Summary
Надлежащий уход и техническое обслуживание необходимы для надежного функционирования устройства для ударной травмы боковой жидкости (LFPI). Здесь мы продемонстрируем, как правильно очистить, наполнить и собрать устройство LFPI, а также обеспечить его надлежащее обслуживание для достижения оптимальных результатов.
Abstract
Черепно-мозговая травма (ЧМТ) является причиной примерно 2,5 миллионов посещений отделений неотложной помощи и госпитализаций ежегодно и является основной причиной смерти и инвалидности у детей и молодых людей. ЧМТ вызывается внезапной силой, приложенной к голове, и, чтобы лучше понять человеческую ЧМТ и лежащие в ее основе механизмы, необходимы экспериментальные модели травм. Боковая жидкостная перкуссионная травма (LFPI) является широко используемой моделью травмы из-за сходства патологических изменений, обнаруженных при ЧМТ человека, по сравнению с LFPI, включая кровоизлияния, сосудистые нарушения, неврологический дефицит и потерю нейронов. В LFPI используется маятник и заполненный жидкостью цилиндр, последний имеет подвижный поршень на одном конце и соединение замка Луера с жесткой, заполненной жидкостью трубкой на другом конце. Подготовка животного включает в себя выполнение краниэктомии и прикрепление втулки Луера к участку. На следующий день трубка от травматического устройства подключается к ступице Луера на черепе животного, и маятник поднимается на заданную высоту и отпускается. Удар маятника поршнем генерирует импульс давления, который передается на неповрежденную твердую мозговую оболочку животного через трубку и производит экспериментальную ЧМТ. Надлежащий уход и техническое обслуживание необходимы для надежной работы устройства LFPI, поскольку характер и тяжесть травмы могут сильно различаться в зависимости от состояния устройства. Здесь мы продемонстрируем, как правильно очистить, наполнить и собрать устройство LFPI, а также обеспечить его надлежащее обслуживание для достижения оптимальных результатов.
Introduction
Черепно-мозговая травма (ЧМТ) вызывается внезапной силой, приложенной к голове. После первичных травм, полученных в результате физического воздействия, выжившие после ЧМТ обычно испытывают вторичные травмы, включая когнитивный дефицит и неврологические дисфункции, которые связаны с физиологическими реакциями на первоначальную травму1. По оценкам, примерно 69 миллионов человек во всем мире ежегодно страдают от ЧМТ2. Только в Соединенных Штатах ежегодно происходит около 2,5 миллионов посещений отделений неотложной помощи и госпитализаций в связи с ЧМТ, что делает ЧМТ одной из основных причин инвалидности и смерти среди детей и молодых людей3. ЧМТ можно классифицировать как легкую, среднюю или тяжелую, при этом легкая ЧМТ (мЧМТ) составляет примерно 70-90% случаев ЧМТ4. Гистологическая и когнитивная патология ЧМТ может возникнуть в течение нескольких минут или часов после травмы, а последствия ЧМТ могут сохраняться в течение нескольких месяцев или лет после первоначального повреждения5.
Разработка экспериментальных моделей сыграла важную роль в понимании эффектов и основных механизмов ЧМТ. Одна из таких моделей, боковая жидкостная перкуссионная травма (LFPI), обычно используется для оценки ЧМТ in vivo. LFPI тесно воспроизводит патологии, связанные с ЧМТ человека, включая сосудистые нарушения, кровоизлияния, потерю нейронов, воспаление, глиоз и молекулярные нарушения 6,7,8. Метод LFPI используется для разнообразных экспериментальных приложений, включая моделирование детской ЧМТ, а также хронических нейродегенеративных состояний, таких как хроническая травматическая энцефалопатия 9,10. LFPI - это четко определенный и воспроизводимый метод экспериментальной ЧМТ, который позволяет корректировать тяжесть травмы11. Устройство LFPI состоит из нескольких важных компонентов, в том числе: маятника с утяжеленным молотком, поршня, заполненного жидкостью цилиндра, преобразователя давления, цифрового осциллографа и небольшой трубки на конце цилиндра с замком Луэра, который прикрепляется к ступице на черепе животного (рис. 1). LFPI работает, раскачивая маятник в поршень, создавая волну давления через жидкость (дегазированную деионизированную воду или физиологический раствор) в мозг прикрепленного животного; это повышает внутричерепное давление, тем самым воспроизводя механические особенности и биологические изменения ЧМТ12. Кроме того, животные, используемые в экспериментах LFPI, подвергаются краниэктомии, чтобы подвергнуть мозг воздействию давления жидкости устройства.
