Summary
I denne artikkelen presenteres en nydesignet 3D-printet innsats som en modell for samkultur og valideres gjennom studiet av den parakrine intercellulære kommunikasjonen mellom endotelceller og keratinocytter.
Abstract
De klassiske analysene av indirekte kommunikasjon mellom ulike celletyper nødvendiggjør bruk av betingede medier. Videre forblir produksjonen av betingede medier tidkrevende og langt fra fysiologiske og patologiske forhold. Selv om noen få modeller av samkultur er kommersielt tilgjengelige, forblir de begrenset til spesifikke analyser og er for det meste for to typer celler.
Her brukes 3D-printede innsatser som er kompatible med mange funksjonelle analyser. Innsatsen tillater separasjon av en brønn på en 6-brønnsplate i fire rom. Et bredt spekter av kombinasjoner kan stilles inn. Videre er vinduene utformet i hver vegg i rommene slik at potensiell intercellulær kommunikasjon mellom hvert rom er mulig i kulturmediet på en volumavhengig måte. For eksempel kan parakrin intercellulær kommunikasjon studeres mellom fire celletyper i monolag, i 3D (sfæroider), eller ved å kombinere begge. I tillegg kan en blanding av forskjellige celletyper sås i samme rom i 2D- eller 3D-format (organoider). Fraværet av en bunn i de 3D-printede innsatsene tillater de vanlige kulturforholdene på platen, mulig belegg på platen som inneholder innsatsen, og direkte visualisering ved optisk mikroskopi. De mange rommene gir muligheten til å samle forskjellige celletyper uavhengig eller å bruke, i hvert rom, forskjellige reagenser for RNA eller proteinekstraksjon. I denne studien er det gitt en detaljert metodikk for å bruke den nye 3D-printede innsatsen som et samkultursystem. For å demonstrere flere kapasiteter i denne fleksible og enkle modellen, ble tidligere publiserte funksjonelle analyser av cellekommunikasjon utført i de nye 3D-printede innsatsene og ble vist å være reproduserbare. De 3D-printede innsatsene og den konvensjonelle cellekulturen ved bruk av betingede medier førte til lignende resultater. Avslutningsvis er den 3D-printede innsatsen en enkel enhet som kan tilpasses mange modeller av samkulturer med adherente celletyper.
Introduction
In vivo kommuniserer celler med hverandre enten direkte (cellekontakt) eller indirekte (ved sekresjon av molekyler). For å studere cellekommunikasjon kan forskjellige kokulturmodeller utvikles, for eksempel direkte samkultur (de forskjellige celletypene er i direkte interaksjon i samme brønn) og kompartmentalisert samkultur (de forskjellige celletypene er i indirekte interaksjon i forskjellige rom i et kultursystem)1. Videre kan betingede medier brukes til samkultursystemer, hvor den indirekte interaksjonen aktiveres ved at utskilte molekyler inneholdt i det kondisjonerte mediet av en effektorcelletype overføres til en respondercelletype1.
Når det gjelder parakrine cellekommunikasjonsstudier, gir indirekte kokultursystemer modeller som sterkt reflekterer celleinteraksjoner in vivo. Indirekte samkultursystemer er utviklet og kommersialisert, noe som gjør det mulig å etablere indirekte samkulturmodeller 2,3. Dessverre gir de fleste indirekte samkultursystemer bare to avdelinger. Andre indirekte samkultursystemer gir flere avdelinger, men de er mindre skalerbare sammenlignet med systemet rapportert i dette manuskriptet. Noen av dem tillater ikke en klassisk visualisering under et mikroskop, og de presenterer ofte spesifikke applikasjonsmetoder. I flere studier blir den parakrine kommunikasjonen mellom forskjellige celletyper undersøkt av den betingede mediemodellen 4,5,6,7. Dette er en enklere måte å undersøke på sammenlignet med indirekte samkultursystemer fordi det ikke er nødvendigå etablere bestemte metoder eller materialer 1. På den annen side er fremstilling av betingede medier tidkrevende og gir bare informasjon om enveis cellesignalering (effektor til responder)1.
I dette papiret foreslås en ny, enkel måte å undersøke cellekommunikasjon på. Ved å tillate kombinasjonen av flere celletyper i direkte eller indirekte interaksjon og i 2D- eller 3D-formater, gir de trykte innsatsene mange fordeler for enkelt å sette opp samkulturmodeller. Den 3D-printede innsatsen er tilpasset for å plasseres i brønnene på 6-brønnsplater, og er sirkulær og tillater separasjon av brønnen i fire rom (to store rom og to små rom; Figur 1A). De 3D-printede innsatsene er preget av fravær av bunn. Dermed er cellene i direkte kontakt med platen som innsatsen er plassert på. I tillegg kan hvert rom belegges uavhengig av de andre. Videre kan celleoppførselen lett følges under optiske mikroskoper. Tilstedeværelsen av kommunikasjonsvinduer i hver vegg av innsatsen gjør det mulig å legge til, på det optimale tidspunktet, av et felles medium for å utføre forskjellige eksperimenter med samkultur. Tallrike kombinasjoner av samkultur kan utføres for å studere direkte og / eller indirekte kommunikasjon mellom flere celletyper. For eksempel kan en modell av indirekte samkultur mellom fire forskjellige celletyper i monolag og/eller i 3D (sfæroider) designes. En kombinasjon av direkte og indirekte kokulturmodeller kan også utføres ved å blande forskjellige celletyper i samme rom. Effekten av komplekse strukturer (organoider, vevseksplant, etc.) på forskjellige celletyper kan være et annet eksempel på modeller som kan gjøres. Videre er de 3D-printede innsatsene kompatible med cellebiologiske funksjonelle analyser (spredning, migrasjon, pseudorørdannelse, differensiering, etc.) og med biokjemiske tester (ekstraksjon av DNA, RNA, protein, lipider, etc.). Til slutt gir de 3D-printede innsatsene et bredt spekter av eksperimentelle ordninger av samkulturmodeller med mulighet til å kombinere samtidig forskjellige analyser i samme eksperiment i de forskjellige rommene.
