطح المكشوف باستخدام برنامج التحليل الكمي الكلاسيكي.
- افتح الصورة على البرنامج وقم بتنشيط أداة التئام الجروح المتوفرة في قائمة الماكرو.
- انقر فوق الزر m لقياس السطح المكشوف لصورة الترحيل.
- يتم حساب السطح المكشوف وفقا للصيغة التالية:
النسبة المئوية للتغطية = ([متوسط المنطقة بدون خلايا عند T0 - المنطقة بدون خلايا في الوقت T] / متوسط المساحة بدون خلايا عند T0) × 100.
ملاحظة: يتم تكييف الإدخالات المطبوعة ثلاثية الأبعاد تماما مع معظم تقنيات بيولوجيا الخلية (مثل مقايسة تكوين الأنبوب الكاذب ، والثقافات ثلاثية الأبعاد) ولتجارب الكيمياء الحيوية (مثل استخراج الحمض النووي والحمض النووي الريبي والبروتين).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في العمل الحالي ، تم وصف نظام الثقافة المشتركة الأمثل للحصول على بيانات قوية وموثوقة ومهمة يمكن مقارنتها بالطرق الكلاسيكية من خلال استخدام الوسائط المكيفة. تحاكي الإدخالات المطبوعة 3D ظروف البيئة المكروية في الجسم الحي لأنواع الخلايا المختلفة في التفاعل من خلال التغلب على الصعوبات والإنتاج الذي يستغرق وقتا طويلا للوسائط المكيفة في المنبع في التجارب. تمت إعادة إجراء دراسة منشورة سابقا لتحليل التفاعلات غير المباشرة بين نوعين من الخلايا الموجودة في بصيلات الشعر: الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة البشرية (HDMECs) والخلايا الكيراتينية البشرية في غمد الجذر الخارجي (KORS) 8. هنا ، تم إثبات قابلية استنساخ النتائج التي تم الحصول عليها باستخدام إدخالات 3D المطبوعة مقارنة بالطريقة الكلاسيكية باستخدام الوسائط المكيفة للتحقيق في التفاعلات غير المباشرة بين HDMECs و KORS. كانت ظروف زراعة الخلايا الموصوفة سابقا في الدراسة8 هي نفسها كما في هذا العمل الحالي. تم تكييفها مع الأخذ في الاعتبار أبعاد الإدخالات المطبوعة 3D (انظر البروتوكول). بادئ ذي بدء ، كان النمط الظاهري وصلاحية الخلية قابلين للمقارنة بين الشرطين (الوسائط المكيفة مقابل الإدخالات المطبوعة .3D) لجميع أنواع الخلايا (الشكل 2). في الواقع ، لوحظت صلاحية 90٪ في آبار الألواح المكونة من 6 آبار (الشكل 2 أ والجدول 1) ، ولوحظت 91٪ في الإدخالات المطبوعة ثلاثية الأبعاد (الشكل 2 ب والجدول 1) ل KORS. كانت صلاحية HDMECs 85٪ في آبار اللوحة المكونة من 6 آبار (الشكل 2C والجدول 2) مقابل 86٪ في الإدخالات المطبوعة ثلاثية الأبعاد (الشكل 2D والجدول 2). تم حساب بيانات صلاحية الخلية بواسطة عداد الخلايا الآلي (جدول المواد) على النحو التالي: عدد الخلايا القابلة للحياة مقسوما على عدد الخلايا الكلية (الخلايا الميتة + الخلايا القابلة للحياة). تم الحصول على متوسط البيانات من خلال حساب النسبة المئوية للجدوى التي تم الحصول عليها في ست تجارب مستقلة تم فيها إجراء نسختين متماثلتين (انظر الجدول 1 والجدول 2).
أشارت هذه النتائج إلى أن الإدراج المطبوع 3D لم يغير سلوك الخلية أو صلاحيتها مقارنة بالثقافة المعتادة على ألواح 6 آبار. لذلك ، تم التحقق من صحة الإدخالات المطبوعة 3D كنموذج جديد للثقافة المشتركة.
تم تحليل المعلمات8 الموضحة سابقا للاتصال الخلوي غير المباشر. بالنسبة لجميع التجارب ، تم تنفيذ الثقافة المشتركة للإدراج المطبوع 3D باتباع البروتوكولات وفقا لظروف الثقافة الكلاسيكية (انظر العملالسابق 8).
