Summary
Neste artigo, um novo inserto impresso em 3D é apresentado como um modelo de co-cultura e validado através do estudo da comunicação intercelular parácrina entre células endoteliais e queratinócitos.
Abstract
As análises clássicas da comunicação indireta entre diferentes tipos celulares requerem o uso de meios condicionados. Além disso, a produção de meios condicionados permanece demorada e distante de condições fisiológicas e patológicas. Embora alguns modelos de co-cultura estejam comercialmente disponíveis, eles permanecem restritos a ensaios específicos e são principalmente para dois tipos de células.
Aqui, são usados insertos impressos em 3D que são compatíveis com inúmeros ensaios funcionais. A pastilha permite a separação de um poço de uma placa de 6 poços em quatro compartimentos. Uma ampla gama de combinações pode ser definida. Além disso, janelas são projetadas em cada parede dos compartimentos para que a comunicação intercelular potencial entre cada compartimento seja possível no meio de cultura de forma dependente do volume. Por exemplo, a comunicação intercelular parácrina pode ser estudada entre quatro tipos celulares em monocamada, em 3D (esferoides) ou combinando ambos. Além disso, uma mistura de diferentes tipos de células pode ser semeada no mesmo compartimento em formato 2D ou 3D (organoides). A ausência de fundo nos insertos impressos em 3D permite as condições usuais de cultura na placa, possível revestimento na placa que contém o inserto e visualização direta por microscopia óptica. Os múltiplos compartimentos oferecem a possibilidade de coletar diferentes tipos celulares de forma independente ou de utilizar, em cada compartimento, diferentes reagentes para extração de RNA ou proteínas. Neste estudo, uma metodologia detalhada é fornecida para usar o novo inserto impresso em 3D como um sistema de co-cultura. Para demonstrar várias capacidades deste modelo flexível e simples, ensaios funcionais de comunicação celular previamente publicados foram realizados nos novos insertos impressos em 3D e demonstraram ser reprodutíveis. As pastilhas impressas em 3D e a cultura celular convencional em meio condicionado levaram a resultados semelhantes. Em conclusão, o inserto impresso em 3D é um dispositivo simples que pode ser adaptado a inúmeros modelos de co-culturas com tipos celulares aderentes.
Introduction
In vivo, as células se comunicam entre si diretamente (contato celular) ou indiretamente (por secreção de moléculas). Para estudar a comunicação celular, diferentes modelos de co-cultura podem ser desenvolvidos, como o co-cultivo direto (os diferentes tipos celulares estão em interação direta no mesmo poço) e o co-cultivo compartimentado (os diferentes tipos celulares estão em interação indireta em diferentes compartimentos de um sistema de cultura)1. Além disso, meios condicionados podem ser usados para sistemas de co-cultura, onde a interação indireta é possibilitada por moléculas secretadas contidas no meio condicionado de um tipo de célula efetora sendo transferida para uma célula respondedora tipo1.
No caso de estudos de comunicação celular parácrina, sistemas de co-cultura indireta fornecem modelos que refletem fortemente as interações celulares in vivo. Sistemas de cocultura indireta têm sido desenvolvidos e comercializados, permitindo o estabelecimento de modelos de cocultura indireta 2,3. Infelizmente, a maioria dos sistemas de co-cultura indireta fornece apenas dois compartimentos. Outros sistemas de co-cultura indireta fornecem múltiplos compartimentos, mas são menos escaláveis em comparação com o sistema relatado no presente manuscrito. Alguns deles não permitem uma visualização clássica ao microscópio e, muitas vezes, apresentam métodos específicos de aplicação. Em vários estudos, a comunicação parácrina entre diferentes tipos celulares é investigada pelo modelo de meioscondicionados 4,5,6,7. Esta é uma maneira mais fácil de investigação em comparação com sistemas de co-cultura indireta, pois não requer métodos ou materiais específicos para serem estabelecidos1. Por outro lado, a preparação de meios condicionados é demorada e fornece informações apenas sobre a sinalização celular unidirecional (efetor para respondedor)1.
