Summary
Bu yazıda, yeni tasarlanmış bir 3D baskılı ek, bir ko-kültür modeli olarak sunulmuş ve endotel hücreleri ile keratinositler arasındaki parakrin hücreler arası iletişimin incelenmesiyle doğrulanmıştır.
Abstract
Farklı hücre tipleri arasındaki dolaylı iletişimin klasik analizleri, şartlandırılmış ortamların kullanılmasını gerektirir. Ayrıca, şartlandırılmış ortamın üretimi zaman alıcı ve fizyolojik ve patolojik koşullardan uzak kalmaktadır. Birkaç ko-kültür modeli ticari olarak mevcut olmasına rağmen, bunlar spesifik tahlillerle sınırlı kalır ve çoğunlukla iki tip hücre içindir.
Burada, çok sayıda fonksiyonel tahlil ile uyumlu 3D baskılı kesici uçlar kullanılmaktadır. Ek parça, 6 oyuklu bir plakanın bir oyuğunun dört bölmeye ayrılmasına izin verir. Çok çeşitli kombinasyonlar ayarlanabilir. Ayrıca, bölmelerin her duvarında pencereler tasarlanmıştır, böylece her bölme arasında potansiyel hücreler arası iletişim, kültür ortamında hacme bağlı bir şekilde mümkün olur. Örneğin, parakrin hücreler arası iletişim, tek katmanlı, 3 boyutlu (sferoidler) veya her ikisini birleştirerek dört hücre tipi arasında incelenebilir. Ek olarak, farklı hücre tiplerinin bir karışımı aynı bölmede 2D veya 3D (organoidler) formatında ekilebilir. 3D baskılı eklerde bir tabanın olmaması, plaka üzerinde olağan kültür koşullarına, eki içeren plaka üzerinde olası kaplamaya ve optik mikroskopi ile doğrudan görselleştirmeye izin verir. Çoklu bölmeler, farklı hücre tiplerini bağımsız olarak toplama veya her bölmede RNA veya protein ekstraksiyonu için farklı reaktifler kullanma imkanı sağlar. Bu çalışmada, yeni 3D baskılı eki bir ko-kültür sistemi olarak kullanmak için ayrıntılı bir metodoloji sağlanmıştır. Bu esnek ve basit modelin çeşitli kapasitelerini göstermek için, daha önce yayınlanmış hücre iletişiminin fonksiyonel tahlilleri yeni 3D baskılı eklerde gerçekleştirildi ve tekrarlanabilir olduğu gösterildi. 3D baskılı ekler ve şartlandırılmış ortam kullanan geleneksel hücre kültürü benzer sonuçlara yol açtı. Sonuç olarak, 3D baskılı ek, yapışık hücre tiplerine sahip çok sayıda ko-kültür modeline uyarlanabilen basit bir cihazdır.
Introduction
İn vivo olarak, hücreler birbirleriyle doğrudan (hücre teması) veya dolaylı olarak (moleküllerin salgılanmasıyla) iletişim kurar. Hücre iletişimini incelemek için, doğrudan ko-kültür (farklı hücre tipleri aynı kuyuda doğrudan etkileşim halindedir) ve bölümlere ayrılmış ko-kültür (farklı hücre tipleri bir kültür sisteminin farklı bölmelerinde dolaylı etkileşim içindedir) gibi farklı ko-kültür modelleri geliştirilebilir1. Ayrıca, koşullu ortam, dolaylı etkileşimin, bir efektör hücre tipinin koşullu ortamında bulunan salgılanan moleküllerin bir yanıt veren hücre tip1'e aktarılmasıyla sağlandığı ko-kültür sistemleri için kullanılabilir.
Parakrin hücre iletişim çalışmaları söz konusu olduğunda, dolaylı ko-kültür sistemleri, hücre etkileşimlerini in vivo olarak güçlü bir şekilde yansıtan modeller sağlar. Dolaylı eş-kültür sistemleri geliştirilmiş ve ticarileştirilmiştir, bu da dolaylı eş-kültür modellerinin kurulmasına olanak sağlamıştır 2,3. Ne yazık ki, çoğu dolaylı ko-kültür sistemi sadece iki bölme sağlar. Diğer dolaylı ko-kültür sistemleri çoklu bölmeler sağlar, ancak bu makalede bildirilen sisteme kıyasla daha az ölçeklenebilirler. Bazıları mikroskop altında klasik bir görselleştirmeye izin vermez ve genellikle belirli uygulama yöntemleri sunarlar. Çeşitli çalışmalarda, farklı hücre tipleri arasındaki parakrin iletişim, koşullu ortam modeli 4,5,6,7 ile incelenmiştir. Bu, dolaylı ko-kültür sistemlerine kıyasla daha kolay bir araştırma yöntemidir, çünkü belirli yöntemlerin veya materyallerin oluşturulmasını gerektirmez1. Öte yandan, şartlandırılmış ortamın hazırlanması zaman alıcıdır ve yalnızca tek yönlü hücre sinyalizasyonu (efektörden yanıtlayıcıya) hakkında bilgi sağlar1.