Noen kapasiteter til de 3D-printede innsatsene presenteres for å validere dem som en rask og brukervennlig samkulturmodell. Sammenlignet med en tidligere publisert studie utført på parakrin cellekommunikasjon, er evnen til de 3D-printede innsatsene til å være en verdifull samkulturmodell demonstrert. For å vurdere dette punktet ble reguleringen av endotelcelleproliferasjon og migrasjon av keratinocytter sammenlignet mellom det 3D-printede innsatssystemet og det klassiske systemet ved bruk av betingede medier. De 3D-printede innsatsene gjør det mulig å oppnå lignende resultater raskt sammenlignet med det konvensjonelle systemet ved bruk av betingede medier. Faktisk gir de 3D-printede innsatsene en robust modell for å studere celleinteraksjoner i begge retninger uten at det er nødvendig å produsere betingede medier og med muligheten til å utføre parallelt sprednings- og migrasjonsanalysene i samme eksperiment.
For å konkludere, i dette papiret, foreslås en ny og klar til bruk modell for å studere cellekommunikasjon. De 3D-printede innsatsene er kompatible med alle adherente celletyper, og gjør det mulig å utføre en rekke kombinasjoner av samkultur som tar sikte på å være nærmere in vivo-forhold .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: 3D-innsatsene (figur 1A) er kommersielt anskaffet og skrives ut ved hjelp av en fotopolymerharpiks som er biokompatibel med cellekultur og autoklavering (se materialtabellen). I dette avsnittet beskrives en detaljert protokoll for å etablere samkulturmodellen ved innstikk (se figur 1B). Noen eksempler på applikasjoner er også gitt.
1. Plassering av den steriliserte innsatsen i 6-brønnsplatene
- Bland de to komponentene som følger med i settet (se materialtabellen), matsilisium (reagens A) og katalysator (reagens B), i forholdet 10: 1 (v / v) i henhold til produsentens instruksjoner. (Figur 1Ba). Bruk en 70% etanolsterilisert slikkepott for å blande de to komponentene.
MERK: Volumet av silisiumblandingen som skal fremstilles, avhenger av antall innlegg som skal festes. Et overskudd av katalysator kan føre til at silisiumblandingen størkner for fort. - Påfør innsatsene på silisiumblandingen med pinsett slik at blandingen fordeles homogent i underkanten av innsatsene (figur 1Bb). Plasser innsatsene i brønnene på en 6-brønnsplate og trykk forsiktig på innsatsene for å sikre at innsatsene er i nær kontakt med platen for å unngå lekkasje av cellekulturmediet (figur 1Bc).
- Sett platen på 37 °C for å støtte silisiumets størkningsprosess i 1 time.
MERK: Tidspunktet for størkning avhenger av mengden katalysator som er tilsatt. - Etter størkning, steriliser platene med innsatsene ved å senke dem i et 70% etanolbad i 30 minutter til 1 time.
- Kast alkoholen ved å pipettere og la tallerkenen tørke (lokket åpent) over natten i en cellekulturhette.
MERK: Alkoholen må være helt fordampet før du utfører neste trinn for å unngå cellefiksering og toksisitet. Den bruksklare platen som inneholder innsatsene kan oppbevares i flere dager før bruk under tørre og sterile forhold ved romtemperatur.
2. Belegg som poly-L-lysin eller poly-HEMA (valgfritt trinn)
MERK: Belegg utføres ikke i dette eksperimentet, og trinnene er gitt for å informere om muligheten for å belegge innsatsene.
- Forbered beleggløsningen i henhold til produsentens instruksjoner.
- Tenk på et volum på 200-400 μL for de største rommene og et volum på 50-100 μL for de minste rommene for belegget av innsatsen. Legg beleggløsningen til de enkelte rommene.
- La belegget tørke som angitt av produsenten under sterile forhold.
3. Såing av cellene
- Kultur keratinocytter av ytre rotskjede (KORS) og humane dermale mikrovaskulære endotelceller (HDMEC) som anbefalt av produsenten. Forbered cellesuspensjonen når cellene når sammenløp.
- Kast mediet fra kolbene og tilsett 5 ml trypsin for å løsne cellene (se materialfortegnelse).
