Summary
In dit artikel wordt een nieuw ontworpen 3D-geprinte insert gepresenteerd als een model van co-cultuur en gevalideerd door de studie van de paracriene intercellulaire communicatie tussen endotheelcellen en keratinocyten.
Abstract
De klassieke analyses van indirecte communicatie tussen verschillende celtypen vereisen het gebruik van geconditioneerde media. Bovendien blijft de productie van geconditioneerde media tijdrovend en ver verwijderd van fysiologische en pathologische omstandigheden. Hoewel een paar modellen van co-cultuur in de handel verkrijgbaar zijn, blijven ze beperkt tot specifieke testen en zijn ze meestal voor twee soorten cellen.
Hier worden 3D-geprinte inserts gebruikt die compatibel zijn met tal van functionele assays. Het inzetstuk maakt de scheiding van één put van een 6-well plaat in vier compartimenten mogelijk. Er kan een breed scala aan combinaties worden ingesteld. Bovendien zijn ramen in elke wand van de compartimenten zo ontworpen dat potentiële intercellulaire communicatie tussen elk compartiment op een volumeafhankelijke manier in het kweekmedium mogelijk is. Paracriene intercellulaire communicatie kan bijvoorbeeld worden bestudeerd tussen vier celtypen in monolaag, in 3D (sferoïden) of door beide te combineren. Bovendien kan een mix van verschillende celtypen in hetzelfde compartiment worden gezaaid in 2D- of 3D-formaat (organoïden). De afwezigheid van een bodem in de 3D-geprinte inzetstukken maakt de gebruikelijke kweekomstandigheden op de plaat, mogelijke coating op de plaat met de insert en directe visualisatie door optische microscopie mogelijk. De meerdere compartimenten bieden de mogelijkheid om verschillende celtypen onafhankelijk van elkaar te verzamelen of om in elk compartiment verschillende reagentia te gebruiken voor RNA- of eiwitextractie. In deze studie wordt een gedetailleerde methodologie gegeven om de nieuwe 3D-geprinte insert te gebruiken als een co-cultuursysteem. Om verschillende capaciteiten van dit flexibele en eenvoudige model aan te tonen, werden eerder gepubliceerde functionele assays van celcommunicatie uitgevoerd in de nieuwe 3D-geprinte inserts en werden aangetoond dat ze reproduceerbaar zijn. De 3D-geprinte inserts en de conventionele celcultuur met behulp van geconditioneerde media leidden tot vergelijkbare resultaten. Kortom, de 3D-geprinte insert is een eenvoudig apparaat dat kan worden aangepast aan tal van modellen van co-culturen met aanhangende celtypen.
Introduction
In vivo communiceren cellen direct (celcontact) of indirect (door afscheiding van moleculen) met elkaar. Om celcommunicatie te bestuderen, kunnen verschillende cocultuurmodellen worden ontwikkeld, zoals directe cocultuur (de verschillende celtypen zijn in directe interactie in dezelfde put) en gecompartimenteerde cocultuur (de verschillende celtypen zijn in indirecte interactie in verschillende compartimenten van een cultuursysteem)1. Bovendien kunnen geconditioneerde media worden gebruikt voor co-cultuursystemen, waarbij de indirecte interactie mogelijk wordt gemaakt door uitgescheiden moleculen in de geconditioneerde media van een effectorceltype dat wordt overgebracht naar een responderceltype1.
In het geval van paracriene celcommunicatiestudies bieden indirecte cocultuursystemen modellen die celinteracties in vivo sterk weerspiegelen. Indirecte co-cultuur systemen zijn ontwikkeld en gecommercialiseerd, waardoor de oprichting van indirecte co-cultuur modellen 2,3. Helaas bieden de meeste indirecte co-cultuursystemen slechts twee compartimenten. Andere indirecte co-cultuursystemen bieden meerdere compartimenten, maar ze zijn minder schaalbaar in vergelijking met het systeem dat in dit manuscript wordt gerapporteerd. Sommigen van hen laten geen klassieke visualisatie onder een microscoop toe en ze presenteren vaak specifieke toepassingsmethoden. In verschillende studies wordt de paracriene communicatie tussen verschillende celtypen onderzocht door het geconditioneerde mediamodel 4,5,6,7. Dit is een gemakkelijkere manier van onderzoek in vergelijking met indirecte cocultuursystemen, omdat het geen specifieke methoden of materialen vereist om te worden vastgesteld1. Aan de andere kant is de voorbereiding van geconditioneerde media tijdrovend en levert alleen informatie op over eenrichtingscelsignalering (effector naar responder)1.
