Summary
Korrekt pleje og vedligeholdelse er afgørende for, at en lateral fluid percussion injury (LFPI) enhed kan fungere pålideligt. Her demonstrerer vi, hvordan man korrekt rengør, fylder og samler en LFPI-enhed og sikrer, at den vedligeholdes tilstrækkeligt for optimale resultater.
Abstract
Traumatisk hjerneskade (TBI) tegner sig for ca. 2,5 millioner skadestuebesøg og indlæggelser årligt og er en førende årsag til død og handicap hos børn og unge. TBI er forårsaget af en pludselig kraft, der påføres hovedet, og for bedre at forstå human TBI og dens underliggende mekanismer er eksperimentelle skademodeller nødvendige. Lateral fluid percussion injury (LFPI) er en almindeligt anvendt skademodel på grund af ligheder i de patologiske ændringer, der findes i human TBI sammenlignet med LFPI, herunder blødninger, vaskulær forstyrrelse, neurologiske underskud og neurontab. LFPI anvender et pendul og en væskefyldt cylinder, hvor sidstnævnte har et bevægeligt stempel i den ene ende og en Luer-låseforbindelse til stive, væskefyldte slanger i den anden ende. Forberedelse af dyret indebærer at udføre en kraniektomi og fastgøre et Luer-nav over stedet. Den næste dag forbindes slangen fra skadeanordningen til Luer-navet på dyrets kranium, og pendulet hæves til en bestemt højde og frigives. Pendulets påvirkning med stemplet genererer en trykpuls, som overføres til dyrets intakte dura mater via slangen og producerer den eksperimentelle TBI. Korrekt pleje og vedligeholdelse er afgørende for, at LFPI-enheden fungerer pålideligt, da skadens karakter og sværhedsgrad kan variere meget afhængigt af enhedens tilstand. Her demonstrerer vi, hvordan man korrekt rengør, fylder og samler LFPI-enheden og sikrer, at den vedligeholdes tilstrækkeligt for optimale resultater.
Introduction
Traumatisk hjerneskade (TBI) er forårsaget af en pludselig kraft påført hovedet. Efter primære skader som følge af den fysiske påvirkning oplever TBI-overlevende ofte sekundære skader, herunder kognitive underskud og neurologiske dysfunktioner, der er forbundet med fysiologiske reaktioner på den oprindelige skade1. Det anslås, at omkring 69 millioner individer verden over lider af TBI årligt2. I USA alene forekommer ca. 2,5 millioner TBI-relaterede skadestuebesøg og hospitalsindlæggelser hvert år, hvilket gør TBI til en af de førende årsager til handicap og død blandt børn og unge voksne3. TBI kan klassificeres som mild, moderat eller svær, hvor mild TBI (mTBI) tegner sig for ca. 70% -90% af TBI-tilfældene4. Histologisk og kognitiv TBI-patologi kan forekomme inden for minutter til timer efter skade, og virkningerne af TBI kan fortsætte i måneder til år efter den første skade5.
Udviklingen af eksperimentelle modeller har været medvirkende til at forstå virkningerne og de underliggende mekanismer i TBI. En sådan model, lateral fluid percussion injury (LFPI), bruges almindeligvis til at vurdere TBI in vivo. LFPI reproducerer tæt patologier forbundet med human TBI, herunder vaskulære forstyrrelser, blødninger, neuronalt tab, inflammation, gliose og molekylære forstyrrelser 6,7,8. LFPI-teknikken bruges til et forskelligt sæt eksperimentelle applikationer, herunder modellering af pædiatrisk TBI samt kroniske neurodegenerative tilstande, såsom kronisk traumatisk encefalopati 9,10. LFPI er en veldefineret og reproducerbar metode til eksperimentel TBI, der gør det muligt at justere skadens sværhedsgrad11. LFPI-enheden har flere vigtige komponenter, herunder: et pendul med en vægtet hammer, et stempel, en væskefyldt cylinder, en tryktransducer, et digitalt oscilloskop og et lille rør i enden af cylinderen med en Luer-lås, der fastgøres til et nav på dyrets kranium (figur 1). LFPI virker ved at svinge pendulet ind i stemplet, hvilket skaber en bølge af tryk gennem væsken (afgasset deioniseret vand eller saltvand) ind i hjernen hos det vedhæftede dyr; dette øger intrakranielt tryk og replikerer således de mekaniske egenskaber og biologiske ændringer af TBI12. Derudover gennemgår dyr, der anvendes i LFPI-eksperimenter, en kraniektomi for at udsætte hjernen for virkningen af enhedens væsketryk.