- Plasser kolben med KORS på 37 °C med 5 % CO2 i 5 minutter. Inkuber kolben som inneholder HDMECs i 5 minutter ved romtemperatur.
- Bland trypsinoppløsningen inneholdende KORS med 5 ml mesenkymalt stamcellemedium (MSCM) tilsatt 5 % føtal bovint serum (FBS) og vekstfaktorer (basalmedium med tilleggssett, se materialfortegnelse). Bland trypsinoppløsningen som inneholder HDMEC med 5 ml endotelcellemedium (ECM) supplert med 5 % FBS og vekstfaktorer (se materialfortegnelse).
- Overfør cellene til et 15 ml sterilt konisk rør. Sentrifuger KORS og HDMEC suspensjonene ved 200 x g i 5 minutter ved romtemperatur.
- Kast supernatanten og resuspender cellene i 2 ml av det respektive mediet.
- Bland 10 μL av cellesuspensjonen med 10 μL trypanblått fargestoff (se materialfortegnelse).
- Tilsett 10 μL av blandingen i kammeret til tellelysbildet.
- Sett inn tellelysbildet i celletellingssystemet (se Materialfortegnelse) og oppdag cellenummeret og levedyktigheten.
- Klargjør cellesuspensjonen i en konsentrasjon på 0,5 x 105 celler/ml i det respektive medium.
MERK: Hvis de forskjellige celletypene krever forskjellige adherenstider og / eller for å nå den ideelle sammenløpet, kan cellesåingen gjøres på forskjellige tidspunkter i henhold til celletypene.
- Fordel 800 μL til 1 ml av cellesuspensjonen i de enkelte store rommene og 100-150 μL i de enkelte små rommene med pipette.
- Frø KORS på 1 x 10 5 celler/ml i MSCM supplert med5% FBS og vekstfaktorer i et av de store rommene.
- Frø HDMEC i ECM supplert med 5% FBS og vekstfaktorer ved 2,5 x 103 celler/ml i de små rommene og ved 1,25 x 105 celler/ml i det andre store rommet.
MERK: Spredningsanalysen kan utføres i de små rommene, og migrerings- og levedyktighetsanalysene kan utføres i de store rommene. Konsentrasjonen av de sådde cellene er optimalisert i henhold til produsentens anbefalinger. Denne konsentrasjonen muliggjør god levedyktighet av cellene etter 24-48 timer inkubasjon.
- Plasser cellekulturplaten ved 37 °C med 5 %CO2 eller under vanlige forhold for å muliggjøre celleadhesjon og/eller modning.
MERK: Inkuber cellene i 24-48 timer uten å endre mediet. Om nødvendig kan mediet i rommene endres uavhengig.
4. Implementering av samkulturen ( figur 1Bd)
MERK: Implementeringen av samkulturen tilsvarer tidspunktet da det felles mediet legges til. Tilsetningen av et unikt medium for alle celletyper i de forskjellige rommene gir mulighet for parakrin kommunikasjon mellom cellene på grunn av tilstedeværelsen av kommunikasjonsvinduer (ovoide hull i veggene til de 3D-trykte innsatsene). For å implementere samkulturen, følg trinn 4.1-4.3.
- Tøm kulturmediet for de forskjellige rommene i innsatsene ved hjelp av en pipette. I tilfelle av en 3D sfæroid cellekultur, kast mediet veldig forsiktig.
- Skyll cellene med 1 ml 37 °C varm PBS i de store rommene og 200 μL 37 °C varm PBS i de små rommene. Sørg for skånsom vask for ikke å løsne cellene.
- Legg til 3 ml av et vanlig medium valgt for å være kompatibelt for alle celletyper.
MERK: I denne studien brukes basal ECM (uten FBS og vekstfaktorer). Forsikre deg om at mediet dekker alle rommene (nivå over kommunikasjonsvinduene [eggformede hull i veggene], som vist i figur 1A). - Plasser platen med kokulturer ved 37 °C med 5 % CO2 i 24-48 timer.
5. Celleobservasjon, telling og skraping
- Observer morfologien og telle cellenummeret til de forskjellige rommene under forsøket under et optisk mikroskop etter 24-48 timers inkubasjon.
MERK: Det forventede antall celler avhenger av celletypene som brukes (størrelse, morfologi osv.) og av romstørrelsen. I dette eksperimentet telles mellom 0,5 x 10 6-1 x 10 6 KORS/ml og mellom 0,25 x 10 6-0,75 x 10 6 HDMEC/ml i de store rommene. - Løsne cellene ved hjelp av trypsin for cellesuspensjonstelling.
MERK: For celleavløsningsløsningen, vurder et volum på 100-500 μL for de største rommene og et volum på 10-50 μL for de minste rommene. - Kontroller levedyktigheten ved å bruke trypanblå farging (se trinn 3.1.6-3.1.8).
6. Sett inn rengjøring for resirkulering
- Fjern innsatsene fra 6-brønnsplaten på slutten av eksperimentet med en liten vri (figur 1Be).