Neste artigo, uma nova e simples forma de investigar a comunicação celular é proposta. Permitindo a combinação de vários tipos celulares em interação direta ou indireta e em formatos 2D ou 3D, os insertos impressos apresentam inúmeras vantagens para a fácil montagem de modelos de co-cultura. Adaptado para ser colocado nos poços de placas de 6 poços, o inserto impresso em 3D é circular e permite a separação do poço em quatro compartimentos (dois grandes compartimentos e dois pequenos compartimentos; Figura 1A). As pastilhas impressas em 3D são caracterizadas pela ausência de um fundo. Assim, as células ficam em contato direto com a placa na qual a pastilha é colocada. Além disso, cada compartimento pode ser revestido independentemente dos outros. Além disso, o comportamento celular pode ser facilmente acompanhado em microscópios ópticos. A presença de janelas de comunicação em cada parede da pastilha permite a adição, no momento ideal, de um meio comum para realizar diferentes experimentos de co-cultura. Inúmeras combinações de co-cultura podem ser realizadas para estudar a comunicação direta e/ou indireta entre vários tipos celulares. Por exemplo, um modelo de co-cultura indireta entre quatro tipos diferentes de células em monocamada e/ou em 3D (esferoides) pode ser projetado. Uma combinação de modelos de co-cultura direta e indireta também pode ser realizada misturando diferentes tipos celulares no mesmo compartimento. O efeito de estruturas complexas (organoides, explantes teciduais, etc.) sobre diferentes tipos celulares poderia ser outro exemplo de modelos que podem ser feitos. Além disso, as inserções impressas em 3D são compatíveis com ensaios funcionais de biologia celular (proliferação, migração, formação de pseudotubos, diferenciação, etc.) e com testes bioquímicos (extração de DNA, RNA, proteínas, lipídios, etc.). Finalmente, os insertos impressos em 3D fornecem uma ampla gama de esquemas experimentais de modelos de co-cultura com a possibilidade de combinar simultaneamente diferentes ensaios no mesmo experimento nos diferentes compartimentos.
Algumas capacidades dos encartes impressos em 3D são apresentadas para validá-los como um modelo de co-cultura rápido e fácil de usar. Em comparação com um estudo publicado anteriormente sobre comunicação celular parácrina, a capacidade das pastilhas impressas em 3D de serem um valioso modelo de co-cultura é demonstrada. Para avaliar esse ponto, a regulação da proliferação e migração de células endoteliais pelos queratinócitos foi comparada entre o sistema de inserção impresso em 3D e o sistema clássico usando meios condicionados. Os insertos impressos em 3D permitem a obtenção de resultados semelhantes rapidamente em relação ao sistema convencional que utiliza meios condicionados. De fato, as pastilhas impressas em 3D fornecem um modelo robusto para estudar interações celulares em ambas as direções sem a necessidade de produzir meios condicionados e com a possibilidade de realizar em paralelo os ensaios de proliferação e migração em um mesmo experimento.
Para concluir, neste artigo, um novo modelo pronto para uso para estudar a comunicação celular é proposto. Compatíveis com todos os tipos celulares aderentes, as pastilhas impressas em 3D permitem realizar inúmeras combinações de co-cultura que visam estar mais próximas das condições in vivo .
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Protocol
NOTA: Os insertos 3D (Figura 1A) são adquiridos comercialmente e impressos usando uma resina fotopolimérica que é biocompatível com cultura de células e autoclavagem (consulte a Tabela de Materiais). Nesta seção, um protocolo detalhado para estabelecer o modelo de co-cultura por inserções é descrito (ver Figura 1B). Alguns exemplos de aplicações também são fornecidos.
1. Colocação da pastilha esterilizada nas placas de 6 poços
- Misturar os dois componentes fornecidos no kit (ver Tabela de Materiais), silício alimentar (reagente A) e catalisador (reagente B), numa proporção de 10:1 (v/v) de acordo com as instruções do fabricante. (Figura 1B). Use uma espátula esterilizada a etanol 70% para misturar os dois componentes.
NOTA: O volume da mistura de silicone a ser preparada depende do número de pastilhas a serem fixadas. Um excesso de catalisador pode fazer com que a mistura de silício se solidifique muito rápido. - Aplicar as pastilhas sobre a mistura de silicone com uma pinça de modo que a mistura seja homogeneamente distribuída na borda inferior das pastilhas (Figura 1Bb). Coloque as pastilhas nos orifícios de uma placa de 6 poços e aplique uma pressão suave sobre as pastilhas para garantir que as pastilhas estejam em contato próximo com a placa para evitar qualquer vazamento do meio de cultura celular (Figura 1Bc).
- Colocar a placa a 37 °C para apoiar o processo de solidificação do silício durante 1 h.
NOTA: O tempo de solidificação depende da quantidade de catalisador que foi adicionada. - Após a solidificação, esterilizar as placas com as pastilhas imergindo-as em banho de etanol 70% por 30 min a 1 h.
- Descarte o álcool por pipetagem e deixe a placa secar (tampa aberta) durante a noite em uma capa de cultura celular.
NOTA: O álcool deve ser totalmente evaporado antes de realizar o próximo passo para evitar a fixação celular e toxicidade. A placa pronta para uso contendo as pastilhas pode ser armazenada por vários dias antes do uso em condições secas e estéreis à temperatura ambiente.
