Summary
Goede zorg en onderhoud zijn essentieel om een lateraal vloeistofpercussieletsel (LFPI) apparaat betrouwbaar te laten functioneren. Hier laten we zien hoe u een LFPI-apparaat op de juiste manier reinigt, vult en monteert en ervoor zorgt dat het adequaat wordt onderhouden voor optimale resultaten.
Abstract
Traumatisch hersenletsel (TBI) is goed voor ongeveer 2,5 miljoen bezoeken aan de spoedeisende hulp en ziekenhuisopnames per jaar en is een belangrijke oorzaak van overlijden en invaliditeit bij kinderen en jonge volwassenen. TBI wordt veroorzaakt door een plotselinge kracht die op het hoofd wordt uitgeoefend en om menselijke TBI en de onderliggende mechanismen beter te begrijpen, zijn experimentele letselmodellen nodig. Lateraal vochtpercussieletsel (LFPI) is een veelgebruikt letselmodel vanwege overeenkomsten in de pathologische veranderingen die worden gevonden in menselijke TBI in vergelijking met LFPI, waaronder bloedingen, vasculaire verstoring, neurologische tekorten en neuronverlies. LFPI maakt gebruik van een slinger en een met vloeistof gevulde cilinder, waarbij de laatste aan het ene uiteinde een beweegbare zuiger heeft en aan het andere uiteinde een Luer-vergrendelingsverbinding met stijve, met vloeistof gevulde buizen. Voorbereiding van het dier omvat het uitvoeren van een craniectomie en het bevestigen van een Luer-hub over de site. De volgende dag wordt de slang van het verwondingsapparaat verbonden met de Luer-hub op de schedel van het dier en wordt de slinger tot een bepaalde hoogte verhoogd en losgelaten. De impact van de slinger met de zuiger genereert een drukpuls die via de buis wordt doorgegeven aan de intacte dura mater van het dier en de experimentele TBI produceert. Goede zorg en onderhoud zijn essentieel voor het LKPI-apparaat om betrouwbaar te functioneren, omdat het karakter en de ernst van het letsel sterk kunnen variëren, afhankelijk van de toestand van het apparaat. Hier laten we zien hoe u het LFPI-apparaat op de juiste manier reinigt, vult en monteert en ervoor zorgt dat het adequaat wordt onderhouden voor optimale resultaten.
Introduction
Traumatisch hersenletsel (TBI) wordt veroorzaakt door een plotselinge kracht die op het hoofd wordt uitgeoefend. Na primaire verwondingen als gevolg van de fysieke impact, ervaren TBI-overlevenden vaak secundaire verwondingen, waaronder cognitieve tekorten en neurologische disfuncties die geassocieerd zijn met fysiologische reacties op het initiële letsel1. Naar schatting lijden jaarlijks ongeveer 69 miljoen mensen wereldwijd aan TBI2. Alleen al in de Verenigde Staten vinden elk jaar ongeveer 2,5 miljoen TBI-gerelateerde bezoeken aan de spoedeisende hulp en ziekenhuisopnames plaats, waardoor TBI een van de belangrijkste oorzaken van invaliditeit en overlijden bij kinderen en jonge volwassenenis 3. TBI kan worden geclassificeerd als mild, matig of ernstig, waarbij milde TBI (mTBI) goed is voor ongeveer 70% -90% van de TBI-gevallen4. Histologische en cognitieve TBI-pathologie kan optreden binnen enkele minuten tot uren na letsel, en de effecten van TBI kunnen maanden tot jaren na de eerste schade aanhouden5.
De ontwikkeling van experimentele modellen heeft een belangrijke rol gespeeld bij het begrijpen van de effecten en onderliggende mechanismen van TBI. Een dergelijk model, de laterale vloeistofpercussieblessure (LFPI), wordt vaak gebruikt om TBI in vivo te beoordelen. LFPI reproduceert nauw pathologieën geassocieerd met menselijke TBI, waaronder vasculaire verstoringen, bloedingen, neuronaal verlies, ontsteking, gliose en moleculaire stoornissen 6,7,8. De LFPI-techniek wordt gebruikt voor een diverse reeks experimentele toepassingen, waaronder het modelleren van pediatrische TBI, evenals chronische neurodegeneratieve aandoeningen, zoals chronische traumatische encefalopathie 9,10. LFPI is een goed gedefinieerde en reproduceerbare methode van experimentele TBI waarmee de ernst van het letsel kan worden aangepast11. Het LFPI-apparaat heeft verschillende belangrijke componenten, waaronder: een slinger met een verzwaarde hamer, een zuiger, een met vloeistof gevulde cilinder, een drukomvormer, een digitale oscilloscoop en een kleine buis aan het einde van de cilinder met een Luer-slot dat wordt bevestigd aan een naaf op de schedel van het dier (figuur 1). LFPI werkt door de slinger in de zuiger te slingeren, waardoor een golf van druk door de vloeistof (ontgast gedeïoniseerd water of zoutoplossing) in de hersenen van het aangehechte dier ontstaat; dit verhoogt de intracraniale druk, waardoor de mechanische kenmerken en biologische veranderingen van TBI12 worden gerepliceerd. Bovendien ondergaan dieren die worden gebruikt in LFPI-experimenten een craniectomie om de hersenen bloot te stellen aan de impact van de vloeistofdruk van het apparaat.