- Fjern silisiumet fra innsatsene ved å trekke det av. Bruk om nødvendig en slikkepott for å fjerne det gjenværende silisiumet som sitter fast på veggene i innsatsene (figur 1Bf).
- Vask innsatsene med konvensjonelle cellekulturvaskemidler og rengjøringsmidler (eksempel gitt i materialfortegnelsen).
- Steriliser innsatsene for fremtidig bruk i en autoklav (fast syklus, 121 ° C i 20 minutter) eller ved å senke dem i et 70% etanolbad i 1 time.
MERK: Fra dette trinnet beskrives to eksempler på mulige analyser (sprednings- og migrasjonsanalyser) ved hjelp av 3D-printede innlegg (figur 1Bd).
7. Celleproliferasjonsanalyse - WST-1-analyse
- Følg trinn 1-3.1 for å dyrke cellene.
MERK: Følg trinnet i dette avsnittet for å implementere samkultursystemet for å undersøke effekten av KORS-sekretomet på HDMEC-spredning. KORS-celler brukes til å sammenligne data publisert tidligere8.- Frø KORS ved 1 x 10 5 celler/ml i mesenkymalt stamcellemedium (MSCM) supplert med5% FBS og vekstfaktorer i de store rommene.
- Plasser cellekulturplaten ved 37 °C med 5 % CO2 i 24 timer.
- Frø HDMECene i endotelcellemedium (ECM) supplert med 5% FBS og vekstfaktorer ved 2,5 x 103 celler / ml i de små rommene.
- Plasser cellekulturplaten ved 37 °C med 5 % CO2 i 24-48 timer.
- Kast mediene fra alle rommene og implementer samkultursystemet ved å tilsette 3 ml ikke-supplert basal ECM (felles cellekulturmedium for alle rommene i de 3D-printede innsatsene).
- Fortynn WST-1 i ECM vanlig cellekulturmedium (1:10 endelig fortynning) for å klargjøre WST-1-oppløsningen.
MERK: For volumet av WST-1-løsning, lag minst 500 μL ekstra løsning for blankt. - Kast cellekulturmediet fra innsatsen ved pipettering.
- Legg WST-1-løsningen til de valgte rommene (150 μL for de små rommene og 600 μL for de store rommene). Sett platen på 37 °C med 5 % CO2.
- Etter den optimale 30 min celleinkubasjonstiden, overfør 100 μL av inkubasjonsmediet fra hver tilstand på en 96-brønnplate.
- Vurder den kolorimetriske reaksjonen ved hjelp av en mikroplateleser mellom 420 nm og 480 nm.
- Sett platen på mikroplateleseren og klikk på knappen rediger en ny protokoll.
- Velg den spesifikke typen 96-brønnsplate (se materialtabell) som brukes og bølgelengden på 450 nm.
- Klikk på knappen start måling.
8. Cellemigrasjonsanalyse - to migrasjonskamre enhet
- Følg trinn 1-3.1 for å dyrke cellene.
MERK: Følg trinnene i denne delen for å implementere samkultursystemet for å undersøke effekten av KORS-sekretomet på HDMEC-spredning.- Frø KORS på 1 x 10 5 celler/ml i MSCM supplert med5% FBS og vekstfaktorer i et av de store rommene.
- Plasser cellekulturplaten ved 37 °C med 5 % CO2 i 24 timer.
- Sett enheten med to migrasjonskamre i det andre store rommet med innsatser.
- Frø HDMECene i ECM supplert med 5% FBS og vekstfaktorer ved 7 x 105 celler / brønn i de to migrasjonskamrene enheten.
- Plasser cellekulturplaten ved 37 °C med 5 % CO2 i 24 timer.
- Kast mediet og enheten med to migrasjonskamre etter 24 timer eller på et optimalt tidspunkt i henhold til celletypen som migrerer. Implementere kokultursystemet ved tilsetning av 3 ml ikke-supplert basal ECM.
MERK: Fortsett forsiktig for ikke å løsne cellene. Hvis cellene er veldig følsomme for løsrivelse indusert ved tilsetning av felles medium, trekk av de to migrasjonskamrene etter tilsetning av det felles medium.
- Observer og ta et bilde av overflaten dekket av cellene på forskjellige tidspunkter under et fasekontrastmikroskop ved 10x forstørrelse.
MERK: Bildene er tatt med et fasekontrastmikroskop (se materialfortegnelse). Bildene lagres i en USB-nøkkel og analyseres deretter av plugin-modulen for sårhelingsverktøyet i programvaren (se Materialfortegnelse). - Mål den avdekkede overflaten ved hjelp av klassisk kvantitativ analyseprogramvare.
- Åpne bildet på programvaren og aktiver sårhelingsverktøyet som er tilgjengelig i makrolisten.
- Klikk på m-knappen for å måle den avdekkede overflaten av migrasjonsbildet.
- Den avdekkede overflaten beregnes i henhold til følgende formel:
Prosentandel av dekning = ([middelareal uten celler ved T0 − område uten celler på tidspunkt T]/middelareal uten celler ved T0) × 100.
