Summary
이 논문에서는 새로 설계된 3D 프린팅 인서트를 공동 배양 모델로 제시하고 내피 세포와 각질 세포 사이의 측분비 세포 간 통신 연구를 통해 검증합니다.
Abstract
서로 다른 세포 유형 간의 간접 통신에 대한 고전적인 분석에서는 조건화된 배지를 사용해야 합니다. 또한, 컨디셔닝 배지의 생산은 시간이 많이 걸리고 생리학적 및 병리학적 상태와는 거리가 멀다. 공동 배양의 몇 가지 모델이 상업적으로 이용 가능하지만 특정 분석으로 제한되며 대부분 두 가지 유형의 세포에 대한 것입니다.
여기에는 수많은 기능 분석과 호환되는 3D 프린팅 인서트가 사용됩니다. 인서트를 사용하면 6웰 플레이트의 웰 하나를 4개의 구획으로 분리할 수 있습니다. 다양한 조합을 설정할 수 있습니다. 또한, 창문은 구획의 각 벽에 설계되어 모든 구획 간의 잠재적인 세포 간 통신이 부피 의존적 방식으로 배양 배지에서 가능합니다. 예를 들어, 측분비 세포 간 통신은 단층, 3D(스페로이드) 또는 이 둘을 결합하여 4가지 세포 유형 간에 연구할 수 있습니다. 또한 서로 다른 세포 유형의 혼합을 2D 또는 3D(오가노이드) 형식으로 동일한 구획에 시딩할 수 있습니다. 3D 프린팅된 인서트에 바닥이 없기 때문에 플레이트의 일반적인 배양 조건, 인서트가 포함된 플레이트의 코팅 가능, 광학 현미경으로 직접 시각화할 수 있습니다. 다중 구획은 서로 다른 세포 유형을 독립적으로 수집하거나 각 구획에서 RNA 또는 단백질 추출을 위해 서로 다른 시약을 사용할 수 있는 가능성을 제공합니다. 본 연구에서는 새로운 3D 프린팅 인서트를 공동 배양 시스템으로 사용하기 위한 상세한 방법론을 제공합니다. 이 유연하고 간단한 모델의 여러 기능을 입증하기 위해 이전에 발표된 세포 통신의 기능적 분석이 새로운 3D 프린팅 인서트에서 수행되었으며 재현 가능한 것으로 입증되었습니다. 3D 프린팅된 삽입물과 컨디셔닝된 배지를 사용한 기존 세포 배양은 유사한 결과를 가져왔습니다. 결론적으로, 3D 프린팅 인서트는 부착 세포 유형을 가진 수많은 공동 배양 모델에 적용할 수 있는 간단한 장치입니다.
Introduction
생체 내에서 세포는 직접적으로(세포 접촉) 또는 간접적으로(분자 분비에 의해) 서로 통신합니다. 세포 통신을 연구하기 위해 직접 공동 배양(서로 다른 세포 유형이 동일한 웰에서 직접 상호 작용함) 및 구획화된 공동 배양(서로 다른 세포 유형이 배양 시스템의 서로 다른 구획에서 간접 상호 작용함)과 같은 다양한 공동 배양 모델을 개발할 수 있습니다1. 또한, 컨디셔닝 배지는 공동 배양 시스템에 사용될 수 있으며, 여기서 간접 상호작용은 반응자 세포 유형1로 전달되는 이펙터 세포 유형의 컨디셔닝 배지에 포함된 분비된 분자에 의해 활성화됩니다.
측분비 세포 통신 연구의 경우, 간접 공동 배양 시스템은 생체 내에서 세포 상호 작용을 강력하게 반영하는 모델을 제공합니다. 간접 공동 배양 시스템이 개발되고 상용화되어 간접 공동 배양 모델 2,3의 확립이 가능해졌습니다. 안타깝게도 대부분의 간접 공동 배양 시스템은 두 개의 구획만 제공합니다. 다른 간접 공동 배양 시스템은 여러 구획을 제공하지만 현재 원고에 보고된 시스템에 비해 확장성이 떨어집니다. 그들 중 일부는 현미경으로 고전적인 시각화를 허용하지 않으며 종종 특정 응용 방법을 제시합니다. 여러 연구에서, 상이한 세포 유형 사이의 측분비 통신은 조건화 된 배지 모델 4,5,6,7에 의해 조사된다. 이것은 특정 방법이나 재료를 확립할 필요가 없기 때문에 간접 공동 배양 시스템에 비해 조사가 더 쉬운 방법입니다1. 반면에, 컨디셔닝 배지의 준비는 시간이 많이 걸리고 단방향 세포 신호전달(이펙터에서 반응자로)에 대한 정보만 제공합니다1.
