Summary
Una cura e una manutenzione adeguate sono essenziali affinché un dispositivo per lesioni a percussione fluida laterale (LFPI) funzioni in modo affidabile. Qui, dimostriamo come pulire, riempire e assemblare correttamente un dispositivo LFPI e garantire che sia adeguatamente mantenuto per risultati ottimali.
Abstract
La lesione cerebrale traumatica (TBI) rappresenta circa 2,5 milioni di visite al pronto soccorso e ricoveri ospedalieri ogni anno ed è una delle principali cause di morte e disabilità nei bambini e nei giovani adulti. Il trauma cranico è causato da una forza improvvisa applicata alla testa e, per comprendere meglio il trauma cranico umano e i suoi meccanismi sottostanti, sono necessari modelli sperimentali di lesioni. La lesione da percussione fluida laterale (LFPI) è un modello di lesione comunemente usato a causa delle somiglianze nei cambiamenti patologici riscontrati nel TBI umano rispetto a LFPI, tra cui emorragie, disturbi vascolari, deficit neurologici e perdita di neuroni. LFPI impiega un pendolo e un cilindro riempito di liquido, quest'ultimo con un pistone mobile a un'estremità e una connessione Luer lock a tubi rigidi e pieni di liquido all'altra estremità. La preparazione dell'animale comporta l'esecuzione di una craniectomia e il collegamento di un mozzo Luer sul sito. Il giorno successivo, il tubo del dispositivo di lesione viene collegato al mozzo Luer sul cranio dell'animale e il pendolo viene sollevato ad un'altezza specificata e rilasciato. L'impatto del pendolo con il pistone genera un impulso di pressione che viene trasmesso alla dura madre intatta dell'animale attraverso il tubo e produce il TBI sperimentale. Una cura e una manutenzione adeguate sono essenziali affinché il dispositivo LFPI funzioni in modo affidabile, poiché il carattere e la gravità della lesione possono variare notevolmente a seconda delle condizioni del dispositivo. Qui, dimostriamo come pulire, riempire e assemblare correttamente il dispositivo LFPI e garantire che sia adeguatamente mantenuto per risultati ottimali.
Introduction
La lesione cerebrale traumatica (TBI) è causata da una forza improvvisa applicata alla testa. A seguito di lesioni primarie derivanti dall'impatto fisico, i sopravvissuti al trauma cranico sperimentano comunemente lesioni secondarie, inclusi deficit cognitivi e disfunzioni neurologiche associate a risposte fisiologiche alla lesione iniziale1. Si stima che circa 69 milioni di individui in tutto il mondo soffrano di TBI ogni anno2. Solo negli Stati Uniti, circa 2,5 milioni di visite al pronto soccorso e ricoveri correlati al TBI si verificano ogni anno, rendendo il trauma cranico una delle principali cause di disabilità e morte tra bambini e giovani adulti3. Il TBI può essere classificato come lieve, moderato o grave, con TBI lieve (mTBI) che rappresenta circa il 70% -90% dei casi di TBI4. La patologia istologica e cognitiva TBI può verificarsi entro pochi minuti o ore dalla lesione e gli effetti del TBI possono persistere per mesi o anni dopo il danno iniziale5.
Lo sviluppo di modelli sperimentali è stato determinante per comprendere gli effetti e i meccanismi sottostanti del TBI. Uno di questi modelli, la lesione da percussione fluida laterale (LFPI), è comunemente usato per valutare il trauma cranico in vivo. LFPI riproduce fedelmente le patologie associate al trauma cranico umano, tra cui disturbi vascolari, emorragie, perdita neuronale, infiammazione, gliosi e disturbi molecolari 6,7,8. La tecnica LFPI viene utilizzata per una serie diversificata di applicazioni sperimentali, tra cui la modellazione di TBI pediatrico, nonché condizioni neurodegenerative croniche, come l'encefalopatia traumatica cronica 9,10. LFPI è un metodo ben definito e riproducibile di TBI sperimentale che consente di regolare la gravità della lesione11. Il dispositivo LFPI ha diversi componenti importanti, tra cui: un pendolo con un martello appesantito, un pistone, un cilindro riempito di liquido, un trasduttore di pressione, un oscilloscopio digitale e un piccolo tubo all'estremità del cilindro con un lucchetto Luer che si attacca a un mozzo sul cranio dell'animale (Figura 1). LFPI funziona facendo oscillare il pendolo nel pistone, creando un'onda di pressione attraverso il fluido (acqua deionizzata degassata o soluzione salina) nel cervello dell'animale attaccato; questo aumenta la pressione intracranica, replicando così le caratteristiche meccaniche e i cambiamenti biologici del TBI12. Inoltre, gli animali utilizzati negli esperimenti LFPI subiscono una craniectomia per esporre il cervello all'impatto della pressione del fluido del dispositivo.