Routineonderhoud en monitoring zijn noodzakelijk om ervoor te zorgen dat het LFPI-apparaat nauwkeurig functioneert. De volgende methoden zijn van vitaal belang om de introductie van verontreinigende luchtbellen in het apparaat te voorkomen. Hier demonstreren we methoden om het LFPI-apparaat goed te reinigen, te vullen en te monteren. We zullen ook oscilloscoopuitgangen en muiscorrectietijden bespreken als manieren om de levensvatbaarheid van de LFPI te bevestigen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. De LFPI-cilinder reinigen
- Maak voorzichtig de spuiten los die aan de behuizing en vulpoort van de transducer zijn bevestigd, evenals de kabel die is aangesloten op de drukomvormer (zie figuur 1 voor een schema van onderdelen van het letselapparaat).
- Terwijl u voorzichtig bent om de cilinder niet te laten vallen, schroeft u de handknoppen aan de achterkant van het apparaat los van de cilinderklemmen om de cilinder vrij te maken.
- Verwijder de zuiger aan het einde van de cilinder, transducer, transducerbehuizing en O-ringen van de zuiger.
- Giet vloeistof uit de cilinder.
- Voeg mild wasmiddel, zoals afwasmiddel, toe aan de cilinder en schrob lichtjes met een afwas- of flessenborstel13.
- Om ervoor te zorgen dat al het wasmiddel wordt afgespoeld, vult u de cilinder volledig met water en spoelt u deze grondig af.
2. Ontgassen van de vloeistof die wordt gebruikt om de cilinder te vullen
- Gebruik een vacuümpomp om de vloeistof te ontgassen voordat u de cilinder bijvult om de vorming van nieuwe bellen te voorkomen en bestaande bellen te absorberen.
OPMERKING: Ongeveer 1,5 l vloeistof is nodig om de cilinder te vullen, hoewel het ontgassen van ongeveer 2 l een kleine toevoer zal achterlaten voor het vervangen van vloeistof die verloren is gegaan tijdens gebruik en testen.
OPMERKING: Huisstofzuigers zijn te zwak om de vloeistof effectief te ontgassen. Het vacuüm moet een druk van 25-28 inHg kunnen produceren. - Voeg een roerstaaf toe aan de vloeistof en plaats de vloeistofcontainer op een roerplaat. Het roeren van de vloeistof tijdens het ontgassingsproces helpt het borrelen en het vrijkomen van gas te stimuleren. Roeren voorkomt ook een grote plotselinge toename van borrelen.
OPMERKING: Het ontgassingsproces moet voorbij zijn wanneer er zeer weinig bubbels worden geproduceerd; Dit gebeurt na ongeveer 45 min.
3. Het LFPI-apparaat opnieuw monteren
- Breng een dun laagje vaseline aan op de zuigerzuiger.
- Bevestig de zuigerzuiger met de zuiger die ongeveer 32 mm uit de cilinder14 steekt.
OPMERKING: Lucht komt vaak vast te zitten aan de zuiger voor de leidende O-ring. Om van deze overtollige lucht af te komen, draait u de zuiger terwijl u deze in en uit beweegt om de lucht uit deze opening te werken. - Breng ook een dun laagje vaseline aan op de andere O-ringen en bevestig deze aan de cilinder, met uitzondering van de O-ring op de vulpoort.
- Wikkel teflontape twee keer rond de draden van de transducer.
4. Het LFPI-apparaat bijvullen en aan de basis bevestigen
- Sluit een spuit van 10 ml gevuld met ontgaste vloeistof en vrij van luchtbellen aan op de Luer-vergrendelingshub op de behuizing van de transducer.