이 논문에서는 세포 통신을 조사하는 새롭고 간단한 방법을 제안합니다. 직접 또는 간접 상호 작용과 2D 또는 3D 형식에서 여러 세포 유형을 결합할 수 있는 인쇄된 인서트는 공동 배양 모델을 쉽게 설정할 수 있는 많은 이점을 제공합니다. 6웰 플레이트의 웰에 배치되도록 조정된 3D 프린팅 인서트는 원형이며 웰을 4개의 구획(2개의 큰 구획과 2개의 작은 구획)으로 분리할 수 있습니다. 그림 1A). 3D 프린팅 인서트는 바닥이 없는 것이 특징입니다. 따라서, 셀은 인서트가 놓인 플레이트와 직접 접촉한다. 또한, 각 구획은 다른 구획과 독립적으로 코팅될 수 있다. 또한, 세포 거동은 광학 현미경으로 쉽게 추적할 수 있습니다. 인서트의 각 벽에 통신 창이 있으면 최적의 시간에 공통 배지를 추가하여 서로 다른 공동 배양 실험을 수행할 수 있습니다. 여러 세포 유형 간의 직접 및/또는 간접 통신을 연구하기 위해 공동 배양의 수많은 조합을 수행할 수 있습니다. 예를 들어, 단층 및/또는 3D(스페로이드)에서 4개의 서로 다른 세포 유형 간의 간접 공동 배양 모델을 설계할 수 있습니다. 직접 및 간접 공동 배양 모델의 조합은 동일한 구획에서 서로 다른 세포 유형을 혼합하여 수행할 수도 있습니다. 복잡한 구조(오가노이드, 조직 외식편 등)가 다양한 세포 유형에 미치는 영향은 만들 수 있는 모델의 또 다른 예가 될 수 있습니다. 또한 3D 프린팅 인서트는 세포 생물학 기능 분석(증식, 이동, 유사관 형성, 분화 등) 및 생화학 검사(DNA, RNA, 단백질, 지질 추출 등)와 호환됩니다. 마지막으로, 3D 프린팅 인서트는 서로 다른 구획에서 동일한 실험에서 서로 다른 분석을 동시에 결합할 수 있는 가능성과 함께 공동 배양 모델의 광범위한 실험 계획을 제공합니다.
3D 프린팅된 인서트의 일부 용량은 빠르고 사용하기 쉬운 공동 배양 모델임을 검증하기 위해 제공됩니다. 측분비 세포 통신에 대해 수행된 이전에 발표된 연구와 비교하여 3D 프린팅 삽입물이 가치 있는 공동 배양 모델이 될 수 있는 능력이 입증되었습니다. 이 점을 평가하기 위해 각질 세포에 의한 내피 세포 증식 및 이동 조절을 3D 프린팅 삽입 시스템과 조건 매체를 사용하는 기존 시스템 간에 비교했습니다. 3D 프린팅 인서트는 컨디셔닝 미디어를 사용하는 기존 시스템과 비교하여 유사한 결과를 빠르게 얻을 수 있습니다. 실제로, 3D 프린팅된 인서트는 컨디셔닝된 배지를 생성할 필요 없이 양방향으로 세포 상호작용을 연구할 수 있는 강력한 모델을 제공하며, 동일한 실험에서 증식 및 이동 분석을 병렬로 수행할 수 있습니다.
결론적으로, 이 논문에서는 세포 통신을 연구하기 위한 새롭고 즉시 사용 가능한 모델을 제안합니다. 모든 부착 세포 유형과 호환되는 3D 프린팅 인서트를 사용하면 생체 내 조건에 더 가까워지는 것을 목표로 하는 다양한 공동 배양 조합을 수행할 수 있습니다.
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Protocol
참고: 3D 인서트(그림 1A)는 상업적으로 조달되며 세포 배양 및 오토클레이빙에 생체 적합성이 있는 포토폴리머 수지를 사용하여 인쇄됩니다( 재료 표 참조). 이 섹션에서는 인서트를 통해 공동 배양 모델을 설정하는 자세한 프로토콜에 대해 설명합니다( 그림 1B 참조). 응용 프로그램의 몇 가지 예도 제공됩니다.
1. 멸균된 인서트를 6웰 플레이트에 배치
- 키트에 제공된 두 가지 구성 요소( 재료 표 참조), 식품 실리콘(시약 A) 및 촉매(시약 B)를 제조업체의 지침에 따라 10:1(v/v)의 비율로 혼합합니다. (그림 1Ba). 70% 에탄올 멸균 주걱을 사용하여 두 성분을 혼합합니다.
알림: 준비할 실리콘 혼합물의 부피는 고정할 인서트의 수에 따라 다릅니다. 촉매가 너무 많으면 실리콘 혼합물이 너무 빨리 응고될 수 있습니다. - 핀셋으로 실리콘 믹스에 인서트를 적용하여 혼합물이 인서트의 하단 가장자리에 균일하게 분포되도록 합니다(그림 1Bb). 삽입물을 6웰 플레이트의 웰에 넣고 삽입물에 부드러운 압력을 가하여 삽입물이 플레이트와 밀접하게 접촉되도록 하여 세포 배양 배지의 누출을 방지합니다(그림 1Bc).
- 플레이트를 37°C에서 1시간 동안 실리콘의 응고 과정을 지지한다.
참고: 응고 시간은 첨가된 촉매의 양에 따라 다릅니다. - 응고 후, 삽입물로 플레이트를 70 % 에탄올 수조에 30 분에서 1 시간 동안 담궈 멸균한다.
- 피펫팅으로 알코올을 버리고 플레이트를 세포 배양 후드에서 밤새 건조(뚜껑 열림)합니다.
