Summary
El cuidado y el mantenimiento adecuados son esenciales para que un dispositivo de lesión por percusión de fluido lateral (LFPI) funcione de manera confiable. Aquí, demostramos cómo limpiar, llenar y ensamblar adecuadamente un dispositivo LFPI, y asegurarnos de que se mantenga adecuadamente para obtener resultados óptimos.
Abstract
La lesión cerebral traumática (TBI) representa aproximadamente 2.5 millones de visitas a la sala de emergencias y hospitalizaciones anualmente y es una de las principales causas de muerte y discapacidad en niños y adultos jóvenes. La LCT es causada por una fuerza repentina aplicada a la cabeza y, para comprender mejor la LCT humana y sus mecanismos subyacentes, se necesitan modelos experimentales de lesiones. La lesión por percusión del líquido lateral (LFPI) es un modelo de lesión comúnmente utilizado debido a las similitudes en los cambios patológicos encontrados en la LCT humana en comparación con la LFPI, incluidas hemorragias, trastornos vasculares, déficits neurológicos y pérdida de neuronas. LFPI emplea un péndulo y un cilindro lleno de líquido, este último con un pistón móvil en un extremo, y una conexión de bloqueo Luer a un tubo rígido lleno de líquido en el otro extremo. La preparación del animal implica realizar una craniectomía y colocar un cubo Luer sobre el sitio. Al día siguiente, el tubo del dispositivo de lesión se conecta al centro Luer en el cráneo del animal y el péndulo se eleva a una altura específica y se libera. El impacto del péndulo con el pistón genera un pulso de presión que se transmite a la duramadre intacta del animal a través del tubo y produce la LCT experimental. El cuidado y el mantenimiento adecuados son esenciales para que el dispositivo LFPI funcione de manera confiable, ya que el carácter y la gravedad de la lesión pueden variar mucho según la condición del dispositivo. Aquí, demostramos cómo limpiar, llenar y ensamblar adecuadamente el dispositivo LFPI, y asegurarnos de que se mantenga adecuadamente para obtener resultados óptimos.
Introduction
La lesión cerebral traumática (LCT) es causada por una fuerza repentina aplicada a la cabeza. Después de las lesiones primarias resultantes del impacto físico, los sobrevivientes de LCT comúnmente experimentan lesiones secundarias, incluyendo déficits cognitivos y disfunciones neurológicas que están asociadas con respuestas fisiológicas a la lesión inicial1. Se estima que aproximadamente 69 millones de personas en todo el mundo sufren de LCT anualmente2. Solo en los Estados Unidos, aproximadamente 2.5 millones de visitas a la sala de emergencias y hospitalizaciones relacionadas con TBI ocurren cada año, lo que hace que TBI sea una de las principales causas de discapacidad y muerte entre niños y adultos jóvenes3. La LCT puede clasificarse como leve, moderada o grave, y la LCT leve (LCTm) representa aproximadamente el 70% -90% de los casos de LCT4. La patología histológica y cognitiva de la LCT puede ocurrir en cuestión de minutos a horas después de la lesión, y los efectos de la LCT pueden persistir durante meses o años después del daño inicial5.
El desarrollo de modelos experimentales ha sido fundamental para comprender los efectos y los mecanismos subyacentes de la LCT. Uno de estos modelos, la lesión por percusión del fluido lateral (LFPI), se usa comúnmente para evaluar TBI in vivo. LFPI reproduce de cerca patologías asociadas con TCE humano, incluyendo trastornos vasculares, hemorragias, pérdida neuronal, inflamación, gliosis y alteraciones moleculares 6,7,8. La técnica LFPI se utiliza para un conjunto diverso de aplicaciones experimentales, incluyendo el modelado de LCT pediátrica, así como condiciones neurodegenerativas crónicas, como la encefalopatía traumática crónica 9,10. LFPI es un método bien definido y reproducible de TCE experimental que permite ajustar la gravedad de la lesión11. El dispositivo LFPI tiene varios componentes importantes, que incluyen: un péndulo con un martillo pesado, un pistón, un cilindro lleno de líquido, un transductor de presión, un osciloscopio digital y un pequeño tubo en el extremo del cilindro con un bloqueo Luer que se conecta a un cubo en el cráneo del animal (Figura 1). LFPI funciona balanceando el péndulo en el pistón, creando una onda de presión a través del fluido (agua desionizada desgasificada o solución salina) en el cerebro del animal unido; esto aumenta la presión intracraneal, replicando así las características mecánicas y los cambios biológicos de TBI12. Además, los animales utilizados en experimentos LFPI se someten a una craniectomía para exponer el cerebro al impacto de la presión del fluido del dispositivo.
