Summary
טיפול ותחזוקה נאותים חיוניים לתפקוד אמין של מכשיר לפציעת כלי הקשה בנוזל רוחבי (LFPI). כאן, אנו מדגימים כיצד לנקות, למלא ולהרכיב כראוי מכשיר LFPI, ולהבטיח שהוא מתוחזק כראוי לקבלת תוצאות אופטימליות.
Abstract
פגיעה מוחית טראומטית (TBI) אחראית לכ-2.5 מיליון ביקורים ואשפוזים בחדרי מיון מדי שנה, והיא גורם מוביל למוות ונכות בקרב ילדים ומבוגרים צעירים. פגיעה מוחית טראומטית נגרמת על-ידי כוח פתאומי המופעל על הראש, וכדי להבין טוב יותר TBI אנושי ואת המנגנונים העומדים בבסיסו, יש צורך במודלים ניסיוניים של פגיעה. פגיעה בכלי הקשה בנוזל הצידי (באנגלית: Lateral fluid percussion injury או בקיצור LFPI) היא מודל פציעות נפוץ בשל דמיון בשינויים הפתולוגיים שנמצאו בפגיעה מוחית טראומטית אנושית בהשוואה ל-LFPI, כולל דימומים, הפרעה בכלי הדם, ליקויים נוירולוגיים ואובדן נוירונים. LFPI משתמשת במטוטלת וצילינדר מלא נוזל, כאשר האחרון בעל בוכנה ניתנת להזזה בקצה אחד, וחיבור נעילת Luer לצינורות נוקשים ומלאי נוזל בקצה השני. הכנת החיה כרוכה בביצוע כריתת גולגולת והצמדת רכזת Luer מעל האתר. למחרת, הצינור ממכשיר הפציעה מחובר לרכזת Luer על גולגולת החיה והמטוטלת מורמת לגובה מוגדר ומשוחררת. השפעת המטוטלת עם הבוכנה יוצרת פולס לחץ אשר מועבר לדורה מאטר השלם של החיה דרך הצינור ומייצר את TBI הניסיוני. טיפול ותחזוקה נאותים חיוניים כדי שמכשיר ה- LFPI יתפקד בצורה אמינה, מכיוון שאופי וחומרת הפציעה יכולים להשתנות במידה רבה בהתאם למצב המכשיר. כאן, אנו מדגימים כיצד לנקות, למלא ולהרכיב כראוי את מכשיר ה- LFPI, ולהבטיח שהוא מתוחזק כראוי לקבלת תוצאות מיטביות.
Introduction
פגיעה מוחית טראומטית (TBI) נגרמת על-ידי כוח פתאומי המופעל על הראש. בעקבות פציעות ראשוניות הנובעות מהפגיעה הפיזית, ניצולי פגיעה מוחית טראומטית חווים בדרך כלל פגיעות משניות, כולל ליקויים קוגניטיביים וליקויים נוירולוגיים הקשורים לתגובות פיזיולוגיות לפגיעה הראשונית1. מעריכים שכ-69 מיליון אנשים ברחבי העולם סובלים מפגיעה מוחית טראומטית מדי שנה2. בארצות הברית לבדה, כ-2.5 מיליון ביקורים ואשפוזים בחדרי מיון הקשורים לפגיעה מוחית טראומטית מתרחשים מדי שנה, מה שהופך את TBI לאחד הגורמים המובילים לנכות ומוות בקרב ילדים ומבוגרים צעירים3. TBI יכולה להיות מסווגת כקלה, בינונית או חמורה, כאשר TBI קלה (mTBI) מהווה כ-70%-90% ממקרי TBI4. פתולוגיה היסטולוגית וקוגניטיבית של TBI יכולה להתרחש בתוך דקות עד שעות מרגע הפציעה, וההשפעות של TBI יכולות להימשך חודשים עד שנים לאחר הנזק הראשוני5.