Rutinemæssig vedligeholdelse og overvågning er nødvendig for at sikre, at LFPI-enheden fungerer nøjagtigt. Følgende metoder er afgørende for at forhindre introduktion af forurenende luftbobler i enheden. Her demonstrerer vi metoder til korrekt rengøring, påfyldning og samling af LFPI-enheden. Vi vil også diskutere oscilloskopudgange og muserettiderne som måder at bekræfte LFPI's levedygtighed på.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Rengøring af LFPI-cylinderen
- Fjern forsigtigt sprøjterne, der er fastgjort til transducerhuset og påfyldningsporten, samt kablet, der er tilsluttet tryktransduceren (se figur 1 for et skema over komponenter til skadesanordninger).
- Mens du passer på ikke at tabe cylinderen, skal du skrue håndknapperne bag på enheden ud af cylinderklemmerne for at frigøre cylinderen.
- Fjern stemplet for enden af cylinderen, transduceren, transducerhuset og stemplets O-ringe.
- Tøm væske ud af cylinderen.
- Tilsæt mildt vaskemiddel, såsom opvaskemiddel, til cylinderen og skrub let med en tallerken eller flaskebørste13.
- For at sikre, at alt vaskemiddel skylles af, skal du fylde cylinderen helt med vand og skylle grundigt.
2. Afgasning af væsken, der bruges til at fylde cylinderen
- Brug en vakuumpumpe til at afgasse væsken, før du genopfylder cylinderen for at forhindre dannelse af nye bobler og absorbere eksisterende bobler.
BEMÆRK: Ca. 1,5 L væske vil være nødvendig for at fylde cylinderen, selvom afgasning ca. 2 L vil efterlade en lille forsyning til erstatning af eventuel væske, der går tabt under brug og test.
BEMÆRK: Husstøvsugere er for svage til effektivt at afgasse væsken. Vakuumet skal kunne producere et tryk på 25-28 inHg. - Tilsæt en omrøringsstang til væsken og læg væskebeholderen på en omrøringsplade. Omrøring af væsken under afgasningsprocessen hjælper med at stimulere bobling og frigivelse af gas. Omrøring forhindrer også en stor pludselig stigning i boblende.
BEMÆRK: Afgasningsprocessen skal være forbi, når der produceres meget få bobler; Dette sker efter ca. 45 min.
3. Genmontering af LFPI-enheden
- Påfør et tyndt lag vaselin på stempelstemplet.
- Fastgør stempelstemplet med stemplet ragende ca. 32 mm ud fra cylinderen14.
BEMÆRK: Luft bliver ofte fanget ved stemplet før den forreste O-ring. For at slippe af med denne overskydende luft skal du dreje stemplet, mens du bevæger det ind og ud for at arbejde luften ud af dette hul. - Påfør også et tyndt lag vaselin på de andre O-ringe, og fastgør dem til cylinderen, med undtagelse af O-ringen på påfyldningsporten.
- Sæt teflontape to gange rundt om transducerens tråde.
4. Genopfyldning af LFPI-enheden og fastgørelse til basen
- Tilslut en 10 ml sprøjte fyldt med afgasset væske og fri for luftbobler til Luer-låsenavet på transducerhuset.
- Hold transduceren med gevindenden pegende opad, og fyld brønden helt inde i transducerens gevindområde med den afgassede væske ved hjælp af en 10 ml sprøjte. Målet her er at fylde transduceren godt uden at indføre luftbobler. Pas på ikke at beskadige den sarte membran i bunden af transducerbrønden.
- Når cylinderen er placeret i en vinkel for at forhindre luft i at komme ind i transducerhuset igen, skal du fastgøre transducerhuset til cylinder13 og bruge en skruenøgle til at stramme det tæt.