El mantenimiento y la supervisión de rutina son necesarios para garantizar que el dispositivo LFPI funcione con precisión. Los siguientes métodos son vitales para prevenir la introducción de burbujas de aire contaminantes en el dispositivo. Aquí, demostramos métodos para limpiar, llenar y ensamblar adecuadamente el dispositivo LFPI. También discutiremos las salidas del osciloscopio y los tiempos de enderezamiento del mouse como formas de confirmar la viabilidad del LFPI.
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Protocol
1. Limpieza del cilindro LFPI
- Separe con cuidado las jeringas conectadas a la carcasa del transductor y al puerto de llenado, así como el cable conectado al transductor de presión (consulte la figura 1 para obtener un esquema de los componentes del dispositivo de lesión).
- Mientras tiene cuidado de no dejar caer el cilindro, desenrosque las perillas de mano en la parte posterior del dispositivo de las abrazaderas del cilindro para liberar el cilindro.
- Retire el pistón en el extremo del cilindro, el transductor, la carcasa del transductor y las juntas tóricas del émbolo.
- Drene el líquido del cilindro.
- Agregue detergente suave, como detergente para lavar platos, al cilindro y frote ligeramente con un cepillo para platos o botellas13.
- Para asegurarse de que todo el detergente se enjuague, llene completamente el cilindro con agua y enjuague bien.
2. Desgasificación del fluido utilizado para llenar el cilindro
- Utilice una bomba de vacío para desgasificar el fluido antes de volver a llenar el cilindro para evitar la formación de nuevas burbujas y absorber las burbujas existentes.
NOTA: Se necesitarán aproximadamente 1,5 L de fluido para llenar el cilindro, aunque la desgasificación de aproximadamente 2 L dejará un pequeño suministro para reemplazar cualquier fluido perdido durante el uso y la prueba.
NOTA: Las aspiradoras domésticas son demasiado débiles para desgasificar eficazmente el fluido. El vacío debe ser capaz de producir una presión de 25-28 inHg. - Agregue una barra de agitación al líquido y coloque el recipiente del líquido en un plato de agitación. La agitación del fluido durante el proceso de desgasificación ayuda a estimular el burbujeo y la liberación de gas. La agitación también evita un gran aumento repentino en el burbujeo.
NOTA: El proceso de desgasificación debería terminar cuando se producen muy pocas burbujas; Esto ocurre después de aproximadamente 45 minutos.
3. Reensamblaje del dispositivo LFPI
- Aplique una capa delgada de vaselina al émbolo del pistón.
- Fije el émbolo del pistón con el émbolo que sobresalga aproximadamente 32 mm del cilindro14.
NOTA: El aire con frecuencia queda atrapado en el émbolo antes de la junta tórica principal. Para deshacerse de este exceso de aire, gire el émbolo mientras lo mueve hacia adentro y hacia afuera para sacar el aire de este espacio. - Aplique una capa delgada de vaselina a las otras juntas tóricas también y conéctelas al cilindro, con excepción de la junta tórica en el puerto de llenado.
- Envuelva la cinta de teflón dos veces alrededor de las roscas del transductor.
4. Recarga del dispositivo LFPI y fijación a la base
- Conecte una jeringa de 10 ml llena de líquido desgasificado y libre de burbujas de aire al cubo de bloqueo Luer en la carcasa del transductor.
- Sostenga el transductor con el extremo roscado apuntando hacia arriba y llene completamente el pozo dentro de la región roscada del transductor con el líquido desgasificado usando una jeringa de 10 ml. El objetivo aquí es llenar bien el transductor sin introducir burbujas de aire. Tenga cuidado de no dañar bien la delicada membrana en la parte inferior del transductor.