In dit artikel wordt een nieuwe, eenvoudige manier voorgesteld om celcommunicatie te onderzoeken. Door de combinatie van verschillende celtypen in directe of indirecte interactie en in 2D- of 3D-formaten mogelijk te maken, bieden de geprinte inserts tal van voordelen voor het eenvoudig opzetten van co-cultuurmodellen. Aangepast om in de putten van 6-putplaten te worden geplaatst, is het 3D-geprinte inzetstuk cirkelvormig en maakt het scheiding van de put in vier compartimenten mogelijk (twee grote compartimenten en twee kleine compartimenten; Figuur 1A). De 3D-geprinte inzetstukken kenmerken zich door de afwezigheid van een bodem. De cellen staan dus in direct contact met de plaat waarop de insert is geplaatst. Bovendien kan elk compartiment onafhankelijk van de andere worden gecoat. Bovendien kan het celgedrag gemakkelijk worden gevolgd onder optische microscopen. De aanwezigheid van communicatievensters in elke wand van de insert maakt de toevoeging, op het optimale moment, van een gemeenschappelijk medium mogelijk om verschillende experimenten van co-cultuur uit te voeren. Talrijke combinaties van co-cultuur kunnen worden uitgevoerd om directe en / of indirecte communicatie tussen verschillende celtypen te bestuderen. Zo kan een model van indirecte cocultuur tussen vier verschillende celtypen in monolaag en/of in 3D (sferoïden) worden ontworpen. Een combinatie van directe en indirecte co-cultuurmodellen kan ook worden uitgevoerd door verschillende celtypen in hetzelfde compartiment te mengen. Het effect van complexe structuren (organoïden, weefselexplant, enz.) op verschillende celtypen zou een ander voorbeeld kunnen zijn van modellen die kunnen worden gemaakt. Bovendien zijn de 3D-geprinte inserts compatibel met functionele assays van de celbiologie (proliferatie, migratie, pseudobuisvorming, differentiatie, enz.) en met biochemische tests (de extractie van DNA, RNA, eiwitten, lipiden, enz.). Ten slotte bieden de 3D-geprinte inserts een breed scala aan experimentele schema's van co-cultuurmodellen met de mogelijkheid om tegelijkertijd verschillende assays in hetzelfde experiment in de verschillende compartimenten te combineren.
Sommige capaciteiten van de 3D-geprinte inserts worden gepresenteerd om ze te valideren als een snel en eenvoudig te gebruiken co-cultuurmodel. In vergelijking met een eerder gepubliceerde studie uitgevoerd op paracriene celcommunicatie, wordt het vermogen van de 3D-geprinte inserts om een waardevol co-cultuurmodel te zijn, aangetoond. Om dit punt te beoordelen, werd de regulatie van endotheelcelproliferatie en migratie door keratinocyten vergeleken tussen het 3D-geprinte insertsysteem en het klassieke systeem met behulp van geconditioneerde media. De 3D-geprinte wisselplaten maken het mogelijk om snel vergelijkbare resultaten te verkrijgen in vergelijking met het conventionele systeem met behulp van geconditioneerde media. De 3D-geprinte inserts bieden inderdaad een robuust model om celinteracties in beide richtingen te bestuderen zonder de noodzaak om geconditioneerde media te produceren en met de mogelijkheid om parallel de proliferatie- en migratietests in hetzelfde experiment uit te voeren.
Tot slot wordt in dit artikel een nieuw en kant-en-klaar model voorgesteld om celcommunicatie te bestuderen. De 3D-geprinte inserts zijn compatibel met alle adherente celtypen en maken het mogelijk om talloze combinaties van co-cultuur uit te voeren die gericht zijn op het dichter bij in vivo omstandigheden zijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: De 3D-inzetstukken (figuur 1A) worden commercieel verkregen en worden geprint met behulp van een fotopolymeerhars die biocompatibel is met celkweek en autoclaveren (zie de materiaaltabel). In deze paragraaf wordt een gedetailleerd protocol beschreven om het cocultuurmodel vast te stellen door middel van inserts (zie figuur 1B). Er worden ook enkele voorbeelden van toepassingen gegeven.
1. Plaatsing van de gesteriliseerde insert in de 6-well platen
- Meng de twee componenten in de kit (zie materiaaltabel), voedingssilicium (reagens A) en katalysator (reagens B), in een verhouding van 10:1 (v/v) volgens de instructies van de fabrikant. (Figuur 1Ba). Gebruik een 70% ethanol gesteriliseerde spatel om de twee componenten te mengen.
OPMERKING: Het volume van het te bereiden siliciummengsel is afhankelijk van het aantal te fixeren inserts. Een teveel aan katalysator kan ertoe leiden dat het siliciummengsel te snel stolt. - Breng de inserts met een pincet aan op het siliconenmengsel, zodat het mengsel homogeen wordt verdeeld aan de onderkant van de inserts (figuur 1Bb). Plaats de inzetstukken in de putjes van een 6-putplaat en oefen zachte druk uit op de inzetstukken om ervoor te zorgen dat de inzetstukken in nauw contact staan met de plaat om lekkage van het celkweekmedium te voorkomen (figuur 1Bc).
- Zet de plaat gedurende 1 uur op 37 °C om het stollingsproces van het silicium te ondersteunen.
OPMERKING: De tijd van stolling is afhankelijk van de hoeveelheid katalysator die is toegevoegd. - Steriliseer na het stollen de platen met de inzetstukken door ze gedurende 30 minuten tot 1 uur onder te dompelen in een 70% ethanolbad.
- Gooi de alcohol weg door pipetteren en laat de plaat een nacht drogen (deksel open) in een celkweekkap.
OPMERKING: De alcohol moet volledig worden verdampt voordat de volgende stap wordt uitgevoerd om celfixatie en toxiciteit te voorkomen. De kant-en-klare plaat met de inzetstukken kan enkele dagen worden bewaard voor gebruik in droge en steriele omstandigheden bij kamertemperatuur.
2. Coatings zoals poly-L-lysine of poly-HEMA (optionele stap)
OPMERKING: Coating wordt niet uitgevoerd in dit experiment en de stappen worden gegeven om te informeren over de mogelijkheid om de inserts te coaten.
- Bereid de coatingoplossing voor volgens de instructies van de fabrikant.
- Overweeg een volume van 200-400 μL voor de grootste compartimenten en een volume van 50-100 μL voor de kleinste compartimenten voor de coating van het inzetstuk. Voeg de coatingoplossing toe aan de afzonderlijke compartimenten.