Bu yazıda, hücre iletişimini araştırmak için yeni ve basit bir yol önerilmiştir. Doğrudan veya dolaylı etkileşimde ve 2D veya 3D formatlarında çeşitli hücre tiplerinin kombinasyonuna izin veren basılı ekler, ko-kültür modellerinin kolayca kurulması için çok sayıda avantaj sunar. 6 oyuklu plakaların kuyucuklarına yerleştirilmek üzere uyarlanmış olan 3D baskılı ek parça daireseldir ve kuyunun dört bölmeye ayrılmasına izin verir (iki büyük bölme ve iki küçük bölme; Şekil 1A). 3D baskılı ekler, bir tabanın olmaması ile karakterize edilir. Böylece hücreler, ekin yerleştirildiği plaka ile doğrudan temas halindedir. Ek olarak, her bölme diğerlerinden bağımsız olarak kaplanabilir. Ayrıca, hücre davranışı optik mikroskoplar altında kolayca takip edilebilir. Ek parçanın her duvarında iletişim pencerelerinin varlığı, farklı ortak kültür deneyleri yapmak için ortak bir ortamın en uygun zamanda eklenmesine izin verir. Çeşitli hücre tipleri arasındaki doğrudan ve/veya dolaylı iletişimi incelemek için çok sayıda ko-kültür kombinasyonu gerçekleştirilebilir. Örneğin, tek tabakalı ve/veya 3 boyutlu (sferoidler) dört farklı hücre tipi arasında dolaylı bir ko-kültür modeli tasarlanabilir. Doğrudan ve dolaylı ko-kültür modellerinin bir kombinasyonu, aynı bölmede farklı hücre tiplerinin karıştırılmasıyla da gerçekleştirilebilir. Karmaşık yapıların (organoidler, doku eksplantı vb.) farklı hücre tipleri üzerindeki etkisi, yapılabilecek modellere başka bir örnek olabilir. Ayrıca, 3D baskılı ekler, hücre biyolojisi fonksiyonel tahlilleri (proliferasyon, migrasyon, psödotüp oluşumu, farklılaşma vb.) ve biyokimya testleri (DNA, RNA, protein, lipitlerin ekstraksiyonu, vb.) ile uyumludur. Son olarak, 3D baskılı ekler, aynı deneyde aynı anda farklı tahlilleri farklı bölmelerde birleştirme imkanı ile çok çeşitli ko-kültür modellerinin deneysel şemalarını sağlar.
3D baskılı eklerin bazı kapasiteleri, bunları hızlı ve kullanımı kolay bir ortak kültür modeli olarak doğrulamak için sunulmuştur. Parakrin hücre iletişimi üzerine daha önce yayınlanmış bir çalışma ile karşılaştırıldığında, 3D baskılı eklerin değerli bir ko-kültür modeli olma yeteneği gösterilmiştir. Bu noktayı değerlendirmek için, keratinositler tarafından endotel hücre proliferasyonunun ve migrasyonunun düzenlenmesi, 3D baskılı insert sistemi ile şartlandırılmış ortam kullanan klasik sistem arasında karşılaştırıldı. 3D baskılı kesici uçlar, şartlandırılmış medya kullanan geleneksel sisteme kıyasla benzer sonuçların hızlı bir şekilde elde edilmesini sağlar. Gerçekten de, 3D baskılı ekler, şartlandırılmış ortam üretme zorunluluğu olmadan ve aynı deneyde proliferasyon ve migrasyon testlerini paralel olarak gerçekleştirme olasılığı ile her iki yönde hücre etkileşimlerini incelemek için sağlam bir model sağlar.
Sonuç olarak, bu yazıda hücre iletişimini incelemek için yeni ve kullanıma hazır bir model önerilmiştir. Tüm yapışık hücre tipleriyle uyumlu olan 3D baskılı ekler, in vivo koşullara daha yakın olmayı amaçlayan çok sayıda ko-kültür kombinasyonunun gerçekleştirilmesine olanak tanır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: 3D ekler (Şekil 1A) ticari olarak temin edilir ve hücre kültürü ve otoklavlama ile biyouyumlu bir fotopolimer reçine kullanılarak basılır (Malzeme Tablosuna bakın). Bu bölümde, eklerle ko-kültür modelini oluşturmak için ayrıntılı bir protokol açıklanmaktadır (bkz. Şekil 1B). Bazı uygulama örnekleri de verilmiştir.
1. Sterilize edilmiş ek parçanın 6 oyuklu plakalara yerleştirilmesi
- Kitte verilen iki bileşeni (Malzeme Tablosuna bakın), gıda silikonunu (reaktif A) ve katalizörü (reaktif B) üreticinin talimatlarına göre 10:1 (v/v) oranında karıştırın. (Şekil 1Ba). İki bileşeni karıştırmak için %70 etanol ile sterilize edilmiş bir spatula kullanın.
NOT: Hazırlanacak silikon karışımının hacmi, sabitlenecek ek parça sayısına bağlıdır. Fazla katalizör, silikon karışımının çok hızlı katılaşmasına neden olabilir. - Karışımın uçların alt kenarında homojen bir şekilde dağılması için ekleri silikon karışımın üzerine cımbızla uygulayın (Şekil 1Bb). Ekleri 6 oyuklu bir plakanın kuyularına yerleştirin ve hücre kültürü ortamının herhangi bir sızıntısını önlemek için eklerin plaka ile yakın temas halinde olduğundan emin olmak için uçlara hafif bir baskı uygulayın (Şekil 1Bc).
- Silikonun katılaşma sürecini 1 saat desteklemek için plakayı 37 °C'ye koyun.
NOT: Katılaşma süresi, eklenen katalizör miktarına bağlıdır. - Katılaşmadan sonra, plakaları 30 dakika ila 1 saat boyunca% 70 etanol banyosuna daldırarak eklerle sterilize edin.
- Alkolü pipetleyerek atın ve plakayı bir hücre kültürü kapağında gece boyunca kurumaya bırakın (kapak açık).
NOT: Hücre fiksasyonunu ve toksisiteyi önlemek için bir sonraki adımı gerçekleştirmeden önce alkol tamamen buharlaştırılmalıdır. Ekleri içeren kullanıma hazır plaka, oda sıcaklığında kuru ve steril koşullarda kullanılmadan önce birkaç gün saklanabilir.
2. Poli-L-lizin veya poli-HEMA gibi kaplamalar (İsteğe bağlı adım)
NOT: Bu deneyde kaplama yapılmamıştır ve eklerin kaplanma olasılığı hakkında bilgi vermek için adımlar verilmiştir.
- Kaplama çözeltisini üreticinin talimatlarına göre hazırlayın.
