Summary
במאמר זה, עלון מודפס תלת-ממדי שעוצב לאחרונה מוצג כמודל של תרבית משותפת ומאומת באמצעות המחקר של התקשורת הבין-תאית הפרקרינית בין תאי אנדותל וקרטינוציטים.
Abstract
הניתוחים הקלאסיים של תקשורת עקיפה בין סוגי תאים שונים מחייבים שימוש במדיה מותנית. יתר על כן, הייצור של מדיה מותנית נשאר זמן רב רחוק תנאים פיזיולוגיים פתולוגיים. למרות שכמה מודלים של תרבית משותפת זמינים מסחרית, הם נשארים מוגבלים לבדיקות ספציפיות והם מיועדים בעיקר לשני סוגים של תאים.
כאן, תוספות מודפסות 3D משמשים כי הם תואמים בדיקות פונקציונליות רבות. התוספת מאפשרת הפרדה של באר אחת של צלחת 6 בארות לארבעה תאים. ניתן להגדיר מגוון רחב של שילובים. יתר על כן, חלונות מתוכננים בכל קיר של התאים כך שתקשורת בין-תאית פוטנציאלית בין כל תא אפשרית במדיום התרבות באופן תלוי נפח. לדוגמה, תקשורת בין-תאית פרקרינית יכולה להיחקר בין ארבעה סוגי תאים בחד-שכבתיים, בתלת-ממד (ספרואידים), או על ידי שילוב של שניהם. בנוסף, ניתן לזרוע תערובת של סוגי תאים שונים באותו תא בפורמט דו-ממדי או תלת-ממדי (אורגנואידים). היעדר תחתית בתוספות המודפסות בתלת-ממד מאפשר את תנאי התרבית הרגילים על הלוח, ציפוי אפשרי על הלוח המכיל את העלון, והדמיה ישירה במיקרוסקופ אופטי. התאים המרובים מאפשרים לאסוף סוגי תאים שונים באופן עצמאי או להשתמש, בכל תא, בריאגנטים שונים למיצוי RNA או חלבונים. במחקר זה, ניתנת מתודולוגיה מפורטת לשימוש בעלון החדש המודפס בתלת-ממד כמערכת תרבות משותפת. כדי להדגים מספר יכולות של מודל גמיש ופשוט זה, בדיקות פונקציונליות שפורסמו בעבר של תקשורת תאית בוצעו בתוספות החדשות שהודפסו בתלת-ממד והודגמו כניתנות לשחזור. התוספות שהודפסו בתלת-ממד ותרבית התאים הקונבנציונלית באמצעות מדיה מותנית הובילו לתוצאות דומות. לסיכום, העלון המודפס בתלת-ממד הוא מכשיר פשוט שניתן להתאים לדגמים רבים של תרביות משותפות עם סוגי תאים דבקים.
Introduction
In vivo, תאים מתקשרים זה עם זה באופן ישיר (מגע עם התא) או בעקיפין (על ידי הפרשת מולקולות). כדי לחקור תקשורת תאים, ניתן לפתח מודלים שונים של תרביות משותפות, כגון תרבית משותפת ישירה (סוגי התאים השונים נמצאים באינטראקציה ישירה באותה באר) ותרבית משותפת ממודרת (סוגי התאים השונים נמצאים באינטראקציה עקיפה בתאים שונים של מערכת תרבית)1. יתר על כן, מדיה מותנית יכולה לשמש למערכות תרבית משותפת, שבהן האינטראקציה העקיפה מתאפשרת על ידי מולקולות מופרשות הכלולות במדיה המותנית של סוג תא משפיע המועברות לתא מגיבמסוג 1.
במקרה של מחקרי תקשורת תאים פרקרינית, מערכות תרבית משותפת עקיפות מספקות מודלים המשקפים באופן חזק אינטראקציות תאים in vivo. מערכות תרבות משותפת עקיפה פותחו ומוסחרו, ומאפשרות הקמת מודלים עקיפים של תרבות משותפת 2,3. למרבה הצער, רוב מערכות התרבות המשותפת העקיפות מספקות רק שני תאים. מערכות תרבות משותפת עקיפות אחרות מספקות תאים מרובים, אך הם פחות ניתנים להרחבה בהשוואה למערכת המדווחת בכתב היד הנוכחי. חלקם אינם מאפשרים הדמיה קלאסית תחת מיקרוסקופ, והם מציגים לעתים קרובות שיטות יישום ספציפיות. במספר מחקרים, התקשורת הפרקרינית בין סוגי תאים שונים נבדקת על ידי מודל המדיה המותנית 4,5,6,7. זוהי דרך חקירה קלה יותר בהשוואה למערכות עקיפות של תרבות משותפת מכיוון שהיא אינה מחייבת שיטות או חומרים ספציפיים כדי לבסס1. מצד שני, הכנת מדיה מותנית גוזלת זמן ומספקת מידע רק על איתות סלולרי חד-כיווני (משפיע למגיב)1.