MERK: De 3D-printede innsatsene er helt tilpasset de fleste teknikker for cellebiologi (for eksempel pseudorørdannelsesanalysen, 3D-kulturer) og for biokjemiske eksperimenter (som ekstraksjon av DNA, RNA, protein).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I dette arbeidet ble det beskrevet et optimalisert samkultursystem for å oppnå robuste, pålitelige og signifikante data som kan sammenlignes med klassiske metoder ved bruk av betingede medier. De 3D-printede innsatsene etterligner in vivo mikromiljøforholdene til forskjellige celletyper i samspill ved å overvinne vanskelighetene og den tidkrevende produksjonen av betingede medier oppstrøms i forsøkene. En tidligere publisert studie har blitt reutført for å analysere de indirekte interaksjonene mellom to celletyper som er tilstede i hårsekkene: humane mikrovaskulære endotelceller (HDMEC) og humane keratinocytter i den ytre rotskjeden (KORS)8. Her ble reproduserbarheten av resultatene oppnådd ved bruk av 3D-printede innsatser sammenlignet med den klassiske metoden ved bruk av betingede medier for å undersøke indirekte interaksjoner mellom HDMEC og KORS demonstrert. Cellekulturbetingelsene som tidligere er beskrevet i studie8 var de samme som i dette nåværende arbeidet. De ble tilpasset med tanke på dimensjonene til de 3D-printede innsatsene (se protokollen). For det første var fenotypen og cellens levedyktighet sammenlignbare mellom de to tilstandene (betingede medier vs.3D trykte innlegg) for alle celletyper (figur 2). Faktisk ble 90% levedyktighet observert i brønnene til 6-brønnplatene (figur 2A og tabell 1), og 91% ble observert i 3D-printede innlegg (figur 2B og tabell 1) for KORS. Levedyktigheten til HDMEC var 85 % i brønnene på 6-brønnsplaten (figur 2C og tabell 2) mot 86 % i 3D-printede innsatser (figur 2D og tabell 2). Dataene for celle levedyktighet ble beregnet av den automatiserte celletelleren (materialfortegnelse) som følger: antall levedyktige celler delt på antall totale celler (døde + levedyktige celler). Gjennomsnittsdataene ble oppnådd ved å beregne prosentvis levedyktighet oppnådd i seks uavhengige eksperimenter der to replikater ble utført (se tabell 1 og tabell 2).
Disse resultatene indikerte at den 3D-printede innsatsen ikke endret celleoppførselen eller levedyktigheten sammenlignet med vanlig kultur på 6-brønnsplater. Derfor ble de 3D-printede innsatsene validert som en ny modell for samkultur.
Tidligere demonstrerte parametere8 for indirekte cellekommunikasjon ble analysert. For alle eksperimentene ble den 3D-printede samkulturimplementeringen realisert etter protokollene i samsvar med de klassiske kulturbetingelsene (se tidligere arbeid8).
Først ble den indirekte cellekommunikasjonen mellom KORS og HDMEC i de 3D-printede innleggene vurdert ved å analysere celleproliferasjonen og sammenlignet med den klassiske metoden ved bruk av betingede medier (figur 3). I nærvær av KORS i innleggene (+ KORS) økte HDMEC-proliferasjonen signifikant med 1,5 ganger etter 24 timer og med 3,1 ganger etter 48 timer sammenlignet med kontrolltilstanden uten KORS (kontroll) (figur 3A). Disse resultatene var i samsvar med de som ble oppnådd ved betingede medieeksperimenter (figur 3B). Faktisk ble KORSCM vist å øke HDMEC-spredningen betydelig med 1,5 ganger etter 24 timer og med 2,1 ganger etter 48 timer.
Den 3D-printede samkulturmodellen ble testet for å bestemme effekten av KORS på HDMEC-migrering. Denne effekten ble tidligere demonstrert i det klassiske samkultursystemet ved bruk av betingede medier8 (figur 4). I kontrolltilstanden uten KORS (kontroll) migrerte HDMEC og dekket ca. 44 % av sårområdet etter 24 timer (figur 4A). I nærvær av KORS (+ KORS) ble det observert en sterk og signifikant økning i HDMEC-migrasjon. Faktisk viste kinetikken til sårheling at 43%, 67% og 99% av sårområdet ble dekket av HDMEC etter henholdsvis 3 timer, 12 timer og 24 timer. Disse resultatene var i samsvar med de som ble oppnådd tidligere8, hvor KORSCM ble vist å øke HDMEC-migrasjonen på lignende måte (figur 4B).