הפיתוח של מודלים ניסיוניים סייע בהבנת ההשפעות והמנגנונים הבסיסיים של פגיעה מוחית טראומטית. מודל אחד כזה, פגיעה בכלי הקשה של נוזל רוחבי (LFPI), משמש בדרך כלל להערכת TBI in vivo. LFPI משחזר באופן הדוק פתולוגיות הקשורות לפגיעה מוחית טראומטית אנושית, כולל הפרעות בכלי הדם, דימומים, אובדן עצבי, דלקת, גליוזה והפרעות מולקולריות 6,7,8. טכניקת LFPI משמשת למגוון רחב של יישומים ניסיוניים, כולל מידול TBI בילדים, כמו גם מצבים נוירודגנרטיביים כרוניים, כגון אנצפלופתיה טראומטית כרונית 9,10. LFPI היא שיטה מוגדרת היטב וניתנת לשחזור של TBI ניסיוני המאפשר להתאים את חומרת הפציעה11. למכשיר ה-LFPI יש כמה מרכיבים חשובים, ביניהם: מטוטלת עם פטיש משוקלל, בוכנה, גליל מלא נוזל, מתמר לחץ, אוסצילוסקופ דיגיטלי, וצינור קטן בקצה הגליל עם מנעול Luer שמתחבר לרכזת על גולגולת החיה (איור 1). LFPI פועל על ידי הנעת המטוטלת לתוך הבוכנה, יצירת גל של לחץ דרך הנוזל (מים degassed deionized או מלוחים) לתוך המוח של החיה המחוברת; זה מגביר את הלחץ התוך גולגולתי, ובכך משכפל את התכונות המכניות והשינויים הביולוגיים של TBI12. בנוסף, בעלי חיים המשמשים בניסויי LFPI עוברים כריתת גולגולת על מנת לחשוף את המוח להשפעת לחץ הנוזלים של המכשיר.
תחזוקה וניטור שגרתיים נחוצים כדי להבטיח שמכשיר ה- LFPI פועל במדויק. השיטות הבאות חיוניות למניעת החדרת בועות אוויר מזהמות למכשיר. כאן, אנו מדגימים שיטות לניקוי, מילוי והרכבה כראוי של מכשיר LFPI. נדון גם ביציאות אוסצילוסקופ ובזמני תיקון עכבר כדרכים לאשר את הכדאיות של ה- LFPI.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ניקוי גליל LFPI
- נתק בזהירות את המזרקים המחוברים לבית המתמר וליציאת המילוי, כמו גם את הכבל המחובר למתמר הלחץ (ראה איור 1 לתרשים של רכיבי התקן פציעה).
- תוך זהירות שלא להפיל את הצילינדר, פתח את ידיות היד בחלק האחורי של המכשיר מהדקי הצילינדר כדי לשחרר את הצילינדר.
- הסר את הבוכנה בקצה הצילינדר, המתמר, בית המתמר וטבעות הבוכנה.
- יש לנקז את הנוזל אל מחוץ לצילינדר.
- הוסיפו לגליל חומר ניקוי עדין, כגון חומר ניקוי לשטיפת כלים, וקרצפו קלות בעזרת מברשת כלים או בקבוקים13.
- כדי להבטיח שכל חומר הניקוי נשטף, מלא לחלוטין את הגליל במים ושטוף היטב.
2. פירוק הנוזל המשמש למילוי הגליל
- השתמש במשאבת ואקום כדי לנטרל את הנוזל לפני מילוי מחדש של הגליל כדי למנוע היווצרות בועות חדשות ולספוג בועות קיימות.
הערה: יהיה צורך בכ-1.5 ליטר נוזל כדי למלא את הצילינדר, אם כי פליטת גז כ-2 ליטר תשאיר אספקה קטנה להחלפת כל נוזל שאבד במהלך השימוש והבדיקה.