- Ek parçanın kaplanması için en büyük bölmeler için 200-400 μL'lik bir hacim ve en küçük bölmeler için 50-100 μL'lik bir hacim düşünün. Kaplama çözeltisini ayrı bölmelere ekleyin.
- Kaplamanın steril koşullar altında üretici tarafından belirtildiği şekilde kurumasını bekleyin.
3. Hücrelerin tohumlanması
- Dış kök kılıfının (KORS) keratinositlerini ve insan dermal mikrovasküler endotel hücrelerini (HDMEC'ler) üretici tarafından önerildiği şekilde kültürleyin. Hücreler birleştiğinde hücre süspansiyonunu hazırlayın.
- Ortamı şişelerden atın ve hücreleri ayırmak için 5 mL tripsin ekleyin (bkz.
- KORS içeren şişeyi 37 °C'de %5 CO2 ile 5 dakika bekletin. HDMEC'leri içeren şişeyi oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
- KORS içeren tripsin solüsyonunu,% 5 fetal sığır serumu (FBS) ve büyüme faktörleri (ek kit ile bazal besiyeri, bkz. Malzeme Tablosu) ile desteklenmiş 5 mL mezenkimal kök hücre ortamı (MSCM) ile karıştırın. HDMEC'leri içeren tripsin çözeltisini,% 5 FBS ve büyüme faktörleri ile desteklenmiş 5 mL endotel hücre ortamı (ECM) ile karıştırın (bkz.
- Hücreleri 15 mL'lik steril konik bir tüpe aktarın. KORS ve HDMEC süspansiyonlarını oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin.
- Süpernatanı atın ve hücreleri ilgili ortamın 2 mL'sinde yeniden süspanse edin.
- 10 μL hücre süspansiyonunu 10 μL tripan mavisi boya ile karıştırın (bkz.
- Sayma slaytının haznesine 10 μL karışım ekleyin.
- Sayma slaytını hücre sayma sistemine yerleştirin (Malzeme Tablosuna bakın) ve hücre numarasını ve canlılığını tespit edin.
- Hücre süspansiyonunu ilgili ortamda 0.5 x 105 hücre / mL konsantrasyonda hazırlayın.
NOT: Farklı hücre tipleri farklı yapışma süreleri gerektiriyorsa ve/veya ideal birleşmeye ulaşmak için hücre tohumlaması hücre tiplerine göre farklı zaman noktalarında yapılabilir.
- 800 μL ila 1 mL hücre süspansiyonunu tek tek büyük bölmelere ve 100-150 μL'yi bir pipetle ayrı küçük bölmelere dağıtın.
- KORS'u 1 x 10 5 hücre/mL'de MSCM'de tohumlayın, büyük bölmelerden birinde%5 FBS ve büyüme faktörleri ile desteklenmiştir.
- ECM'deki tohum HDMEC, küçük bölmelerde 2.5 x 103 hücre/mL'de ve diğer büyük bölmede 1.25 x 105 hücre/mL'de %5 FBS ve büyüme faktörleri ile desteklenmiştir.
NOT: Proliferasyon testi küçük bölmelerde, migrasyon ve canlılık deneyleri ise büyük bölmelerde gerçekleştirilebilir. Ekilen hücrelerin konsantrasyonu, üreticinin tavsiyelerine göre optimize edilmiştir. Bu konsantrasyon, 24-48 saatlik inkübasyondan sonra hücrelerin iyi bir şekilde yaşamasını sağlar.
- Hücre kültürü plakasını 37 °C'de %5 CO2 ile veya hücre yapışmasına ve/veya olgunlaşmasına izin vermek için normal koşullar altında yerleştirin.
NOT: Ortamı değiştirmeden hücreleri 24-48 saat inkübe edin. Gerekirse, bölmelerin ortamı bağımsız olarak değiştirilebilir.
4. Ortak kültürün uygulanması (Şekil 1Bd)
NOT: Ortak kültürün uygulanması, ortak ortamın eklendiği zamana karşılık gelir. Farklı bölmelerdeki tüm hücre tipleri için benzersiz bir ortamın eklenmesi, iletişim pencerelerinin (3D baskılı eklerin duvarlarındaki oval delikler) varlığı nedeniyle hücreler arasında parakrin iletişim imkanı sağlar. Ortak kültürü uygulamak için 4.1-4.3 adımlarını izleyin.
- Bir pipet kullanarak eklerin farklı bölmelerinin kültür ortamını boşaltın. 3D sferoid hücre kültürü durumunda, ortamı çok nazikçe atın.
- Hücreleri büyük bölmelerde 1 mL 37 °C sıcak PBS ve küçük bölmelerde 200 μL 37 °C sıcak PBS ile durulayın. Hücreleri ayırmamak için nazikçe yıkadığınızdan emin olun.
- Tüm hücre tipleri için uyumlu olacak şekilde seçilen ortak bir ortamdan 3 mL ekleyin.
NOT: Bu çalışmada bazal ECM (FBS ve büyüme faktörleri olmadan) kullanılmıştır. Ortamın tüm bölmeleri kapladığından emin olun ( Şekil 1A'da gösterildiği gibi iletişim pencerelerinin [duvarlardaki oval delikler] üzerindeki seviye). - Ko-kültürleri içeren plakayı 37 °C'de %5 CO2 ile 24-48 saat yerleştirin.
5. Hücre gözlemi, sayma ve kazıma
- Morfolojiyi gözlemleyin ve deney sırasında 24-48 saatlik inkübasyondan sonra optik mikroskop altında farklı bölmelerin hücre sayısını sayın.
NOT: Beklenen hücre sayısı, kullanılan hücre tiplerine (boyut, morfoloji vb.) ve bölme boyutuna bağlıdır. Bu deneyde, büyük bölmelerde 0.5 x 10 6-1 x 10 6 KORS/mL arasında ve 0.25 x 10 6-0.75 x 10 6 HDMECs/mL arasında sayılmıştır. - Hücre süspansiyonu sayımı için tripsin kullanarak hücreleri ayırın.