- Con el cilindro colocado en ángulo para evitar que el aire vuelva a entrar en la carcasa del transductor, fije la carcasa del transductor al cilindro13 y use una llave para apretarlo cómodamente.
- Retire la tapa del puerto de llenado y del cilindro una vez que el fluido desgasificado alcance aproximadamente 2/3 de la capacidad del cilindro.
- Coloque el cilindro horizontalmente y termine de llenar el cilindro con líquido desgasificado.
NOTA: Para evitar la formación de burbujas de aire, se recomienda verter el líquido lentamente14. - Vuelva a colocar la tapa en el puerto de llenado y cierre todas las llaves de paso.
- Manipule el cilindro para que las burbujas de aire funcionen en el puerto de llenado14.
- Abra la llave de paso en el puerto de llenado e inyecte líquido usando la jeringa en la carcasa del transductor para forzar cualquier burbuja de aire fuera del puerto14.
- Inspeccione todo el dispositivo y asegúrese de que no haya burbujas de aire.
- Agregue una jeringa de 10 ml llena de líquido desgasificado al cubo de bloqueo Luer en la tapa de llenado.
- Vuelva a colocar el cilindro en la base con los tornillos manuales.
- Asegúrese de que el cilindro esté horizontal y alineado con el centro del martillo pesado en el péndulo.
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Representative Results
Probamos los efectos de la contaminación de burbujas de aire en un dispositivo LFPI en la formación de formas de onda. Inyectamos burbujas de aire en el dispositivo y comparamos las salidas del osciloscopio con los datos del osciloscopio recopilados de un dispositivo LFPI no contaminado. Las condiciones fueron las siguientes: no contaminado, inyección de 5 mL de aire, inyección de 10 mL de aire e inyección de 15 mL de aire. Mantuvimos el péndulo a una altura constante para todos los impactos para todas las condiciones, y realizamos 15 impactos por condición.
Al realizar una lesión o probar el dispositivo LFPI, la forma de onda de presión en el osciloscopio debe mostrar un pico único y agudo (Figura 2A). La presencia de burbujas de aire en el dispositivo dará como resultado una forma de onda con varios picos cortos (Figura 2B), lo que indica burbujas que deben eliminarse. Después de volver a montar el dispositivo, y antes de cualquier sesión de lesión, también recomendamos realizar de cuatro a cinco gotas de prueba (sin ratón conectado) con el péndulo para garantizar que el dispositivo funcione de forma repetitiva. Además de las irregularidades en la forma de onda de presión, los cambios de comportamiento después de una lesión/LFPI simulada también pueden ser indicativos de si el dispositivo está funcionando correctamente. Los ratones lesionados deben tener tiempos de reflejo de enderezamiento prolongados después de LFPI en comparación con los ratones simulados, y estos tiempos deben ser monitoreados y registrados. Los tiempos de enderezamiento demasiado largos o demasiado cortos pueden ser una indicación de un montaje y/o limpieza incorrectos del dispositivo15. Síntomas similares también pueden aparecer gradualmente en un dispositivo que se ha limpiado y llenado adecuadamente (probablemente debido a la lenta acumulación de burbujas durante el uso rutinario), lo que indica que es hora de repetir la limpieza y el relleno. Programar el mantenimiento preventivo una vez cada 6 meses puede ayudar a garantizar un rendimiento constante del dispositivo LFPI.
Como se ve en la Tabla 1, la presencia de burbujas de aire cambió el voltaje de la forma de onda en comparación con un dispositivo LFPI completamente lleno y no contaminado. El aumento del tamaño de la burbuja de aire disminuyó gradualmente el voltaje de la onda, como lo indican las salidas del osciloscopio.