2. Revestimentos como poli-L-lisina, ou poli-HEMA (etapa opcional)
OBS: O revestimento não é realizado neste experimento, e são fornecidas as etapas para informar quanto à possibilidade de revestimento dos insertos.
- Prepare a solução de revestimento de acordo com as instruções do fabricante.
- Considere um volume de 200-400 μL para os compartimentos maiores e um volume de 50-100 μL para os compartimentos menores para o revestimento da pastilha. Adicione a solução de revestimento aos compartimentos individuais.
- Deixe o revestimento secar conforme indicado pelo fabricante em condições estéreis.
3. Semeadura das células
- Cultivar os queratinócitos da bainha radicular externa (KORS) e as células endoteliais microvasculares dérmicas humanas (HDMECs), conforme recomendação do fabricante. Prepare a suspensão celular assim que as células atingirem a confluência.
- Eliminar o meio dos frascos e adicionar 5 ml de tripsina para separar as células (ver Tabela de Materiais).
- Colocar o balão contendo o KORS a 37 °C com 5% de CO2 durante 5 min. Incubar o balão contendo os HDMECs durante 5 min à temperatura ambiente.
- Misturar a solução de tripsina contendo o KORS com 5 mL de meio de células-tronco mesenquimais (CTMM) suplementado com 5% de soro fetal bovino (SFB) e fatores de crescimento (meio basal com kit suplementar, ver Tabela de Materiais). Misturar a solução de tripsina contendo os HDMECs com 5 mL de meio de célula endotelial (ECM) suplementado com 5% de SFB e fatores de crescimento (ver Tabela de Materiais).
- Transfira as células para um tubo cônico estéril de 15 mL. Centrifugar as suspensões KORS e HDMEC a 200 x g por 5 min à temperatura ambiente.
- Eliminar o sobrenadante e ressuspender as células em 2 mL do respectivo meio.
- Misturar 10 μL da suspensão celular com 10 μL de corante azul de tripano (ver Tabela de Materiais).
- Adicionar 10 μL da mistura à câmara da lâmina de contagem.
- Insira a lâmina de contagem no sistema de contagem de células (consulte Tabela de Materiais) e detecte o número de células e a viabilidade.
- Preparar a suspensão celular na concentração de 0,5 x 105 células/mL no respectivo meio.
NOTA: Se os diferentes tipos celulares requerem diferentes tempos de aderência e/ou para atingir a confluência ideal, a semeadura celular pode ser feita em diferentes pontos de tempo de acordo com os tipos celulares.
- Distribuir 800 μL a 1 mL da suspensão celular nos grandes compartimentos individuais e 100-150 μL nos pequenos compartimentos individuais com uma pipeta.
- Semeando o KORS a 1 x 10 5 células/mL em CTMM suplementada com5% de SFB e fatores de crescimento em um dos grandes compartimentos.
- HDMEC em ECM suplementada com 5% de SFB e fatores de crescimento a 2,5 x 103 células/mL nos compartimentos pequenos e a 1,25 x 105 células/mL no outro compartimento grande.
NOTA: O ensaio de proliferação pode ser realizado nos pequenos compartimentos, e os ensaios de migração e viabilidade podem ser realizados nos grandes compartimentos. A concentração das células semeadas foi otimizada de acordo com as recomendações do fabricante. Esta concentração permite uma boa viabilidade das células após 24-48 h de incubação.
- Colocar a placa de cultura celular a 37 °C com 5% de CO2 ou nas condições habituais para permitir a adesão e/ou maturação celular.
NOTA: Incubar as células por 24-48 h sem alterar o meio. Se necessário, o meio dos compartimentos pode ser trocado independentemente.
4. Implementação da co-cultura ( Figura 1Bd)
NOTA: A implementação da co-cultura corresponde ao momento em que o meio comum é adicionado. A adição de um meio único para todos os tipos celulares nos diferentes compartimentos proporciona a possibilidade de comunicação parácrina entre as células devido à presença de janelas de comunicação (orifícios ovoides nas paredes das pastilhas impressas em 3D). Para implementar a cocultura, siga as etapas 4.1-4.3.
- Esvazie os meios de cultura dos diferentes compartimentos das pastilhas usando uma pipeta. No caso de uma cultura de células esferoides 3D, descarte o meio com muita delicadeza.
- Enxaguar as células com 1 mL de PBS aquecido a 37 °C nos compartimentos grandes e 200 μL de PBS aquecido a 37 °C nos compartimentos pequenos. Certifique-se de lavar suavemente para não desprender as células.
- Adicionar 3 mL de um meio comum selecionado para ser compatível com todos os tipos celulares.