הערה: שואבי אבק ביתיים חלשים מכדי לנטרל את הנוזל ביעילות. הוואקום חייב להיות מסוגל לייצר לחץ של 25-28 inHg. - מוסיפים לנוזל ערבוב ומניחים את מיכל הנוזלים על צלחת ערבוב. ערבוב הנוזל במהלך תהליך פירוק הגז מסייע לעורר בעבוע ושחרור גז. ערבוב גם מונע עלייה פתאומית גדולה בעבוע.
הערה: תהליך פירוק הגז צריך להסתיים כאשר מעט מאוד בועות מיוצרות; זה קורה לאחר כ 45 דקות.
3. הרכבה מחדש של התקן LFPI
- החל שכבה דקה של ג'ל נפט על בוכנה בוכנה.
- חבר את בוכנה הבוכנה כאשר הבוכנה בולטת כ 32 מ"מ מן הצילינדר14.
הערה: האוויר נלכד לעתים קרובות בבוכנה לפני טבעת ה-O המובילה. כדי להיפטר מעודפי האוויר האלה, סובבו את הבוכנה תוך כדי הזזתה פנימה והחוצה כדי להוציא את האוויר מהמרווח הזה. - מרחו שכבה דקה של וזלין גם על שאר האורינגים וחברו אותם לצילינדר, למעט טבעת ה-O בפתח המילוי.
- עוטפים את סרט הטפלון פעמיים סביב חוטי המתמר.
4. מילוי מחדש של מכשיר LFPI וחיבור לבסיס
- חברו מזרק בנפח 10 מ"ל מלא בנוזל נטול גז וללא בועות אוויר לרכזת נעילת Luer שעל בית המתמר.
- החזיקו את המתמר כשהקצה המושחל מצביע כלפי מעלה, ומלאו לחלוטין את הבאר בתוך האזור המושחל של המתמר בנוזל נטול הגז באמצעות מזרק 10 מ"ל. המטרה כאן היא למלא היטב את המתמר מבלי להכניס בועות אוויר. יש להיזהר שלא לפגוע היטב בקרום העדין שבתחתית המתמר.
- כאשר הצילינדר ממוקם בזווית כדי למנוע מאוויר להיכנס מחדש לבית המתמר, חברו את בית המתמר לצילינדר13 והשתמשו במפתח ברגים כדי להדק אותו היטב.
- הסר את המכסה מפתח המילוי והצילינדר ברגע שהנוזל ששוחרר מהגז מגיע לכ-2/3 מקיבולת הצילינדר.
- מניחים את הגליל בצורה אופקית ומסיימים למלא את הגליל בנוזל נטול גזים.
הערה: כדי למנוע היווצרות של בועות אוויר, מומלץ לשפוך את הנוזל פנימה באיטיות14. - החלף את המכסה ביציאת המילוי וסגור את כל הסטופקוקים.
- תמרן את הגליל כדי להפעיל בועות אוויר ליציאת המילוי14.
- פתח את הסטופרקוק בפתח המילוי והזריק נוזל באמצעות המזרק על בית המתמר כדי לדחוף בועות אוויר החוצה מהיציאה14.
- בדוק את המכשיר כולו וודא שאין בועות אוויר.
- הוסף מזרק 10 מ"ל מלא בנוזל נטול גז לרכזת נעילת Luer במכסה המילוי.
- חברו מחדש את הצילינדר לבסיס באמצעות ברגי היד.
- ודא שהגליל אופקי ומסודר עם מרכז הפטיש המשוקלל על המטוטלת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בדקנו את ההשפעות של זיהום בועות אוויר במכשיר LFPI על היווצרות צורת גל. הזרקנו בועות אוויר למכשיר והשווינו את יציאות האוסילוסקופ עם נתוני אוסצילוסקופ שנאספו ממכשיר LFPI לא מזוהם. התנאים היו כדלקמן: לא מזוהם, הזרקה של 5 מ"ל אוויר, הזרקה של 10 מ"ל אוויר, והזרקה של 15 מ"ל אוויר. שמרנו על המטוטלת בגובה עקבי לכל הפגיעות בכל התנאים, וביצענו 15 פגיעות לכל מצב.