במאמר זה מוצעת דרך חדשה ופשוטה לחקור תקשורת תאית. מאפשר שילוב של מספר סוגי תאים באינטראקציה ישירה או עקיפה ובפורמטים דו-ממדיים או תלת-ממדיים, התוספות המודפסות מציגות יתרונות רבים להגדרת מודלים של תרבות משותפת בקלות. התוספת המודפסת בתלת-ממד, המותאמת להצבה בבארות של לוחות 6 בארות, היא מעגלית ומאפשרת הפרדה של הבאר לארבעה תאים (שני תאים גדולים ושני תאים קטנים; איור 1A). התוספות המודפסות בתלת-ממד מאופיינות בהיעדר תחתית. לפיכך, התאים נמצאים במגע ישיר עם הצלחת שעליה ממוקם העלון. בנוסף, ניתן לצפות כל תא בנפרד מהאחרים. יתר על כן, ניתן לעקוב בקלות אחר התנהגות התא תחת מיקרוסקופים אופטיים. נוכחותם של חלונות תקשורת בכל קיר של הכנס מאפשרת תוספת, בזמן אופטימלי, של מדיום משותף לביצוע ניסויים שונים של תרבות משותפת. שילובים רבים של תרביות משותפות יכולים להתבצע כדי לחקור תקשורת ישירה ו / או עקיפה בין מספר סוגי תאים. לדוגמה, ניתן לתכנן מודל של תרבית משותפת עקיפה בין ארבעה סוגי תאים שונים בחד-שכבה ו/או בתלת-ממד (ספרואידים). שילוב של מודלים ישירים ועקיפים של תרביות משותפות יכול להתבצע גם על ידי ערבוב סוגי תאים שונים באותו תא. ההשפעה של מבנים מורכבים (אורגנואידים, צמחי רקמות וכו ') על סוגי תאים שונים יכולה להיות דוגמה נוספת למודלים שניתן ליצור. יתר על כן, התוספות המודפסות בתלת-ממד תואמות לבדיקות פונקציונליות של ביולוגיה של התא (התפשטות, הגירה, היווצרות פסאודו-צינורות, התמיינות וכו ') ולבדיקות ביוכימיות (מיצוי DNA, RNA, חלבון, שומנים וכו '). לבסוף, התוספות המודפסות בתלת-ממד מספקות מגוון רחב של סכמות ניסיוניות של מודלים של תרבות משותפת עם אפשרות לשלב בו זמנית בדיקות שונות באותו ניסוי בתאים השונים.
חלק מהיכולות של התוספות המודפסות בתלת-ממד מוצגות כדי לאמת אותן כמודל מהיר וקל לשימוש של תרבות משותפת. בהשוואה למחקר שפורסם בעבר שנערך על תקשורת תאים פרקרינית, הודגמה היכולת של התוספות המודפסות בתלת-ממד להיות מודל תרבית משותפת בעל ערך. כדי להעריך נקודה זו, הושוותה ויסות התרבות תאי אנדותל ונדידתם על ידי קרטינוציטים בין מערכת ההחדרה המודפסת בתלת-ממד לבין המערכת הקלאסית באמצעות מדיה מותנית. התוספות המודפסות בתלת-ממד מאפשרות קבלת תוצאות דומות במהירות בהשוואה למערכת הקונבנציונלית המשתמשת במדיה מותנית. ואכן, התוספות המודפסות בתלת-ממד מספקות מודל חזק לחקר אינטראקציות תאים בשני הכיוונים ללא צורך לייצר מדיה מותנית ועם אפשרות לבצע במקביל את מבחני ההתרבות והנדידה באותו ניסוי.
לסיכום, במאמר זה, מוצע מודל חדש ומוכן לשימוש לחקר תקשורת תאית. תואמות לכל סוגי התאים הדבקים, התוספות המודפסות בתלת-ממד מאפשרות לבצע שילובים רבים של תרביות משותפות שמטרתן להיות קרובות יותר לתנאי in vivo .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: התוספות התלת-ממדיות (איור 1A) נרכשות באופן מסחרי ומודפסות באמצעות שרף פוטופולימרי שתואם ביולוגית לתרביות תאים ולאוטוקלאבינג (ראו טבלת חומרים). בחלק זה מתואר פרוטוקול מפורט לביסוס מודל התרבות המשותפת באמצעות תוספות (ראו איור 1B). כמה דוגמאות של יישומים מסופקים גם.
1. מיקום התוספת המעוקרת בצלחות 6 בארות
- ערבבו את שני הרכיבים המסופקים בערכה (ראו טבלת חומרים), סיליקון מזון (מגיב A) וזרז (מגיב B), ביחס של 10:1 (v/v) בהתאם להוראות היצרן. (איור 1Ba). השתמש במרית מעוקרת אתנול 70% כדי לערבב את שני המרכיבים.
הערה: נפח תערובת הסיליקון שיש להכין תלוי במספר התוספות שיש לתקן. עודף של זרז יכול לגרום לתערובת הסיליקון להתמצק מהר מדי. - מרחו את התוספות על תערובת הסיליקון עם פינצטה כך שהתערובת תפוזר בצורה הומוגנית בקצה התחתון של התוספות (איור 1Bb). הכניסו את התוספות לבארות של צלחת בעלת 6 בארות והפעילו לחץ עדין על התוספות כדי להבטיח שהתוספות נמצאות במגע הדוק עם הצלחת כדי למנוע דליפה של מדיום תרבית התאים (איור 1Bc).
- הניחו את הצלחת בטמפרטורה של 37°C כדי לתמוך בתהליך ההתמצקות של הסיליקון למשך שעה אחת.
הערה: זמן ההתמצקות תלוי בכמות הזרז שנוסף. - לאחר המיצוק, לעקר את הצלחות עם תוספות על ידי טבילתם באמבט אתנול 70% במשך 30 דקות עד 1 שעות.
- יש להשליך את האלכוהול על ידי פיפטינג ולתת לצלחת להתייבש (המכסה נפתח) למשך הלילה במכסה מנוע של תרבית תאים.
הערה: יש לאדות את האלכוהול במלואו לפני ביצוע השלב הבא כדי למנוע קיבוע תאים ורעילות. את הצלחת המוכנה לשימוש המכילה את התוספות ניתן לאחסן מספר ימים לפני השימוש בתנאים יבשים וסטריליים בטמפרטורת החדר.
2. ציפויים כגון פולי-ל-ליזין, או פולי-HEMA (שלב אופציונלי)
הערה: ציפוי אינו מבוצע בניסוי זה, והשלבים ניתנים כדי ליידע לגבי האפשרות של ציפוי התוספות.
- הכינו את תמיסת הציפוי בהתאם להוראות היצרן.