NOTA: Neste estudo, o ECM basal (sem SFB e fatores de crescimento) é usado. Certifique-se de que o meio cubra todos os compartimentos (nível acima das janelas de comunicação [orifícios ovoides nas paredes], como mostra a Figura 1A). - Colocar a placa contendo as co-culturas a 37 °C com 5% de CO2 durante 24-48 horas.
5. Observação, contagem e raspagem de células
- Observar a morfologia e contar o número de células dos diferentes compartimentos durante o experimento em microscópio óptico após 24-48 h de incubação.
NOTA: O número esperado de células depende dos tipos de células utilizadas (tamanho, morfologia, etc.) e do tamanho do compartimento. Neste experimento, entre 0,5 x 10 6-1 x 10 6 KORS/mL e entre 0,25 x 10 6-0,75 x 10 6 HDMECs/mL são contados nos grandes compartimentos. - Destacar as células usando tripsina para contagem de suspensão celular.
NOTA: Para a solução de descolamento celular, considere um volume de 100-500 μL para os compartimentos maiores e um volume de 10-50 μL para os compartimentos menores. - Verificar a viabilidade utilizando a coloração azul de tripano (ver passos 3.1.6-3.1.8).
6. Limpeza de pastilhas para reciclagem
- Remova as pastilhas da placa de 6 poços no final do experimento por uma leve torção (Figura 1Be).
- Remova o silicone das pastilhas puxando-o. Se necessário, use uma espátula para remover o silicone restante preso às paredes dos insertos (Figura 1Bf).
- Lave as pastilhas com detergentes convencionais para cultura de células e materiais de limpeza (exemplo fornecido na Tabela de Materiais).
- Esterilizar as pastilhas para uso futuro em autoclave (ciclo sólido, 121 °C por 20 min) ou imergindo-as em banho de etanol 70% por 1 h.
NOTA: A partir desta etapa, dois exemplos de ensaios possíveis (ensaios de proliferação e migração) são descritos usando os insertos impressos em 3D (Figura 1Bd).
7. Ensaio de proliferação celular - ensaio WST-1
- Siga as etapas 1-3.1 para cultivar as células.
NOTA: Siga o passo nesta seção para implementar o sistema de co-cultura, a fim de investigar o efeito do secretoma KORS na proliferação de HDMEC. As células KORS são utilizadas para comparar os dados publicados anteriormente8.- Semeando o KORS a 1 x 10 5 células/mL em meio de células-tronco mesenquimais (CTMM) suplementado com5% de SFB e fatores de crescimento nos grandes compartimentos.
- Colocar a placa de cultura celular a 37 °C com 5% de CO2 durante 24 horas.
- Semeando as HDMECs em meio de células endoteliais (ECM) suplementado com 5% de SFB e fatores de crescimento a 2,5 x 103 células/mL nos pequenos compartimentos.
- Colocar a placa de cultura celular a 37 °C com 5% de CO2 durante 24-48 horas.
- Eliminar o meio de todos os compartimentos e implementar o sistema de co-cultura pela adição de 3 mL de ECM basal não suplementado (meio de cultura celular comum para todos os compartimentos das pastilhas impressas em 3D).
- Diluir o WST-1 no meio de cultura de células comuns ECM (diluição final 1:10) para preparar a solução de WST-1.
NOTA: Para o volume de solução WST-1, prepare pelo menos 500 μL de solução extra para o branco. - Descarte o meio de cultura celular da inserção por pipetagem.
- Adicionar a solução WST-1 aos compartimentos seleccionados (150 μL para os compartimentos pequenos e 600 μL para os compartimentos grandes). Colocar a placa a 37 °C com 5% de CO2.
- Após o tempo ideal de incubação celular de 30 min, transfira 100 μL do meio de incubação de cada condição em uma placa de 96 poços.
- Avaliar a reação colorimétrica utilizando um leitor de microplacas entre 420 nm e 480 nm.
- Coloque a placa no leitor de microplacas e clique no botão editar um novo protocolo.
- Selecione o tipo específico de placa de 96 poços (consulte Tabela de Materiais) usada e o comprimento de onda de 450 nm.
- Clique no botão iniciar medição.
8. Ensaio de migração celular - dispositivo de duas câmaras de migração
- Siga as etapas 1-3.1 para cultivar as células.
NOTA: Siga as etapas nesta seção para implementar o sistema de co-cultura a fim de investigar o efeito do secretoma KORS na proliferação de HDMEC.- Semeando o KORS a 1 x 10 5 células/mL em CTMM suplementada com5% de SFB e fatores de crescimento em um dos grandes compartimentos.
- Colocar a placa de cultura celular a 37 °C com 5% de CO2 durante 24 horas.
- Coloque o dispositivo de duas câmaras de migração no outro grande compartimento de inserções.
- Semeando os HDMECs em ECM suplementado com 5% de SFB e fatores de crescimento a 7 x 105 células/poço do dispositivo das duas câmaras de migração.