NOT: Hücre ayırma çözümü için, en büyük bölmeler için 100-500 μL'lik bir hacim ve en küçük bölmeler için 10-50 μL'lik bir hacim düşünün. - Tripan mavisi boyamayı kullanarak canlılığı kontrol edin (bkz. adım 3.1.6-3.1.8).
6. Geri dönüşüm için temizlik ekleyin
- Deneyin sonunda 6 oyuklu plakadan ekleri hafif bir bükülme ile çıkarın (Şekil 1Be).
- Silikonu çekerek eklerden çıkarın. Gerekirse, eklerin duvarlarına yapışmış kalan silikonu çıkarmak için bir spatula kullanın (Şekil 1Bf).
- Ekleri geleneksel hücre kültürü deterjanları ve temizlik malzemeleriyle yıkayın (örn.ampMalzeme Tablosunda verilmiştir).
- Ekleri ileride bir otoklavda (katı döngü, 20 dakika boyunca 121 °C) veya 1 saat boyunca %70 etanol banyosuna daldırarak kullanmak üzere sterilize edin.
NOT: Bu adımdan, 3D baskılı ekler kullanılarak iki olası test örneği (proliferasyon ve migrasyon deneyleri) açıklanmaktadır (Şekil 1Bd).
7. Hücre proliferasyon testi - WST-1 testi
- Hücreleri kültürlemek için 1-3.1 arasındaki adımları izleyin.
NOT: KORS sekretomunun HDMEC proliferasyonu üzerindeki etkisini araştırmak için ko-kültür sistemini uygulamak için bu bölümdeki adımı izleyin. KORS hücreleri, daha önce yayınlanan verileri karşılaştırmak için kullanılır8.- KORS'u 1 x 10 5 hücre / mL'de mezenkimal kök hücre ortamında (MSCM) tohumlayın, büyük bölmelerde%5 FBS ve büyüme faktörleri ile desteklenmiştir.
- Hücre kültürü plakasını 24 saat boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C'ye yerleştirin.
- HDMEC'leri, küçük bölmelerde 2.5 x 103 hücre / mL'de% 5 FBS ve büyüme faktörleri ile desteklenmiş endotel hücre ortamında (ECM) tohumlayın.
- Hücre kültürü plakasını 24-48 saat boyunca %5 CO2 ile 37 °C'ye yerleştirin.
- Ortamı tüm bölmelerden atın ve 3 mL takviye edilmemiş bazal ECM (3D baskılı eklerin tüm bölmeleri için ortak hücre kültürü ortamı) ekleyerek ko-kültür sistemini uygulayın.
- WST-1 çözeltisini hazırlamak için WST-1'i ECM ortak hücre kültürü ortamında (1:10 son seyreltme) seyreltin.
NOT: WST-1 çözeltisinin hacmi için, boşluk için en az 500 μL ekstra çözelti hazırlayın. - Pipetleme yoluyla hücre kültürü ortamını çekirdekten atın.
- WST-1 solüsyonunu seçilen bölmelere ekleyin (küçük bölmeler için 150 μL ve büyük bölmeler için 600 μL). Plakayı %5 CO ile 37 °C'ye getirin2.
- Optimum 30 dakikalık hücre inkübasyon süresinden sonra, her koşuldan 100 μL inkübasyon ortamını 96 oyuklu bir plaka üzerine aktarın.
- 420 nm ile 480 nm arasında bir mikroplaka okuyucu kullanarak kolorimetrik reaksiyonu değerlendirin.
- Plakayı mikroplaka okuyucuya koyun ve yeni bir protokol düzenle düğmesine tıklayın.
- Kullanılan 96 oyuklu plakanın özel tipini ( Malzeme Tablosuna bakın) ve 450 nm dalga boyunu seçin.
- Ölçümü başlat düğmesine tıklayın.
8. Hücre migrasyon tahlili - iki migrasyon odası cihazı
- Hücreleri kültürlemek için 1-3.1 arasındaki adımları izleyin.
NOT: KORS sekretomunun HDMEC proliferasyonu üzerindeki etkisini araştırmak amacıyla ko-kültür sistemini uygulamak için bu bölümdeki adımları izleyin.- KORS'u 1 x 10 5 hücre/mL'de MSCM'de tohumlayın, büyük bölmelerden birinde%5 FBS ve büyüme faktörleri ile desteklenmiştir.
- Hücre kültürü plakasını 24 saat boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C'ye yerleştirin.
- İki migrasyon haznesi cihazını diğer büyük ek bölmesine yerleştirin.
- İki migrasyon odası cihazının 7 x 10 5 hücresinde/kuyusunda%5 FBS ve büyüme faktörleri ile desteklenmiş ECM'deki HDMEC'leri tohumlayın.
- Hücre kültürü plakasını 24 saat boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C'ye yerleştirin.
- Ortamı ve iki migrasyon odası cihazını 24 saat sonra veya taşınan hücre tipine göre en uygun zamanda atın. Ko-kültür sistemini, 3 mL takviye edilmemiş bazal ECM ilavesiyle uygulayın.
NOT: Hücreleri ayırmamak için dikkatli bir şekilde ilerleyin. Hücreler, ortak ortamın eklenmesiyle indüklenen ayrılmaya karşı gerçekten hassassa, ortak ortamın eklenmesinden sonra iki migrasyon odası cihazını çekin.
- 10x büyütmede faz kontrast mikroskobu altında farklı zaman noktalarında hücrelerin kapladığı yüzeyi gözlemleyin ve fotoğrafını çekin.
NOT: Resimler faz kontrast mikroskobu ile çekilmiştir (bkz. Resimler bir USB anahtarına kaydedilir ve daha sonra yazılımın yara iyileştirme aracı eklentisi tarafından analiz edilir (bkz. - Klasik kantitatif analiz yazılımını kullanarak ortaya çıkarılan yüzeyi ölçün.