- שקול נפח של 200-400 μL עבור התאים הגדולים ביותר ונפח של 50-100 μL עבור התאים הקטנים ביותר עבור ציפוי של העלון. הוסיפו את תמיסת הציפוי לתאים הנפרדים.
- יש לתת לציפוי להתייבש כפי שצוין על ידי היצרן בתנאים סטריליים.
3. זריעת התאים
- תרבית את הקרטינוציטים של מעטפת השורש החיצוני (KORS) ותאי אנדותל מיקרו-וסקולריים עוריים אנושיים (HDMECs) לפי המלצת היצרן. הכינו את תרחיף התא ברגע שהתאים מגיעים למפגש.
- השליכו את התווך מהצלוחיות והוסיפו 5 מ"ל טריפסין כדי לנתק את התאים (ראו טבלת חומרים).
- מניחים את הבקבוק המכיל את KORS בטמפרטורה של 37°C עם 5% CO2 למשך 5 דקות. יש לדגור על הבקבוק המכיל את ה-HDMECs למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- ערבבו את תמיסת הטריפסין המכילה את KORS עם 5 מ"ל של תווך תאי גזע מזנכימליים (MSCM) בתוספת 5% נסיוב בקר עוברי (FBS) וגורמי גדילה (מדיום בסיסי עם ערכת תוספים, ראו טבלת חומרים). ערבבו את תמיסת הטריפסין המכילה את ה-HDMECs עם 5 מ"ל של תווך תאי אנדותל (ECM) בתוספת 5% FBS וגורמי גדילה (ראו טבלת חומרים).
- מעבירים את התאים לתוך 15 מ"ל של צינור חרוטי סטרילי. צנטריפוגה את מתלי KORS ו-HDMEC במהירות של 200 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- השליכו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את התאים ב-2 מ"ל של המדיום המתאים.
- מערבבים 10 μL של תרחיף התא עם 10 μL של צבע כחול טריפאן (ראה טבלת חומרים).
- הוסף 10 μL של תערובת לתוך התא של שקופית הספירה.
- הכנס את שקופית הספירה למערכת ספירת התאים (ראה טבלת חומרים) וזהה את מספר התא ואת הכדאיות.
- הכינו את תרחיף התא בריכוז של 0.5 x 105 תאים/מ"ל בתווך המתאים.
הערה: אם סוגי התאים השונים דורשים זמני היצמדות שונים ו/או כדי להגיע למפגש האידיאלי, ניתן לבצע את זריעת התאים בנקודות זמן שונות בהתאם לסוגי התאים.
- מפזרים 800 μL עד 1 מ"ל של תרחיף התא לתוך תאים גדולים בודדים ו 100-150 μL לתוך תאים קטנים בודדים עם פיפטה.
- זרעו את KORS ב 1 x 105 תאים / מ"ל ב MSCM בתוספת 5% FBS וגורמי גדילה באחד התאים הגדולים.
- HDMEC זרעים ב- ECM בתוספת FBS 5% וגורמי גדילה ב- 2.5 x 103 תאים / מ"ל בתאים הקטנים וב- 1.25 x 105 תאים / מ"ל בתא הגדול האחר.
הערה: ניתן לבצע את בדיקת ההתפשטות בתאים הקטנים, ואת מבחני הנדידה והכדאיות ניתן לבצע בתאים הגדולים. ריכוז התאים שנזרעו הותאם בהתאם להמלצות היצרן. ריכוז זה מאפשר כדאיות טובה של התאים לאחר 24-48 שעות של דגירה.
- הניחו את צלחת תרבית התאים בטמפרטורה של 37°C עם 5%CO2 או בתנאים הרגילים כדי לאפשר היצמדות ו/או הבשלה של התא.
הערה: דגרו על התאים במשך 24-48 שעות מבלי לשנות את המדיה. במידת הצורך, ניתן להחליף את המדיום של התאים באופן עצמאי.
4. יישום התרבות המשותפת (איור 1Bd)
הערה: יישום התרבות המשותפת מתאים לזמן שבו נוסף המדיום המשותף. הוספת מדיום ייחודי לכל סוגי התאים בתאים השונים מספקת אפשרות לתקשורת פרקרינית בין התאים בשל נוכחותם של חלונות תקשורת (חורים ביציים בדפנות התוספות המודפסות בתלת מימד). כדי ליישם את התרבות המשותפת, בצע את השלבים 4.1-4.3.
- רוקנו את אמצעי התרבות מהתאים השונים של התוספות באמצעות פיפטה. במקרה של תרבית תאים ספרואידית תלת ממדית, השליכו את המדיום בעדינות רבה.
- שטפו את התאים עם 1 מ"ל של PBS חם 37°C בתאים הגדולים ו-200 μL של PBS חם 37°C בתאים הקטנים. הקפידו על שטיפה עדינה כדי לא לנתק את התאים.
- הוסף 3 מ"ל של מדיום משותף שנבחר כדי להיות תואם לכל סוגי התאים.
הערה: במחקר זה, ECM הבסיסי (ללא FBS וגורמי גדילה) משמש. ודאו שהתווך מכסה את כל התאים (מפלס מעל חלונות התקשורת [חורים בקירות], כפי שמוצג באיור 1A). - הניחו את הצלחת המכילה את התרביות המשותפות בטמפרטורה של 37°C עם 5%CO2 למשך 24-48 שעות.
5. תצפית, ספירה וגירוד של תאים
- התבוננו במורפולוגיה וספרו את מספר התאים של התאים השונים במהלך הניסוי תחת מיקרוסקופ אופטי לאחר 24-48 שעות של דגירה.
הערה: מספר התאים הצפוי תלוי בסוגי התאים שבהם נעשה שימוש (גודל, מורפולוגיה וכו') ובגודל התא. בניסוי זה, בין 0.5 x 10 6-1 x 10 6 KORS/mL ובין 0.25 x 10 6-0.75 x 10 6 HDMECs/mL נספרים בתאים הגדולים. - נתקו את התאים באמצעות טריפסין לספירת תרחיף תאים.