- Laat de coating drogen zoals aangegeven door de fabrikant onder steriele omstandigheden.
3. Zaaien van de cellen
- Kweek de keratinocyten van de buitenste wortelschede (KORS) en menselijke dermale microvasculaire endotheelcellen (HDMECs) zoals aanbevolen door de fabrikant. Bereid de celsuspensie voor zodra de cellen samenvloeiing bereiken.
- Gooi het medium uit de kolven en voeg 5 ml trypsine toe om de cellen los te maken (zie materiaaltabel).
- Plaats de kolf met de KORS gedurende 5 minuten op 37 °C met 5% CO2 . Incubeer de kolf met de HDMEC's gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Meng de trypsine-oplossing met de KORS met 5 ml mesenchymaal stamcelmedium (MSCM) aangevuld met 5% foetaal runderserum (FBS) en groeifactoren (basaal medium met supplementkit, zie materiaaltabel). Meng de trypsine-oplossing met de HDMECs met 5 ml endotheelcelmedium (ECM) aangevuld met 5% FBS en groeifactoren (zie tabel met materialen).
- Breng de cellen over in een 15 ml steriele conische buis. Centrifugeer de KORS- en HDMEC-suspensies gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur op 200 x g.
- Gooi het supernatant weg en resuspensie de cellen in 2 ml van het betreffende medium.
- Meng 10 μL van de celsuspensie met 10 μL trypanblauwe kleurstof (zie materiaaltabel).
- Voeg 10 μL van het mengsel toe aan de kamer van de telglaas.
- Plaats de telschuif in het celtelsysteem (zie materiaaltabel) en detecteer het celnummer en de levensvatbaarheid.
- Bereid de celsuspensie in een concentratie van 0,5 x 105 cellen/ml in het betreffende medium.
OPMERKING: Als de verschillende celtypen verschillende tijdstippen van hechting vereisen en/of om de ideale samenvloeiing te bereiken, kan de celzaaiing op verschillende tijdstippen worden gemaakt, afhankelijk van de celtypen.
- Verdeel 800 μL tot 1 ml van de celsuspensie in de afzonderlijke grote compartimenten en 100-150 μL in de afzonderlijke kleine compartimenten met een pipet.
- Zaai de KORS op 1 x 10 5 cellen/ml in MSCM aangevuld met5% FBS en groeifactoren in een van de grote compartimenten.
- Zaad HDMEC in ECM aangevuld met 5% FBS en groeifactoren bij 2,5 x 103 cellen/ml in de kleine compartimenten en bij 1,25 x 105 cellen/ml in het andere grote compartiment.
OPMERKING: De proliferatietest kan worden uitgevoerd in de kleine compartimenten en de migratie- en levensvatbaarheidstests kunnen worden uitgevoerd in de grote compartimenten. De concentratie van de gezaaide cellen is geoptimaliseerd volgens de aanbevelingen van de fabrikant. Deze concentratie zorgt voor een goede levensvatbaarheid van de cellen na 24-48 uur incubatie.
- Plaats de celkweekplaat op 37 °C met 5% CO2 of onder de gebruikelijke omstandigheden om celhechting en/of rijping mogelijk te maken.
OPMERKING: Incubeer de cellen gedurende 24-48 uur zonder de media te veranderen. Indien nodig kan het medium van de compartimenten onafhankelijk worden gewijzigd.
4. Implementatie van de cocultuur (figuur 1Bd)
OPMERKING: De implementatie van de co-cultuur komt overeen met het tijdstip waarop het gemeenschappelijke medium wordt toegevoegd. De toevoeging van een uniek medium voor alle celtypen in de verschillende compartimenten biedt de mogelijkheid van paracriene communicatie tussen de cellen vanwege de aanwezigheid van communicatievensters (eivormige gaten in de wanden van de 3D-geprinte inserts). Volg de stappen 4.1-4.3 om de cocultuur te implementeren.
- Leeg de kweekmedia van de verschillende compartimenten van de inzetstukken met behulp van een pipet. In het geval van een 3D-sferoïde celcultuur, gooi het medium heel voorzichtig weg.
- Spoel de cellen met 1 ml warme PBS van 37 °C in de grote compartimenten en 200 μL van 37 °C warme PBS in de kleine compartimenten. Zorg voor voorzichtig wassen om de cellen niet los te maken.
- Voeg 3 ml van een gemeenschappelijk medium toe dat is geselecteerd om compatibel te zijn voor alle celtypen.
OPMERKING: In deze studie wordt de basale ECM (zonder FBS en groeifactoren) gebruikt. Zorg ervoor dat het medium alle compartimenten bedekt (niveau boven de communicatievensters [eivormige gaten in de wanden], zoals weergegeven in figuur 1A). - Plaats de plaat met de coculturen gedurende 24-48 uur op 37 °C met 5% CO2 .
5. Celobservatie, tellen en schrapen
- Observeer de morfologie en tel het celnummer van de verschillende compartimenten tijdens het experiment onder een optische microscoop na 24-48 uur incubatie.
OPMERKING: Het verwachte aantal cellen is afhankelijk van de gebruikte celtypen (grootte, morfologie, enz.) en van de grootte van het compartiment. In dit experiment worden tussen 0,5 x 10 6-1 x 10 6 KORS/ml en tussen 0,25 x 10 6-0,75 x 10 6 HDMECs/ml geteld in de grote compartimenten. - Maak de cellen los met trypsine voor het tellen van de celsuspensie.
OPMERKING: Overweeg voor de celloslatingsoplossing een volume van 100-500 μL voor de grootste compartimenten en een volume van 10-50 μL voor de kleinste compartimenten. - Controleer de levensvatbaarheid met behulp van trypan blue kleuring (zie stappen 3.1.6-3.1.8).