- Fjern hætten fra påfyldningsporten og cylinderen, når den afgassede væske når ca. 2/3 af flaskekapaciteten.
- Placer cylinderen vandret, og fyld cylinderen med afgasset væske.
BEMÆRK: For at undgå dannelse af luftbobler anbefales det at hælde væsken langsomt i14. - Sæt hætten på igen ved påfyldningsporten, og luk alle stophaner.
- Manipuler cylinderen til at arbejde eventuelle luftbobler til påfyldningsporten14.
- Åbn stophanen på påfyldningsporten, og injicer væske ved hjælp af sprøjten på transducerhuset for at tvinge eventuelle luftbobler ud af port14.
- Undersøg hele enheden, og sørg for, at der ikke er luftbobler.
- Tilføj en 10 ml sprøjte fyldt med afgasset væske til Luer-låsenavet på påfyldningshætten.
- Fastgør cylinderen igen til bunden ved hjælp af håndskruerne.
- Sørg for, at cylinderen er vandret og foret med midten af den vægtede hammer på pendulet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi testede virkningerne af luftbobleforurening i en LFPI-enhed på bølgeformdannelse. Vi injicerede luftbobler i enheden og sammenlignede oscilloskopudgangene med oscilloskopdata indsamlet fra en ikke-forurenet LFPI-enhed. Betingelserne var som følger: ikke-forurenet, injektion af 5 ml luft, injektion af 10 ml luft og injektion af 15 ml luft. Vi holdt pendulet i en ensartet højde for alle stød under alle forhold, og vi udførte 15 stød pr. tilstand.
Når du udfører en skade eller tester LFPI-enheden, skal trykbølgeformen på oscilloskopet vise en enkelt, skarp top (figur 2A). Tilstedeværelsen af luftbobler i enheden vil resultere i en bølgeform med flere korte toppe (figur 2B), hvilket indikerer bobler, der skal fjernes. Efter genmontering af enheden og før enhver skadesession anbefaler vi også at udføre fire til fem testdråber (ingen mus tilsluttet) med pendulet for at sikre, at enheden fungerer gentagne gange. Ud over uregelmæssigheder i trykbølgeformen kan adfærdsændringer efter skade/falsk LFPI også være vejledende for, om enheden fungerer korrekt. Tilskadekomne mus bør have forlænget oprettende reflekstider efter LFPI sammenlignet med falske mus, og disse tider bør overvåges og registreres. Opretholdelsestider, der enten er for lange eller for korte, kan være en indikation af forkert montering og/eller rengøringaf enheden 15. Lignende symptomer kan også forekomme gradvist i en enhed, der er blevet korrekt rengjort og fyldt (sandsynligvis på grund af den langsomme ophobning af bobler under rutinemæssig brug), hvilket indikerer, at det er tid til at gentage rengøringen og genopfyldningen. Planlægning af forebyggende vedligeholdelse en gang hver 6. måned kan hjælpe med at sikre ensartet ydelse af LFPI-enheden.
Som det ses i tabel 1, ændrede tilstedeværelsen af luftbobler bølgeformens spænding sammenlignet med en fuldt fyldt, ikke-forurenet LFPI-enhed. Forøgelse af luftboblens størrelse reducerede gradvist bølgens spænding, som angivet ved oscilloskopudgangene.