알림: 세포 고정 및 독성을 피하기 위해 다음 단계를 수행하기 전에 알코올을 완전히 증발시켜야 합니다. 인서트가 들어있는 즉시 사용 가능한 플레이트는 실온에서 건조하고 멸균 된 조건에서 사용하기 전에 며칠 동안 보관할 수 있습니다.
2. 폴리-L-라이신 또는 폴리-HEMA와 같은 코팅(선택적 단계)
참고: 코팅은 이 실험에서 수행되지 않으며, 인서트 코팅의 가능성에 대해 알리기 위해 단계가 제공됩니다.
- 제조업체의 지침에 따라 코팅 용액을 준비하십시오.
- 가장 큰 구획의 경우 200-400 μL의 부피를 고려하고 인서트 코팅을 위한 가장 작은 구획의 경우 50-100 μL의 부피를 고려하십시오. 코팅 용액을 개별 구획에 추가합니다.
- 멸균 상태에서 제조업체가 표시한대로 코팅을 건조시킵니다.
3. 세포의 파종
- 제조업체에서 권장하는 바깥쪽 뿌리초(KORS)와 인간 진피 미세혈관 내피 세포(HDMEC)의 각질형성세포를 배양합니다. 세포가 합류에 도달하면 세포 현탁액을 준비합니다.
- 플라스크에서 배지를 버리고 5mL의 트립신을 첨가하여 세포를 분리합니다( 재료 표 참조).
- KORS가 담긴 플라스크를 5%CO2 와 함께 37°C에서 5분 동안 놓는다. HDMEC가 들어 있는 플라스크를 실온에서 5분 동안 배양합니다.
- KORS를 함유한 트립신 용액을 5% 소태아혈청(FBS)과 성장인자로 보충된 중간엽 줄기세포 배지(MSCM) 5 mL와 섞는다(basal medium with supplement kit, see of Table of Materials). HDMEC를 함유하는 트립신 용액을 5% FBS 및 성장 인자로 보충된 5mL의 내피 세포 배지(ECM)와 혼합합니다( 재료 표 참조).
- 세포를 15mL의 멸균 원뿔형 튜브로 옮깁니다. KORS 및 HDMEC 현탁액을 실온에서 5분 동안 200 x g로 원심분리합니다.
- 상청액을 버리고 세포를 각 배지 2mL에 재현탁합니다.
- 10 μL의 세포 현탁액을 10 μL의 트리판 블루 염료와 혼합합니다( 재료 표 참조).
- 혼합물 10μL를 계수 슬라이드의 챔버에 추가합니다.
- 계수 슬라이드를 세포 계수 시스템( 재료 표 참조)에 삽입하고 세포 번호와 생존력을 감지합니다.
- 각 배지에서 0.5 x 105 cells/mL의 농도로 세포 현탁액을 준비합니다.
참고: 서로 다른 세포 유형이 서로 다른 부착 시간을 필요로 하거나 이상적인 밀도에 도달하는 경우 세포 유형에 따라 서로 다른 시점에서 세포 시딩을 수행할 수 있습니다.
- 800 μL - 1 mL의 세포 현탁액을 개별 대형 구획에 분배하고 100-150 μL를 피펫을 사용하여 개별 소형 구획에 분배합니다.
- 큰 구획 중 하나에 5% FBS와 성장 인자로 보충된 MSCM에서 1 x 105 cells/mL로 KORS를 시드합니다.
- ECM 의 시드 HDMEC는 작은 구획에서 2.5 x 103 cells/mL로, 다른 큰 구획에서 1.25 x 105 cells/mL에서 5% FBS 및 성장 인자로 보충되었습니다.
참고: 증식 분석은 작은 구획에서 수행할 수 있고 이동 및 생존도 분석은 큰 구획에서 수행할 수 있습니다. 시드된 세포의 농도는 제조업체의 권장 사항에 따라 최적화되었습니다. 이 농도는 배양 24-48 시간 후에 세포의 우수한 생존력을 허용합니다.
- 세포 배양 플레이트를 5%CO2 로 37°C에서 또는 세포 부착 및/또는 성숙을 허용하는 일반적인 조건 하에 놓습니다.
참고: 배지를 교체하지 않고 24-48시간 동안 세포를 배양합니다. 필요한 경우 구획의 매체를 독립적으로 변경할 수 있습니다.
4. 공동 배양의 구현 (그림 1Bd)
참고: 공동 배양의 구현은 공통 배지가 추가되는 시간에 해당합니다. 서로 다른 구획의 모든 세포 유형에 대해 고유한 배지를 추가하면 통신 창(3D 프린팅 삽입물 벽의 난형 구멍)이 있기 때문에 세포 간 측분비 통신의 가능성이 제공됩니다. 공동 culture를 구현하려면 4.1-4.3단계를 수행합니다.
- 피펫을 사용하여 삽입물의 다른 구획의 배양 배지를 비웁니다. 3D 스페로이드 세포 배양의 경우 배지를 매우 부드럽게 폐기합니다.
- 큰 구획에서 1mL의 37°C 따뜻한 PBS로 세포를 헹구고 작은 구획에서 200μL의 37°C 따뜻한 PBS로 세포를 헹굽니다. 세포가 분리되지 않도록 부드럽게 세척하십시오.
- 모든 세포 유형에 대해 호환되도록 선택된 공통 배지 3mL를 추가합니다.