6. Insert reiniging voor recycling
- Verwijder de inzetstukken van de 6-putplaat aan het einde van het experiment met een lichte draaiing (figuur 1Be).
- Verwijder het silicium van de inzetstukken door het eraf te trekken. Gebruik indien nodig een spatel om het resterende silicium dat aan de wanden van de inzetstukken is vastgeplakt te verwijderen (figuur 1Bf).
- Was de inzetstukken met conventionele celkweekreinigingsmiddelen en reinigingsmaterialen (voorbeeld in de materiaaltabel).
- Steriliseer de inzetstukken voor toekomstig gebruik in een autoclaaf (vaste cyclus, 121 °C gedurende 20 minuten) of door ze gedurende 1 uur onder te dompelen in een 70% ethanolbad.
OPMERKING: In deze stap worden twee voorbeelden van mogelijke assays (proliferatie- en migratietests) beschreven met behulp van de 3D-geprinte inserts (figuur 1Bd).
7. Celproliferatietest - WST-1-test
- Volg stap 1-3.1 om de cellen te kweken.
OPMERKING: Volg de stap in deze sectie om het co-cultuursysteem te implementeren om het effect van het KORS-secretoom op HDMEC-proliferatie te onderzoeken. KORS-cellen worden gebruikt om de eerder gepubliceerde gegevens te vergelijken8.- Zaai de KORS op 1 x 10 5 cellen/ml in mesenchymaal stamcelmedium (MSCM) aangevuld met5% FBS en groeifactoren in de grote compartimenten.
- Plaats de celkweekplaat gedurende 24 uur op 37 °C met 5% CO2 .
- Zaai de HDMECs in endotheelcelmedium (ECM) aangevuld met 5% FBS en groeifactoren bij 2,5 x 103 cellen/ml in de kleine compartimenten.
- Plaats de celkweekplaat op 37 °C met 5% CO2 gedurende 24-48 uur.
- Gooi de media uit alle compartimenten weg en implementeer het co-cultuursysteem door toevoeging van 3 ml niet-aangevuld basaal ECM (gemeenschappelijk celkweekmedium voor alle compartimenten van de 3D-geprinte inserts).
- Verdun WST-1 in het ECM common cell culture medium (1:10 eindverdunning) om de WST-1 oplossing te bereiden.
OPMERKING: Bereid voor het volume WST-1-oplossing ten minste 500 μL extra oplossing voor de blanco. - Gooi het celkweekmedium uit de insert door pipetteren.
- Voeg de WST-1-oplossing toe aan de geselecteerde compartimenten (150 μL voor de kleine compartimenten en 600 μL voor de grote compartimenten). Zet de plaat op 37 °C met 5% CO2.
- Na de optimale celincubatietijd van 30 minuten, breng 100 μL van het incubatiemedium van elke toestand over op een plaat met 96 putten.
- Beoordeel de colorimetrische reactie met behulp van een microplaatlezer tussen 420 nm en 480 nm.
- Plaats de plaat op de microplaatlezer en klik op de knop een nieuw protocol bewerken.
- Selecteer het specifieke type 96-putplaat (zie materiaaltabel) dat wordt gebruikt en de golflengte van 450 nm.
- Klik op de knop meting starten.
8. Celmigratietest - apparaat met twee migratiekamers
- Volg stap 1-3.1 om de cellen te kweken.
OPMERKING: Volg de stappen in deze sectie om het co-cultuursysteem te implementeren om het effect van het KORS-secretoom op HDMEC-proliferatie te onderzoeken.- Zaai de KORS op 1 x 10 5 cellen/ml in MSCM aangevuld met5% FBS en groeifactoren in een van de grote compartimenten.
- Plaats de celkweekplaat gedurende 24 uur op 37 °C met 5% CO2 .
- Plaats het apparaat met twee migratiekamers in het andere grote compartiment van inzetstukken.
- Zaai de HDMECs in ECM aangevuld met 5% FBS en groeifactoren bij 7 x 105 cellen/put van de twee migratiekamers apparaat.
- Plaats de celkweekplaat gedurende 24 uur op 37 °C met 5% CO2 .
- Gooi de media en het apparaat van de twee migratiekamers na 24 uur of op een optimaal tijdstip weg, afhankelijk van het celtype dat migreert. Implementeer het co-cultuursysteem door toevoeging van 3 ml niet-aangevulde basale ECM.
OPMERKING: Ga voorzichtig te werk om de cellen niet los te maken. Als de cellen echt gevoelig zijn voor loslating veroorzaakt door de toevoeging van gemeenschappelijk medium, trek dan het apparaat van de twee migratiekamers af na de toevoeging van het gemeenschappelijke medium.
- Observeer en maak een foto van het oppervlak bedekt door de cellen op verschillende tijdstippen onder een fasecontrastmicroscoop bij 10x vergroting.
OPMERKING: De foto's zijn gemaakt met een fasecontrastmicroscoop (zie materiaaltabel). De foto's worden opgeslagen in een USB-stick en vervolgens geanalyseerd door de plug-in voor wondgenezingstools van de software (zie Materiaaltabel). - Meet het onbedekte oppervlak met behulp van klassieke kwantitatieve analysesoftware.
- Open de afbeelding in de software en activeer de wondgenezingstool die beschikbaar is in de macrolijst.
- Klik op de m-knop om het onbedekte oppervlak van de migratieafbeelding te meten.