Плановое техническое обслуживание и мониторинг необходимы для обеспечения точного функционирования устройства LFPI. Следующие методы жизненно важны для предотвращения попадания загрязняющих пузырьков воздуха в устройство. Здесь мы продемонстрируем методы правильной очистки, заполнения и сборки устройства LFPI. Мы также обсудим выходы осциллографа и время выпрямления мыши как способы подтверждения жизнеспособности LFPI.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Очистка цилиндра LFPI
- Осторожно отсоедините шприцы, прикрепленные к корпусу преобразователя и заливному отверстию, а также кабель, подключенный к датчику давления (см. Рисунок 1 для схемы компонентов травмирующего устройства).
- Стараясь не уронить цилиндр, отвинтите ручки на задней панели устройства от зажимов цилиндра, чтобы освободить цилиндр.
- Снимите поршень на конце цилиндра, преобразователь, корпус преобразователя и уплотнительные кольца плунжера.
- Слейте жидкость из цилиндра.
- Добавьте мягкое моющее средство, такое как средство для мытья посуды, в цилиндр и слегка потрите щеткой для посуды или бутылки13.
- Чтобы убедиться, что все моющее средство смыто, полностью заполните цилиндр водой и тщательно промойте.
2. Дегазация жидкости, используемой для заполнения баллона
- Используйте вакуумный насос для дегазации жидкости перед заправкой баллона, чтобы предотвратить образование новых пузырьков и поглотить существующие пузырьки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для заполнения баллона потребуется примерно 1,5 л жидкости, хотя дегазация примерно 2 л оставит небольшой запас для замены любой жидкости, потерянной во время использования и тестирования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Домашние пылесосы слишком слабы, чтобы эффективно дегазировать жидкость. Вакуум должен быть в состоянии создавать давление 25-28 дюймов ртутного столба. - Добавьте в жидкость мешалку и поставьте емкость с жидкостью на мешалку. Перемешивание жидкости в процессе дегазации помогает стимулировать барботирование и выделение газа. Перемешивание также предотвращает резкое увеличение пузырьков.
ПРИМЕЧАНИЕ: Процесс дегазации должен быть завершен, когда образуется очень мало пузырьков; Это происходит примерно через 45 минут.
3. Повторная сборка устройства LFPI
- Нанесите тонкий слой вазелина на поршневой поршень.
- Прикрепите поршневой плунжер так, чтобы плунжер выступал примерно на 32 мм из цилиндра14.
ПРИМЕЧАНИЕ: Воздух часто попадает в плунжер перед ведущим уплотнительным кольцом. Чтобы избавиться от этого лишнего воздуха, поверните поршень, перемещая его внутрь и наружу, чтобы выпустить воздух из этого зазора. - Нанесите тонкий слой вазелина и на другие уплотнительные кольца и прикрепите их к цилиндру, за исключением уплотнительного кольца на заливном отверстии.
- Дважды оберните тефлоновую ленту вокруг нитей датчика.
4. Заправка устройства LFPI и крепление к основанию
- Подсоедините шприц объемом 10 мл, заполненный дегазированной жидкостью и не содержащий пузырьков воздуха, к ступице замка Luer на корпусе преобразователя.
- Держите преобразователь резьбовым концом, направленным вверх, и полностью заполните лунку внутри резьбовой области датчика дегазированной жидкостью с помощью шприца объемом 10 мл. Цель здесь состоит в том, чтобы заполнить датчик хорошо, не вводя пузырьков воздуха. Будьте осторожны, чтобы не повредить деликатную мембрану в нижней части колодца датчика.