- Colocar a placa de cultura celular a 37 °C com 5% de CO2 durante 24 horas.
- Descarte a mídia e o dispositivo das duas câmaras de migração após 24 h ou em um momento ideal de acordo com o tipo de célula que está migrando. Implementar o sistema de co-cultura pela adição de 3 mL de ECM basal não suplementada.
NOTA: Prossiga com cuidado para não desanexar as células. Se as células forem realmente sensíveis ao descolamento induzido pela adição de meio comum, retire o dispositivo de duas câmaras de migração após a adição do meio comum.
- Observe e tire uma foto da superfície coberta pelas células em diferentes momentos em um microscópio de contraste de fase com aumento de 10x.
NOTA: As fotos são tiradas com um microscópio de contraste de fase (ver Tabela de Materiais). As imagens são salvas em uma chave USB e, em seguida, analisadas pelo plugin da ferramenta de cicatrização de feridas do software (consulte Tabela de Materiais). - Meça a superfície descoberta usando um software clássico de análise quantitativa.
- Abra a imagem no software e ative a ferramenta de cicatrização de feridas disponível na lista de macros.
- Clique no botão m para medir a superfície descoberta da imagem de migração.
- A superfície descoberta é calculada de acordo com a seguinte fórmula:
Porcentagem de cobertura = ([área média sem células em T0 − área sem células no tempo T]/área média sem células em T0) × 100.
NOTA: As inserções impressas em 3D são totalmente adaptadas à maioria das técnicas de biologia celular (como o ensaio de formação de pseudotubos, culturas 3D) e para experimentos de bioquímica (como a extração de DNA, RNA, proteína).
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Representative Results
No presente trabalho, um sistema de co-cultivo otimizado foi descrito para obter dados robustos, confiáveis e significativos comparáveis aos métodos clássicos através do uso de meios condicionados. As inserções impressas em 3D mimetizam as condições do microambiente in vivo de diferentes tipos celulares em interação, superando as dificuldades e a demorada produção de meios condicionados a montante nos experimentos. Um estudo publicado anteriormente foi reconduzido para analisar as interações indiretas entre dois tipos celulares presentes nos folículos pilosos: células endoteliais microvasculares humanas (HDMECs) e queratinócitos humanos da bainha radicular externa (KORS)8. Aqui, foi demonstrada a reprodutibilidade dos resultados obtidos com o uso dos insertos impressos em 3D em comparação com o método clássico que utiliza meios condicionados para investigar interações indiretas entre HDMECs e KORS. As condições de cultura celular descritas anteriormente no estudo8 foram as mesmas do presente trabalho. Eles foram adaptados considerando as dimensões dos encartes impressos em 3D (veja o protocolo). Em primeiro lugar, o fenótipo e a viabilidade celular foram comparáveis entre as duas condições (meio condicionado vs.3D insertos impressos) para todos os tipos celulares (Figura 2). De fato, observou-se 90% de viabilidade nos poços das placas de 6 poços (Figura 2A e Tabela 1), e 91% nos insertos impressos em 3D (Figura 2B e Tabela 1) para o KORS. A viabilidade dos HDMECs foi de 85% nos poços da placa de 6 poços (Figura 2C e Tabela 2) versus 86% nos insertos impressos em 3D (Figura 2D e Tabela 2). Os dados de viabilidade celular foram calculados pelo contador automático de células (Tabela de Materiais) da seguinte forma: o número de células viáveis dividido pelo número de células totais (células mortas + viáveis). Os dados médios foram obtidos calculando-se a porcentagem de viabilidade obtida em seis experimentos independentes nos quais foram realizadas duas repetições (ver Tabela 1 e Tabela 2).
Esses resultados indicaram que a pastilha impressa em 3D não alterou o comportamento ou a viabilidade celular em comparação com a cultura usual em placas de 6 poços. Portanto, os encartes impressos em 3D foram validados como um novo modelo de co-cultura.
Foram analisados os parâmetros8 de comunicação celular indireta previamente demonstrados. Para todos os experimentos, a implementação da co-cultura de pastilhas impressas em 3D foi realizada seguindo os protocolos de acordo com as condições clássicas de cultura (ver trabalho anterior8).
Primeiramente, as comunicações celulares indiretas entre KORS e HDMECs nas bulas impressas em 3D foram avaliadas por meio da análise da proliferação celular e comparadas com o método clássico utilizando meios condicionados (Figura 3). Na presença de KORS nas pastilhas (+ KORS), a proliferação de HDMEC aumentou significativamente em 1,5 vezes após 24 h e em 3,1 vezes após 48 h em comparação com a condição controle sem KORS (Controle) (Figura 3A). Esses resultados foram condizentes com os obtidos por meio de experimentos em meios condicionados (Figura 3B). De fato, oMC KORS demonstrou aumentar significativamente a proliferação do HDMEC em 1,5 vezes após 24 h e em 2,1 vezes após 48 h.