참고: 이 연구에서는 기본 ECM (FBS 및 성장 인자 없음)을 사용합니다. 매체가 모든 구획을 덮고 있는지 확인하십시오( 그림 1A와 같이 통신 창[벽의 난형 구멍] 위 수준). - 공배양물이 들어있는 플레이트를 37°C에서 24-48시간 동안 5%CO2 로 두었다.
5. 세포 관찰, 계수 및 긁기
- 형태를 관찰하고 배양 24-48시간 후 광학 현미경으로 실험하는 동안 다른 구획의 세포 수를 계산합니다.
참고: 예상되는 세포 수는 사용된 세포 유형(크기, 형태 등)과 구획 크기에 따라 다릅니다. 이 실험에서는 0.5 x 10 6-1 x 10 6 KORS/mL 사이와 0.25 x 10 6-0.75 x 10 6 HDMEC/mL가 큰 구획에서 계산됩니다. - 세포 현탁액 계수를 위해 트립신을 사용하여 세포를 분리합니다.
알림: 세포 분리 솔루션의 경우 가장 큰 구획의 경우 100-500μL의 부피를 고려하고 가장 작은 구획의 경우 10-50μL의 부피를 고려하십시오. - 트리판 블루 염색을 사용하여 생존력을 확인하십시오(단계 3.1.6-3.1.8 참조).
6. 재활용을 위한 인서트 클리닝
- 실험이 끝날 때 6웰 플레이트에서 삽입물을 약간 비틀어 제거합니다(그림 1Be).
- 인서트에서 실리콘을 당겨 제거합니다. 필요한 경우 주걱을 사용하여 인서트 벽에 붙어있는 나머지 실리콘을 제거합니다 (그림 1Bf).
- 기존의 세포 배양 세제와 세척 물질로 삽입물을 세척하십시오(예:amp재료 표에 제공됨).
- 오토클레이브(고체 사이클, 121°C에서 20분)로 사용하거나 70% 에탄올 수조에 1시간 동안 담가 나중에 사용할 수 있도록 인서트를 멸균합니다.
참고: 이 단계에서 3D 프린팅 인서트를 사용하여 가능한 분석(증식 및 이동 분석)의 두 가지 예가 설명됩니다(그림 1Bd).
7. 세포 증식 분석 - WST-1 분석
- 1-3.1단계에 따라 세포를 배양합니다.
참고: HDMEC 증식에 대한 KORS 세크레톰의 영향을 조사하기 위해 이 섹션의 단계에 따라 공동 배양 시스템을 구현하십시오. KORS 셀은 이전에 발표된 데이터를 비교하기 위해사용된다 8.- 큰 구획에 5% FBS와 성장 인자를 보충한 중간엽 줄기 세포 배지(MSCM)에서 1 x 105 cells/mL로 KORS를 시드합니다.
- 세포 배양 플레이트를 37°C에서 5%CO2 로 24시간 동안 두었다.
- 5% FBS와 성장 인자를 2.5 x 103 cells/mL로 보충된 내피 세포 배지(ECM)에 HDMEC를 작은 구획에 시드합니다.
- 세포 배양 플레이트를 37°C에서 5%CO2 로 24-48시간 동안 두었다.
- 모든 구획에서 배지를 폐기하고 3mL의 보충되지 않은 기저 ECM (3D 프린팅 삽입물의 모든 구획에 대한 공통 세포 배양 배지)을 추가하여 공동 배양 시스템을 구현합니다.
- WST-1을 ECM 흔합 세포 배양액에 희석(1:10 최종 희석)하여 WST-1 용액을 제조하였다.
알림: WST-1 용액의 부피에 대해 블랭크에 대해 최소 500μL의 추가 용액을 준비하십시오. - 삽입물로부터 세포 배양 배지를 피펫팅으로 폐기한다.
- WST-1 용액을 선택한 구획에 추가합니다(작은 구획의 경우 150μL, 큰 구획의 경우 600μL). 플레이트를 5%CO2로 37°C에 두었다.
- 최적의 세포 배양 시간 30분 후, 각 조건에서 배양 배지 100μL를 96웰 플레이트에 옮깁니다.
- 420nm와 480nm 사이의 마이크로플레이트 리더를 사용하여 비색 반응을 평가합니다.
- 플레이트를 마이크로플레이트 리더에 놓고 버튼을 클릭하여 새 프로토콜을 편집합니다.
- 사용된 96웰 플레이트의 특정 유형( 재료 표 참조)과 450nm의 파장을 선택합니다.
- 버튼을 클릭하면 측정 시작.
8. 세포 이동 분석 - 2개의 이동 챔버 장치
- 1-3.1단계에 따라 세포를 배양합니다.
참고: HDMEC 증식에 대한 KORS 세크레톰의 영향을 조사하기 위해 이 섹션의 단계에 따라 공동 배양 시스템을 구현하십시오.- 큰 구획 중 하나에 5% FBS와 성장 인자로 보충된 MSCM에서 1 x 105 cells/mL로 KORS를 시드합니다.
- 세포 배양 플레이트를 37°C에서 5%CO2 로 24시간 동안 두었다.
- 두 개의 마이그레이션 챔버 장치를 다른 큰 인서트 구획에 넣습니다.