Figur 1: Skematisk oversigt over LFPI-enheden og lateral kraniektomi udført før skade. Denne enhed bruges til at reproducere TBI'er uden kraniebrud i dyremodeller ved at forårsage forskydning og / eller deformation af hjernen på grund af en stigning i interkranielt tryk. Oprettet med Biorender.com. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Overvågning af tryktransduceroutput for at vurdere LFPI-enhedens vedligeholdelse og funktionsstatus13. (A) Repræsentativt billede af trykbølgeformen frembragt af en korrekt rengjort og fungerende LFPI-enhed. B) Prøvebillede af en trykbølgeform, der viser tilstedeværelse af luftboblekontaminering. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Repræsentativt billede af oscilloskopudgange for alle fire forhold . (A, B, C, D) Oscilloskopudgangene for henholdsvis ikke-kontamineret, 5 ml luftindsprøjtning, 10 ml luftindsprøjtning og 15 ml luftindsprøjtning. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Luftboble forurening tilstand | |||||
| Fyldt og ikke-forurenet LFPI-enhed | 5 ml total luft injiceret | 10 ml total luft injiceret | 15 ml total luft indsprøjtet | ||
| Bølgeformudgang (mV) | 240 | 218 | 230 | 218 | |
| 234 | 222 | 226 | 220 | ||
| 240 | 228 | 226 | 220 | ||
| 244 | 226 | 228 | 218 | ||
| 246 | 228 | 230 | 218 | ||
| 248 | 232 | 226 | 220 | ||
| 248 | 230 | 226 | 220 | ||
| 250 | 230 | 228 | 220 | ||
| 248 | 232 | 228 | 224 | ||
| 252 | 232 | 228 | 222 | ||
| 250 | 232 | 226 | 220 | ||
| 250 | 230 | 228 | 222 | ||
| 252 | 230 | 228 | 222 | ||
| 252 | 232 | 228 | 220 | ||
| Gennemsnitlig bølgeformudgang (mV) | 246.7 | 228.7 | 227.6 | 220.3 | |
Tabel 1: Oscilloskopspændingsudgange fra ikke-kontamineret kontrolgruppe sammenlignet med forurenede forhold. Parrede t-tests blev udført mellem de ikke-kontaminerede forhold og hver kontamineret tilstand. Alle kontaminerede tilstande blev signifikant reduceret sammenlignet med ikke-kontaminerede tilstande (p < 0,0001).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De ovenfor skitserede teknikker demonstrerer, hvordan man korrekt vedligeholder en LFPI-enhed. Rutinemæssig rengøring og overvågning er nødvendig for at holde LFPI-enheden fungerer korrekt og pålideligt. På grund af LFPI-procedurens invasive karakter er det desuden bydende nødvendigt, at enheden rengøres grundigt for at forhindre infektion af forsøgsdyr.
Undgå dannelse af luftbobler i enheden er afgørende for at opnå optimale skader og trykbølgeformer. Luftbobler ændrer egenskaberne ved trykpulsen, der leveres til hjernen, hvilket forårsager inkonsekvente skader og gør det vanskeligt at reproducere kliniske TBI'er korrekt. De supplerende data, der indsamles her, viser, at luftbobleforurening ændrer spændingen af bølgen produceret af en påvirkning. Oscilloskopudgangene vist i figur 3 hjælper med at illustrere luftens virkninger på trykbølger; Bølgeformerne er ikke så skarpe og har i stedet flere toppe, når der er luftforurening til stede. Målet med LFPI-enheden er at tilvejebringe en enestående målbar væskepuls til hjernen; Resultaterne tyder på, at når luftbobler er til stede, skabes der flere impulser, hvilket gør det vanskeligt at skelne, hvilket tryk der påføres hjernen.
De teknikker, der anvendes her, reducerer sandsynligheden for, at gasser indføres i enheden og / eller hjælper med at fjerne små lommer af gas, der ikke desto mindre kan forurene væsken. Brug af afgasset væske reducerer risikoen for luftbobleforurening og kan forlænge vedligeholdelsesintervallet13. Således er de handlinger, der udføres i trin 2, kritiske for at reducere risikoen for dannelse af luftbobler i LFPI-enheden. Trin 3.4-3.9 fremhæver vigtigheden af at fjerne dvælende gasser i enheden, inden der udføres skader. Det er bemærkelsesværdigt, at synligheden i både tryktransduceren og midten af påfyldningsporten er begrænset efter genmontering af skadeanordningen; Disse områder kræver således særlig opmærksomhed, når man kontrollerer for luftbobledannelse efter påfyldning af cylinderen.
Denne procedure er specielt skræddersyet til LFPI-enheden fremstillet af Custom Design &; Fabrication Inc. Mindre ændringer af protokollen kan være nødvendige, når du bruger LFPI-enheder fremstillet af andre virksomheder.