- Het onbedekte oppervlak wordt berekend volgens de volgende formule:
Dekkingspercentage = ([gemiddelde oppervlakte zonder cellen bij T0 − oppervlakte zonder cellen op tijdstip T]/gemiddeld gebied zonder cellen bij T0) × 100.
OPMERKING: De 3D-geprinte inserts zijn volledig aangepast aan de meeste technieken van de celbiologie (zoals de pseudobuisvormingstest, 3D-culturen) en voor biochemische experimenten (zoals de extractie van DNA, RNA, eiwit).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In het huidige werk werd een geoptimaliseerd co-cultuursysteem beschreven om robuuste, betrouwbare en significante gegevens te verkrijgen die vergelijkbaar zijn met klassieke methoden door het gebruik van geconditioneerde media. De 3D-geprinte inserts bootsen de in vivo micro-omgevingsomstandigheden van verschillende celtypen in interactie na door de moeilijkheden en de tijdrovende productie van geconditioneerde media stroomopwaarts in de experimenten te overwinnen. Een eerder gepubliceerde studie is opnieuw uitgevoerd om de indirecte interacties tussen twee celtypen in haarzakjes te analyseren: menselijke microvasculaire endotheelcellen (HDMECs) en menselijke keratinocyten van de buitenste wortelschede (KORS)8. Hier werd de reproduceerbaarheid aangetoond van de resultaten verkregen door het gebruik van de 3D-geprinte inserts in vergelijking met de klassieke methode met behulp van geconditioneerde media om indirecte interacties tussen HDMECs en KORS te onderzoeken. De celkweekomstandigheden die eerder in studie8 werden beschreven, waren dezelfde als in dit huidige werk. Ze werden aangepast rekening houdend met de afmetingen van de 3D-geprinte inserts (zie het protocol). Allereerst waren het fenotype en de levensvatbaarheid van de cel vergelijkbaar tussen de twee omstandigheden (geconditioneerde media vs.3D gedrukte inserts) voor alle celtypen (figuur 2). Inderdaad, 90% levensvatbaarheid werd waargenomen in de putten van de 6-putplaten (figuur 2A en tabel 1), en 91% werd waargenomen in de 3D-geprinte inserts (figuur 2B en tabel 1) voor KORS. De levensvatbaarheid van HDMECs was 85% in de putten van de 6-well plaat (figuur 2C en tabel 2) versus 86% in de 3D-geprinte inserts (figuur 2D en tabel 2). De gegevens voor de levensvatbaarheid van cellen werden door de geautomatiseerde cellenteller (Table of Materials) als volgt berekend: het aantal levensvatbare cellen gedeeld door het aantal totale cellen (dode + levensvatbare cellen). De gemiddelde gegevens werden verkregen door het percentage levensvatbaarheid te berekenen dat werd verkregen in zes onafhankelijke experimenten waarin twee replicaties werden uitgevoerd (zie tabel 1 en tabel 2).
Deze resultaten gaven aan dat het 3D-geprinte inzetstuk het celgedrag of de levensvatbaarheid niet veranderde in vergelijking met de gebruikelijke cultuur op 6-putplaten. Daarom werden de 3D-geprinte inserts gevalideerd als een nieuw model van co-cultuur.
Eerder aangetoonde parameters8 van indirecte celcommunicatie werden geanalyseerd. Voor alle experimenten werd de 3D-geprinte insert co-cultuur implementatie gerealiseerd volgens de protocollen in overeenstemming met de klassieke cultuuromstandigheden (zie eerder werk8).
Eerst werd de indirecte celcommunicatie tussen KORS en HDMECs in de 3D-geprinte inserts beoordeeld door de celproliferatie te analyseren en te vergelijken met de klassieke methode met behulp van geconditioneerde media (figuur 3). In aanwezigheid van KORS in de inserts (+ KORS) nam de HDMEC-proliferatie significant toe met 1,5-voudig na 24 uur en met 3,1-voudig na 48 uur in vergelijking met de controleconditie zonder KORS (Control) (Figuur 3A). Deze resultaten kwamen overeen met die verkregen door geconditioneerde media-experimenten (figuur 3B). Inderdaad, de KORSCM bleek de HDMEC-proliferatie significant te verhogen met 1,5-voudig na 24 uur en met 2,1-voudig na 48 uur.
Het 3D-geprinte insert co-culture model werd getest om het effect van KORS op HDMEC-migratie te bepalen. Dit effect werd eerder aangetoond in het klassieke co-cultuursysteem met behulp van geconditioneerde media8 (figuur 4). In de controleconditie zonder KORS (Control) migreerden HDMEC's en bedekten ongeveer 44% van het wondgebied na 24 uur (figuur 4A). In aanwezigheid van KORS (+ KORS) werd een sterke en significante toename van hdmec-migratie waargenomen. Inderdaad, de kinetiek van de wondgenezing toonde aan dat 43%, 67% en 99% van het wondgebied werd bedekt door HDMECs na respectievelijk 3 uur, 12 uur en 24 uur. Deze resultaten waren in overeenstemming met die verkregeneerder 8, waar de KORSCM de HDMEC-migratie op een vergelijkbare manier bleek te verhogen (figuur 4B).