- 5% FBS와 성장 인자로 보충된 ECM 의 HDMEC를 두 개의 이동 챔버 장치의 7 x 105 세포/웰에서 시드합니다.
- 세포 배양 플레이트를 37°C에서 5%CO2 로 24시간 동안 두었다.
- 24시간 후에 또는 이동되는 세포 유형에 따라 최적의 시간에 매체 및 2개의 이동 챔버 장치를 폐기한다. 3 mL의 보충되지 않은 기저 ECM을 첨가하여 공동 배양 시스템을 구현한다.
알림: 셀을 분리하지 않도록 주의해서 진행하십시오. 세포가 공통 배지 첨가로 유도된 박리에 정말 민감한 경우 공통 배지를 첨가한 후 두 개의 이동 챔버 장치를 떼어냅니다.
- 10x 배율의 위상차 현미경으로 서로 다른 시점에서 세포로 덮인 표면을 관찰하고 사진을 찍습니다.
참고: 사진은 위상차 현미경으로 촬영한 것입니다( 재료 표 참조). 사진은 USB 키에 저장된 다음 소프트웨어의 상처 치유 도구 플러그인으로 분석됩니다( 재료 표 참조). - 기존의 정량 분석 소프트웨어를 사용하여 덮개가 없는 표면을 측정합니다.
- 소프트웨어에서 이미지를 열고 매크로 목록에서 사용할 수 있는 상처 치유 도구를 활성화합니다.
- m 버튼을 클릭하여 마이그레이션 이미지의 덮이지 않은 표면을 측정합니다.
- 덮개가 없는 표면은 다음 공식에 따라 계산됩니다.
커버리지 백분율 = ([T0에서 셀이 없는 평균 면적 - 시간 T0에서 셀이 없는 영역]/T0에서 셀이 없는 평균 면적) × 100.
참고: 3D 프린팅 인서트는 대부분의 세포 생물학 기술(예: 유사관 형성 분석, 3D 배양) 및 생화학 실험(예: DNA, RNA, 단백질 추출)에 완전히 적용됩니다.
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Representative Results
본 연구에서는 컨디셔닝 배지를 사용하여 기존 방법에 필적하는 강력하고 신뢰할 수 있으며 중요한 데이터를 얻기 위해 최적화된 공동 배양 시스템에 대해 설명했습니다. 3D 프린팅된 인서트는 실험에서 업스트림의 컨디셔닝 배지의 어려움과 시간 소모적인 생산을 극복함으로써 상호 작용에서 다양한 세포 유형의 생체 내 미세 환경 조건을 모방합니다. 이전에 발표된 연구는 모낭에 존재하는 두 가지 세포 유형인 인간 미세혈관 내피 세포(HDMEC)와 인간 외근초의 각질 세포(KORS) 간의 간접적인 상호 작용을 분석하기 위해 다시 수행되었습니다8. 여기에서 HDMEC와 KORS 간의 간접 상호 작용을 조사하기 위해 컨디셔닝 미디어를 사용하는 고전적인 방법과 비교하여 3D 프린팅 인서트를 사용하여 얻은 결과의 재현성을 입증했습니다. 연구8에서 이전에 기술된 세포 배양 조건은 본 연구에서와 동일하였다. 3D 프린팅 인서트의 치수를 고려하여 조정되었습니다(프로토콜 참조). 우선, 표현형과 세포 생존율은 모든 세포 유형에 대해 두 조건(조건화된 배지 .3D대 인쇄된 삽입물) 사이에서 비슷했습니다(그림 2). 실제로, 90%의 생존율은 6-웰 플레이트의 웰에서 관찰되었고(그림 2A 및 표 1), KORS에 대한 3D 프린팅 삽입물(그림 2B 및 표 1)에서 91%가 관찰되었습니다. HDMEC의 생존율은 6웰 플레이트의 웰에서 85%(그림 2C 및 표 2)인 반면, 3D 프린팅 삽입물(그림 2D 및 표 2)에서는 86%였습니다. 세포 생존율에 대한 데이터는 다음과 같이 자동 세포 계수기(Table of Materials)에 의해 계산되었다: 생존 세포의 수를 총 세포 수(dead + viable cells)로 나눈 값. 평균 데이터는 2회 반복이 수행된 6개의 독립적인 실험에서 얻어진 생존율을 백분율로 계산하여 얻었다(표 1 및 표 2 참조).
이러한 결과는 3D 프린팅된 삽입물이 6웰 플레이트에서 일반적인 배양과 비교하여 세포 거동 또는 생존율을 변경하지 않았음을 나타냅니다. 따라서 3D 프린팅 인서트는 공동 배양의 새로운 모델로 검증되었습니다.
간접 셀 통신의 이전에 입증된 파라미터(8 )를 분석하였다. 모든 실험에서 3D 프린팅된 인서트 공동 배양 구현은 고전 배양 조건에 따른 프로토콜에 따라 실현되었습니다(이전 작업8 참조).