הערה: עבור תמיסת ניתוק תאים, שקול נפח של 100-500 μL עבור התאים הגדולים ביותר ונפח של 10-50 μL עבור התאים הקטנים ביותר. - בדוק את הכדאיות באמצעות צביעה כחולה טריפאן (ראה שלבים 3.1.6-3.1.8).
6. הכנסת ניקוי למיחזור
- הסירו את התוספות מלוח 6 הקידוחים בסוף הניסוי באמצעות פיתול קל (איור 1Be).
- הסר את הסיליקון מהתוספות על ידי משיכתו. במידת הצורך, השתמשו במרית כדי להסיר את שאריות הסיליקון שנדבק לדפנות התוספות (איור 1Bf).
- שטפו את התוספות עם חומרי ניקוי וחומרי ניקוי קונבנציונליים לתרבית תאים (דוגמה לכך מופיעה בטבלת החומרים).
- לעקר את התוספות לשימוש עתידי autoclave (מחזור מוצק, 121 ° C במשך 20 דקות) או על ידי טבילתם באמבט אתנול 70% במשך 1 שעה.
הערה: משלב זה, שתי דוגמאות של בדיקות אפשריות (מבחני ריבוי והעברה) מתוארות באמצעות התוספות המודפסות בתלת-ממד (איור 1Bd).
7. בדיקת התפשטות תאים - בדיקת WST-1
- בצע את שלבים 1-3.1 כדי לגדל את התאים בתרבית.
הערה: בצע את השלב בסעיף זה כדי ליישם את מערכת התרבות המשותפת כדי לחקור את ההשפעה של הפרשת KORS על התפשטות HDMEC. תאי KORS משמשים להשוואת הנתונים שפורסמו בעבר8.- זרעו את KORS ב 1 x 105 תאים / מ"ל במדיום תאי גזע מזנכימליים (MSCM) בתוספת 5% FBS וגורמי גדילה בתאים הגדולים.
- מניחים את צלחת תרבית התאים על 37 ° C עם 5% CO2 במשך 24 שעות.
- זרעו את ה-HDMECs בתאי אנדותל בינוניים (ECM) בתוספת FBS של 5% וגורמי גדילה ב-2.5 x 103 תאים/מ"ל בתאים הקטנים.
- מניחים את צלחת תרבית התאים ב 37 ° C עם 5% CO2 במשך 24-48 שעות.
- השליכו את המדיה מכל התאים ויישמו את מערכת התרבית המשותפת על ידי תוספת של 3 מ"ל של ECM בסיסי ללא תוספת (מדיום תרבית תאים נפוץ לכל התאים של התוספות המודפסות בתלת-ממד).
- דללו את WST-1 בתווך תרבית התאים המשותףEC M (דילול סופי ביחס של 1:10) להכנת תמיסת WST-1.
הערה: עבור נפח של תמיסת WST-1, הכן לפחות 500 μL של תמיסה נוספת עבור החסר. - יש להשליך את מדיום תרבית התאים מהעלון על ידי פיפטציה.
- הוסף את פתרון WST-1 לתאים שנבחרו (150 μL עבור התאים הקטנים ו- 600 μL עבור התאים הגדולים). שים את הצלחת על 37 ° C עם 5% CO2.
- לאחר זמן הדגירה האופטימלי של 30 דקות, העבירו 100 מיקרוליטר של מדיום הדגירה מכל מצב על צלחת של 96 בארות.
- הערך את התגובה הקולורימטרית באמצעות קורא microplate בין 420 ננומטר ל 480 ננומטר.
- שים את הצלחת על קורא microplate ולחץ על כפתור לערוך פרוטוקול חדש.
- בחר את הסוג הספציפי של לוח 96 בארות (ראה טבלת חומרים) המשמש ואת אורך הגל של 450 ננומטר.
- לחץ על כפתור התחל מדידה.
8. בדיקת נדידת תאים - מכשיר שני תאי נדידה
- בצע את שלבים 1-3.1 כדי לגדל את התאים בתרבית.
הערה: בצע את השלבים בסעיף זה כדי ליישם את מערכת התרבות המשותפת כדי לחקור את ההשפעה של הפרשת KORS על התפשטות HDMEC.- זרעו את KORS ב 1 x 105 תאים / מ"ל ב MSCM בתוספת 5% FBS וגורמי גדילה באחד התאים הגדולים.
- מניחים את צלחת תרבית התאים על 37 ° C עם 5% CO2 במשך 24 שעות.
- הכנס את התקן שני תאי ההעברה לתא הגדול השני של תוספות.
- זרעו את ה- HDMECs ב- ECM בתוספת FBS של 5% וגורמי גדילה ב 7 x 105 תאים / באר של שני תאי הנדידה.
- מניחים את צלחת תרבית התאים על 37 ° C עם 5% CO2 במשך 24 שעות.
- השליכו את המדיה ואת התקן שני תאי הנדידה לאחר 24 שעות או בזמן אופטימלי בהתאם לסוג התא הנודד. ליישם את מערכת התרבות המשותפת על ידי תוספת של 3 מ"ל של ECM בסיסי ללא השלמה.
הערה: המשך בזהירות כדי לא לנתק את התאים. אם התאים באמת רגישים לניתוק הנגרם על ידי הוספת התווך המשותף, משוך את התקן שני תאי הנדידה לאחר הוספת התווך המשותף.
- התבונן וצלם תמונה של פני השטח המכוסים על ידי התאים בנקודות זמן שונות תחת מיקרוסקופ ניגודיות פאזה בהגדלה של פי 10.
הערה: התמונות מצולמות במיקרוסקופ עם ניגודיות פאזה (ראה טבלת חומרים). התמונות נשמרות במפתח USB ולאחר מכן מנותחות על ידי תוסף הכלי לריפוי פצעים של התוכנה (ראה טבלת חומרים). - מדוד את פני השטח החשופים באמצעות תוכנת ניתוח כמותית קלאסית.