- Houd de transducer met het schroefdraaduiteinde naar boven gericht en vul de put in het schroefdraadgebied van de transducer volledig met de ontgaste vloeistof met behulp van een spuit van 10 ml. Het doel hier is om de transducer goed te vullen zonder luchtbellen te introduceren. Zorg ervoor dat u het delicate membraan aan de onderkant van de transducer niet goed beschadigt.
- Met de cilinder onder een hoek geplaatst om te voorkomen dat lucht opnieuw de behuizing van de transducer binnendringt, bevestigt u de behuizing van de transducer aan de cilinder13 en gebruikt u een moersleutel om deze goed vast te draaien.
- Verwijder de dop van de vulpoort en cilinder zodra de ontgaste vloeistof ongeveer 2/3 van de cilinderinhoud bereikt.
- Plaats de cilinder horizontaal en vul de cilinder met ontgaste vloeistof.
OPMERKING: Om de vorming van luchtbellen te voorkomen, wordt aanbevolen om de vloeistof langzaam in te gieten14. - Plaats de dop terug bij de vulpoort en sluit alle stopkranen.
- Manipuleer de cilinder om eventuele luchtbellen naar de vulpoort14 te werken.
- Open de stopkraan op de vulpoort en injecteer vloeistof met behulp van de spuit op de behuizing van de transducer om eventuele luchtbellen uit de poort te persen14.
- Inspecteer het hele apparaat en zorg ervoor dat er geen luchtbellen zijn.
- Voeg een spuit van 10 ml gevuld met ontgaste vloeistof toe aan de Luer-vergrendelingshub op de vuldop.
- Bevestig de cilinder opnieuw aan de basis met behulp van de handschroeven.
- Zorg ervoor dat de cilinder horizontaal is en is uitgelijnd met het midden van de verzwaarde hamer op de slinger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
We hebben de effecten van luchtbelverontreiniging in een LFPI-apparaat op golfvormvorming getest. We injecteerden luchtbellen in het apparaat en vergeleken de oscilloscoopuitgangen met oscilloscoopgegevens verzameld van een niet-besmet LFPI-apparaat. De omstandigheden waren als volgt: niet-verontreinigd, injectie van 5 ml lucht, injectie van 10 ml lucht en injectie van 15 ml lucht. We hielden de slinger op een consistente hoogte voor alle effecten voor alle omstandigheden en we voerden 15 stoten per toestand uit.
Bij het uitvoeren van een verwonding of het testen van het LFPI-apparaat moet de drukgolfvorm op de oscilloscoop een enkele, scherpe piek vertonen (figuur 2A). De aanwezigheid van luchtbellen in het apparaat zal resulteren in een golfvorm met verschillende korte pieken (figuur 2B), wat wijst op bellen die moeten worden verwijderd. Na het opnieuw monteren van het apparaat en vóór elke letselsessie, raden we ook aan om vier tot vijf testdruppels (geen muis bevestigd) met de slinger uit te voeren om ervoor te zorgen dat het apparaat herhaaldelijk presteert. Naast onregelmatigheden in de drukgolfvorm, kunnen gedragsveranderingen na letsel/schijn-LFPI ook een indicatie zijn of het apparaat goed functioneert. Gewonde muizen moeten langere rechtrichtreflextijden hebben na LFPI in vergelijking met schijnmuizen, en deze tijden moeten worden gecontroleerd en geregistreerd. Correctietijden die te lang of te kort zijn, kunnen een indicatie zijn van onjuiste montage en/of reiniging van het apparaat15. Soortgelijke symptomen kunnen ook geleidelijk optreden in een apparaat dat goed is gereinigd en gevuld (waarschijnlijk als gevolg van de langzame ophoping van bubbels tijdens routinematig gebruik), wat aangeeft dat het tijd is om het reinigen en bijvullen te herhalen. Het plannen van preventief onderhoud eens in de 6 maanden kan helpen om consistente prestaties van het LFPI-apparaat te garanderen.
Zoals te zien is in tabel 1, veranderde de aanwezigheid van luchtbellen de spanning van de golfvorm in vergelijking met een volledig gevuld, niet-verontreinigd LFPI-apparaat. Het vergroten van de grootte van de luchtbel verminderde geleidelijk de spanning van de golf, zoals aangegeven door de oscilloscoopuitgangen.