Figura 1: Esquema del dispositivo LFPI y craniectomía lateral realizada antes de la lesión. Este dispositivo se utiliza para reproducir TBI sin fractura de cráneo en modelos animales al causar desplazamiento y / o deformación del cerebro debido a un aumento de la presión intercraneal. Creado con Biorender.com. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Monitoreo de la salida del transductor de presión para evaluar el mantenimiento y el estado funcional del dispositivo LFPI13. (A) Imagen representativa de la forma de onda de presión producida por un dispositivo LFPI debidamente limpiado y en funcionamiento. (B) Imagen de muestra de una forma de onda de presión que indica la presencia de contaminación por burbujas de aire. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Imagen representativa de las salidas del osciloscopio para las cuatro condiciones. (A, B, C, D) El osciloscopio produce para los no contaminados, 5 ml de inyección de aire, 10 ml de inyección de aire y 15 ml de inyección de aire, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Condición de contaminación de burbujas de aire | |||||
| Dispositivo LFPI lleno y no contaminado | 5 ml de aire total inyectado | 10 ml de aire total inyectado | 15 ml de aire total inyectado | ||
| Salida de forma de onda (mV) | 240 | 218 | 230 | 218 | |
| 234 | 222 | 226 | 220 | ||
| 240 | 228 | 226 | 220 | ||
| 244 | 226 | 228 | 218 | ||
| 246 | 228 | 230 | 218 | ||
| 248 | 232 | 226 | 220 | ||
| 248 | 230 | 226 | 220 | ||
| 250 | 230 | 228 | 220 | ||
| 248 | 232 | 228 | 224 | ||
| 252 | 232 | 228 | 222 | ||
| 250 | 232 | 226 | 220 | ||
| 250 | 230 | 228 | 222 | ||
| 252 | 230 | 228 | 222 | ||
| 252 | 232 | 228 | 220 | ||
| Salida de forma de onda promedio (mV) | 246.7 | 228.7 | 227.6 | 220.3 | |
Tabla 1: Salidas de voltaje del osciloscopio del grupo de control no contaminado en comparación con condiciones contaminadas. Se realizaron pruebas t pareadas entre las condiciones no contaminadas y cada condición contaminada. Todas las condiciones contaminadas disminuyeron significativamente en comparación con las condiciones no contaminadas (p < 0,0001).
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Discussion
Las técnicas descritas anteriormente demuestran cómo mantener adecuadamente un dispositivo LFPI. La limpieza y el monitoreo de rutina son necesarios para mantener el dispositivo LFPI funcionando correctamente y de manera confiable. Además, debido a la naturaleza invasiva del procedimiento LFPI, es imperativo que el dispositivo se limpie a fondo para prevenir la infección de animales de laboratorio.
Evitar la formación de burbujas de aire en el dispositivo es crucial para obtener lesiones óptimas y formas de onda de presión. Las burbujas de aire alteran las características del pulso de presión entregado al cerebro, causando lesiones inconsistentes y dificultando la reproducción adecuada de las LCT clínicas. Los datos suplementarios recopilados aquí muestran que la contaminación de burbujas de aire altera el voltaje de la onda producida por un impacto. Las salidas del osciloscopio que se muestran en la Figura 3 ayudan a ilustrar los efectos del aire en las ondas de presión; Las formas de onda no son tan nítidas y, en cambio, tienen múltiples picos cuando la contaminación del aire está presente. El objetivo del dispositivo LFPI es proporcionar un pulso de líquido medible singular al cerebro; Los resultados sugieren que cuando las burbujas de aire están presentes, se crean múltiples pulsos, lo que dificulta discernir qué presión se está aplicando al cerebro.
Las técnicas empleadas aquí reducen la probabilidad de que se introduzcan gases en el dispositivo y / o ayudan a eliminar cualquier pequeña bolsa de gas que, sin embargo, pueda estar contaminando el fluido. El uso de fluido desgasificado reduce el riesgo de contaminación por burbujas de aire y puede extender el intervalo de mantenimiento13. Por lo tanto, las acciones realizadas en el paso 2 son críticas para reducir la posibilidad de formación de burbujas de aire en el dispositivo LFPI. Los pasos 3.4-3.9 resaltan la importancia de eliminar los gases persistentes en el dispositivo antes de realizar lesiones. Cabe destacar que, después de volver a montar el dispositivo de lesión, la visibilidad tanto en el transductor de presión como en el centro del puerto de llenado es limitada; Por lo tanto, estas áreas requieren especial atención al verificar la formación de burbujas de aire después de llenar el cilindro.
Este procedimiento se adapta específicamente al dispositivo LFPI fabricado por Custom Design & Fabrication Inc. Pueden ser necesarios cambios menores en el protocolo cuando se utilizan dispositivos LFPI fabricados por otras compañías.