- Расположив цилиндр под углом, чтобы предотвратить повторное попадание воздуха в корпус преобразователя, прикрепите корпус преобразователя к цилиндру13 и плотно затяните его с помощью гаечного ключа.
- Снимите крышку с заливного отверстия и цилиндра, как только дегазированная жидкость достигнет примерно 2/3 емкости баллона.
- Поместите баллон горизонтально и завершите заполнение баллона дегазированной жидкостью.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать образования пузырьков воздуха, рекомендуется медленно вливать жидкость14. - Установите на место крышку заливного отверстия и закройте все запорные краны.
- Манипулируйте цилиндром, чтобы пузырьки воздуха направлялись к заливному отверстию14.
- Откройте запорный кран на заливном отверстии и впрысните жидкость с помощью шприца на корпусе преобразователя, чтобы вытеснить пузырьки воздуха из отверстия14.
- Осмотрите все устройство и убедитесь, что на нем нет пузырьков воздуха.
- Добавьте шприц объемом 10 мл, наполненный дегазированной жидкостью, в ступицу замка Luer на крышке заливки.
- Снова прикрепите цилиндр к основанию с помощью ручных винтов.
- Убедитесь, что цилиндр горизонтальный и выровнен с центром утяжеленного молотка на маятнике.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мы проверили влияние загрязнения пузырьков воздуха в устройстве LFPI на формирование формы волны. Мы впрыскивали пузырьки воздуха в устройство и сравнивали выходы осциллографа с данными осциллографа, собранными с незагрязненного устройства LFPI. Условия были следующими: незагрязненный, впрыскивание 5 мл воздуха, впрыскивание 10 мл воздуха и впрыскивание 15 мл воздуха. Мы держали маятник на постоянной высоте для всех ударов для всех условий, и мы выполнили 15 ударов для каждого условия.
При выполнении травмы или тестировании устройства LFPI форма волны давления на осциллографе должна показывать один резкий пик (рис. 2A). Наличие пузырьков воздуха в устройстве приведет к форме волны с несколькими короткими пиками (рис. 2B), указывающим на пузырьки, которые необходимо удалить. После повторной сборки устройства и перед любым сеансом травмы мы также рекомендуем выполнить четыре-пять тестовых капель (без прикрепленной мыши) с маятником, чтобы убедиться, что устройство работает повторно. В дополнение к нарушениям формы волны давления, поведенческие изменения после травмы / фиктивного LFPI также могут свидетельствовать о том, правильно ли функционирует устройство. У травмированных мышей должно быть более длительное время рефлекса выпрямления после LFPI по сравнению с фиктивными мышами, и это время следует контролировать и регистрировать. Слишком большое или слишком короткое время исправления может свидетельствовать о неправильной сборке и/или очисткеустройства 15. Подобные симптомы также могут постепенно появляться в устройстве, которое было должным образом очищено и заполнено (вероятно, из-за медленного накопления пузырьков при обычном использовании), что указывает на то, что пришло время повторить очистку и повторное наполнение. Планирование профилактического обслуживания один раз в 6 месяцев может помочь обеспечить стабильную работу устройства LFPI.
Как видно из таблицы 1, наличие пузырьков воздуха изменяло напряжение формы сигнала по сравнению с полностью заполненным, незагрязненным устройством LFPI. Увеличение размера пузырька воздуха постепенно уменьшало напряжение волны, на что указывали выходы осциллографа.