- Görüntüyü yazılımda açın ve makro listesinde bulunan yara iyileştirme aracını etkinleştirin.
- Geçiş görüntüsünün açıkta kalan yüzeyini ölçmek için m düğmesine tıklayın.
- Ortaya çıkarılan yüzey aşağıdaki formüle göre hesaplanır:
Kapsama yüzdesi = ([T0'da hücresiz ortalama alan − T zamanında hücresiz alan]/T0'da hücresiz ortalama alan) × 100.
NOT: 3D baskılı ekler, hücre biyolojisi tekniklerinin çoğuna (psödotüp oluşum testi, 3D kültürler gibi) ve biyokimya deneylerine (DNA, RNA, protein ekstraksiyonu gibi) tamamen uyarlanmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu çalışmada, şartlandırılmış ortamların kullanımı yoluyla klasik yöntemlerle karşılaştırılabilir sağlam, güvenilir ve anlamlı veriler elde etmek için optimize edilmiş bir ko-kültür sistemi tanımlanmıştır. 3D baskılı ekler, deneylerde zorlukların ve zaman alıcı koşullu ortam üretiminin üstesinden gelerek, etkileşim halindeki farklı hücre tiplerinin in vivo mikroçevre koşullarını taklit eder. Saç foliküllerinde bulunan iki hücre tipi arasındaki dolaylı etkileşimleri analiz etmek için daha önce yayınlanmış bir çalışma yeniden yapılmıştır: insan mikrovasküler endotel hücreleri (HDMEC'ler) ve dış kök kılıfının (KORS) insan keratinositleri8. Burada, HDMEC'ler ve KORS arasındaki dolaylı etkileşimleri araştırmak için şartlandırılmış ortam kullanan klasik yönteme kıyasla 3D baskılı ekler kullanılarak elde edilen sonuçların tekrarlanabilirliği gösterilmiştir. Daha önce çalışma8'de açıklanan hücre kültürü koşulları, bu çalışmadakiyle aynıydı. 3D baskılı eklerin boyutları göz önünde bulundurularak uyarlandılar (protokole bakın). Her şeyden önce, fenotip ve hücre canlılığı, tüm hücre tipleri için iki koşul (koşullu ortam ve .3D baskılı ekler) arasında karşılaştırılabilirdi (Şekil 2). Gerçekten de, 6 oyuklu plakaların kuyularında %90 canlılık gözlenmiştir (Şekil 2A ve Tablo 1) ve KORS için 3D baskılı eklerde (Şekil 2B ve Tablo 1) %91 gözlenmiştir. HDMEC'lerin canlılığı, 6 oyuklu plakanın kuyularında (Şekil 2C ve Tablo 2) %85 iken, 3D baskılı eklerde %86 idi (Şekil 2D ve Tablo 2). Hücre canlılığı verileri, otomatik hücre sayacı (Malzeme Tablosu) tarafından şu şekilde hesaplandı: canlı hücre sayısı, toplam hücre sayısına bölünür (ölü + canlı hücreler). Ortalama veriler, iki tekrarın gerçekleştirildiği altı bağımsız deneyde elde edilen canlılık yüzdesi hesaplanarak elde edilmiştir (bakınız Tablo 1 ve Tablo 2).
Bu sonuçlar, 3D baskılı ekin, 6 oyuklu plakalardaki normal kültüre kıyasla hücre davranışını veya canlılığını değiştirmediğini gösterdi. Bu nedenle, 3D baskılı ekler yeni bir ortak kültür modeli olarak doğrulandı.
Dolaylı hücre iletişiminindaha önce gösterilen 8 numaralı parametreleri analiz edildi. Tüm deneyler için, klasik kültür koşullarına uygun protokoller izlenerek 3D baskılı insert ko-kültür uygulaması gerçekleştirilmiştir (bkz. önceki çalışma8).
İlk olarak, 3D baskılı eklerde KORS ve HDMEC'ler arasındaki dolaylı hücre iletişimi, hücre proliferasyonu analiz edilerek değerlendirildi ve şartlandırılmış ortam kullanılarak klasik yöntemle karşılaştırıldı (Şekil 3). Eklerde (+ KORS) KORS varlığında, HDMEC proliferasyonu, KORS'suz kontrol durumuna (Kontrol) kıyasla 24 saat sonra 1,5 kat ve 48 saat sonra 3,1 kat önemli ölçüde artmıştır (Şekil 3A). Bu sonuçlar, koşullu ortam deneyleri ile elde edilenlerle uyumluydu (Şekil 3B). Gerçekten de, KORSCM'nin HDMEC proliferasyonunu 24 saat sonra 1,5 kat ve 48 saat sonra 2,1 kat önemli ölçüde arttırdığı gösterilmiştir.
KORS'un HDMEC göçü üzerindeki etkisini belirlemek için 3D baskılı kesici uç ko-kültür modeli test edildi. Bu etki daha önce şartlandırılmış ortam8 kullanılarak klasik ko-kültür sisteminde gösterilmiştir (Şekil 4). KORS'suz kontrol durumunda (Kontrol), HDMEC'ler göç etti ve 24 saat sonra yara alanının yaklaşık% 44'ünü kapladı (Şekil 4A). KORS (+ KORS) varlığında, HDMEC göçünde güçlü ve önemli bir artış gözlenmiştir. Gerçekten de, yara iyileşmesinin kinetiği, yara alanının sırasıyla %43, %67 ve %99'unun 3 saat, 12 saat ve 24 saat sonra HDMEC'ler tarafından kaplandığını gösterdi. Bu sonuçlar, KORSCM'nin HDMEC göçünü benzer şekilde arttırdığı gösterilen daha önce8 elde edilenlerle uyumluydu (Şekil 4B).