O modelo de co-cultura de pastilhas impresso em 3D foi testado para determinar o efeito do KORS na migração do HDMEC. Esse efeito foi previamente demonstrado no sistema clássico de co-cultivo utilizando meios condicionados8 (Figura 4). Na condição controle sem KORS (Control), os HDMECs migraram e cobriram aproximadamente 44% da área da ferida após 24 h (Figura 4A). Na presença de KORS (+ KORS), observou-se um forte e significativo aumento na migração de HDMEC. De fato, a cinética de cicatrização mostrou que 43%, 67% e 99% da área da ferida foi coberta por HDMECs após 3 h, 12 h e 24 h, respectivamente. Esses resultados estão de acordo com os obtidosanteriormente8, onde oMC KORS demonstrou aumentar a migração de HDMEC de maneira semelhante (Figura 4B).
Figura 1: Fluxo de trabalho mostrando a implementação da co-cultura de inserção impressa em 3D desde a limpeza até a reciclagem da pastilha . (A) Uma imagem representativa do encarte impresso em 3D. (B) Um exemplo representativo dos ensaios apresentados neste manuscrito é ilustrado. Observe que um ensaio de proliferação pode ser feito em um compartimento da pastilha impressa em 3D em paralelo a um ensaio de migração realizado no outro compartimento usando um dispositivo de duas câmaras de migração colocado nos outros compartimentos das pastilhas impressas em 3D. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Viabilidade de KORS e HDMEC. (A,B) morfologia KORS (10x) em (A) um poço de uma placa de 6 poços e (B) em um inserto impresso em 3D. (C,D) Morfologia HDMEC (10x) em (C) um poço de placa de 6 poços e (D) em um inserto impresso em 3D. Barra de escala: 200 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Efeito do KORS na proliferação do HDMEC. (A) A proliferação de HDMEC foi medida por ensaio colorimétrico usando corante WST-1 na pastilha impressa em 3D na ausência de KORS (controle = CTRL) ou na presença de KORS (+ KORS) por 24 h ou 48 h. (B) A proliferação de HDMEC foi medida por ensaio colorimétrico usando corante WST-1 na presença de meio de cultura de células basais ECM ou KORSCM por 24 h ou 48 h. Os resultados foram expressos em média ± EPM, n = 8 repetições, e dois experimentos independentes foram realizados. *p < 0,05, ***p < 0,001, ****p < 0,0001 e *****p < 0,00001. Os KORS foram incubados em ECM sem SFB e fatores de crescimento. Após 48 h, esse meio condicionado foi coletado e armazenado a −80 °C para os experimentos. Este valor foi modificado de 8 e reproduzido com permissão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Efeito do KORS na migração do HDMEC. (A) A migração do HDMEC no inserto impresso em 3D na ausência de KORS (controle = CTRL) ou na presença de KORS (+ KORS) é mostrada e quantificada como a porcentagem de recuperação. (B) A migração dos HDMECs no ECM ou KORSCM é mostrada e quantificada como a porcentagem de recuperação. Os resultados foram expressos como média ± EPM, n=3 repetições, sendo analisados três campos por repetição, sendo realizados dois experimentos independentes. **p<0,01, ******p<0,00001. Barra de escala: 200 μm. Os KORS foram incubados em ECM sem SFB e fatores de crescimento. Após 48 h, esse meio condicionado foi coletado e armazenado a -80 °C para os experimentos. Este valor foi modificado de 8 e reproduzido com permissão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Contagem 1 | Contagem 2 | Significar | Média total | ||
| Placa de 6 poços | Replicar 1 | 95% | 84% | 90% | 90% |
| Réplica 2 | 90% | 88% | 89% | ||
| Réplica 3 | 85% | 89% | 87% | ||
| Réplica 4 | 97% | 89% | 93% | ||
| Réplica 5 | 88% | 94% | 91% | ||
| Replicar 6 | 86% | 92% | 89% | ||
| Encarte impresso em 3D | Replicar 1 | 92% | 89% | 91% | 91% |
| Réplica 2 | 91% | 80% | 86% | ||
| Réplica 3 | 93% | 92% | 93% | ||
| Réplica 4 | 94% | 98% | 96% | ||
| Réplica 5 | 88% | 86% | 87% | ||
| Replicar 6 | 93% | 97% | 95% |
Tabela 1: Medição da viabilidade do KORS. A viabilidade do KORS foi medida em um poço de uma placa de 6 poços e em um inserto impresso em 3D usando coloração azul de tripano e contagem automática.