- פתח את התמונה בתוכנה והפעל את כלי ריפוי הפצעים הזמין ברשימת המאקרו.
- לחץ על כפתור m כדי למדוד את פני השטח החשופים של תמונת ההעברה.
- המשטח החשוף מחושב לפי הנוסחה הבאה:
אחוז הכיסוי = ([שטח ממוצע ללא תאים ב- T0 − אזור ללא תאים בזמן T]/אזור ממוצע ללא תאים ב- T0) × 100.
הערה: התוספות המודפסות בתלת-ממד מותאמות לחלוטין לרוב הטכניקות של ביולוגיה של התא (כגון בדיקת היווצרות צינור מדומה, תרביות תלת-ממדיות) ולניסויים ביוכימיים (כגון מיצוי DNA, RNA, חלבון).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בעבודה הנוכחית תוארה מערכת תרבות משותפת אופטימלית להשגת נתונים חזקים, אמינים ומשמעותיים הדומים לשיטות קלאסיות באמצעות שימוש במדיה מותנית. התוספות המודפסות בתלת-ממד מחקות את תנאי המיקרו-סביבה in vivo של סוגי תאים שונים באינטראקציה על ידי התגברות על הקשיים והייצור הגוזל זמן של מדיה מותנית במעלה הזרם בניסויים. מחקר שפורסם בעבר נערך מחדש כדי לנתח את האינטראקציות העקיפות בין שני סוגי תאים הנמצאים בזקיקי שיער: תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים אנושיים (HDMECs) וקרטינוציטים אנושיים של מעטפת השורש החיצוני (KORS)8. כאן, הודגמה יכולת השחזור של התוצאות המתקבלות באמצעות תוספות מודפסות בתלת-ממד בהשוואה לשיטה הקלאסית המשתמשת במדיה מותנית כדי לחקור אינטראקציות עקיפות בין HDMECs ו- KORS. תנאי תרבית התאים שתוארו קודם לכן במחקר8 היו זהים לאלה שבעבודה הנוכחית. הם הותאמו בהתחשב במידות התוספות המודפסות בתלת-ממד (ראה פרוטוקול). ראשית, הפנוטיפ ויכולת הקיום של התא היו דומים בין שני התנאים (מדיה מותנית .3D לעומת תוספות מודפסות) עבור כל סוגי התאים (איור 2). ואכן, 90% כדאיות נצפתה בבארות של לוחות 6 בארות (איור 2A וטבלה 1), ו-91% נצפתה בתוספות המודפסות בתלת-ממד (איור 2B וטבלה 1) עבור KORS. הכדאיות של HDMECs הייתה 85% בבארות של לוח 6 הקידוחים (איור 2C וטבלה 2) לעומת 86% בתוספות שהודפסו בתלת-ממד (איור 2D וטבלה 2). נתוני כדאיות התא חושבו על ידי מונה התאים האוטומטי (טבלת חומרים) באופן הבא: מספר התאים בני קיימא חלקי מספר התאים הכולל (תאים מתים + בני קיימא). הנתונים הממוצעים התקבלו על ידי חישוב אחוזי הכדאיות שהתקבלו בשישה ניסויים עצמאיים שבהם בוצעו שני עותקים משוכפלים (ראו טבלה 1 וטבלה 2).
תוצאות אלה הצביעו על כך שהעלון המודפס בתלת-ממד לא שינה את התנהגות התא או את יכולת הקיום שלו בהשוואה לתרבית רגילה על לוחות בעלי 6 בארות. לכן, התוספות המודפסות בתלת-ממד אומתו כמודל חדש של תרבות משותפת.
בעבר הודגמו פרמטרים8 של תקשורת סלולרית עקיפה נותחו. עבור כל הניסויים, יישום התרבות המשותפת בהדפסה תלת-ממדית מומש בהתאם לפרוטוקולים בהתאם לתנאי התרבות הקלאסית (ראה עבודה קודמת8).
ראשית, התקשורת התאית העקיפה בין KORS ו-HDMECs בתוספות המודפסות בתלת-ממד הוערכה על-ידי ניתוח התפשטות התאים והושוותה לשיטה הקלאסית באמצעות מדיה מותנית (איור 3). בנוכחות KORS בתוספות (+ KORS), התפשטות ה-HDMEC גדלה באופן משמעותי פי 1.5 לאחר 24 שעות ופי 3.1 לאחר 48 שעות בהשוואה למצב הבקרה ללא KORS (בקרה) (איור 3A). התוצאות האלה היו בהתאם לאלה שהתקבלו בניסויי מדיה מותנים (איור 3B). ואכן, KORSCM הוכח כמגביר באופן משמעותי את התפשטות HDMEC פי 1.5 לאחר 24 שעות ופי 2.1 לאחר 48 שעות.
מודל התרבות המשותפת של הוספה מודפסת בתלת-ממד נבדק כדי לקבוע את ההשפעה של KORS על העברת HDMEC. השפעה זו הודגמה בעבר במערכת התרבות המשותפת הקלאסית באמצעות מדיה מותנית8 (איור 4). במצב הבקרה ללא KORS (בקרה), HDMECs נדדו וכיסו כ-44% מאזור הפצע לאחר 24 שעות (איור 4A). בנוכחות KORS (+ KORS) נצפתה עלייה חזקה ומשמעותית בנדידת HDMEC. ואכן, הקינטיקה של ריפוי הפצע הראתה כי 43%, 67% ו -99% מאזור הפצע כוסו על ידי HDMECs לאחר 3 שעות, 12 שעות ו -24 שעות, בהתאמה. תוצאות אלה היו בהתאם לאלה שהתקבלו קודם לכן8, כאשר KORSCM הראה להגביר את נדידת HDMEC באופן דומה (איור 4B).