Şekil 1: Kesici ucun temizlenmesinden geri dönüşümüne kadar 3D baskılı kesici uç ko-kültürünün uygulanmasını gösteren iş akışı . (A) 3D baskılı ek parçanın temsili bir resmi. (B) Bu yazıda sunulan tahlillerin temsili bir örneği gösterilmiştir. Bir proliferasyon testinin, 3D baskılı eklerin diğer bölmelerine yerleştirilmiş iki migrasyon odası cihazı kullanılarak diğer bölmede gerçekleştirilen bir migrasyon testine paralel olarak 3D baskılı ekin bir bölmesinde yapılabileceğini unutmayın. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: KORS ve HDMEC canlılığı. (A,B) KORS morfolojisi (10x) (A) 6 oyuklu bir plakanın kuyusunda ve (B) 3D baskılı bir ekte. (C,D) HDMEC morfolojisi (10x) (C) 6 oyuklu plakalı bir kuyuda ve (D) 3D baskılı bir ekte. Ölçek çubuğu: 200 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: KORS'un HDMEC proliferasyonu üzerindeki etkisi. (A) HDMEC proliferasyonu, 24 saat veya 48 saat boyunca KORS (kontrol = CTRL) yokluğunda veya KORS (+ KORS) varlığında 3D baskılı ekte WST-1 boyası kullanılarak kolorimetrik test ile ölçüldü. (B) HDMEC proliferasyonu, ECM bazal hücre kültürü ortamı veya KORSCM varlığında WST-1 boyası kullanılarak kolorimetrik test ile ölçüldü 24 saat veya 48 saat için. Sonuçlar ortalama ± SEM olarak ifade edilir, n = 8 tekrar eder ve iki bağımsız deney yapılmıştır. *p < 0.05, ***p < 0.001, ****p < 0.0001 ve *****p < 0.00001. KORS, FBS ve büyüme faktörleri olmadan ECM'de inkübe edildi. 48 saat sonra, bu şartlandırılmış ortam toplandı ve deneyler için -80 ° C'de saklandı. Bu rakam 8'den değiştirilmiş ve izin alınarak çoğaltılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: KORS'un HDMEC göçü üzerindeki etkisi . (A) KORS yokluğunda (kontrol = CTRL) veya KORS (+ KORS) varlığında 3D baskılı ekte HDMEC'nin migrasyonu, geri kazanım yüzdesi olarak gösterilir ve ölçülür. (B) ECM veya KORSCM'deki HDMEC'lerin göçü, iyileşme yüzdesi olarak gösterilir ve ölçülür. Sonuçlar ortalama ± SEM olarak ifade edilmiş, n=3 tekrar edilmiş ve her tekrar için üç alan analiz edilmiş, iki bağımsız deney gerçekleştirilmiştir. **p<0.01, *****p<0.00001. Ölçek çubuğu: 200 μm. KORS, FBS ve büyüme faktörleri olmadan ECM'de inkübe edildi. 48 saat sonra, bu şartlandırılmış ortam toplandı ve deneyler için -80 ° C'de saklandı. Bu rakam 8'den değiştirilmiş ve izin alınarak çoğaltılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Sayı 1 | Sayı 2 | Demek | Toplam ortalama | ||
| 6 oyuklu plaka | Çoğalt 1 | 95% | 84% | 90% | 90% |
| 2'yi çoğalt | 90% | 88% | 89% | ||
| Çoğalt 3 | 85% | 89% | 87% | ||
| Çoğalt 4 | 97% | 89% | 93% | ||
| Çoğalt 5 | 88% | 94% | 91% | ||
| Çoğalt 6 | 86% | 92% | 89% | ||
| 3D baskılı ek parça | Çoğalt 1 | 92% | 89% | 91% | 91% |
| 2'yi çoğalt | 91% | 80% | 86% | ||
| Çoğalt 3 | 93% | 92% | 93% | ||
| Çoğalt 4 | 94% | 98% | 96% | ||
| Çoğalt 5 | 88% | 86% | 87% | ||
| Çoğalt 6 | 93% | 97% | 95% |
Tablo 1: KORS canlılık ölçümü. KORS canlılığı, 6 oyuklu bir plakanın kuyusunda ve tripan mavisi boyama ve otomatik sayım kullanılarak 3D baskılı bir ekte ölçüldü.
| Sayı 1 | Sayı 2 | Demek | Toplam ortalama | ||
| 6 oyuklu plaka | Çoğalt 1 | 90% | 88% | 89% | 85% |
| 2'yi çoğalt | 79% | 78% | 79% | ||
| Çoğalt 3 | 71% | 75% | 73% | ||
| Çoğalt 4 | 86% | 82% | 84% | ||
| Çoğalt 5 | 91% | 88% | 90% | ||
| Çoğalt 6 | 99% | 94% | 97% | ||
| 3D baskılı ek parça | Çoğalt 1 | 99% | 86% | 93% | 86% |
| 2'yi çoğalt | 80% | 75% | 78% | ||
| Çoğalt 3 | 79% | 80% | 80% | ||
| Çoğalt 4 | 98% | 85% | 92% | ||
| Çoğalt 5 | 85% | 78% | 82% | ||
| Çoğalt 6 | 89% | 93% | 91% |
Tablo 2: HDMEC canlılık ölçümü. HDMEC canlılığı, 6 oyuklu bir plakanın kuyusunda ve tripan mavisi boyama ve otomatik sayım kullanılarak 3D baskılı bir ekte ölçüldü.