בעת ביצוע פציעה או בדיקת מכשיר LFPI, צורת גל הלחץ על האוסילוסקופ צריכה להראות שיא יחיד וחד (איור 2A). הנוכחות של בועות אוויר במכשיר תגרום ליצירת צורת גל עם כמה פסגות קצרות (איור 2B), מה שמצביע על בועות שצריך להסיר. לאחר ההרכבה מחדש של המכשיר, ולפני כל פציעה, אנו ממליצים גם לבצע ארבע עד חמש טיפות בדיקה (ללא עכבר מחובר) עם המטוטלת כדי לוודא שהמכשיר מתפקד שוב ושוב. בנוסף לאי סדירות בצורת גל הלחץ, שינויים התנהגותיים לאחר פציעה / דמה LFPI יכולים גם להצביע על תפקוד תקין של המכשיר. עכברים פצועים צריכים להיות בעלי זמני רפלקס ימין ארוכים לאחר LFPI בהשוואה לעכברי דמה, ויש לעקוב אחר זמנים אלה ולתעד. זמני תיקון ארוכים מדי או קצרים מדי עשויים להעיד על הרכבה לא נכונה של המכשיר ו/או ניקוי15. תסמינים דומים יכולים להופיע בהדרגה גם במכשיר שנוקה ומולא כראוי (ככל הנראה בשל הצטברות איטית של בועות במהלך שימוש שגרתי), מה שמצביע על כך שהגיע הזמן לחזור על הניקוי והמילוי מחדש. תזמון תחזוקה מונעת אחת ל-6 חודשים יכול לסייע להבטיח ביצועים עקביים של התקן LFPI.
כפי שניתן לראות בטבלה 1, נוכחותן של בועות אוויר שינתה את המתח של צורת הגל בהשוואה להתקן LFPI מלא ולא מזוהם. הגדלת גודל בועת האוויר הפחיתה בהדרגה את מתח הגל, כפי שמצוין על ידי יציאות האוסילוסקופ.
איור 1: סכמה של מכשיר LFPI וכריתת גולגולת צידית שבוצעה לפני הפציעה. מכשיר זה משמש לשחזור TBIs ללא שבר בגולגולת במודלים של בעלי חיים על-ידי גרימת תזוזה ו/או עיוות של המוח עקב עלייה בלחץ הבין-גולגולתי. נוצר באמצעות Biorender.com. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: ניטור תפוקת מתמר לחץ להערכת תחזוקת התקן LFPI ומצב תפקודי13. (A) תמונה מייצגת של צורת גל הלחץ המיוצרת על ידי התקן LFPI מנוקה ומתפקד כראוי. (B) תמונה מדגמית של צורת גל לחץ המעידה על נוכחות זיהום בועות אוויר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: תמונה מייצגת של תפוקות אוסצילוסקופ עבור כל ארבעת התנאים . (A,B,C,D) תפוקות האוסילוסקופ עבור לא מזוהם, 5 מ"ל של הזרקת אוויר, 10 מ"ל של הזרקת אוויר, ו 15 מ"ל של הזרקת אוויר, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
| מצב זיהום בועות אוויר | |||||
| התקן LFPI מלא ולא מזוהם | 5 מ"ל של אוויר מוזרק | 10 מ"ל של אוויר מוזרק | 15 מ"ל של אוויר מוזרק | ||
| פלט צורת גל (mV) | 240 | 218 | 230 | 218 | |
| 234 | 222 | 226 | 220 | ||
| 240 | 228 | 226 | 220 | ||
| 244 | 226 | 228 | 218 | ||
| 246 | 228 | 230 | 218 | ||
| 248 | 232 | 226 | 220 | ||
| 248 | 230 | 226 | 220 | ||
| 250 | 230 | 228 | 220 | ||
| 248 | 232 | 228 | 224 | ||
| 252 | 232 | 228 | 222 | ||