Figur 1: Arbeidsflyt som viser implementeringen av den 3D-printede samkulturen for innsatsen, fra rengjøring til resirkulering av innsatsen . (A) Et representativt bilde av det 3D-printede innlegget. (B) Et representativt eksempel på analysene som presenteres i dette manuskriptet er illustrert. Merk at en spredningsanalyse kan gjøres i ett rom i den 3D-printede innsatsen parallelt med en migrasjonsanalyse utført i det andre rommet ved hjelp av en enhet med to migrasjonskamre plassert i de andre rommene i de 3D-printede innsatsene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: KORS og HDMEC levedyktighet. (A,B) KORS morfologi (10x) i (A) en brønn med en 6-brønns plate og (B) i en 3D-printet innsats. (C,D) HDMEC morfologi (10x) i (C) en brønn med 6-brønns plate og (D) i en 3D-printet innsats. Skala bar: 200 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Effekt av KORS på HDMEC-spredning. (A) HDMEC-proliferasjon ble målt ved kolorimetrisk analyse ved bruk av WST-1-fargestoff i den 3D-printede innsatsen i fravær av KORS (kontroll = CTRL) eller i nærvær av KORS (+ KORS) i 24 timer eller 48 timer. (B) HDMEC-proliferasjon ble målt ved kolorimetrisk analyse ved bruk av WST-1-fargestoff i nærvær av ECM basalcellekulturmedium eller KORS CM i 24 timer eller 48 timer. Resultatene uttrykkes som gjennomsnitt ± SEM, n = 8 replikater, og to uavhengige eksperimenter ble utført. *p < 0,05, ***p < 0,001, ****p < 0,0001 og *****p < 0,00001. KORS ble inkubert i ECM uten FBS og vekstfaktorer. Etter 48 timer ble dette kondisjonerte mediet samlet og lagret ved -80 °C for forsøkene. Denne figuren er endret fra 8 og gjengitt med tillatelse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Effekt av KORS på HDMEC-migrasjon. (A) Migreringen av HDMEC i det 3D-printede innlegget i fravær av KORS (kontroll = CTRL) eller i nærvær av KORS (+ KORS) vises og kvantifiseres som prosentandelen av utvinning. (B) Migrasjonen av HDMEC i ECM eller KORSCM vises og kvantifiseres som prosentandelen av utvinning. Resultatene uttrykkes som gjennomsnittet ± SEM, n = 3 replikater, og tre felt ble analysert per replikat, to uavhengige eksperimenter ble utført. **p<0.01, ******p<0.00001. Skala bar: 200 μm. KORS ble inkubert i ECM uten FBS og vekstfaktorer. Etter 48 timer ble dette kondisjonerte mediet samlet opp og lagret ved -80 °C for forsøkene. Denne figuren er endret fra 8 og gjengitt med tillatelse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Telling 1 | Telling 2 | Bety | Totalt gjennomsnitt | ||
| 6-brønns plate | Replikere 1 | 95% | 84% | 90% | 90% |
| Replikere 2 | 90% | 88% | 89% | ||
| Replikere 3 | 85% | 89% | 87% | ||
| Replikere 4 | 97% | 89% | 93% | ||
| Replikere 5 | 88% | 94% | 91% | ||
| Replikere 6 | 86% | 92% | 89% | ||
| 3D-trykt innsats | Replikere 1 | 92% | 89% | 91% | 91% |
| Replikere 2 | 91% | 80% | 86% | ||
| Replikere 3 | 93% | 92% | 93% | ||
| Replikere 4 | 94% | 98% | 96% | ||
| Replikere 5 | 88% | 86% | 87% | ||
| Replikere 6 | 93% | 97% | 95% |
Tabell 1: KORS levedyktighetsmåling. KORS levedyktighet ble målt i en brønn med en 6-brønns plate og i en 3D-printet innsats ved hjelp av trypanblå farging og automatisk telling.
| Telling 1 | Telling 2 | Bety | Totalt gjennomsnitt | ||
| 6-brønns plate | Replikere 1 | 90% | 88% | 89% | 85% |
| Replikere 2 | 79% | 78% | 79% | ||
| Replikere 3 | 71% | 75% | 73% | ||
| Replikere 4 | 86% | 82% | 84% | ||
| Replikere 5 | 91% | 88% | 90% | ||
| Replikere 6 | 99% | 94% | 97% | ||
| 3D-trykt innsats | Replikere 1 | 99% | 86% | 93% | 86% |
| Replikere 2 | 80% | 75% | 78% | ||
| Replikere 3 | 79% | 80% | 80% | ||
| Replikere 4 | 98% | 85% | 92% | ||
| Replikere 5 | 85% | 78% | 82% | ||
| Replikere 6 | 89% | 93% | 91% |
Tabell 2: HDMEC levedyktighetsmåling. HDMECs levedyktighet ble målt i en brønn med en 6-brønns plate og i en 3D-printet innsats ved hjelp av trypanblå farging og automatisk telling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Indirekte cellekommunikasjon blir ofte undersøkt ved hjelp av betingede medier eller samkultursystemenheter. Betinget mediepreparering er tidkrevende oppstrøms i forsøkene, og denne metoden er begrenset til ensidige effektanalyser. Den forrige studien av Colin-Pierre et al.8 Bruk av betingede medier ble utført på indirekte cellekommunikasjon mellom to celletyper (HDMEC og KORS). Dataene fra denne tidligere studien viste effekten av KORS betingede medier på HDMEC-spredning og effekten av KORS betingede medier på HDMEC-migrasjon, pseudorørdannelse og GPC1-uttrykk8. I denne studien beskrives en enklere og raskere måte å undersøke indirekte cellekommunikasjon på. Faktisk tillater 3D-printede innsatser fleksibilitet i eksperimentell design og flere kombinasjoner av cellekultur. For å validere disse 3D-printede innsatsene som en modell for kokulturer, ble celleproliferasjon og cellemigrasjon analysert og sammenlignet med den forrige studien ved bruk av betinget media8. I begge studiene ble sårhelingsanalysen utført ved hjelp av en to migrasjonskamre (Culture-Insert 2 Well in μ-Dish 35 mm) plassert i brønnen som inneholdt eller ikke inneholdt innsatsen. Denne migrasjonstestenheten9,10 skiller seg fra scratch-analyser11,12 ved at fotavtrykket som er igjen av veggen (simulerer såret) som avgrenser de to kamrene, er konstant. Derfor er det svært reproduserbart. Resultatene av denne studien har ført til en lignende konklusjon i forhold til betingede medieeksperimenter. De 3D-printede innsatsene endrer ikke celleoppførselen og er tilpasset for å lage uavhengige rombelegg som fremmer celleadherens. Imidlertid tillater de 3D-printede innsatsene også å lage et belegg med poly-HEMA, for eksempel for å indusere lavt vedlegg for kulturen til sfæroid / organoid. Indirekte kommunikasjon mellom HDMEC og KORS ble her undersøkt som et eksempel på de mange applikasjonene som leveres av de 3D-printede innsatsene.