أولا ، تم تقييم اتصالات الخلية غير المباشرة بين KORS و HDMECs في الإدخالات المطبوعة ثلاثية الأبعاد من خلال تحليل تكاثر الخلايا ومقارنتها بالطريقة الكلاسيكية باستخدام الوسائط المشروطة (الشكل 3). في وجود KORS في الإدخالات (+ KORS) ، زاد انتشار HDMEC بشكل كبير بمقدار 1.5 ضعف بعد 24 ساعة وبمقدار 3.1 أضعاف بعد 48 ساعة مقارنة بحالة التحكم بدون KORS (التحكم) (الشكل 3 أ). كانت هذه النتائج متوافقة مع تلك التي تم الحصول عليها من خلال تجارب الوسائط المشروطة (الشكل 3 ب). في الواقع ، تبين أن KORSCM يزيد بشكل كبير من انتشار HDMEC بمقدار 1.5 ضعف بعد 24 ساعة وبمقدار 2.1 ضعف بعد 48 ساعة.
تم اختبار نموذج الثقافة المشتركة للإدراج المطبوع 3D لتحديد تأثير KORS على انتقال HDMEC. تم إثبات هذا التأثير سابقا في نظام الثقافة المشتركة الكلاسيكي باستخدام الوسائط المشروطة8 (الشكل 4). في حالة التحكم بدون KORS (التحكم) ، هاجرت HDMECs وغطت حوالي 44٪ من منطقة الجرح بعد 24 ساعة (الشكل 4 أ). في وجود KORS (+ KORS) ، لوحظت زيادة قوية وكبيرة في هجرة HDMEC. في الواقع ، أظهرت حركية التئام الجروح أن 43٪ و 67٪ و 99٪ من منطقة الجرح كانت مغطاة ب HDMECs بعد 3 ساعات و 12 ساعة و 24 ساعة على التوالي. كانت هذه النتائج متوافقة مع تلك التي تم الحصول عليها سابقا8 ، حيث تبين أن KORSCM يزيد من انتقال HDMEC بطريقة مماثلة (الشكل 4B).
الشكل 1: سير عمل يوضح تنفيذ الثقافة المشتركة للإدراج المطبوع ثلاثي الأبعاد من التنظيف إلى إعادة تدوير الملحق. (أ) صورة تمثيلية للملحق المطبوع ثلاثي الأبعاد. (ب) يوضح مثال تمثيلي للمقايسات المعروضة في هذه المخطوطة. لاحظ أنه يمكن إجراء اختبار الانتشار في حجرة واحدة من الإدراج المطبوع ثلاثي الأبعاد بالتوازي مع اختبار الترحيل الذي يتم إجراؤه في الحجرة الأخرى باستخدام جهاز غرفتي ترحيل موضوعين في الأجزاء الأخرى من الإدخالات المطبوعة ثلاثية الأبعاد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: صلاحية KORS و HDMEC. (أ ، ب) مورفولوجيا KORS (10x) في (أ) بئر من لوحة 6 آبار و (ب) في ملحق مطبوع 3D. (ج، د) مورفولوجيا HDMEC (10x) في (C) بئر من لوحة 6 آبار و (D) في ملحق مطبوع ثلاثي الأبعاد. شريط المقياس: 200 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: تأثير KORS على انتشار HDMEC. (أ) تم قياس انتشار HDMEC بواسطة المقايسة اللونية باستخدام صبغة WST-1 في الملحق المطبوع ثلاثي الأبعاد في غياب KORS (التحكم = CTRL) أو في وجود KORS (+ KORS) لمدة 24 ساعة أو 48 ساعة. (ب) تم قياس انتشار HDMEC بواسطة المقايسة اللونية باستخدام صبغة WST-1 في وجود وسط زراعة الخلايا القاعدية ECM أو KORSCM لمدة 24 ساعة أو 48 ساعة. يتم التعبير عن النتائج كمتوسط ± SEM ، n = 8 مكررات ، وتم إجراء تجربتين مستقلتين. * p < 0.05 و ***p < 0.001 و ****p < 0.0001 و *****p < 0.00001. تم احتضان KORS في ECM بدون FBS وعوامل النمو. بعد 48 ساعة ، تم جمع هذا الوسيط المكيف وتخزينه عند -80 درجة مئوية للتجارب. تم تعديل هذا الرقم من 8 واستنسخه بإذن. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تأثير KORS على انتقال HDMEC. (أ) يتم عرض ترحيل HDMEC في الملحق المطبوع 3D في غياب KORS (التحكم = CTRL) أو في وجود KORS (+ KORS) وقياسه كميا كنسبة مئوية من الاسترداد. (ب) يتم عرض ترحيل HDMECs في ECM أوKORS CM وقياسه كميا كنسبة مئوية للاسترداد. تم التعبير عن النتائج كمتوسط ± SEM ، n = 3 مكررات ، وتم تحليل ثلاثة حقول لكل نسخة متماثلة ، وتم إجراء تجربتين مستقلتين. ** ص < 0.01 ، ***** ص < 0.00001. شريط الميزان: 200 ميكرومتر. تم احتضان KORS في ECM بدون FBS وعوامل النمو. بعد 48 ساعة ، تم جمع هذا الوسط المكيف وتخزينه عند -80 درجة مئوية للتجارب. تم تعديل هذا الرقم من 8 واستنسخه بإذن. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| عد 1 | عد 2 | دني | المتوسط الكلي | ||
| لوحة 6 آبار | النسخ المتماثل 1 | 95% | 84% | 90% | 90% |
| النسخ المتماثل 2 | 90% | 88% | 89% | ||
| النسخ المتماثل 3 | 85% | 89% | 87% | ||
| النسخ المتماثل 4 | 97% | 89% | 93% | ||
| النسخ المتماثل 5 | 88% | 94% | 91% | ||
| النسخ المتماثل 6 | 86% | 92% | 89% | ||
| 3D إدراج المطبوعة | النسخ المتماثل 1 | 92% | 89% | 91% | 91% |
| النسخ المتماثل 2 | 91% | 80% | 86% | ||
| النسخ المتماثل 3 | 93% | 92% | 93% | ||
| النسخ المتماثل 4 | 94% | 98% | 96% | ||
| النسخ المتماثل 5 | 88% | 86% | 87% | ||
| النسخ المتماثل 6 | 93% | 97% | 95% |
الجدول 1: قياس صلاحية KORS. تم قياس صلاحية KORS في بئر من لوحة 6 آبار وفي ملحق مطبوع 3D باستخدام تلطيخ أزرق trypan والعد التلقائي.
| عد 1 | عد 2 | دني | المتوسط الكلي | ||
| لوحة 6 آبار | النسخ المتماثل 1 | 90% | 88% | 89% | 85% |
| النسخ المتماثل 2 | 79% | 78% | 79% | ||
| النسخ المتماثل 3 | 71% | 75% | 73% | ||
| النسخ المتماثل 4 | 86% | 82% | 84% | ||
| النسخ المتماثل 5 | 91% | 88% | 90% | ||
| النسخ المتماثل 6 | 99% | 94% | 97% | ||
| 3D إدراج المطبوعة | النسخ المتماثل 1 | 99% | 86% | 93% | 86% |
| النسخ المتماثل 2 | 80% | 75% | 78% | ||
| النسخ المتماثل 3 | 79% | 80% | 80% | ||
| النسخ المتماثل 4 | 98% | 85% | 92% | ||
| النسخ المتماثل 5 | 85% | 78% | 82% | ||
| النسخ المتماثل 6 | 89% | 93% | 91% |
الجدول 2: قياس صلاحية HDMEC. تم قياس صلاحية HDMEC في بئر من لوحة 6 آبار وفي ملحق مطبوع 3D باستخدام تلطيخ أزرق trypan والعد التلقائي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
عادة ما يتم التحقيق في الاتصال الخلوي غير المباشر باستخدام الوسائط المكيفة أو أجهزة نظام الثقافة المشتركة. يستغرق تحضير الوسائط المشروطة وقتا طويلا في المراحل الأولى من التجارب ، وتقتصر هذه الطريقة على تحليلات التأثير من جانب واحد. الدراسة السابقة التي أجراها كولين بيير وآخرون.8 باستخدام وسائط مشروطة أجريت على اتصال الخلية غير المباشر بين نوعين من الخلايا (HDMECs و KORS). أظهرت بيانات هذه الدراسة السابقة تأثير الوسائط المكيفة KORS على انتشار HDMEC وتأثير الوسائط المشروطة KORS على انتقال HDMEC وتكوين الأنبوب الكاذب وتعبير GPC18. في هذه الدراسة ، تم وصف طريقة أبسط وأسرع للتحقيق في اتصال الخلية غير المباشر. في الواقع ، تسمح الإدخالات المطبوعة 3D بالمرونة في التصميم التجريبي ومجموعات متعددة من ثقافة الخلية. للتحقق من صحة هذه الإدخالات المطبوعة 