איור 1: זרימת עבודה המציגה את היישום של התרבות המשותפת של העלון המודפס בתלת-ממד מהניקוי ועד למיחזור העלון. (A) תמונה מייצגת של העלון המודפס בתלת-ממד. (ב) מובאת דוגמה מייצגת של הבדיקות המובאות בכתב יד זה. שים לב שניתן לבצע בדיקת ריבוי בתא אחד של העלון המודפס בתלת-ממד במקביל לבדיקת העברה המבוצעת בתא השני באמצעות התקן של שני תאי נדידה הממוקם בתאים האחרים של התוספות המודפסות בתלת-ממד. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: כדאיות KORS ו-HDMEC. (A,B) מורפולוגיית KORS (10x) ב-(A) באר של לוח בעל 6 בארות ו-(B) בעלון מודפס בתלת-ממד. (ג,ד) מורפולוגיית HDMEC (10x) ב-(C) באר של לוח 6 בארות ו-(D) בהוספה מודפסת בתלת-ממד. סרגל קנה מידה: 200 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: השפעת KORS על התפשטות HDMEC. (A) התפשטות HDMEC נמדדה על-ידי בדיקה קולורימטרית באמצעות צבע WST-1 בעלון המודפס בתלת-ממד בהיעדר KORS (בקרה = CTRL) או בנוכחות KORS (+ KORS) במשך 24 שעות או 48 שעות. (B) התפשטות HDMEC נמדדה על-ידי בדיקה קולורימטרית באמצעות צבע WST-1 בנוכחות מדיום תרבית תאי הבסיס ECM או KORSCM למשך 24 שעות או 48 שעות. התוצאות מבוטאות כממוצע ± SEM, n = 8 משוכפלים, ובוצעו שני ניסויים עצמאיים. *p < 0.05, ***p < 0.001, ****p < 0.0001 ו- *****p < 0.00001. ה- KORS הודגרו ב- ECM ללא FBS וגורמי צמיחה. לאחר 48 שעות, התווך המותנה הזה נאסף ואוחסן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עבור הניסויים. נתון זה שונה מ-8 ושוחזר באישור. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: השפעת KORS על העברת HDMEC. (A) ההעברה של HDMEC בעלון המודפס בתלת-ממד בהיעדר KORS (בקרה = CTRL) או בנוכחות KORS (+ KORS) מוצגת ומכומתת כאחוז ההתאוששות. (B) המעבר של HDMECs ב- ECM או KORSCM מוצג ומכומת כאחוז ההתאוששות. התוצאות מבוטאות כממוצע ± SEM, n=3 משוכפל, ונותחו שלושה שדות לכל שכפול, בוצעו שני ניסויים עצמאיים. **p<0.01, *****p<0.00001. סרגל קנה מידה: 200 מיקרומטר. ה- KORS הודגרו ב- ECM ללא FBS וגורמי צמיחה. לאחר 48 שעות, תווך מותנה זה נאסף ואוחסן ב -80 מעלות צלזיוס עבור הניסויים. נתון זה שונה מ-8 ושוחזר באישור. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
| ספירה 1 | ספירה 2 | התכוון | ממוצע כולל | ||
| צלחת 6 בארות | שכפול 1 | 95% | 84% | 90% | 90% |
| שכפול 2 | 90% | 88% | 89% | ||
| שכפול 3 | 85% | 89% | 87% | ||
| שכפול 4 | 97% | 89% | 93% | ||
| שכפול 5 | 88% | 94% | 91% | ||
| שכפול 6 | 86% | 92% | 89% | ||
| הוספה מודפסת בתלת-ממד | שכפול 1 | 92% | 89% | 91% | 91% |
| שכפול 2 | 91% | 80% | 86% | ||
| שכפול 3 | 93% | 92% | 93% | ||
| שכפול 4 | 94% | 98% | 96% | ||
| שכפול 5 | 88% | 86% | 87% | ||
| שכפול 6 | 93% | 97% | 95% |
טבלה 1: מדידת כדאיות KORS. יכולת הקיום של KORS נמדדה בבאר של צלחת בעלת 6 בארות ובעלון מודפס בתלת-ממד באמצעות צביעה כחולה טריפאן וספירה אוטומטית.