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dolaylı hücre iletişimi genellikle koşullu ortam veya ko-kültür sistemi cihazları kullanılarak araştırılır. Şartlandırılmış ortam hazırlama, deneylerde yukarı yönde zaman alıcıdır ve bu yöntem tek taraflı etki analizleriyle sınırlıdır. Colin-Pierre ve arkadaşları tarafından yapılan önceki çalışma.8 şartlandırılmış ortam kullanılarak, iki hücre tipi (HDMEC'ler ve KORS) arasındaki dolaylı hücre iletişimi üzerinde gerçekleştirilmiştir. Bu önceki çalışmanın verileri, KORS koşullu ortamın HDMEC proliferasyonu üzerindeki etkisini ve KORS koşullu ortamın HDMEC migrasyonu, psödotüp oluşumu ve GPC1 ekspresyonu üzerindeki etkisini göstermiştir8. Bu çalışmada, dolaylı hücre iletişimini araştırmak için daha basit ve hızlı bir yol anlatılmıştır. Aslında, 3D baskılı ekler, deneysel tasarımda ve çoklu hücre kültürü kombinasyonlarında esneklik sağlar. Bu 3D baskılı ekleri ko-kültürler için bir model olarak doğrulamak için, hücre proliferasyonu ve hücre göçü analiz edildi ve koşullu ortam8 kullanılarak önceki çalışma ile karşılaştırıldı. Her iki çalışmada da, yara iyileşme testi, eki içeren veya içermeyen kuyucuğa yerleştirilen iki migrasyon odası cihazı (Kültür-Ekleme 2 Kuyusu μ-Çanak 35 mm) kullanılarak gerçekleştirildi. Bu migrasyon test cihazı 9,10, iki odayı sınırlayan duvarın (yarayı simüle eden) bıraktığı ayak izinin sabit olması nedeniyle sıfırdan tahlillerden11,12 farklıdır. Bu nedenle, yüksek oranda tekrarlanabilir. Bu çalışmanın sonuçları, şartlı medya deneylerine kıyasla benzer bir sonuca yol açmıştır. 3D baskılı ekler hücre davranışını değiştirmez ve hücre yapışmasını destekleyen bağımsız bölme kaplamaları yapmak için uyarlanmıştır. Bununla birlikte, 3D baskılı ekler, örneğin sferoid/organoid kültürü için düşük yapışmayı indüklemek için poli-HEMA ile bir kaplama yapılmasına da izin verir. HDMEC'ler ve KORS arasındaki dolaylı iletişim, 3D baskılı ekler tarafından sağlanan çoklu uygulamaların bir örneği olarak burada araştırılmıştır.
Belirli bir kaplama gerektiren veya gerektirmeyen yapışkan hücre tiplerine uygulanabilir olan bu yeni cihaz, ko-kültür modelinin oluşturulması için önemli ölçüde zaman tasarrufu sağlar. Gerçekten de, 3D baskılı eklerin dört bölmesi, farklı kombinasyonlarla aynı kuyucukta tek katmanlı veya 3D (agregalar veya sferoidler) olarak birkaç hücre tipinin kültürüne izin verir. Örneğin, dört hücre tipinin tek katmanlı, 3D (sferoidler) veya her ikisinin bir kombinasyonu olarak dolaylı iletişimi analiz edilebilir. Deneyler sırasında, sferoidler bir poli-HEMA kaplama kullanılarak 3D baskılı eklerde kültürlendi (veriler gösterilmemiştir). Sferoidler, düşük ataşman bağlama plakası nedeniyle 3D olarak ekilen hücrelerden oluşuyordu ve 48 saat sonra analizler için 3D baskılı eke aktarıldı. Birkaç günlük kültürden sonra, sferoidlerin büyümesi gözlendi. Bu sonuçlar, 3D baskılı ekin, bir kültür plakasında olduğu gibi sferoidlerin transferinden sonra 3D hücre büyümesini takip etmek için kullanılabileceğini göstermektedir13,14. Ayrıca, hem doğrudan hem de dolaylı hücre iletişimini incelemek için farklı hücre tiplerinin bir karışımı, 2D veya 3D (organoidler) olarak aynı bölmede bir araya getirilebilir. Gerçekten de, 3D baskılı eklerin sunduğu geniş modülerlik yelpazesi, bu yenilikçi hücre ko-kültür sistemini karakterize eder. Ek olarak, iletişim pencerelerinin varlığı, koşullu ortamın yardımı olmadan seçilen bir zamanda tüm hücre tipleri için ortak bir ortamda kullanılmasına izin verir. Bu nedenle, bu teknik süspansiyon halinde kültürlenen hücrelere uygulanamaz. Dört bölmeyi ayıran duvarlar, her hücre tipinin diğerlerinden bağımsız olarak tohumlanmasına, hasat edilmesine ve analiz edilmesine izin verir. Psödotüp oluşum testleri ve proliferasyonu, migrasyon, DNA, RNA, protein ve diğer analizler gibi çeşitli uygulamalar yapılabilir. 3D baskılı ekler, örneğin moleküllerin veya hücre dışı veziküllerin etkisini analiz etme imkanı da sunar. Ayrıca, bu eklerin 3D baskı ile yapılmış olması, bölme yerleşimi ve çok sayıda fonksiyonel tahlil için sayısız olanak sağlar.
Bununla birlikte, plakadaki 3D baskılı kesici uç sızdırmazlığının kritik adımı dikkatlice düşünülmelidir. Gerçekten de, silikonun homojen bir şekilde yeniden bölünmesi, sızdırmazlığı sağlamak ve hücre kültürü ortamının veya hücrelerin bir bölmeden diğerine sızmasını önlemek için çok önemlidir. Herhangi bir sorunu önlemek için, silikonun 3D baskılı eklerin plaka ile temas edecek kısmını kapladığından emin olunmalıdır. Hücreleri tohumlamadan önce, bir bölmeye hücre kültürü ortamı ekleyerek ve diğer bölmelerde ortam sızıntısı olmadığını gözlemleyerek doğru sızdırmazlığı kontrol edilmelidir. Silikonun %70 etanol banyosunda inkübasyondan sonra kuruma süresi de kritik bir adımdır. Gerçekten de, kalan alkol izleri hücre fiksasyonuna ve toksisiteye yol açabilir. Herhangi bir sorun yaşamamak için kuruma süresine uyulmalıdır.