Limpiar y volver a montar un dispositivo LFPI requiere tiempo y atención, pero es clave para producir lesiones consistentes. Evitar las burbujas de aire es particularmente importante, ya que puede ayudar a reducir los resultados defectuosos y limitar la necesidad de realizar experimentos adicionales.
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Disclosures
No se han declarado conflictos de intereses.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer a Custom Design & Fabrication Inc. por su asistencia técnica y apoyo. Este trabajo fue financiado por las subvenciones R01NS120099-01A1 y R37HD059288-19 de los Institutos Nacionales de Salud.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 - 10 mL syringes with Luer lock capability | Ensures that needle is secure and reduces possible leaks of fluid | ||
| Degassed fluid | Helps to reduce air bubble formation during injury procedure | ||
| Fluid Percussion Injury (FPI) device (Model 01-B) | Custom Designs & Fabrications Inc. | N/A | Injury device used to model TBI in rodents |
| Mild detergent | Allows to thoroughly clean the LFPI cylinder | ||
| Petroleum Jelly | Used as a water-repellent and protects LFPI device form rust | ||
| Teflon tape | Helps with tight seal of pipe joints on the LFPI device | ||
| *Materials other than the LFPI device can be purchased from any reliable company. |
References
- Centers for Disease Control and Prevention. Surveillance Report of Traumatic Brain Injury-related Emergency Department Visits, Hospitalizations, and Deaths. Centers for Disease Control and Prevention, U.S. Department of Health and Human Services. , https://www.cdc.gov/traumaticbraininjury/get_the_facts.html (2014).
- Dewan, M. C. Estimating the global incidence of traumatic brain injury. Journal of Neurosurgery. 130 (4), 1080-1097 (2018).
- National Center for Injury Prevention and Control; Division of Unintentional Injury Prevention. Traumatic Brain Injury in the United States: Epidemiology and Rehabilitation. , Centers for Disease Control and Prevention. Atlanta, GA. (2015).
- Holm, L., Cassidy, J. D., Carroll, L. J., Borg, J. Summary of the WHO Collaborating Centre for neurotrauma task force on mild traumatic brain injury. Journal of Rehabilitation Medicine. 37 (3), 137-141 (2005).
- Pavlovic, D., Pekic, S., Stojanovic, M., Popovic, V. Traumatic brain injury: neuropathological, neurocognitive and neurobehavioral sequelae. Pituitary. 22 (3), 270-282 (2019).
- Dixon, C. E. A fluid percussion model of experimental brain injury in the rat. Journal of Neurosurgery. 67 (1), 110-119 (1987).
- McIntosh, T. K. Traumatic brain injury in the rat: characterization of a lateral fluid-percussion model. Neuroscience. 28 (1), 233-244 (1989).
- Ma, X., Aravind, A., Pfister, B. J., Chandra, N., Haorah, J. Animal models of traumatic brain injury and assessment of injury severity. Molecular Neurobiology. 56 (8), 5332-5345 (2019).
- Nwafor, D. C. Pediatric traumatic brain injury: an update on preclinical models, clinical biomarkers, and the implications of cerebrovascular dysfunction. Journal of Central Nervous System Disease. 14, (2022).
- Turner, R. C. Modeling chronic traumatic encephalopathy: the way forward for future discovery. Frontiers in Neurology. 6, 223 (2015).
- Petersen, A., Soderstrom, M., Saha, B., Sharma, P. Animal models of traumatic brain injury: a review of pathophysiology to biomarkers and treatments. Experimental Brain Research. 239 (10), 2939-2950 (2021).
- Sullivan, H. G. Fluid-percussion model of mechanical brain injury in the cat. Journal of Neurosurgery. 45 (5), 521-534 (1976).
- Fluid Percussion Injury Model 01-B: General Operation. , Custom Design & Fabrication, Inc. Available from: http://www.cdf-products.com/ (2023).
- Fluid Percussion Injury Model 01-B: Assembly Instructions. , Custom Design & Fabrication, Inc. Available from: http://www.cdf-products.com/ (2023).
- Pernici, C. D. Longitudinal optical imaging technique to visualize progressive axonal damage after brain injury in mice reveals responses to different minocycline treatments. Scientific Reports. 10, 7815-78 (2020).