Gjeldende for adherente celletyper som krever eller ikke krever et bestemt belegg, gir denne nye enheten betydelig tidsbesparelse for etablering av samkulturmodellen. Faktisk tillater de fire rommene i de 3D-printede innsatsene kulturen av flere celletyper i monolag eller i 3D (aggregater eller sfæroider) i samme brønn med forskjellige kombinasjoner. For eksempel kan den indirekte kommunikasjonen av fire celletyper i monolag, i 3D (sfæroider), eller en kombinasjon av begge analyseres. Under forsøkene ble sfæroider dyrket i de 3D-printede innsatsene ved hjelp av et poly-HEMA belegg (data ikke vist). Sfæroidene besto av celler sådd i 3D på grunn av den lave bindingsplaten og overført etter 48 timer til den 3D-printede innsatsen for analyser. Etter flere dager med kultur ble veksten av sfæroidene observert. Disse resultatene viser at den 3D-printede innsatsen kan brukes til å følge 3D-cellevekst etter overføring av sfæroidene på samme måte som i en kulturplate13,14. Videre kan en blanding av forskjellige celletyper settes sammen i samme rom i 2D eller 3D (organoider) for å studere både direkte og indirekte cellekommunikasjon. Faktisk kjennetegner det brede spekteret av modularitet som tilbys av de 3D-printede innsatsene dette innovative celle-samkultursystemet. I tillegg tillater tilstedeværelsen av kommunikasjonsvinduene bruk i et felles medium for alle celletyper på et valgt tidspunkt uten hjelp av betingede medier. Dermed er denne teknikken ikke anvendelig for celler dyrket i suspensjon. Veggene som skiller de fire rommene tillater såing, høsting og analyse av hver celletype uavhengig av de andre. Flere applikasjoner kan gjøres, for eksempel pseudorørdannelsesanalyser og spredning, migrasjon, DNA, RNA, protein og andre analyser. De 3D-printede innsatsene gir også muligheten til å analysere effekten av molekyler eller ekstracellulære vesikler, for eksempel. Videre gir det faktum at disse innsatsene ble laget av 3D-utskrift mange muligheter for romoppsett og mange funksjonelle analyser.
Det kritiske trinnet med den 3D-printede innsatsforseglingen i platen må imidlertid vurderes nøye. Faktisk er en homogen repartisjonering av silisiumet avgjørende for å sikre forsegling og for å forhindre lekkasje av cellekulturmedium eller celler fra ett rom til et annet. For å unngå problemer, bør man sørge for at silisiumet dekker den delen av de 3D-printede innsatsene som kommer i kontakt med platen. Før såing av cellene, bør man sjekke for riktig tetning ved å legge cellekulturmedium til ett rom og observere fraværet av mediumlekkasje i de andre rommene. Tørketiden til silisiumet etter inkubasjonen i 70% etanolbadet er også et kritisk skritt. Faktisk kan de resterende sporene av alkohol føre til cellefiksering og toksisitet. For å unngå problemer må tørketiden respekteres.
For å konkludere, er de 3D-printede innsatsene kompatible med de fleste adherente celletyper for kultur i 2D eller 3D og tillater mange eksperimenteringsmetoder. De kan tilpasses for en rekke samkulturstudier og kan gi et nytt verktøy for å undersøke indirekte cellekommunikasjon. De 3D-printede innsatsene er modulable, fleksible, skalerbare og kan brukes til å designe eksperimentelle modeller for studier av fysiopatologier som kreft, immunologi eller angiogenese.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne oppgir ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Denne studien ble gjort i samarbeid med BASF Beauty Care Solutions. Charlie Colin-Pierre er en BASF / CNRS-finansiert PhD-stipendiat.