3D كنموذج للثقافات المشتركة ، تم تحليل تكاثر الخلايا وهجرة الخلايا ومقارنتها بالدراسة السابقة باستخدام الوسائطالمشروطة 8. في كلتا الدراستين ، تم إجراء اختبار التئام الجروح باستخدام جهاز غرفتي ترحيل (Culture-Insert 2 Well in μ-Dish 35 mm) تم وضعه في البئر الذي يحتوي أو لا يحتوي على الإدخال. يختلف جهاز اختبار الهجرة هذا 9,10 عن مقايسات الصفر11,12 من خلال حقيقة أن البصمة التي خلفها الجدار (محاكاة الجرح) التي تحدد الغرفتين ثابتة. لذلك ، فهي قابلة للتكرار بدرجة كبيرة. أدت نتائج الدراسة الحالية إلى استنتاج مماثل مقارنة بتجارب الوسائط المشروطة. لا تغير الإدخالات المطبوعة 3D سلوك الخلية ويتم تكييفها لعمل طبقات حجرة مستقلة تعزز التصاق الخلية. ومع ذلك ، فإن إدراج 3D المطبوعة تسمح أيضا لجعل طلاء مع بولي هيما ، على سبيل المثال ، للحث على انخفاض التعلق لثقافة كروية / عضوية. تم التحقيق هنا في الاتصال غير المباشر بين HDMECs و KORS كمثال على التطبيقات المتعددة التي توفرها الإدخالات المطبوعة 3D.
ينطبق هذا الجهاز الجديد على أنواع الخلايا الملتصقة التي تتطلب أو لا تتطلب طلاءا معينا ، ويوفر توفيرا كبيرا للوقت لإنشاء نموذج الثقافة المشتركة. في الواقع ، تسمح الأجزاء الأربعة للإدخالات المطبوعة ثلاثية الأبعاد بزراعة عدة أنواع من الخلايا في طبقة أحادية أو ثلاثية الأبعاد (مجاميع أو كروية) في نفس البئر مع مجموعات مختلفة. على سبيل المثال ، يمكن تحليل الاتصال غير المباشر لأربعة أنواع من الخلايا في طبقة واحدة ، في 3D (كروية) ، أو مزيج من الاثنين معا. خلال التجارب ، تم استزراع الكرات في إدخالات مطبوعة 3D باستخدام طلاء بولي HEMA (البيانات غير معروضة). تتكون الكرويات من خلايا مصنفة في 3D بسبب لوحة ربط منخفضة التعلق ونقلها بعد 48 ساعة إلى الملحق المطبوع ثلاثي الأبعاد للتحليل. بعد عدة أيام من الثقافة ، لوحظ نمو الكروية. توضح هذه النتائج أنه يمكن استخدام الملحق المطبوع ثلاثي الأبعاد لمتابعة نمو الخلايا ثلاثية الأبعاد بعد نقل الأجسام الكروية بنفس الطريقة كما في لوحة الثقافة13,14. علاوة على ذلك ، يمكن وضع مزيج من أنواع الخلايا المختلفة معا في نفس الحجرة في 2D أو 3D (المواد العضوية) لدراسة كل من الاتصالات الخلوية المباشرة وغير المباشرة. في الواقع ، فإن النطاق الواسع للنمطية التي توفرها الإدخالات المطبوعة 3D يميز نظام الثقافة المشتركة للخلايا المبتكر هذا. بالإضافة إلى ذلك ، يسمح وجود نوافذ الاتصال بالاستخدام في وسيط مشترك لجميع أنواع الخلايا في وقت محدد دون مساعدة الوسائط المكيفة. وبالتالي ، لا تنطبق هذه التقنية على الخلايا المزروعة في التعليق. تسمح الجدران التي تفصل بين المقصورات الأربع ببذر وحصاد وتحليل كل نوع من أنواع الخلايا بشكل مستقل عن الأنواع الأخرى. يمكن إجراء العديد من التطبيقات ، مثل فحوصات تكوين الأنبوب الكاذب وانتشاره ، والهجرة ، والحمض النووي ، والحمض النووي الريبي ، والبروتين ، وغيرها من التحليلات. توفر الإدخالات المطبوعة 3D أيضا إمكانية تحليل تأثير الجزيئات أو الحويصلات خارج الخلية ، على سبيل المثال. علاوة على ذلك ، فإن حقيقة أن هذه الإدخالات تم إجراؤها بواسطة الطباعة 3D توفر إمكانيات عديدة لتخطيط المقصورة والعديد من المقايسات الوظيفية.