| ספירה 1 | ספירה 2 | התכוון | ממוצע כולל | ||
| צלחת 6 בארות | שכפול 1 | 90% | 88% | 89% | 85% |
| שכפול 2 | 79% | 78% | 79% | ||
| שכפול 3 | 71% | 75% | 73% | ||
| שכפול 4 | 86% | 82% | 84% | ||
| שכפול 5 | 91% | 88% | 90% | ||
| שכפול 6 | 99% | 94% | 97% | ||
| הוספה מודפסת בתלת-ממד | שכפול 1 | 99% | 86% | 93% | 86% |
| שכפול 2 | 80% | 75% | 78% | ||
| שכפול 3 | 79% | 80% | 80% | ||
| שכפול 4 | 98% | 85% | 92% | ||
| שכפול 5 | 85% | 78% | 82% | ||
| שכפול 6 | 89% | 93% | 91% |
טבלה 2: מדידת כדאיות HDMEC. כדאיות HDMEC נמדדה בבאר של צלחת 6 בארות ובעלון מודפס בתלת-ממד באמצעות צביעה כחולה טריפאן וספירה אוטומטית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
תקשורת סלולרית עקיפה נחקרת בדרך כלל באמצעות מדיה מותנית או התקני מערכת תרבות משותפת. הכנת מדיה מותנית גוזלת זמן רב במעלה הזרם בניסויים, ושיטה זו מוגבלת לניתוחי אפקטים חד-צדדיים. המחקר הקודם של Colin-Pierre et al.8 באמצעות מדיה מותנית נערך על תקשורת תאית עקיפה בין שני סוגי תאים (HDMECs ו- KORS). הנתונים של מחקר קודם זה הדגימו את ההשפעה של מדיה מותנית KORS על התפשטות HDMEC ואת ההשפעה של מדיה מותנית KORS על נדידת HDMEC, היווצרות pseudotube, וביטוי GPC18. במחקר הנוכחי מתוארת דרך פשוטה ומהירה יותר לחקור תקשורת תאית עקיפה. למעשה, תוספות המודפסות בתלת-ממד מאפשרות גמישות בתכנון הניסוי ובשילובים מרובים של תרביות תאים. כדי לאמת את התוספות המודפסות בתלת-ממד כמודל לתרביות משותפות, נותחו התפשטות תאים ונדידת תאים והושוו למחקר הקודם באמצעות מדיה מותנית8. בשני המחקרים, בדיקת ריפוי הפצע בוצעה באמצעות מכשיר בעל שני תאי נדידה (תרבית-אינסרט 2 באר בצלחת μ 35 מ"מ) שהונח בבאר המכילה או לא מכילה את העלון. מכשיר בדיקת הגירהזה 9,10 שונה ממבחני אפס11,12 בכך שטביעת הרגל שהותיר הקיר (המדמה את הפצע) התוחם את שני החדרים היא קבועה. לכן, הוא ניתן לשחזור מאוד. תוצאות המחקר הנוכחי הובילו למסקנה דומה בהשוואה לניסויי מדיה מותנים. התוספות המודפסות בתלת-ממד אינן משנות את התנהגות התא ומותאמות ליצירת ציפויי תאים עצמאיים המקדמים היצמדות לתאים. עם זאת, התוספות המודפסות בתלת-ממד מאפשרות גם ליצור ציפוי עם פולי-HEMA, למשל, כדי לגרום לחיבור נמוך לתרבית הספרואידים/אורגנואידים. תקשורת עקיפה בין HDMECs ו- KORS נחקרה כאן כדוגמה ליישומים מרובים שסופקו על ידי הוספות המודפסות בתלת-ממד.
התקן חדש זה, המתאים לסוגי תאים דבקים הדורשים או אינם דורשים ציפוי ספציפי, מספק חיסכון משמעותי בזמן להקמת מודל התרבית המשותפת. ואכן, ארבעת התאים של התוספות המודפסות בתלת-ממד מאפשרים תרבית של מספר סוגי תאים בחד-שכבתית או בתלת-ממד (אגרגטים או כדורואידים) באותה באר עם שילובים שונים. לדוגמה, ניתן לנתח את התקשורת העקיפה של ארבעה סוגי תאים בחד-שכבתיים, בתלת-ממד (ספרואידים), או שילוב של שניהם. במהלך הניסויים, ספרואידים תורבתו בתוספות שהודפסו בתלת-ממד באמצעות ציפוי poly-HEMA (הנתונים אינם מוצגים). הספרואידים הורכבו מתאים שנזרעו בתלת-ממד בשל לוח הקישור הנמוך והועברו לאחר 48 שעות לעלון המודפס בתלת-ממד לצורך ניתוח. לאחר מספר ימים של תרבית, נצפתה צמיחת הספרואידים. תוצאות אלה מראות כי ניתן להשתמש בעלון המודפס בתלת-ממד כדי לעקוב אחר צמיחת תאים תלת-ממדיים לאחר העברת הספרואידים באותו אופן כמו בלוח תרבית13,14. יתר על כן, ניתן להרכיב תערובת של סוגי תאים שונים באותו תא בדו-ממד או בתלת-ממד (אורגנואידים) כדי לחקור תקשורת תאית ישירה ועקיפה. ואכן, המגוון הרחב של המודולריות המוצעות על ידי התוספות המודפסות בתלת-ממד מאפיין מערכת חדשנית זו של תרביות תאים. בנוסף, נוכחותם של חלונות התקשורת מאפשרת שימוש במדיום משותף לכל סוגי התאים בזמן נבחר ללא סיוע של מדיה מותנית. לפיכך, טכניקה זו אינה ישימה לתאים בתרבית בהשעיה. הדפנות המפרידות בין ארבעת התאים מאפשרות זריעה, קציר וניתוח של כל סוג תא בנפרד מהאחרים. מספר יישומים יכולים להיעשות, כגון בדיקות היווצרות pseudotube והתפשטות, הגירה, DNA, RNA, חלבון, וניתוחים אחרים. התוספות המודפסות בתלת-ממד מציעות גם אפשרות לנתח את ההשפעה של מולקולות או שלפוחיות חוץ-תאיות, למשל. יתר על כן, העובדה כי תוספות אלה נעשו על ידי הדפסה 3D מספק אפשרויות רבות עבור פריסת התא בדיקות פונקציונליות רבות.
עם זאת, יש לשקול בזהירות את השלב הקריטי של איטום ההוספה המודפסת בתלת-ממד בלוח. ואכן, חלוקה הומוגנית מחדש של הסיליקון חיונית כדי להבטיח איטום ולמנוע דליפה של מדיום תרבית תאים או תאים מתא אחד למשנהו. כדי למנוע בעיות, יש לוודא כי הסיליקון מכסה את החלק של תוספות מודפס 3D כי יהיה במגע עם הצלחת. לפני זריעת התאים יש לבדוק איטום נכון על ידי הוספת מדיום תרבית תאים לתא אחד והתבוננות בהיעדר דליפה בינונית בתאים האחרים. זמן הייבוש של הסיליקון לאחר הדגירה באמבט אתנול 70% הוא גם שלב קריטי. ואכן, העקבות הנותרים של אלכוהול עלולים להוביל לקיבוע תאים ורעילות. כדי למנוע בעיות, יש לכבד את זמן הייבוש.