Sonuç olarak, 3D baskılı ekler, 2D veya 3D kültür için çoğu yapışık hücre tipiyle uyumludur ve çok sayıda deney yöntemine izin verir. Çok sayıda ko-kültür çalışması için uyarlanabilirler ve dolaylı hücre iletişimini araştırmak için yeni bir araç sağlayabilirler. 3D baskılı ekler modüle edilebilir, esnek, ölçeklenebilirdir ve kanseroloji, immünoloji veya anjiyogenez gibi fizyo-patolojilerin çalışmaları için deneysel modeller tasarlamak için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkar beyan etmemektedir.
Acknowledgments
Bu çalışma BASF Beauty Care Solutions ile işbirliği içinde yapılmıştır. Charlie Colin-Pierre, BASF /CNRS tarafından finanse edilen bir doktora bursiyeridir.
Sayın Mehdi Sellami'ye 3D baskılı eklerin konsepti için teşekkür etmek istiyoruz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Autoclave | Getinge | APHP | Solid cycle, 121 °C for 20 min |
| Biomed Clear | Formlabs | RS-F2-BMCL-01 | Impression performed by 3D-Morphoz company (Reims, France) |
| Cell culture detergents | Tounett | A18590/0116 | |
| Cell Proliferation Reagent WST-1 | Roche | 11,64,48,07,001 | |
| Counting slide | NanoEnTek | EVE-050 | |
| Culture-Insert 2 Well in μ-Dish 35 mm | Ibidi | 80206 | two-migration chambers device. |
| Endothelial cell medium | ScienCell | 1001 | Basal medium +/- 25 mL of fetal bovine serum (FBS, 0025), 5 mL of endothelial cell growth supplement (ECGS, 1052), and 5 mL of penicillin/streptomycin solution (P/S, 0503). |
| EVE Automated cell counter | NanoEnTek | NESCT-EVE-001E | |
| EVOS XL Core | Fisher Scientific | AMEX1200 | 10x of magnification |
| Food silicon reagent and catalyst kit | Artificina | RTV 3428 A and B | (10:1) |
| FORM 3B printer | Formlabs | PKG-F3B-WSVC-DSP-BASIC | Impression performed by 3D-Morphoz company |
| Human Dermal Microvascular Endothelial Cells (HDMEC) | ScienCell | 2000 | |
| Keratinocytes of Outer Root Sheath (KORS ) | ScienCell | 2420 | |
| Macro Wound Healing Tool Software | ImageJ | Software used for the measurement of the uncovered surface (for migration assays) | |
| Mesenchymal stem cell medium | ScienCell | 7501 | Basal medium +/-25 mL of fetal bovine serum (FBS, 0025), 5 mL of mesenchymal stem cell growth supplement (MSCGS, 7552), and 5 mL of penicillin/streptomycin solution (P/S, 0503) |
| Microplate reader SPECTRO star NANO | BMG Labtech | BMG LABTECH software | |
| PBS | Promocell | C-40232 | Without Ca2+ / Mg2+ |
| Trypan Blue Stain | NanoEnTek | EBT-001 | |
| Trypsin / EDTA | Promocell | C-41020 | Incubation of KORS at 37 °C with 5% CO2 for 5 min. Incubation of HDMECs for 5 min at room temperature |
| 96-well plate Nunclon Delta Surface | Thermoscientific | 167008 |
References
- Regier, M. C., Alarid, E. T., Beebe, D. J. Progress towards understanding heterotypic interactions in multi-culture models of breast cancer. Integrative Biology. 8 (6), 684-692 (2016).
- Doğan, A., Demirci, S., Apdik, H., Apdik, E. A., Şahin, F. Mesenchymal stem cell isolation from pulp tissue and co-culture with cancer cells to study their interactions. Journal of Visualized Experiments. (143), e58825 (2019).
- Lin, J., et al. Long non-coding RNA UBE2CP3 enhances HCC cell secretion of VEGFA and promotes angiogenesis by activating ERK1/2/HIF-1α/VEGFA signalling in hepatocellular carcinoma. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 37 (1), 113 (2018).
- Soares, N. L., et al. Carbon monoxide modulation of microglia-neuron communication: Anti-neuroinflammatory and neurotrophic role. Molecular Neurobiology. 59 (2), 872-889 (2022).
- Al Halawani, A., Abdulkhalek, L., Mithieux, S. M., Weiss, A. S. Tropoelastin promotes the formation of dense, interconnected endothelial networks. Biomolecules. 11 (9), 1318 (2021).
- Mercatali, L., et al. Development of a human preclinical model of osteoclastogenesis from peripheral blood monocytes co-cultured with breast cancer cell lines. Journal of Visualized Experiments. (127), e56311 (2017).
- Orona, N. S., Astort, F., Maglione, G. A., Yakisich, J. S., Tasat, D. R. Direct and indirect effect of air particles exposure induce Nrf2-dependent cardiomyocyte cellular response in vitro. Cardiovascular Toxicology. 19 (6), 575-587 (2019).
- Colin-Pierre, C., et al. The glypican-1/HGF/C-met and glypican-1/VEGF/VEGFR2 ternary complexes regulate hair follicle angiogenesis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 781172 (2021).
- Toubal, A., et al. The NC1 domain of type XIX collagen inhibits melanoma cell migration. European Journal of Dermatology. 20 (6), 712-718 (2010).
- Wu, A. -L., et al. Role of growth factors and internal limiting membrane constituents in müller cell migration. Experimental Eye Research. 202, 108352 (2021).
- Oudart, J. -B., et al. Plasmin releases the anti-tumor peptide from the NC1 domain of collagen XIX. Oncotarget. 6 (6), 3656-3668 (2015).
- Martinotti, S., Ranzato, E.
- Cattin, S., Ramont, L., Rüegg, C. Characterization and in vivo validation of a three-dimensional multi-cellular culture model to study heterotypic interactions in colorectal cancer cell growth, invasion and metastasis. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 97 (2018).
- Ma, Y. N., et al. Three-dimensional spheroid culture of adipose stromal vascular cells for studying adipogenesis in beef cattle. Animal. 12 (10), 2123-2129 (2018).