Figuur 1: Workflow met de implementatie van de 3D-geprinte wisselplaat co-cultuur van de reiniging tot de recycling van de insert. (A) Een representatieve afbeelding van de 3D-geprinte insert. (B) Een representatief voorbeeld van de in dit manuscript gepresenteerde assays wordt geïllustreerd. Merk op dat een proliferatietest kan worden uitgevoerd in het ene compartiment van het 3D-geprinte inzetstuk parallel aan een migratietest die in het andere compartiment wordt uitgevoerd met behulp van een apparaat met twee migratiekamers dat in de andere compartimenten van de 3D-geprinte inserts is geplaatst. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: KORS en HDMEC levensvatbaarheid. (A,B) KORS morfologie (10x) in (A) een put van een 6-well plaat en (B) in een 3D-geprinte insert. (C,D) HDMEC morfologie (10x) in (C) een put van 6-well plaat en (D) in een 3D-geprinte insert. Schaalbalk: 200 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Effect van KORS op HDMEC proliferatie. (A) HDMEC-proliferatie werd gemeten door middel van colorimetrische assay met behulp van WST-1-kleurstof in de 3D-geprinte insert in afwezigheid van KORS (controle = CTRL) of in aanwezigheid van KORS (+ KORS) gedurende 24 uur of 48 uur. (B) HDMEC-proliferatie werd gemeten door colorimetrische assay met behulp van WST-1-kleurstof in aanwezigheid van ECM basaalcelkweekmedium of KORSCM gedurende 24 uur of 48 uur. De resultaten worden uitgedrukt als gemiddelde ± SEM, n = 8 replicaties, en er werden twee onafhankelijke experimenten uitgevoerd. *p < 0,05, ***p < 0,001, ****p < 0,0001 en *****p < 0,00001. De KORS werden geïncubeerd in ECM zonder FBS en groeifactoren. Na 48 uur werd dit geconditioneerde medium verzameld en opgeslagen bij −80 °C voor de experimenten. Deze figuur is gewijzigd van 8 en met toestemming gereproduceerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Effect van KORS op HDMEC-migratie. (A) De migratie van HDMEC in de 3D-geprinte insert in afwezigheid van KORS (control = CTRL) of in aanwezigheid van KORS (+ KORS) wordt weergegeven en gekwantificeerd als het percentage herstel. (B) De migratie van HDMEC's in de ECM of KORSCM wordt weergegeven en gekwantificeerd als het percentage van de terugwinning. De resultaten worden uitgedrukt als het gemiddelde ± SEM, n = 3 repliceert, en drie velden werden geanalyseerd per replicatie, twee onafhankelijke experimenten werden uitgevoerd. **p<0,01, *****p<0,00001. Schaalbalk: 200 μm. De KORS werden geïncubeerd in ECM zonder FBS en groeifactoren. Na 48 uur werd dit geconditioneerde medium verzameld en opgeslagen bij -80 °C voor de experimenten. Deze figuur is gewijzigd van 8 en met toestemming gereproduceerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Aantal 1 | Aantal 2 | Bedoelen | Totaal gemiddelde | ||
| 6-well plaat | Repliceren 1 | 95% | 84% | 90% | 90% |
| Repliceren 2 | 90% | 88% | 89% | ||
| Repliceren 3 | 85% | 89% | 87% | ||
| Replicatie 4 | 97% | 89% | 93% | ||
| Repliceren 5 | 88% | 94% | 91% | ||
| Repliceren 6 | 86% | 92% | 89% | ||
| 3D-geprinte insert | Repliceren 1 | 92% | 89% | 91% | 91% |
| Repliceren 2 | 91% | 80% | 86% | ||
| Repliceren 3 | 93% | 92% | 93% | ||
| Replicatie 4 | 94% | 98% | 96% | ||
| Repliceren 5 | 88% | 86% | 87% | ||
| Repliceren 6 | 93% | 97% | 95% |
Tabel 1: KORS levensvatbaarheidsmeting. De KORS-levensvatbaarheid werd gemeten in een put van een 6-putplaat en in een 3D-geprinte insert met behulp van trypanblauwe kleuring en automatisch tellen.
| Aantal 1 | Aantal 2 | Bedoelen | Totaal gemiddelde | ||
| 6-well plaat | Repliceren 1 | 90% | 88% | 89% | 85% |
| Repliceren 2 | 79% | 78% | 79% | ||
| Repliceren 3 | 71% | 75% | 73% | ||
| Replicatie 4 | 86% | 82% | 84% | ||
| Repliceren 5 | 91% | 88% | 90% | ||
| Repliceren 6 | 99% | 94% | 97% | ||
| 3D-geprinte insert | Repliceren 1 | 99% | 86% | 93% | 86% |
| Repliceren 2 | 80% | 75% | 78% | ||
| Repliceren 3 | 79% | 80% | 80% | ||
| Replicatie 4 | 98% | 85% | 92% | ||
| Repliceren 5 | 85% | 78% | 82% | ||
| Repliceren 6 | 89% | 93% | 91% |
Tabel 2: Meting van de levensvatbaarheid van HDMEC. De levensvatbaarheid van HDMEC werd gemeten in een put van een 6-well plaat en in een 3D-geprinte insert met behulp van trypan blue kleuring en automatisch tellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Indirecte celcommunicatie wordt vaak onderzocht met behulp van geconditioneerde media of co-cultuursysteemapparaten. Geconditioneerde mediavoorbereiding is stroomopwaarts in de experimenten tijdrovend en deze methode is beperkt tot eenzijdige effectanalyses. De vorige studie van Colin-Pierre et al.8 met behulp van geconditioneerde media werd uitgevoerd op de indirecte celcommunicatie tussen twee celtypen (HDMECs en KORS). De gegevens van deze eerdere studie toonden het effect aan van KORS geconditioneerde media op HDMEC proliferatie en het effect van KORS geconditioneerde media op HDMEC migratie, pseudobuisvorming en GPC1 expressie8. In deze studie wordt een eenvoudigere en snellere manier beschreven om indirecte celcommunicatie te onderzoeken. In feite bieden 3D-geprinte inserts flexibiliteit in experimenteel ontwerp en meerdere combinaties van celcultuur. Om deze 3D-geprinte inserts te valideren als een model voor co-culturen, werden celproliferatie en celmigratie geanalyseerd en vergeleken met de vorige studie met behulp van geconditioneerde media8. In beide onderzoeken werd de wondgenezingstest uitgevoerd met behulp van een apparaat met twee migratiekamers (Culture-Insert 2 Well in μ-Dish 35 mm) dat in de put werd geplaatst die de insert al dan niet bevatte. Dit migratietestapparaat9,10 verschilt van scratch assays11,12 door het feit dat de voetafdruk achtergelaten door de muur (die de wond simuleert) die de twee kamers afbakent, constant is. Daarom is het zeer reproduceerbaar. De resultaten van de huidige studie hebben geleid tot een vergelijkbare conclusie in vergelijking met geconditioneerde media-experimenten. De 3D-geprinte inzetstukken veranderen het celgedrag niet en zijn aangepast om onafhankelijke compartimentcoatings te maken die de celhechting bevorderen. De 3D-geprinte inzetstukken maken het echter ook mogelijk om een coating met poly-HEMA te maken, bijvoorbeeld om een lage hechting voor de cultuur van de sferoïde / organoïde te induceren. Indirecte communicatie tussen HDMECs en KORS werd hier onderzocht als een voorbeeld van de vele toepassingen die de 3D-geprinte inserts leveren.