Figuur 1: Schema van het LFPI-apparaat en laterale craniectomie uitgevoerd voorafgaand aan het letsel. Dit apparaat wordt gebruikt om TBI's zonder schedelbreuk in diermodellen te reproduceren door verplaatsing en / of vervorming van de hersenen te veroorzaken als gevolg van een toename van de intercraniale druk. Gemaakt met Biorender.com. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Bewaking van de output van de drukomvormer om het onderhoud en de functionele status van het LFPI-apparaat te beoordelen13. (A) Representatief beeld van de drukgolfvorm die wordt geproduceerd door een goed gereinigde en functionerende LFPI-inrichting. (B) Voorbeeldafbeelding van een drukgolfvorm die de aanwezigheid van luchtbelverontreiniging aangeeft. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Representatief beeld van oscilloscoopuitgangen voor alle vier de omstandigheden . (A,B,C,D) De oscilloscoopuitgangen voor de niet-verontreinigde, respectievelijk 5 ml luchtinjectie, 10 ml luchtinjectie en 15 ml luchtinjectie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Toestand van luchtbelverontreiniging | |||||
| Gevuld en niet-verontreinigd LFPI-apparaat | 5 ml totale ingespoten lucht | 10 ml totale ingespoten lucht | 15 ml totale ingespoten lucht | ||
| Golfvormuitgang (mV) | 240 | 218 | 230 | 218 | |
| 234 | 222 | 226 | 220 | ||
| 240 | 228 | 226 | 220 | ||
| 244 | 226 | 228 | 218 | ||
| 246 | 228 | 230 | 218 | ||
| 248 | 232 | 226 | 220 | ||
| 248 | 230 | 226 | 220 | ||
| 250 | 230 | 228 | 220 | ||
| 248 | 232 | 228 | 224 | ||
| 252 | 232 | 228 | 222 | ||
| 250 | 232 | 226 | 220 | ||
| 250 | 230 | 228 | 222 | ||
| 252 | 230 | 228 | 222 | ||
| 252 | 232 | 228 | 220 | ||
| Gemiddelde golfvormuitgang (mV) | 246.7 | 228.7 | 227.6 | 220.3 | |
Tabel 1: Oscilloscoopspanningsuitgangen van niet-verontreinigde controlegroep in vergelijking met verontreinigde omstandigheden. Gepaarde t-tests werden uitgevoerd tussen de niet-verontreinigde omstandigheden en elke besmette toestand. Alle verontreinigde omstandigheden waren significant afgenomen in vergelijking met niet-verontreinigde omstandigheden (p < 0,0001).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De hierboven beschreven technieken laten zien hoe u een LFPI-apparaat op de juiste manier kunt onderhouden. Routinematige reiniging en monitoring zijn noodzakelijk om het LFPI-apparaat correct en betrouwbaar te laten functioneren. Bovendien is het vanwege de invasieve aard van de FFPI-procedure noodzakelijk dat het apparaat grondig wordt gereinigd om infectie van proefdieren te voorkomen.
Het vermijden van de vorming van luchtbellen in het apparaat is cruciaal voor het verkrijgen van optimale verwondingen en drukgolfvormen. Luchtbellen veranderen de kenmerken van de drukpuls die aan de hersenen wordt afgegeven, waardoor inconsistente verwondingen ontstaan en het moeilijk wordt om klinische TBI's goed te reproduceren. De aanvullende gegevens die hier worden verzameld, laten zien dat luchtbelverontreiniging de spanning van de golf die door een inslag wordt geproduceerd, verandert. De oscilloscoopuitgangen in figuur 3 helpen de effecten van lucht op drukgolven te illustreren; De golfvormen zijn niet zo scherp en hebben in plaats daarvan meerdere pieken wanneer luchtverontreiniging aanwezig is. Het doel van het LFPI-apparaat is om een enkelvoudig meetbare vloeistofpuls naar de hersenen te sturen; De resultaten suggereren dat wanneer luchtbellen aanwezig zijn, er meerdere pulsen worden gecreëerd, waardoor het moeilijk is om te onderscheiden welke druk op de hersenen wordt uitgeoefend.
De hier gebruikte technieken verminderen de kans dat gassen in het apparaat worden gebracht en / of helpen kleine gaszakjes te verwijderen die de vloeistof toch kunnen verontreinigen. Het gebruik van ontgaste vloeistof vermindert het risico op luchtbelverontreiniging en kan het onderhoudsinterval verlengen13. De acties die in stap 2 worden uitgevoerd, zijn dus van cruciaal belang voor het verminderen van de kans op luchtbelvorming in het LFPI-apparaat. Stappen 3.4-3.9 benadrukken het belang van het verwijderen van achtergebleven gassen in het apparaat voorafgaand aan het uitvoeren van verwondingen. Het is opmerkelijk dat, na het opnieuw monteren van het letselapparaat, het zicht in zowel de drukomvormer als het midden van de vulpoort beperkt is; Deze gebieden vereisen dus bijzondere aandacht bij het controleren op luchtbelvorming na het vullen van de cilinder.