לסיכום, התוספות המודפסות בתלת-ממד תואמות לרוב סוגי התאים הדבקים לתרבית בדו-ממד או בתלת-ממד ומאפשרות שיטות רבות של ניסויים. הם יכולים להיות מותאמים למחקרים רבים של תרביות משותפות ועשויים לספק כלי חדש לחקר תקשורת תאית עקיפה. התוספות המודפסות בתלת-ממד ניתנות לשינוי, גמישות, ניתנות להרחבה, וניתן להשתמש בהן לתכנון מודלים ניסיוניים למחקרים של פיזיולוגיות-פתולוגיות כגון סרטן, אימונולוגיה או אנגיוגנזה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
מחקר זה נעשה בשיתוף פעולה עם BASF Beauty Care Solutions. גב' צ'רלי קולין-פייר היא עמיתת דוקטורט במימון BASF / CNRS.
ברצוננו להודות למר מהדי סלאמי על הרעיון של התוספות המודפסות בתלת-ממד.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Autoclave | Getinge | APHP | Solid cycle, 121 °C for 20 min |
| Biomed Clear | Formlabs | RS-F2-BMCL-01 | Impression performed by 3D-Morphoz company (Reims, France) |
| Cell culture detergents | Tounett | A18590/0116 | |
| Cell Proliferation Reagent WST-1 | Roche | 11,64,48,07,001 | |
| Counting slide | NanoEnTek | EVE-050 | |
| Culture-Insert 2 Well in μ-Dish 35 mm | Ibidi | 80206 | two-migration chambers device. |
| Endothelial cell medium | ScienCell | 1001 | Basal medium +/- 25 mL of fetal bovine serum (FBS, 0025), 5 mL of endothelial cell growth supplement (ECGS, 1052), and 5 mL of penicillin/streptomycin solution (P/S, 0503). |
| EVE Automated cell counter | NanoEnTek | NESCT-EVE-001E | |
| EVOS XL Core | Fisher Scientific | AMEX1200 | 10x of magnification |
| Food silicon reagent and catalyst kit | Artificina | RTV 3428 A and B | (10:1) |
| FORM 3B printer | Formlabs | PKG-F3B-WSVC-DSP-BASIC | Impression performed by 3D-Morphoz company |
| Human Dermal Microvascular Endothelial Cells (HDMEC) | ScienCell | 2000 | |
| Keratinocytes of Outer Root Sheath (KORS ) | ScienCell | 2420 | |
| Macro Wound Healing Tool Software | ImageJ | Software used for the measurement of the uncovered surface (for migration assays) | |
| Mesenchymal stem cell medium | ScienCell | 7501 | Basal medium +/-25 mL of fetal bovine serum (FBS, 0025), 5 mL of mesenchymal stem cell growth supplement (MSCGS, 7552), and 5 mL of penicillin/streptomycin solution (P/S, 0503) |
| Microplate reader SPECTRO star NANO | BMG Labtech | BMG LABTECH software | |
| PBS | Promocell | C-40232 | Without Ca2+ / Mg2+ |
| Trypan Blue Stain | NanoEnTek | EBT-001 | |
| Trypsin / EDTA | Promocell | C-41020 | Incubation of KORS at 37 °C with 5% CO2 for 5 min. Incubation of HDMECs for 5 min at room temperature |
| 96-well plate Nunclon Delta Surface | Thermoscientific | 167008 |
References
- Regier, M. C., Alarid, E. T., Beebe, D. J. Progress towards understanding heterotypic interactions in multi-culture models of breast cancer. Integrative Biology. 8 (6), 684-692 (2016).
- Doğan, A., Demirci, S., Apdik, H., Apdik, E. A., Şahin, F. Mesenchymal stem cell isolation from pulp tissue and co-culture with cancer cells to study their interactions. Journal of Visualized Experiments. (143), e58825 (2019).
- Lin, J., et al. Long non-coding RNA UBE2CP3 enhances HCC cell secretion of VEGFA and promotes angiogenesis by activating ERK1/2/HIF-1α/VEGFA signalling in hepatocellular carcinoma. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 37 (1), 113 (2018).
- Soares, N. L., et al. Carbon monoxide modulation of microglia-neuron communication: Anti-neuroinflammatory and neurotrophic role. Molecular Neurobiology. 59 (2), 872-889 (2022).
- Al Halawani, A., Abdulkhalek, L., Mithieux, S. M., Weiss, A. S. Tropoelastin promotes the formation of dense, interconnected endothelial networks. Biomolecules. 11 (9), 1318 (2021).
- Mercatali, L., et al. Development of a human preclinical model of osteoclastogenesis from peripheral blood monocytes co-cultured with breast cancer cell lines. Journal of Visualized Experiments. (127), e56311 (2017).
- Orona, N. S., Astort, F., Maglione, G. A., Yakisich, J. S., Tasat, D. R. Direct and indirect effect of air particles exposure induce Nrf2-dependent cardiomyocyte cellular response in vitro. Cardiovascular Toxicology. 19 (6), 575-587 (2019).
- Colin-Pierre, C., et al. The glypican-1/HGF/C-met and glypican-1/VEGF/VEGFR2 ternary complexes regulate hair follicle angiogenesis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 781172 (2021).
- Toubal, A., et al. The NC1 domain of type XIX collagen inhibits melanoma cell migration. European Journal of Dermatology. 20 (6), 712-718 (2010).
- Wu, A. -L., et al. Role of growth factors and internal limiting membrane constituents in müller cell migration. Experimental Eye Research. 202, 108352 (2021).
- Oudart, J. -B., et al. Plasmin releases the anti-tumor peptide from the NC1 domain of collagen XIX. Oncotarget. 6 (6), 3656-3668 (2015).
- Martinotti, S., Ranzato, E.
- Cattin, S., Ramont, L., Rüegg, C. Characterization and in vivo validation of a three-dimensional multi-cellular culture model to study heterotypic interactions in colorectal cancer cell growth, invasion and metastasis. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 97 (2018).
- Ma, Y. N., et al. Three-dimensional spheroid culture of adipose stromal vascular cells for studying adipogenesis in beef cattle. Animal. 12 (10), 2123-2129 (2018).