| Contagem 1 | Contagem 2 | Significar | Média total | ||
| Placa de 6 poços | Replicar 1 | 90% | 88% | 89% | 85% |
| Réplica 2 | 79% | 78% | 79% | ||
| Réplica 3 | 71% | 75% | 73% | ||
| Réplica 4 | 86% | 82% | 84% | ||
| Réplica 5 | 91% | 88% | 90% | ||
| Replicar 6 | 99% | 94% | 97% | ||
| Encarte impresso em 3D | Replicar 1 | 99% | 86% | 93% | 86% |
| Réplica 2 | 80% | 75% | 78% | ||
| Réplica 3 | 79% | 80% | 80% | ||
| Réplica 4 | 98% | 85% | 92% | ||
| Réplica 5 | 85% | 78% | 82% | ||
| Replicar 6 | 89% | 93% | 91% |
Tabela 2: Medição da viabilidade do HDMEC. A viabilidade do HDMEC foi medida em um poço de uma placa de 6 poços e em um inserto impresso em 3D usando coloração com azul de tripano e contagem automática.
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Discussion
A comunicação celular indireta é comumente investigada usando meios condicionados ou dispositivos de sistemas de co-cultura. A preparação de meios condicionados é demorada a montante nos experimentos, e esse método é restrito a análises de efeitos unilaterais. O estudo anterior de Colin-Pierre et al.8 utilizando meios condicionados foi realizada a comunicação celular indireta entre dois tipos celulares (HDMECs e KORS). Os dados deste estudo anterior demonstraram o efeito do meio condicionado KORS sobre a proliferação do HDMEC e o efeito do meio condicionado KORS sobre a migração do HDMEC, formação de pseudotubose expressão de GPC18. No presente estudo, descreve-se uma forma mais simples e rápida de investigar a comunicação celular indireta. De fato, as pastilhas impressas em 3D permitem flexibilidade no planejamento experimental e múltiplas combinações de cultura celular. Para validar esses insertos impressos em 3D como modelo para co-culturas, a proliferação e migração celular foram analisadas e comparadas com o estudo anterior utilizando meioscondicionados 8. Em ambos os estudos, o ensaio de cicatrização foi realizado utilizando-se um dispositivo de duas câmaras de migração (Culture-Insert 2 Well in μ-Dish 35 mm) colocado no poço contendo ou não a inserção. Esse dispositivo de teste de migração 9,10 difere dos ensaios de arranhões11,12 pelo fato de a impressão da impressão deixada pela parede (simulando a ferida) delimitando as duas câmaras ser constante. Portanto, é altamente reprodutível. Os resultados do presente estudo levaram a uma conclusão semelhante em comparação com experimentos de mídia condicionada. As pastilhas impressas em 3D não alteram o comportamento celular e são adaptadas para fazer revestimentos compartimentais independentes promovendo a aderência celular. No entanto, as pastilhas impressas em 3D também permitem fazer um revestimento com poli-HEMA, por exemplo, para induzir baixa fixação para a cultura do esferoide/organoide. A comunicação indireta entre HDMECs e KORS foi aqui investigada como um exemplo das múltiplas aplicações fornecidas pelos insertos impressos em 3D.
Aplicável a tipos celulares aderentes que necessitam ou não de um revestimento específico, este novo dispositivo proporciona significativa economia de tempo para o estabelecimento do modelo de co-cultura. De fato, os quatro compartimentos das pastilhas impressas em 3D permitem o cultivo de vários tipos celulares em monocamada ou em 3D (agregados ou esferoides) no mesmo poço com diferentes combinações. Por exemplo, a comunicação indireta de quatro tipos celulares em monocamada, em 3D (esferoides), ou uma combinação de ambos pode ser analisada. Durante os experimentos, esferoides foram cultivados nos insertos impressos em 3D usando um revestimento poli-HEMA (dados não mostrados). Os esferoides consistiram de células semeadas em 3D devido à placa de baixa fixação e transferidas após 48 h para o inserto impresso em 3D para análises. Após vários dias de cultivo, observou-se o crescimento dos esferoides. Esses resultados demonstram que a pastilha impressa em 3D pode ser usada para acompanhar o crescimento celular 3D após a transferência dos esferoides da mesma forma que em uma placa de cultura13,14. Além disso, uma mistura de diferentes tipos de células pode ser montada no mesmo compartimento em 2D ou 3D (organoides) para estudar a comunicação celular direta e indireta. De fato, a ampla gama de modularidade oferecida pelas pastilhas impressas em 3D caracteriza este inovador sistema de co-cultura celular. Além disso, a presença das janelas de comunicação permite o uso em um meio comum para todos os tipos de células em um momento selecionado sem o auxílio de mídia condicionada. Assim, esta técnica não é aplicável a células cultivadas em suspensão. As paredes que separam os quatro compartimentos permitem semear, colher e analisar cada tipo de célula independentemente das demais. Várias aplicações podem ser feitas, tais como ensaios de formação e proliferação de pseudotubos, migração, DNA, RNA, proteínas, entre outras análises. As pastilhas impressas em 3D também oferecem a possibilidade de analisar o efeito de moléculas ou vesículas extracelulares, por exemplo. Além disso, o fato de essas pastilhas terem sido feitas por impressão 3D oferece inúmeras possibilidades de disposição de compartimentos e inúmeros ensaios funcionais.