Toepasbaar op adherente celtypen die al dan niet een specifieke coating vereisen, biedt dit nieuwe apparaat een aanzienlijke tijdsbesparing voor de oprichting van het co-cultuurmodel. Inderdaad, de vier compartimenten van de 3D-geprinte inserts maken het mogelijk om verschillende celtypen in monolaag of in 3D (aggregaten of sferoïden) in dezelfde put met verschillende combinaties te kweken. De indirecte communicatie van vier celtypen in monolaag, in 3D (sferoïden) of een combinatie van beide kan bijvoorbeeld worden geanalyseerd. Tijdens de experimenten werden sferoïden gekweekt in de 3D-geprinte inserts met behulp van een poly-HEMA-coating (gegevens niet getoond). De sferoïden bestonden uit cellen die in 3D werden gezaaid vanwege de lage hechtingsbindingsplaat en na 48 uur werden overgebracht naar de 3D-geprinte insert voor analyses. Na enkele dagen cultuur werd de groei van de sferoïden waargenomen. Deze resultaten tonen aan dat de 3D-geprinte insert kan worden gebruikt om 3D-celgroei na de overdracht van de sferoïden op dezelfde manier te volgen als in een kweekplaat13,14. Bovendien kan een mix van verschillende celtypen in hetzelfde compartiment in 2D of 3D (organoïden) worden samengevoegd om zowel directe als indirecte celcommunicatie te bestuderen. Inderdaad, het brede scala aan modulariteit dat de 3D-geprinte inserts bieden, kenmerkt dit innovatieve celcocultuursysteem. Bovendien maakt de aanwezigheid van de communicatievensters het mogelijk om op een geselecteerd tijdstip in een gemeenschappelijk medium voor alle celtypen te gebruiken zonder de hulp van geconditioneerde media. Deze techniek is dus niet van toepassing op cellen die in suspensie zijn gekweekt. De wanden die de vier compartimenten scheiden, maken het mogelijk om elk celtype onafhankelijk van de andere te zaaien, te oogsten en te analyseren. Verschillende toepassingen kunnen worden gemaakt, zoals pseudobuisvormingstests en proliferatie, migratie, DNA, RNA, eiwit en andere analyses. De 3D-geprinte inserts bieden ook de mogelijkheid om bijvoorbeeld het effect van moleculen of extracellulaire blaasjes te analyseren. Bovendien biedt het feit dat deze wisselplaten zijn gemaakt door 3D-printen tal van mogelijkheden voor compartimentindeling en tal van functionele assays.
De kritieke stap van de 3D-geprinte wisselplaatafdichting in de plaat moet echter zorgvuldig worden overwogen. Een homogene herverdeling van het silicium is immers cruciaal om afdichting te garanderen en het lekken van celkweekmedium of cellen van het ene compartiment naar het andere te voorkomen. Om problemen te voorkomen, moet men ervoor zorgen dat het silicium het deel van de 3D-geprinte inzetstukken bedekt dat in contact komt met de plaat. Alvorens de cellen te zaaien, moet men controleren op de juiste afdichting door celkweekmedium aan één compartiment toe te voegen en de afwezigheid van mediumlekkage in de andere compartimenten te observeren. De droogtijd van het silicium na de incubatie in het 70% ethanolbad is ook een kritische stap. Inderdaad, de resterende sporen van alcohol kunnen leiden tot celfixatie en toxiciteit. Om problemen te voorkomen, moet de droogtijd worden gerespecteerd.
Kortom, de 3D-geprinte inserts zijn compatibel met de meeste adherente celtypen voor cultuur in 2D of 3D en maken tal van experimenteermethoden mogelijk. Ze kunnen worden aangepast voor tal van co-cultuurstudies en kunnen een nieuw hulpmiddel bieden om indirecte celcommunicatie te onderzoeken. De 3D-geprinte inserts zijn moduleerbaar, flexibel, schaalbaar en kunnen worden gebruikt om experimentele modellen te ontwerpen voor studies van fysiopathologieën zoals kankerologie, immunologie of angiogenese.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen te hebben.