La manutenzione ordinaria e il monitoraggio sono necessari per garantire che il dispositivo LFPI funzioni correttamente. I seguenti metodi sono fondamentali per prevenire l'introduzione di bolle d'aria contaminanti nel dispositivo. Qui, dimostriamo i metodi per pulire, riempire e assemblare correttamente il dispositivo LFPI. Discuteremo anche le uscite dell'oscilloscopio e i tempi di raddrizzamento del mouse come modi per confermare la fattibilità dell'LFPI.
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Protocol
1. Pulizia del cilindro LFPI
- Staccare con cautela le siringhe collegate all'alloggiamento del trasduttore e alla porta di riempimento, nonché il cavo collegato al trasduttore di pressione (vedere la Figura 1 per uno schema dei componenti del dispositivo di lesione).
- Facendo attenzione a non far cadere il cilindro, svitare le manopole sul retro del dispositivo dai morsetti del cilindro per liberare il cilindro.
- Rimuovere il pistone all'estremità del cilindro, del trasduttore, dell'alloggiamento del trasduttore e degli O-ring dello stantuffo.
- Drenare il fluido dal cilindro.
- Aggiungere un detergente delicato, come detersivo per piatti, al cilindro e strofinare leggermente con un piatto o una spazzola per bottiglie13.
- Per assicurarsi che tutto il detersivo sia risciacquato, riempire completamente il cilindro con acqua e risciacquare abbondantemente.
2. Degasaggio del fluido utilizzato per riempire la bombola
- Utilizzare una pompa per vuoto per degassare il fluido prima di riempire nuovamente la bombola per evitare la formazione di nuove bolle e assorbire le bolle esistenti.
NOTA: Saranno necessari circa 1,5 L di fluido per riempire la bombola, anche se il degasaggio di circa 2 L lascerà una piccola scorta per sostituire qualsiasi fluido perso durante l'uso e il test.
NOTA: gli aspirapolvere domestici sono troppo deboli per degassare efficacemente il fluido. Il vuoto deve essere in grado di produrre una pressione di 25-28 inHg. - Aggiungere una barra di agitazione al fluido e posizionare il contenitore del fluido su una piastra di agitazione. Mescolare il fluido durante il processo di degasaggio aiuta a stimolare il gorgogliamento e il rilascio di gas. L'agitazione impedisce anche un grande aumento improvviso di gorgogliamento.
NOTA: Il processo di degasaggio dovrebbe terminare quando vengono prodotte pochissime bolle; Ciò si verifica dopo circa 45 minuti.
3. Riassemblaggio del dispositivo LFPI
- Applicare un sottile strato di vaselina allo stantuffo del pistone.
- Fissare lo stantuffo del pistone con lo stantuffo sporgente di circa 32 mm dal cilindro14.
NOTA: l'aria rimane spesso intrappolata nello stantuffo prima dell'O-ring principale. Per eliminare questa aria in eccesso, ruotare lo stantuffo mentre lo si sposta dentro e fuori per far uscire l'aria da questo spazio. - Applicare un sottile strato di vaselina anche agli altri O-ring e collegarli al cilindro, ad eccezione dell'O-ring sulla porta di riempimento.
- Avvolgere il nastro di teflon due volte attorno ai fili del trasduttore.
4. Ricarica del dispositivo LFPI e fissaggio alla base
- Collegare una siringa da 10 mL riempita di fluido degassato e priva di bolle d'aria all'hub Luer lock sull'alloggiamento del trasduttore.