No entanto, a etapa crítica da vedação da pastilha impressa em 3D na placa deve ser considerada com cuidado. De fato, uma partição homogênea do silício é crucial para garantir a vedação e evitar o vazamento de meio de cultura celular ou células de um compartimento para outro. Para evitar problemas, deve-se certificar-se de que o silicone cubra a parte das pastilhas impressas em 3D que estarão em contato com a placa. Antes da semeadura das células, deve-se verificar se há vedação correta, adicionando meio de cultura celular a um compartimento e observando a ausência de vazamento do meio nos outros compartimentos. O tempo de secagem do silício após a incubação no banho de etanol 70% também é uma etapa crítica. De fato, os vestígios remanescentes de álcool podem levar à fixação celular e toxicidade. Para evitar problemas, o tempo de secagem deve ser respeitado.
Concluindo, os insertos impressos em 3D são compatíveis com a maioria dos tipos celulares aderentes para cultura em 2D ou 3D e permitem inúmeros métodos de experimentação. Eles podem ser adaptados para numerosos estudos de co-cultura e podem fornecer uma nova ferramenta para investigar a comunicação celular indireta. Os insertos impressos em 3D são moduláveis, flexíveis, escaláveis e podem ser usados para projetar modelos experimentais para estudos de fisiopatologias como cancerologia, imunologia ou angiogênese.
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Disclosures
Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Este estudo foi realizado em colaboração com a BASF Beauty Care Solutions. A Sra. Charlie Colin-Pierre é bolsista de doutorado financiada pela BASF/CNRS.
Agradecemos ao Sr. Mehdi Sellami pela concepção dos encartes impressos em 3D.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Autoclave | Getinge | APHP | Solid cycle, 121 °C for 20 min |
| Biomed Clear | Formlabs | RS-F2-BMCL-01 | Impression performed by 3D-Morphoz company (Reims, France) |
| Cell culture detergents | Tounett | A18590/0116 | |
| Cell Proliferation Reagent WST-1 | Roche | 11,64,48,07,001 | |
| Counting slide | NanoEnTek | EVE-050 | |
| Culture-Insert 2 Well in μ-Dish 35 mm | Ibidi | 80206 | two-migration chambers device. |
| Endothelial cell medium | ScienCell | 1001 | Basal medium +/- 25 mL of fetal bovine serum (FBS, 0025), 5 mL of endothelial cell growth supplement (ECGS, 1052), and 5 mL of penicillin/streptomycin solution (P/S, 0503). |
| EVE Automated cell counter | NanoEnTek | NESCT-EVE-001E | |
| EVOS XL Core | Fisher Scientific | AMEX1200 | 10x of magnification |
| Food silicon reagent and catalyst kit | Artificina | RTV 3428 A and B | (10:1) |
| FORM 3B printer | Formlabs | PKG-F3B-WSVC-DSP-BASIC | Impression performed by 3D-Morphoz company |
| Human Dermal Microvascular Endothelial Cells (HDMEC) | ScienCell | 2000 | |
| Keratinocytes of Outer Root Sheath (KORS ) | ScienCell | 2420 | |
| Macro Wound Healing Tool Software | ImageJ | Software used for the measurement of the uncovered surface (for migration assays) | |
| Mesenchymal stem cell medium | ScienCell | 7501 | Basal medium +/-25 mL of fetal bovine serum (FBS, 0025), 5 mL of mesenchymal stem cell growth supplement (MSCGS, 7552), and 5 mL of penicillin/streptomycin solution (P/S, 0503) |
| Microplate reader SPECTRO star NANO | BMG Labtech | BMG LABTECH software | |
| PBS | Promocell | C-40232 | Without Ca2+ / Mg2+ |
| Trypan Blue Stain | NanoEnTek | EBT-001 | |
| Trypsin / EDTA | Promocell | C-41020 | Incubation of KORS at 37 °C with 5% CO2 for 5 min. Incubation of HDMECs for 5 min at room temperature |
| 96-well plate Nunclon Delta Surface | Thermoscientific | 167008 |
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