ومع ذلك ، يجب النظر بعناية في الخطوة الحاسمة المتمثلة في ختم إدراج 3D المطبوع في اللوحة. في الواقع ، فإن إعادة التقسيم المتجانس للسيليكون أمر بالغ الأهمية لضمان الختم ومنع تسرب وسط أو خلايا زراعة الخلايا من حجرة إلى أخرى. لتجنب أي مشاكل ، يجب على المرء التأكد من أن السيليكون يغطي جزء من إدراج 3D المطبوعة التي ستكون على اتصال مع لوحة. قبل بذر الخلايا ، يجب على المرء التحقق من الختم الصحيح عن طريق إضافة وسط زراعة الخلايا إلى حجرة واحدة ومراقبة عدم وجود تسرب متوسط في المقصورات الأخرى. يعد وقت تجفيف السيليكون بعد الحضانة في حمام الإيثانول بنسبة 70٪ خطوة حاسمة أيضا. في الواقع ، يمكن أن تؤدي الآثار المتبقية للكحول إلى تثبيت الخلايا والسمية. لتجنب أي مشاكل ، يجب احترام وقت التجفيف.
في الختام ، تتوافق الإدخالات المطبوعة ثلاثية الأبعاد مع معظم أنواع الخلايا الملتصقة للثقافة في 2D أو 3D وتسمح بالعديد من طرق التجريب. يمكن تكييفها للعديد من دراسات الثقافة المشتركة وقد توفر أداة جديدة للتحقيق في الاتصال الخلوي غير المباشر. الإدخالات المطبوعة 3D قابلة للتعديل ومرنة وقابلة للتطوير ويمكن استخدامها لتصميم نماذج تجريبية لدراسات الأمراض الفسيولوجية مثل علم السرطان أو علم المناعة أو تكوين الأوعية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود مصالح مالية متنافسة.
Acknowledgments
تم إجراء هذه الدراسة بالتعاون مع BASF Beauty Care Solutions. السيدة تشارلي كولين بيير هي زميلة دكتوراه ممولة من BASF / CNRS.