Acknowledgments
Deze studie werd uitgevoerd in samenwerking met BASF Beauty Care Solutions. Mevrouw Charlie Colin-Pierre is een door BASF / CNRS gefinancierde PhD-fellow.
We willen de heer Mehdi Sellami bedanken voor het ontwerp van de 3D-geprinte inserts.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Autoclave | Getinge | APHP | Solid cycle, 121 °C for 20 min |
| Biomed Clear | Formlabs | RS-F2-BMCL-01 | Impression performed by 3D-Morphoz company (Reims, France) |
| Cell culture detergents | Tounett | A18590/0116 | |
| Cell Proliferation Reagent WST-1 | Roche | 11,64,48,07,001 | |
| Counting slide | NanoEnTek | EVE-050 | |
| Culture-Insert 2 Well in μ-Dish 35 mm | Ibidi | 80206 | two-migration chambers device. |
| Endothelial cell medium | ScienCell | 1001 | Basal medium +/- 25 mL of fetal bovine serum (FBS, 0025), 5 mL of endothelial cell growth supplement (ECGS, 1052), and 5 mL of penicillin/streptomycin solution (P/S, 0503). |
| EVE Automated cell counter | NanoEnTek | NESCT-EVE-001E | |
| EVOS XL Core | Fisher Scientific | AMEX1200 | 10x of magnification |
| Food silicon reagent and catalyst kit | Artificina | RTV 3428 A and B | (10:1) |
| FORM 3B printer | Formlabs | PKG-F3B-WSVC-DSP-BASIC | Impression performed by 3D-Morphoz company |
| Human Dermal Microvascular Endothelial Cells (HDMEC) | ScienCell | 2000 | |
| Keratinocytes of Outer Root Sheath (KORS ) | ScienCell | 2420 | |
| Macro Wound Healing Tool Software | ImageJ | Software used for the measurement of the uncovered surface (for migration assays) | |
| Mesenchymal stem cell medium | ScienCell | 7501 | Basal medium +/-25 mL of fetal bovine serum (FBS, 0025), 5 mL of mesenchymal stem cell growth supplement (MSCGS, 7552), and 5 mL of penicillin/streptomycin solution (P/S, 0503) |
| Microplate reader SPECTRO star NANO | BMG Labtech | BMG LABTECH software | |
| PBS | Promocell | C-40232 | Without Ca2+ / Mg2+ |
| Trypan Blue Stain | NanoEnTek | EBT-001 | |
| Trypsin / EDTA | Promocell | C-41020 | Incubation of KORS at 37 °C with 5% CO2 for 5 min. Incubation of HDMECs for 5 min at room temperature |
| 96-well plate Nunclon Delta Surface | Thermoscientific | 167008 |
References
- Regier, M. C., Alarid, E. T., Beebe, D. J. Progress towards understanding heterotypic interactions in multi-culture models of breast cancer. Integrative Biology. 8 (6), 684-692 (2016).
- Doğan, A., Demirci, S., Apdik, H., Apdik, E. A., Şahin, F. Mesenchymal stem cell isolation from pulp tissue and co-culture with cancer cells to study their interactions. Journal of Visualized Experiments. (143), e58825 (2019).
- Lin, J., et al. Long non-coding RNA UBE2CP3 enhances HCC cell secretion of VEGFA and promotes angiogenesis by activating ERK1/2/HIF-1α/VEGFA signalling in hepatocellular carcinoma. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 37 (1), 113 (2018).
- Soares, N. L., et al. Carbon monoxide modulation of microglia-neuron communication: Anti-neuroinflammatory and neurotrophic role. Molecular Neurobiology. 59 (2), 872-889 (2022).
- Al Halawani, A., Abdulkhalek, L., Mithieux, S. M., Weiss, A. S. Tropoelastin promotes the formation of dense, interconnected endothelial networks. Biomolecules. 11 (9), 1318 (2021).
- Mercatali, L., et al. Development of a human preclinical model of osteoclastogenesis from peripheral blood monocytes co-cultured with breast cancer cell lines. Journal of Visualized Experiments. (127), e56311 (2017).
- Orona, N. S., Astort, F., Maglione, G. A., Yakisich, J. S., Tasat, D. R. Direct and indirect effect of air particles exposure induce Nrf2-dependent cardiomyocyte cellular response in vitro. Cardiovascular Toxicology. 19 (6), 575-587 (2019).
- Colin-Pierre, C., et al. The glypican-1/HGF/C-met and glypican-1/VEGF/VEGFR2 ternary complexes regulate hair follicle angiogenesis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 781172 (2021).
- Toubal, A., et al. The NC1 domain of type XIX collagen inhibits melanoma cell migration. European Journal of Dermatology. 20 (6), 712-718 (2010).
- Wu, A. -L., et al. Role of growth factors and internal limiting membrane constituents in müller cell migration. Experimental Eye Research. 202, 108352 (2021).
- Oudart, J. -B., et al. Plasmin releases the anti-tumor peptide from the NC1 domain of collagen XIX. Oncotarget. 6 (6), 3656-3668 (2015).
- Martinotti, S., Ranzato, E.
- Cattin, S., Ramont, L., Rüegg, C. Characterization and in vivo validation of a three-dimensional multi-cellular culture model to study heterotypic interactions in colorectal cancer cell growth, invasion and metastasis. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 97 (2018).
- Ma, Y. N., et al. Three-dimensional spheroid culture of adipose stromal vascular cells for studying adipogenesis in beef cattle. Animal. 12 (10), 2123-2129 (2018).