Рисунок 1: Схема устройства LFPI и латеральной краниэктомии, выполненной до травмы. Это устройство используется для воспроизведения ЧМТ без перелома черепа на животных моделях, вызывая смещение и/или деформацию мозга из-за повышения межчерепного давления. Создано с помощью Biorender.com. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Контроль выходного сигнала преобразователя давления для оценки технического обслуживания и функционального состояния устройства LFPI13. (A) Репрезентативное изображение формы волны давления, полученное надлежащим образом очищенным и функционирующим устройством LFPI. (B) Образец изображения формы волны давления, указывающей на наличие загрязнения пузырьками воздуха. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Репрезентативное изображение выходов осциллографа для всех четырех условий. (A, B, C, D) Выходы осциллографа для незагрязненных, 5 мл впрыска воздуха, 10 мл впрыска воздуха и 15 мл впрыска воздуха соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Состояние загрязнения пузырьками воздуха | |||||
| Заполненное и незагрязненное устройство LFPI | 5 мл общего количества впрыскиваемого воздуха | 10 мл общего количества впрыскиваемого воздуха | 15 мл общего количества впрыскиваемого воздуха | ||
| Выходной сигнал (мВ) | 240 | 218 | 230 | 218 | |
| 234 | 222 | 226 | 220 | ||
| 240 | 228 | 226 | 220 | ||
| 244 | 226 | 228 | 218 | ||
| 246 | 228 | 230 | 218 | ||
| 248 | 232 | 226 | 220 | ||
| 248 | 230 | 226 | 220 | ||
| 250 | 230 | 228 | 220 | ||
| 248 | 232 | 228 | 224 | ||
| 252 | 232 | 228 | 222 | ||
| 250 | 232 | 226 | 220 | ||
| 250 | 230 | 228 | 222 | ||
| 252 | 230 | 228 | 222 | ||
| 252 | 232 | 228 | 220 | ||
| Средняя выходная форма сигнала (мВ) | 246.7 | 228.7 | 227.6 | 220.3 | |
Таблица 1: Выходное напряжение осциллографа из незагрязненной контрольной группы по сравнению с загрязненными условиями. Парные t-критерии были проведены между незагрязненными условиями и каждым загрязненным состоянием. Все загрязненные условия были значительно снижены по сравнению с незагрязненными условиями (p < 0,0001).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Методы, описанные выше, демонстрируют, как правильно обслуживать устройство LFPI. Регулярная очистка и мониторинг необходимы для правильной и надежной работы устройства LFPI. Кроме того, из-за инвазивного характера процедуры LFPI крайне важно, чтобы устройство было тщательно очищено, чтобы предотвратить заражение лабораторных животных.
Предотвращение образования пузырьков воздуха в устройстве имеет решающее значение для получения оптимальных травм и форм волн давления. Пузырьки воздуха изменяют характеристики импульса давления, подаваемого в мозг, вызывая непоследовательные травмы и затрудняя правильное воспроизведение клинических ЧМТ. Дополнительные данные, собранные здесь, показывают, что загрязнение пузырьками воздуха изменяет напряжение волны, создаваемой ударом. Выходы осциллографа, показанные на рисунке 3 , помогают проиллюстрировать влияние воздуха на волны давления; Формы волн не такие резкие и вместо этого имеют несколько пиков при наличии загрязнения воздуха. Целью устройства LFPI является обеспечение единственного измеримого импульса жидкости в мозге; Результаты показывают, что при наличии пузырьков воздуха создается несколько импульсов, что затрудняет различение, какое давление прикладывается к мозгу.
Используемые здесь методы снижают вероятность попадания газов в устройство и/или помогают удалить любые небольшие карманы газа, которые, тем не менее, могут загрязнять жидкость. Использование дегазированной жидкости снижает риск загрязнения пузырьками воздуха и может увеличить интервал технического обслуживания13. Таким образом, действия, выполняемые на шаге 2, имеют решающее значение для снижения вероятности образования пузырьков воздуха в устройстве LFPI. Шаги 3.4-3.9 подчеркивают важность удаления задержавшихся газов в устройстве перед выполнением травм. Примечательно, что после повторной сборки травмирующего устройства видимость как в датчике давления, так и в центре заливного отверстия ограничена; Таким образом, эти области требуют особого внимания при проверке образования пузырьков воздуха после заполнения баллона.
Эта процедура специально адаптирована к устройству LFPI, изготовленному компанией Custom Design & Fabrication Inc. Незначительные изменения в протоколе могут потребоваться при использовании устройств LFPI, произведенных другими компаниями.