- Tenere il trasduttore con l'estremità filettata rivolta verso l'alto e riempire completamente il pozzetto all'interno della regione filettata del trasduttore con il fluido degassato usando una siringa da 10 ml. L'obiettivo qui è quello di riempire bene il trasduttore senza introdurre bolle d'aria. Fare attenzione a non danneggiare la delicata membrana sul fondo del pozzo del trasduttore.
- Con il cilindro posizionato ad angolo per impedire all'aria di rientrare nell'alloggiamento del trasduttore, collegare l'alloggiamento del trasduttore al cilindro13 e utilizzare una chiave per serrarlo saldamente.
- Rimuovere il tappo dalla porta di riempimento e dal cilindro una volta che il fluido degassato raggiunge circa 2/3 della capacità del cilindro.
- Posizionare il cilindro orizzontalmente e terminare di riempire il cilindro con fluido degassato.
NOTA: Per evitare la formazione di bolle d'aria, si consiglia di versare lentamente il fluido14. - Riposizionare il tappo nella porta di riempimento e chiudere tutti i rubinetti di arresto.
- Manipolare il cilindro per far funzionare eventuali bolle d'aria sulla porta di riempimento14.
- Aprire il rubinetto di arresto sulla porta di riempimento e iniettare fluido utilizzando la siringa sull'alloggiamento del trasduttore per forzare eventuali bolle d'aria fuori dalla porta14.
- Ispezionare l'intero dispositivo e assicurarsi che non ci siano bolle d'aria.
- Aggiungere una siringa da 10 mL riempita con fluido degassato al mozzo Luer lock sul tappo di riempimento.
- Riattaccare il cilindro alla base usando le viti a mano.
- Assicurarsi che il cilindro sia orizzontale e allineato con il centro del martello appesantito sul pendolo.
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Representative Results
Abbiamo testato gli effetti della contaminazione da bolle d'aria in un dispositivo LFPI sulla formazione della forma d'onda. Abbiamo iniettato bolle d'aria nel dispositivo e confrontato le uscite dell'oscilloscopio con i dati dell'oscilloscopio raccolti da un dispositivo LFPI non contaminato. Le condizioni erano le seguenti: non contaminato, iniezione di 5 ml di aria, iniezione di 10 ml di aria e iniezione di 15 ml di aria. Abbiamo mantenuto il pendolo ad un'altezza costante per tutti gli impatti per tutte le condizioni e abbiamo eseguito 15 impatti per condizione.
Quando si esegue un infortunio o si testa il dispositivo LFPI, la forma d'onda della pressione sull'oscilloscopio dovrebbe mostrare un singolo picco acuto (Figura 2A). La presenza di bolle d'aria nel dispositivo si tradurrà in una forma d'onda con diversi picchi brevi (Figura 2B), indicando bolle che devono essere rimosse. Dopo aver riassemblato il dispositivo e prima di qualsiasi sessione di infortunio, si consiglia inoltre di eseguire da quattro a cinque test drop (senza mouse collegato) con il pendolo per garantire che il dispositivo funzioni ripetutamente. Oltre alle irregolarità nella forma d'onda della pressione, i cambiamenti comportamentali dopo lesioni / finzione LFPI possono anche essere indicativi del corretto funzionamento del dispositivo. I topi feriti dovrebbero avere tempi di riflesso di raddrizzamento prolungati dopo LFPI rispetto ai topi finti, e questi tempi dovrebbero essere monitorati e registrati. Tempi di raddrizzamento troppo lunghi o troppo brevi possono essere un'indicazione di assemblaggio e/o pulizia impropri del dispositivo15. Sintomi simili possono anche apparire gradualmente in un dispositivo che è stato adeguatamente pulito e riempito (probabilmente a causa del lento accumulo di bolle durante l'uso di routine), indicando che è il momento di ripetere la pulizia e il riempimento. La pianificazione della manutenzione preventiva una volta ogni 6 mesi può aiutare a garantire prestazioni costanti del dispositivo LFPI.
Come si vede nella Tabella 1, la presenza di bolle d'aria ha cambiato la tensione della forma d'onda rispetto a un dispositivo LFPI completamente riempito e non contaminato. Aumentando la dimensione della bolla d'aria si è gradualmente diminuita la tensione dell'onda, come indicato dalle uscite dell'oscilloscopio.