نود أن نشكر السيد مهدي سلامي على تصور إدراج 3D المطبوعة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Autoclave | Getinge | APHP | Solid cycle, 121 °C for 20 min |
| Biomed Clear | Formlabs | RS-F2-BMCL-01 | Impression performed by 3D-Morphoz company (Reims, France) |
| Cell culture detergents | Tounett | A18590/0116 | |
| Cell Proliferation Reagent WST-1 | Roche | 11,64,48,07,001 | |
| Counting slide | NanoEnTek | EVE-050 | |
| Culture-Insert 2 Well in μ-Dish 35 mm | Ibidi | 80206 | two-migration chambers device. |
| Endothelial cell medium | ScienCell | 1001 | Basal medium +/- 25 mL of fetal bovine serum (FBS, 0025), 5 mL of endothelial cell growth supplement (ECGS, 1052), and 5 mL of penicillin/streptomycin solution (P/S, 0503). |
| EVE Automated cell counter | NanoEnTek | NESCT-EVE-001E | |
| EVOS XL Core | Fisher Scientific | AMEX1200 | 10x of magnification |
| Food silicon reagent and catalyst kit | Artificina | RTV 3428 A and B | (10:1) |
| FORM 3B printer | Formlabs | PKG-F3B-WSVC-DSP-BASIC | Impression performed by 3D-Morphoz company |
| Human Dermal Microvascular Endothelial Cells (HDMEC) | ScienCell | 2000 | |
| Keratinocytes of Outer Root Sheath (KORS ) | ScienCell | 2420 | |
| Macro Wound Healing Tool Software | ImageJ | Software used for the measurement of the uncovered surface (for migration assays) | |
| Mesenchymal stem cell medium | ScienCell | 7501 | Basal medium +/-25 mL of fetal bovine serum (FBS, 0025), 5 mL of mesenchymal stem cell growth supplement (MSCGS, 7552), and 5 mL of penicillin/streptomycin solution (P/S, 0503) |
| Microplate reader SPECTRO star NANO | BMG Labtech | BMG LABTECH software | |
| PBS | Promocell | C-40232 | Without Ca2+ / Mg2+ |
| Trypan Blue Stain | NanoEnTek | EBT-001 | |
| Trypsin / EDTA | Promocell | C-41020 | Incubation of KORS at 37 °C with 5% CO2 for 5 min. Incubation of HDMECs for 5 min at room temperature |
| 96-well plate Nunclon Delta Surface | Thermoscientific | 167008 |
References
- Regier, M. C., Alarid, E. T., Beebe, D. J. Progress towards understanding heterotypic interactions in multi-culture models of breast cancer. Integrative Biology. 8 (6), 684-692 (2016).
- Doğan, A., Demirci, S., Apdik, H., Apdik, E. A., Şahin, F. Mesenchymal stem cell isolation from pulp tissue and co-culture with cancer cells to study their interactions. Journal of Visualized Experiments. (143), e58825 (2019).
- Lin, J., et al. Long non-coding RNA UBE2CP3 enhances HCC cell secretion of VEGFA and promotes angiogenesis by activating ERK1/2/HIF-1α/VEGFA signalling in hepatocellular carcinoma. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 37 (1), 113 (2018).
- Soares, N. L., et al. Carbon monoxide modulation of microglia-neuron communication: Anti-neuroinflammatory and neurotrophic role. Molecular Neurobiology. 59 (2), 872-889 (2022).
- Al Halawani, A., Abdulkhalek, L., Mithieux, S. M., Weiss, A. S. Tropoelastin promotes the formation of dense, interconnected endothelial networks. Biomolecules. 11 (9), 1318 (2021).
- Mercatali, L., et al. Development of a human preclinical model of osteoclastogenesis from peripheral blood monocytes co-cultured with breast cancer cell lines. Journal of Visualized Experiments. (127), e56311 (2017).
- Orona, N. S., Astort, F., Maglione, G. A., Yakisich, J. S., Tasat, D. R. Direct and indirect effect of air particles exposure induce Nrf2-dependent cardiomyocyte cellular response in vitro. Cardiovascular Toxicology. 19 (6), 575-587 (2019).
- Colin-Pierre, C., et al. The glypican-1/HGF/C-met and glypican-1/VEGF/VEGFR2 ternary complexes regulate hair follicle angiogenesis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 781172 (2021).
- Toubal, A., et al. The NC1 domain of type XIX collagen inhibits melanoma cell migration. European Journal of Dermatology. 20 (6), 712-718 (2010).
- Wu, A. -L., et al. Role of growth factors and internal limiting membrane constituents in müller cell migration. Experimental Eye Research. 202, 108352 (2021).
- Oudart, J. -B., et al. Plasmin releases the anti-tumor peptide from the NC1 domain of collagen XIX. Oncotarget. 6 (6), 3656-3668 (2015).
- Martinotti, S., Ranzato, E.
- Cattin, S., Ramont, L., Rüegg, C. Characterization and in vivo validation of a three-dimensional multi-cellular culture model to study heterotypic interactions in colorectal cancer cell growth, invasion and metastasis. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 97 (2018).
- Ma, Y. N., et al. Three-dimensional spheroid culture of adipose stromal vascular cells for studying adipogenesis in beef cattle. Animal. 12 (10), 2123-2129 (2018).