먼저, 3D 프린팅 인서트에서 KORS와 HDMEC 간의 간접 세포 통신을 세포 증식을 분석하고 컨디셔닝 미디어를 사용하는 기존 방법과 비교하여 평가했습니다(그림 3). 삽입물(+KORS)에 KORS가 있는 경우, HDMEC 증식은 KORS(대조군)가 없는 대조군 조건에 비해 24시간 후 1.5배, 48시간 후 3.1배 유의하게 증가했습니다(그림 3A). 이러한 결과는 조건화된 배지 실험에 의해 얻어진 것과 일치하였다(도 3B). 실제로 KORSCM 은 HDMEC 증식을 24시간 후 1.5배, 48시간 후 2.1배 유의하게 증가시키는 것으로 나타났습니다.
HDMEC 마이그레이션에 대한 KORS의 영향을 확인하기 위해 3D 프린팅된 인서트 공동 배양 모델을 테스트했습니다. 이 효과는 이전에 조건화된 배지8 을 사용하는 고전적인 공동 배양 시스템에서 입증되었습니다(그림 4). KORS(대조군)가 없는 대조군 조건에서 HDMEC는 24시간 후에 상처 부위의 약 44%를 이동하여 덮었습니다(그림 4A). KORS (+ KORS)가있는 경우 HDMEC 마이그레이션이 강력하고 크게 증가했습니다. 실제로, 상처 치유의 동역학은 상처 부위의 43%, 67% 및 99%가 각각 3시간, 12시간 및 24시간 후에 HDMEC로 덮인 것으로 나타났습니다. 이러한결과는 이전에 얻어진 것과 일치하였다 8, 여기서 KORSCM 은 유사한 방식으로 HDMEC 마이그레이션을 증가시키는 것으로 나타났다(도 4B).
그림 1: 세척에서 인서트 재활용까지 3D 프린팅된 인서트 공동 배양의 구현을 보여주는 워크플로. (A) 3D 프린팅된 인서트의 대표 사진. (B) 이 원고에 제시된 분석의 대표적인 예가 예시되어 있다. 증식 분석은 3D 프린팅된 인서트의 다른 구획에 배치된 두 개의 이동 챔버 장치를 사용하여 다른 구획에서 수행되는 이동 분석과 병행하여 3D 프린팅된 인서트의 한 구획에서 수행될 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: KORS 및 HDMEC 생존도. (A,B) KORS 형태 (A) 6웰 플레이트의 웰 및 (B) 3D 프린팅 삽입물의 (10x). (씨, 디) HDMEC 형태 (10x) (C) 6웰 플레이트 웰 및 (D) 3D 프린팅 인서트. 스케일 바: 200 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: HDMEC 증식에 대한 KORS의 영향. (A) HDMEC 증식은 24시간 또는 48시간 동안 KORS가 없는 상태(대조군 = CTRL) 또는 KORS(+ KORS)가 있는 상태에서 3D 프린팅된 삽입물에 WST-1 염료를 사용한 비색 분석으로 측정되었습니다. (B) HDMEC 증식은 ECM 기저 세포 배양 배지 또는 KORSCM의 존재 하에 WST-1 염료를 사용한 비색 분석으로 측정되었습니다. 24 시간 또는 48 시간 동안. 결과는 평균 SEM±, n=8회 반복으로 나타내었으며, 2개의 독립적인 실험을 수행하였다. *p < 0.05, ***p < 0.001, ****p < 0.0001 및 *****p < 0.00001. KORS는 FBS 및 성장 인자 없이 ECM에서 배양되었습니다. 48시간 후, 이 컨디셔닝 배지를 수집하여 실험을 위해 -80°C에서 보관하였다. 이 그림은 8에서 수정되었으며 허가를 받아 복제되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: HDMEC 마이그레이션에 대한 KORS의 영향 . (A) KORS가 없는 경우(control = CTRL) 또는 KORS(+ KORS)가 있는 경우 3D 프린팅된 인서트에서 HDMEC의 마이그레이션을 복구 백분율로 표시하고 정량화합니다. (B) ECM 또는 KORSCM 에서 HDMEC의 마이그레이션을 표시하고 회수 백분율로 정량화합니다. 결과는 SEM± 평균으로 표현하였으며, n=3 반복실험, 반복실험 당 3개의 필드를 분석하였고, 2개의 독립적인 실험을 수행하였다. **p<0.01, *****p<0.00001입니다. 스케일 바: 200μm. KORS는 FBS 및 성장 인자 없이 ECM 에서 배양되었습니다. 48시간 후, 이러한 조건화 배지를 수집하여 실험을 위해 -80°C에서 보관하였다. 이 그림은 8 에서 수정되었으며 허가를 받아 복제되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 카운트 1 | 카운트 2 | 의미하다 | 총 평균 | ||
| 6웰 플레이트 | 복제 1 | 95% | 84% | 90% | 90% |
| 복제 2 | 90% | 88% | 89% | ||
| 복제 3 | 85% | 89% | 87% | ||
| 복제 4 | 97% | 89% | 93% | ||
| 복제 5 | 88% | 94% | 91% | ||
| 복제 6 | 86% | 92% | 89% | ||
| 3D 프린팅 인서트 | 복제 1 | 92% | 89% | 91% | 91% |
| 복제 2 | 91% | 80% | 86% | ||
| 복제 3 | 93% | 92% | 93% | ||
| 복제 4 | 94% | 98% | 96% | ||
| 복제 5 | 88% | 86% | 87% | ||
| 복제 6 | 93% | 97% | 95% |
표 1: KORS 생존율 측정. KORS 생존율은 6-웰 플레이트의 웰과 트리판 블루 염색 및 자동 계수를 사용하여 3D 프린팅된 삽입물에서 측정되었습니다.