| 250 | 232 | 226 | 220 | ||
| 250 | 230 | 228 | 222 | ||
| 252 | 230 | 228 | 222 | ||
| 252 | 232 | 228 | 220 | ||
| תפוקת צורת גל ממוצעת (mV) | 246.7 | 228.7 | 227.6 | 220.3 | |
טבלה 1: תפוקות מתח אוסצילוסקופ מקבוצת ביקורת לא מזוהמת בהשוואה לתנאים מזוהמים. בדיקות t זוגיות בוצעו בין התנאים הלא מזוהמים לבין כל מצב מזוהם. כל התנאים המזוהמים פחתו באופן משמעותי בהשוואה לתנאים לא מזוהמים (p < 0.0001).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הטכניקות המתוארות לעיל מדגימות כיצד לתחזק כראוי מכשיר LFPI. ניקוי וניטור שגרתיים נחוצים כדי לשמור על תפקוד תקין ואמין של מכשיר LFPI. בנוסף, בשל אופיו הפולשני של הליך LFPI, חובה לנקות את המכשיר ביסודיות כדי למנוע זיהום של חיות מעבדה.
הימנעות מהיווצרות בועות אוויר במכשיר חיונית להשגת פציעות אופטימליות וצורות גלי לחץ. בועות אוויר משנות את המאפיינים של פולס הלחץ המועבר למוח, גורמות לפציעות לא עקביות ומקשות על שחזור תקין של TBI קלינית. הנתונים המשלימים שנאספו כאן מראים כי זיהום בועות אוויר משנה את מתח הגל שנוצר על ידי פגיעה. פלטי האוסילוסקופ המוצגים באיור 3 עוזרים להמחיש את השפעות האוויר על גלי לחץ; צורות הגל אינן חדות כל כך ובמקום זאת יש להן פסגות מרובות כאשר קיים זיהום אוויר. מטרת מכשיר ה-LFPI היא לספק דופק נוזל יחיד ומדיד למוח; התוצאות מצביעות על כך שכאשר קיימות בועות אוויר, נוצרים פולסים מרובים, מה שמקשה להבחין איזה לחץ מופעל על המוח.
הטכניקות המשמשות כאן מפחיתות את הסבירות של החדרת גזים למכשיר ו / או עוזרות להסיר כיסים קטנים של גז שעלולים בכל זאת לזהם את הנוזל. שימוש בנוזל נטול גזים מפחית את הסיכון לזיהום בועות אוויר ויכול להאריך את מרווח התחזוקה13. לפיכך, הפעולות המבוצעות בשלב 2 הן קריטיות להפחתת הסיכוי להיווצרות בועות אוויר במכשיר LFPI. שלבים 3.4-3.9 מדגישים את החשיבות של הסרת גזים מתמשכים במכשיר לפני ביצוע פציעות. ראוי לציין כי לאחר הרכבה מחדש של מכשיר הפציעה, הראות הן במתמר הלחץ והן במרכז יציאת המילוי מוגבלת; לכן, אזורים אלה דורשים תשומת לב מיוחדת בעת בדיקת היווצרות בועות אוויר לאחר מילוי הצילינדר.
הליך זה מותאם במיוחד להתקן LFPI שנעשה על ידי Custom Design &; Fabrication Inc. שינויים קלים בפרוטוקול עשויים להיות נחוצים בעת שימוש בהתקני LFPI המיוצרים על ידי חברות אחרות.
ניקוי והרכבה מחדש של מכשיר LFPI דורשים זמן ותשומת לב, אך הם המפתח ליצירת פציעות עקביות. הימנעות מבועות אוויר חשובה במיוחד, שכן היא יכולה לסייע בהפחתת תוצאות שגויות ולהגביל את הצורך בביצוע ניסויים נוספים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
לא הוכרז על ניגוד עניינים.