Deze procedure is specifiek afgestemd op het LFPI-apparaat van Custom Design & Fabrication Inc. Kleine wijzigingen in het protocol kunnen nodig zijn bij het gebruik van LFPI-apparaten die door andere bedrijven zijn vervaardigd.
Het reinigen en opnieuw monteren van een LFPI-apparaat vereist tijd en aandacht, maar is de sleutel tot het produceren van consistente verwondingen. Het vermijden van luchtbellen is vooral belangrijk, omdat het kan helpen om foutieve resultaten te verminderen en de noodzaak om extra experimenten uit te voeren te beperken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten aangegeven.
Acknowledgments
De auteurs willen Custom Design &; Fabrication Inc. bedanken voor hun technische assistentie en ondersteuning. Dit werk werd gefinancierd door de National Institutes of Health subsidies R01NS120099-01A1 en R37HD059288-19.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 - 10 mL syringes with Luer lock capability | Ensures that needle is secure and reduces possible leaks of fluid | ||
| Degassed fluid | Helps to reduce air bubble formation during injury procedure | ||
| Fluid Percussion Injury (FPI) device (Model 01-B) | Custom Designs & Fabrications Inc. | N/A | Injury device used to model TBI in rodents |
| Mild detergent | Allows to thoroughly clean the LFPI cylinder | ||
| Petroleum Jelly | Used as a water-repellent and protects LFPI device form rust | ||
| Teflon tape | Helps with tight seal of pipe joints on the LFPI device | ||
| *Materials other than the LFPI device can be purchased from any reliable company. |
References
- Centers for Disease Control and Prevention. Surveillance Report of Traumatic Brain Injury-related Emergency Department Visits, Hospitalizations, and Deaths. Centers for Disease Control and Prevention, U.S. Department of Health and Human Services. , https://www.cdc.gov/traumaticbraininjury/get_the_facts.html (2014).
- Dewan, M. C. Estimating the global incidence of traumatic brain injury. Journal of Neurosurgery. 130 (4), 1080-1097 (2018).
- National Center for Injury Prevention and Control; Division of Unintentional Injury Prevention. Traumatic Brain Injury in the United States: Epidemiology and Rehabilitation. , Centers for Disease Control and Prevention. Atlanta, GA. (2015).
- Holm, L., Cassidy, J. D., Carroll, L. J., Borg, J. Summary of the WHO Collaborating Centre for neurotrauma task force on mild traumatic brain injury. Journal of Rehabilitation Medicine. 37 (3), 137-141 (2005).
- Pavlovic, D., Pekic, S., Stojanovic, M., Popovic, V. Traumatic brain injury: neuropathological, neurocognitive and neurobehavioral sequelae. Pituitary. 22 (3), 270-282 (2019).
- Dixon, C. E. A fluid percussion model of experimental brain injury in the rat. Journal of Neurosurgery. 67 (1), 110-119 (1987).
- McIntosh, T. K. Traumatic brain injury in the rat: characterization of a lateral fluid-percussion model. Neuroscience. 28 (1), 233-244 (1989).
- Ma, X., Aravind, A., Pfister, B. J., Chandra, N., Haorah, J. Animal models of traumatic brain injury and assessment of injury severity. Molecular Neurobiology. 56 (8), 5332-5345 (2019).
- Nwafor, D. C. Pediatric traumatic brain injury: an update on preclinical models, clinical biomarkers, and the implications of cerebrovascular dysfunction. Journal of Central Nervous System Disease. 14, (2022).
- Turner, R. C. Modeling chronic traumatic encephalopathy: the way forward for future discovery. Frontiers in Neurology. 6, 223 (2015).
- Petersen, A., Soderstrom, M., Saha, B., Sharma, P. Animal models of traumatic brain injury: a review of pathophysiology to biomarkers and treatments. Experimental Brain Research. 239 (10), 2939-2950 (2021).
- Sullivan, H. G. Fluid-percussion model of mechanical brain injury in the cat. Journal of Neurosurgery. 45 (5), 521-534 (1976).
- Fluid Percussion Injury Model 01-B: General Operation. , Custom Design & Fabrication, Inc. Available from: http://www.cdf-products.com/ (2023).
- Fluid Percussion Injury Model 01-B: Assembly Instructions. , Custom Design & Fabrication, Inc. Available from: http://www.cdf-products.com/ (2023).
- Pernici, C. D. Longitudinal optical imaging technique to visualize progressive axonal damage after brain injury in mice reveals responses to different minocycline treatments. Scientific Reports. 10, 7815-78 (2020).