Rengøring og genmontering af en LFPI-enhed kræver tid og opmærksomhed, men er nøglen til at producere ensartede skader. Det er især vigtigt at undgå luftbobler, da det kan hjælpe med at reducere fejlresultater og begrænse behovet for at udføre yderligere eksperimenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen angivne interessekonflikter.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Custom Design & Fabrication Inc. for deres tekniske assistance og support. Dette arbejde blev finansieret af National Institutes of Health-tilskud R01NS120099-01A1 og R37HD059288-19.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 - 10 mL syringes with Luer lock capability | Ensures that needle is secure and reduces possible leaks of fluid | ||
| Degassed fluid | Helps to reduce air bubble formation during injury procedure | ||
| Fluid Percussion Injury (FPI) device (Model 01-B) | Custom Designs & Fabrications Inc. | N/A | Injury device used to model TBI in rodents |
| Mild detergent | Allows to thoroughly clean the LFPI cylinder | ||
| Petroleum Jelly | Used as a water-repellent and protects LFPI device form rust | ||
| Teflon tape | Helps with tight seal of pipe joints on the LFPI device | ||
| *Materials other than the LFPI device can be purchased from any reliable company. |
References
- Centers for Disease Control and Prevention. Surveillance Report of Traumatic Brain Injury-related Emergency Department Visits, Hospitalizations, and Deaths. Centers for Disease Control and Prevention, U.S. Department of Health and Human Services. , https://www.cdc.gov/traumaticbraininjury/get_the_facts.html (2014).
- Dewan, M. C. Estimating the global incidence of traumatic brain injury. Journal of Neurosurgery. 130 (4), 1080-1097 (2018).
- National Center for Injury Prevention and Control; Division of Unintentional Injury Prevention. Traumatic Brain Injury in the United States: Epidemiology and Rehabilitation. , Centers for Disease Control and Prevention. Atlanta, GA. (2015).
- Holm, L., Cassidy, J. D., Carroll, L. J., Borg, J. Summary of the WHO Collaborating Centre for neurotrauma task force on mild traumatic brain injury. Journal of Rehabilitation Medicine. 37 (3), 137-141 (2005).
- Pavlovic, D., Pekic, S., Stojanovic, M., Popovic, V. Traumatic brain injury: neuropathological, neurocognitive and neurobehavioral sequelae. Pituitary. 22 (3), 270-282 (2019).
- Dixon, C. E. A fluid percussion model of experimental brain injury in the rat. Journal of Neurosurgery. 67 (1), 110-119 (1987).
- McIntosh, T. K. Traumatic brain injury in the rat: characterization of a lateral fluid-percussion model. Neuroscience. 28 (1), 233-244 (1989).
- Ma, X., Aravind, A., Pfister, B. J., Chandra, N., Haorah, J. Animal models of traumatic brain injury and assessment of injury severity. Molecular Neurobiology. 56 (8), 5332-5345 (2019).
- Nwafor, D. C. Pediatric traumatic brain injury: an update on preclinical models, clinical biomarkers, and the implications of cerebrovascular dysfunction. Journal of Central Nervous System Disease. 14, (2022).
- Turner, R. C. Modeling chronic traumatic encephalopathy: the way forward for future discovery. Frontiers in Neurology. 6, 223 (2015).
- Petersen, A., Soderstrom, M., Saha, B., Sharma, P. Animal models of traumatic brain injury: a review of pathophysiology to biomarkers and treatments. Experimental Brain Research. 239 (10), 2939-2950 (2021).
- Sullivan, H. G. Fluid-percussion model of mechanical brain injury in the cat. Journal of Neurosurgery. 45 (5), 521-534 (1976).
- Fluid Percussion Injury Model 01-B: General Operation. , Custom Design & Fabrication, Inc. Available from: http://www.cdf-products.com/ (2023).
- Fluid Percussion Injury Model 01-B: Assembly Instructions. , Custom Design & Fabrication, Inc. Available from: http://www.cdf-products.com/ (2023).
- Pernici, C. D. Longitudinal optical imaging technique to visualize progressive axonal damage after brain injury in mice reveals responses to different minocycline treatments. Scientific Reports. 10, 7815-78 (2020).