| 카운트 1 | 카운트 2 | 의미하다 | 총 평균 | ||
| 6웰 플레이트 | 복제 1 | 90% | 88% | 89% | 85% |
| 복제 2 | 79% | 78% | 79% | ||
| 복제 3 | 71% | 75% | 73% | ||
| 복제 4 | 86% | 82% | 84% | ||
| 복제 5 | 91% | 88% | 90% | ||
| 복제 6 | 99% | 94% | 97% | ||
| 3D 프린팅 인서트 | 복제 1 | 99% | 86% | 93% | 86% |
| 복제 2 | 80% | 75% | 78% | ||
| 복제 3 | 79% | 80% | 80% | ||
| 복제 4 | 98% | 85% | 92% | ||
| 복제 5 | 85% | 78% | 82% | ||
| 복제 6 | 89% | 93% | 91% |
표 2: HDMEC 생존율 측정. HDMEC 생존율은 6웰 플레이트의 웰과 트리판 블루 염색 및 자동 계수를 사용하여 3D 프린팅된 삽입물에서 측정되었습니다.
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Discussion
간접 세포 통신은 일반적으로 조건화된 배지 또는 공동 배양 시스템 장치를 사용하여 조사됩니다. 조건화된 배지 준비는 실험의 업스트림에서 시간이 많이 소요되며, 이 방법은 단측 효과 분석으로 제한됩니다. Colin-Pierre et al.의 이전 연구.8 컨디셔닝 배지를 사용하여 두 세포 유형(HDMEC 및 KORS) 간의 간접 세포 통신에 대해 수행되었습니다. 이 이전 연구의 데이터는 HDMEC 증식에 대한 KORS 조건 배지의 효과와 HDMEC 이동, 유사관 형성 및 GPC1 발현에 대한 KORS 조건 배지의 효과를 입증했습니다8. 본 연구에서는 간접 세포 통신을 조사하는 더 간단하고 빠른 방법이 설명됩니다. 실제로 3D 프린팅 인서트는 실험 설계와 세포 배양의 다양한 조합에 유연성을 제공합니다. 이러한 3D 프린팅 삽입물을 공동 배양을 위한 모델로 검증하기 위해 세포 증식 및 세포 이동을 분석하고 조건화된 배지8을 사용하여 이전 연구와 비교했습니다. 두 연구 모두에서, 상처 치유 분석은 삽입물을 함유하거나 함유하지 않는 웰에 배치된 2개의 이동 챔버 장치(Culture-Insert 2 Well in μ-Dish 35 mm)를 사용하여 수행하였다. 이러한 이동 시험 장치(9,10)는 2개의 챔버를 구분하는 벽(상처를 모사하는)에 의해 남겨진 발자국이 일정하다는 사실에 의해 스크래치 분석(11,12)과 상이하다. 따라서 재현성이 높습니다. 본 연구의 결과는 조건 배지 실험과 비교하여 유사한 결론을 이끌어 냈습니다. 3D 프린팅 인서트는 세포 거동을 변경하지 않으며 세포 부착을 촉진하는 독립적인 구획 코팅을 만드는 데 적합합니다. 그러나 3D 프린팅 인서트는 예를 들어 스페로이드/오가노이드 배양을 위한 낮은 부착을 유도하기 위해 poly-HEMA로 코팅할 수도 있습니다. 여기서는 HDMEC와 KORS 간의 간접 통신이 3D 프린팅 인서트가 제공하는 여러 응용 분야의 예로 조사되었습니다.
특정 코팅이 필요하거나 필요하지 않은 부착 세포 유형에 적용할 수 있는 이 새로운 장치는 공동 배양 모델을 구축하는 데 상당한 시간을 절약합니다. 실제로 3D 프린팅 인서트의 4개 구획을 통해 여러 세포 유형을 단층 또는 3D(응집체 또는 스페로이드)로 동일한 웰에서 서로 다른 조합으로 배양할 수 있습니다. 예를 들어, 단층, 3D(스페로이드) 또는 이 둘의 조합에서 4가지 세포 유형의 간접 통신을 분석할 수 있습니다. 실험 동안, 스페로이드는 폴리-HEMA 코팅을 사용하여 3D-프린팅된 삽입물에서 배양되었다(데이터는 나타내지 않음). 스페로이드는 부착 결합판이 낮기 때문에 3D로 시딩된 세포로 구성되었으며 48시간 후에 분석을 위해 3D 프린팅된 인서트로 옮겨졌습니다. 며칠간의 배양 후, 스페로이드의 성장이 관찰되었습니다. 이러한 결과는 3D 프린팅된 삽입물이 배양 플레이트13,14에서와 동일한 방식으로 스페로이드 전사 후 3D 세포 성장을 추적하는 데 사용될 수 있음을 보여줍니다. 또한 서로 다른 세포 유형의 혼합물을 2D 또는 3D(오가노이드)의 동일한 구획에 모아 직접 및 간접 세포 통신을 모두 연구할 수 있습니다. 실제로 3D 프린팅 인서트가 제공하는 광범위한 모듈성은 이 혁신적인 세포 공동 배양 시스템의 특징입니다. 또한, 통신 윈도우의 존재는 컨디셔닝 매체의 도움 없이 선택된 시간에 모든 세포 유형에 대해 공통 배지에서 사용할 수 있게 한다. 따라서, 이 기술은 현탁액에서 배양된 세포에는 적용할 수 없다. 4개의 구획을 분리하는 벽은 각 세포 유형을 다른 세포와 독립적으로 파종, 수확 및 분석할 수 있습니다. 유사관 형성 분석 및 증식, 이동, DNA, RNA, 단백질 및 기타 분석과 같은 여러 응용 분야를 만들 수 있습니다. 3D 프린팅 인서트는 예를 들어 분자 또는 세포외 소포체의 효과를 분석할 수 있는 가능성도 제공합니다. 또한, 이러한 인서트가 3D 프린팅으로 만들어졌다는 사실은 구획 레이아웃 및 수많은 기능 분석에 대한 수많은 가능성을 제공합니다.