Vi ønsker å takke Mr. Mehdi Sellami for ideen om de 3D-printede innsatsene.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Autoclave | Getinge | APHP | Solid cycle, 121 °C for 20 min |
| Biomed Clear | Formlabs | RS-F2-BMCL-01 | Impression performed by 3D-Morphoz company (Reims, France) |
| Cell culture detergents | Tounett | A18590/0116 | |
| Cell Proliferation Reagent WST-1 | Roche | 11,64,48,07,001 | |
| Counting slide | NanoEnTek | EVE-050 | |
| Culture-Insert 2 Well in μ-Dish 35 mm | Ibidi | 80206 | two-migration chambers device. |
| Endothelial cell medium | ScienCell | 1001 | Basal medium +/- 25 mL of fetal bovine serum (FBS, 0025), 5 mL of endothelial cell growth supplement (ECGS, 1052), and 5 mL of penicillin/streptomycin solution (P/S, 0503). |
| EVE Automated cell counter | NanoEnTek | NESCT-EVE-001E | |
| EVOS XL Core | Fisher Scientific | AMEX1200 | 10x of magnification |
| Food silicon reagent and catalyst kit | Artificina | RTV 3428 A and B | (10:1) |
| FORM 3B printer | Formlabs | PKG-F3B-WSVC-DSP-BASIC | Impression performed by 3D-Morphoz company |
| Human Dermal Microvascular Endothelial Cells (HDMEC) | ScienCell | 2000 | |
| Keratinocytes of Outer Root Sheath (KORS ) | ScienCell | 2420 | |
| Macro Wound Healing Tool Software | ImageJ | Software used for the measurement of the uncovered surface (for migration assays) | |
| Mesenchymal stem cell medium | ScienCell | 7501 | Basal medium +/-25 mL of fetal bovine serum (FBS, 0025), 5 mL of mesenchymal stem cell growth supplement (MSCGS, 7552), and 5 mL of penicillin/streptomycin solution (P/S, 0503) |
| Microplate reader SPECTRO star NANO | BMG Labtech | BMG LABTECH software | |
| PBS | Promocell | C-40232 | Without Ca2+ / Mg2+ |
| Trypan Blue Stain | NanoEnTek | EBT-001 | |
| Trypsin / EDTA | Promocell | C-41020 | Incubation of KORS at 37 °C with 5% CO2 for 5 min. Incubation of HDMECs for 5 min at room temperature |
| 96-well plate Nunclon Delta Surface | Thermoscientific | 167008 |
References
- Regier, M. C., Alarid, E. T., Beebe, D. J. Progress towards understanding heterotypic interactions in multi-culture models of breast cancer. Integrative Biology. 8 (6), 684-692 (2016).
- Doğan, A., Demirci, S., Apdik, H., Apdik, E. A., Şahin, F. Mesenchymal stem cell isolation from pulp tissue and co-culture with cancer cells to study their interactions. Journal of Visualized Experiments. (143), e58825 (2019).
- Lin, J., et al. Long non-coding RNA UBE2CP3 enhances HCC cell secretion of VEGFA and promotes angiogenesis by activating ERK1/2/HIF-1α/VEGFA signalling in hepatocellular carcinoma. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 37 (1), 113 (2018).
- Soares, N. L., et al. Carbon monoxide modulation of microglia-neuron communication: Anti-neuroinflammatory and neurotrophic role. Molecular Neurobiology. 59 (2), 872-889 (2022).
- Al Halawani, A., Abdulkhalek, L., Mithieux, S. M., Weiss, A. S. Tropoelastin promotes the formation of dense, interconnected endothelial networks. Biomolecules. 11 (9), 1318 (2021).
- Mercatali, L., et al. Development of a human preclinical model of osteoclastogenesis from peripheral blood monocytes co-cultured with breast cancer cell lines. Journal of Visualized Experiments. (127), e56311 (2017).
- Orona, N. S., Astort, F., Maglione, G. A., Yakisich, J. S., Tasat, D. R. Direct and indirect effect of air particles exposure induce Nrf2-dependent cardiomyocyte cellular response in vitro. Cardiovascular Toxicology. 19 (6), 575-587 (2019).
- Colin-Pierre, C., et al. The glypican-1/HGF/C-met and glypican-1/VEGF/VEGFR2 ternary complexes regulate hair follicle angiogenesis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 781172 (2021).
- Toubal, A., et al. The NC1 domain of type XIX collagen inhibits melanoma cell migration. European Journal of Dermatology. 20 (6), 712-718 (2010).
- Wu, A. -L., et al. Role of growth factors and internal limiting membrane constituents in müller cell migration. Experimental Eye Research. 202, 108352 (2021).
- Oudart, J. -B., et al. Plasmin releases the anti-tumor peptide from the NC1 domain of collagen XIX. Oncotarget. 6 (6), 3656-3668 (2015).
- Martinotti, S., Ranzato, E.
- Cattin, S., Ramont, L., Rüegg, C. Characterization and in vivo validation of a three-dimensional multi-cellular culture model to study heterotypic interactions in colorectal cancer cell growth, invasion and metastasis. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 97 (2018).
- Ma, Y. N., et al. Three-dimensional spheroid culture of adipose stromal vascular cells for studying adipogenesis in beef cattle. Animal. 12 (10), 2123-2129 (2018).