Очистка и повторная сборка устройства LFPI требуют времени и внимания, но являются ключом к получению постоянных травм. Избегание пузырьков воздуха особенно важно, так как это может помочь уменьшить ошибочные результаты и ограничить необходимость проведения дополнительных экспериментов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Конфликты интересов не заявлены.
Acknowledgments
Авторы выражают благодарность компании Custom Design & Fabrication Inc. за техническую помощь и поддержку. Эта работа финансировалась грантами Национального института здравоохранения R01NS120099-01A1 и R37HD059288-19.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 - 10 mL syringes with Luer lock capability | Ensures that needle is secure and reduces possible leaks of fluid | ||
| Degassed fluid | Helps to reduce air bubble formation during injury procedure | ||
| Fluid Percussion Injury (FPI) device (Model 01-B) | Custom Designs & Fabrications Inc. | N/A | Injury device used to model TBI in rodents |
| Mild detergent | Allows to thoroughly clean the LFPI cylinder | ||
| Petroleum Jelly | Used as a water-repellent and protects LFPI device form rust | ||
| Teflon tape | Helps with tight seal of pipe joints on the LFPI device | ||
| *Materials other than the LFPI device can be purchased from any reliable company. |
References
- Centers for Disease Control and Prevention. Surveillance Report of Traumatic Brain Injury-related Emergency Department Visits, Hospitalizations, and Deaths. Centers for Disease Control and Prevention, U.S. Department of Health and Human Services. , https://www.cdc.gov/traumaticbraininjury/get_the_facts.html (2014).
- Dewan, M. C. Estimating the global incidence of traumatic brain injury. Journal of Neurosurgery. 130 (4), 1080-1097 (2018).
- National Center for Injury Prevention and Control; Division of Unintentional Injury Prevention. Traumatic Brain Injury in the United States: Epidemiology and Rehabilitation. , Centers for Disease Control and Prevention. Atlanta, GA. (2015).
- Holm, L., Cassidy, J. D., Carroll, L. J., Borg, J. Summary of the WHO Collaborating Centre for neurotrauma task force on mild traumatic brain injury. Journal of Rehabilitation Medicine. 37 (3), 137-141 (2005).
- Pavlovic, D., Pekic, S., Stojanovic, M., Popovic, V. Traumatic brain injury: neuropathological, neurocognitive and neurobehavioral sequelae. Pituitary. 22 (3), 270-282 (2019).
- Dixon, C. E. A fluid percussion model of experimental brain injury in the rat. Journal of Neurosurgery. 67 (1), 110-119 (1987).
- McIntosh, T. K. Traumatic brain injury in the rat: characterization of a lateral fluid-percussion model. Neuroscience. 28 (1), 233-244 (1989).
- Ma, X., Aravind, A., Pfister, B. J., Chandra, N., Haorah, J. Animal models of traumatic brain injury and assessment of injury severity. Molecular Neurobiology. 56 (8), 5332-5345 (2019).
- Nwafor, D. C. Pediatric traumatic brain injury: an update on preclinical models, clinical biomarkers, and the implications of cerebrovascular dysfunction. Journal of Central Nervous System Disease. 14, (2022).
- Turner, R. C. Modeling chronic traumatic encephalopathy: the way forward for future discovery. Frontiers in Neurology. 6, 223 (2015).
- Petersen, A., Soderstrom, M., Saha, B., Sharma, P. Animal models of traumatic brain injury: a review of pathophysiology to biomarkers and treatments. Experimental Brain Research. 239 (10), 2939-2950 (2021).
- Sullivan, H. G. Fluid-percussion model of mechanical brain injury in the cat. Journal of Neurosurgery. 45 (5), 521-534 (1976).
- Fluid Percussion Injury Model 01-B: General Operation. , Custom Design & Fabrication, Inc. Available from: http://www.cdf-products.com/ (2023).
- Fluid Percussion Injury Model 01-B: Assembly Instructions. , Custom Design & Fabrication, Inc. Available from: http://www.cdf-products.com/ (2023).
- Pernici, C. D. Longitudinal optical imaging technique to visualize progressive axonal damage after brain injury in mice reveals responses to different minocycline treatments. Scientific Reports. 10, 7815-78 (2020).