그러나 플레이트의 3D 프린팅 인서트 밀봉의 중요한 단계는 신중하게 고려해야 합니다. 실제로, 실리콘의 균질한 재분배는 밀봉을 보장하고 세포 배양 배지 또는 세포가 한 구획에서 다른 구획으로 누출되는 것을 방지하는 데 중요합니다. 문제를 방지하려면 실리콘이 플레이트와 접촉할 3D 프린팅 인서트 부분을 덮고 있는지 확인해야 합니다. 세포를 파종하기 전에 한 구획에 세포 배양 배지를 추가하고 다른 구획에 배지 누출이 없는지 관찰하여 올바른 밀봉을 확인해야 합니다. 70% 에탄올 수조에서 배양한 후 실리콘의 건조 시간도 중요한 단계입니다. 실제로, 알코올의 나머지 흔적은 세포 고정 및 독성으로 이어질 수 있습니다. 문제를 방지하려면 건조 시간을 준수해야 합니다.
결론적으로, 3D 프린팅 인서트는 2D 또는 3D 배양을 위한 대부분의 부착 세포 유형과 호환되며 다양한 실험 방법을 허용합니다. 이들은 수많은 공동 배양 연구에 적용될 수 있으며 간접 세포 통신을 조사하는 새로운 도구를 제공할 수 있습니다. 3D 프린팅 인서트는 모듈화, 유연성, 확장성이 뛰어나며 암학, 면역학 또는 혈관신생과 같은 생리병리학 연구를 위한 실험 모델을 설계하는 데 사용할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 경쟁하는 재정적 이익을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 연구는 BASF Beauty Care Solutions와 공동으로 이루어졌습니다. Charlie Colin-Pierre는 BASF / CNRS가 후원하는 박사 학위 펠로우입니다.
3D 프린팅 인서트의 개념에 대해 Mr. Mehdi Sellami에게 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Autoclave | Getinge | APHP | Solid cycle, 121 °C for 20 min |
| Biomed Clear | Formlabs | RS-F2-BMCL-01 | Impression performed by 3D-Morphoz company (Reims, France) |
| Cell culture detergents | Tounett | A18590/0116 | |
| Cell Proliferation Reagent WST-1 | Roche | 11,64,48,07,001 | |
| Counting slide | NanoEnTek | EVE-050 | |
| Culture-Insert 2 Well in μ-Dish 35 mm | Ibidi | 80206 | two-migration chambers device. |
| Endothelial cell medium | ScienCell | 1001 | Basal medium +/- 25 mL of fetal bovine serum (FBS, 0025), 5 mL of endothelial cell growth supplement (ECGS, 1052), and 5 mL of penicillin/streptomycin solution (P/S, 0503). |
| EVE Automated cell counter | NanoEnTek | NESCT-EVE-001E | |
| EVOS XL Core | Fisher Scientific | AMEX1200 | 10x of magnification |
| Food silicon reagent and catalyst kit | Artificina | RTV 3428 A and B | (10:1) |
| FORM 3B printer | Formlabs | PKG-F3B-WSVC-DSP-BASIC | Impression performed by 3D-Morphoz company |
| Human Dermal Microvascular Endothelial Cells (HDMEC) | ScienCell | 2000 | |
| Keratinocytes of Outer Root Sheath (KORS ) | ScienCell | 2420 | |
| Macro Wound Healing Tool Software | ImageJ | Software used for the measurement of the uncovered surface (for migration assays) | |
| Mesenchymal stem cell medium | ScienCell | 7501 | Basal medium +/-25 mL of fetal bovine serum (FBS, 0025), 5 mL of mesenchymal stem cell growth supplement (MSCGS, 7552), and 5 mL of penicillin/streptomycin solution (P/S, 0503) |
| Microplate reader SPECTRO star NANO | BMG Labtech | BMG LABTECH software | |
| PBS | Promocell | C-40232 | Without Ca2+ / Mg2+ |
| Trypan Blue Stain | NanoEnTek | EBT-001 | |
| Trypsin / EDTA | Promocell | C-41020 | Incubation of KORS at 37 °C with 5% CO2 for 5 min. Incubation of HDMECs for 5 min at room temperature |
| 96-well plate Nunclon Delta Surface | Thermoscientific | 167008 |
References
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