Acknowledgments
המחברים רוצים להודות ל-Custom Design &; Fabrication Inc. על הסיוע הטכני והתמיכה שלהם. עבודה זו מומנה על ידי מענקי המכונים הלאומיים לבריאות R01NS120099-01A1 ו- R37HD059288-19.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 - 10 mL syringes with Luer lock capability | Ensures that needle is secure and reduces possible leaks of fluid | ||
| Degassed fluid | Helps to reduce air bubble formation during injury procedure | ||
| Fluid Percussion Injury (FPI) device (Model 01-B) | Custom Designs & Fabrications Inc. | N/A | Injury device used to model TBI in rodents |
| Mild detergent | Allows to thoroughly clean the LFPI cylinder | ||
| Petroleum Jelly | Used as a water-repellent and protects LFPI device form rust | ||
| Teflon tape | Helps with tight seal of pipe joints on the LFPI device | ||
| *Materials other than the LFPI device can be purchased from any reliable company. |
References
- Centers for Disease Control and Prevention. Surveillance Report of Traumatic Brain Injury-related Emergency Department Visits, Hospitalizations, and Deaths. Centers for Disease Control and Prevention, U.S. Department of Health and Human Services. , https://www.cdc.gov/traumaticbraininjury/get_the_facts.html (2014).
- Dewan, M. C. Estimating the global incidence of traumatic brain injury. Journal of Neurosurgery. 130 (4), 1080-1097 (2018).
- National Center for Injury Prevention and Control; Division of Unintentional Injury Prevention. Traumatic Brain Injury in the United States: Epidemiology and Rehabilitation. , Centers for Disease Control and Prevention. Atlanta, GA. (2015).
- Holm, L., Cassidy, J. D., Carroll, L. J., Borg, J. Summary of the WHO Collaborating Centre for neurotrauma task force on mild traumatic brain injury. Journal of Rehabilitation Medicine. 37 (3), 137-141 (2005).
- Pavlovic, D., Pekic, S., Stojanovic, M., Popovic, V. Traumatic brain injury: neuropathological, neurocognitive and neurobehavioral sequelae. Pituitary. 22 (3), 270-282 (2019).
- Dixon, C. E. A fluid percussion model of experimental brain injury in the rat. Journal of Neurosurgery. 67 (1), 110-119 (1987).
- McIntosh, T. K. Traumatic brain injury in the rat: characterization of a lateral fluid-percussion model. Neuroscience. 28 (1), 233-244 (1989).
- Ma, X., Aravind, A., Pfister, B. J., Chandra, N., Haorah, J. Animal models of traumatic brain injury and assessment of injury severity. Molecular Neurobiology. 56 (8), 5332-5345 (2019).
- Nwafor, D. C. Pediatric traumatic brain injury: an update on preclinical models, clinical biomarkers, and the implications of cerebrovascular dysfunction. Journal of Central Nervous System Disease. 14, (2022).
- Turner, R. C. Modeling chronic traumatic encephalopathy: the way forward for future discovery. Frontiers in Neurology. 6, 223 (2015).
- Petersen, A., Soderstrom, M., Saha, B., Sharma, P. Animal models of traumatic brain injury: a review of pathophysiology to biomarkers and treatments. Experimental Brain Research. 239 (10), 2939-2950 (2021).
- Sullivan, H. G. Fluid-percussion model of mechanical brain injury in the cat. Journal of Neurosurgery. 45 (5), 521-534 (1976).
- Fluid Percussion Injury Model 01-B: General Operation. , Custom Design & Fabrication, Inc. Available from: http://www.cdf-products.com/ (2023).
- Fluid Percussion Injury Model 01-B: Assembly Instructions. , Custom Design & Fabrication, Inc. Available from: http://www.cdf-products.com/ (2023).
- Pernici, C. D. Longitudinal optical imaging technique to visualize progressive axonal damage after brain injury in mice reveals responses to different minocycline treatments. Scientific Reports. 10, 7815-78 (2020).