Figura 1: Schema del dispositivo LFPI e craniectomia laterale eseguita prima della lesione. Questo dispositivo viene utilizzato per riprodurre TBI senza frattura del cranio in modelli animali causando spostamento e / o deformazione del cervello a causa di un aumento della pressione intercranica. Creato con Biorender.com. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Monitoraggio dell'uscita del trasduttore di pressione per valutare la manutenzione del dispositivo LFPI e lo stato funzionale13. (A) Immagine rappresentativa della forma d'onda della pressione prodotta da un dispositivo LFPI correttamente pulito e funzionante. (B) Immagine campione di una forma d'onda di pressione che indica la presenza di contaminazione da bolle d'aria. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Immagine rappresentativa delle uscite dell'oscilloscopio per tutte e quattro le condizioni. (A,B,C,D) Le uscite dell'oscilloscopio per i non contaminati, 5 mL di iniezione d'aria, 10 mL di iniezione d'aria e 15 mL di iniezione d'aria, rispettivamente. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
| Condizioni di contaminazione da bolle d'aria | |||||
| Dispositivo LFPI riempito e non contaminato | 5 ml di aria totale iniettata | 10 ml di aria totale iniettata | 15 ml di aria totale iniettata | ||
| Uscita forma d'onda (mV) | 240 | 218 | 230 | 218 | |
| 234 | 222 | 226 | 220 | ||
| 240 | 228 | 226 | 220 | ||
| 244 | 226 | 228 | 218 | ||
| 246 | 228 | 230 | 218 | ||
| 248 | 232 | 226 | 220 | ||
| 248 | 230 | 226 | 220 | ||
| 250 | 230 | 228 | 220 | ||
| 248 | 232 | 228 | 224 | ||
| 252 | 232 | 228 | 222 | ||
| 250 | 232 | 226 | 220 | ||
| 250 | 230 | 228 | 222 | ||
| 252 | 230 | 228 | 222 | ||
| 252 | 232 | 228 | 220 | ||
| Uscita media della forma d'onda (mV) | 246.7 | 228.7 | 227.6 | 220.3 | |
Tabella 1: Uscite di tensione dell'oscilloscopio dal gruppo di controllo non contaminato rispetto alle condizioni contaminate. Sono stati eseguiti test t accoppiati tra le condizioni non contaminate e ciascuna condizione contaminata. Tutte le condizioni contaminate sono state significativamente ridotte rispetto alle condizioni non contaminate (p < 0,0001).
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Discussion
Le tecniche descritte sopra dimostrano come mantenere correttamente un dispositivo LFPI. La pulizia e il monitoraggio di routine sono necessari per mantenere il dispositivo LFPI funzionante correttamente e in modo affidabile. Inoltre, a causa della natura invasiva della procedura LFPI, è imperativo che il dispositivo venga pulito accuratamente per prevenire l'infezione degli animali da laboratorio.
Evitare la formazione di bolle d'aria nel dispositivo è fondamentale per ottenere lesioni ottimali e forme d'onda di pressione. Le bolle d'aria alterano le caratteristiche dell'impulso di pressione erogato al cervello, causando lesioni incoerenti e rendendo difficile riprodurre correttamente i TBI clinici. I dati supplementari qui raccolti mostrano che la contaminazione da bolle d'aria altera la tensione dell'onda prodotta da un impatto. Le uscite dell'oscilloscopio mostrate in Figura 3 aiutano a illustrare gli effetti dell'aria sulle onde di pressione; Le forme d'onda non sono così nitide e invece hanno picchi multipli quando è presente la contaminazione dell'aria. L'obiettivo del dispositivo LFPI è quello di fornire un singolo impulso fluido misurabile al cervello; I risultati suggeriscono che quando sono presenti bolle d'aria, vengono creati impulsi multipli, rendendo difficile discernere quale pressione viene applicata al cervello.
Le tecniche qui impiegate riducono la probabilità che i gas vengano introdotti nel dispositivo e / o aiutano a rimuovere eventuali piccole sacche di gas che potrebbero tuttavia contaminare il fluido. L'uso di fluido degassato riduce il rischio di contaminazione da bolle d'aria e può prolungare l'intervallo di manutenzione13. Pertanto, le azioni eseguite nella fase 2 sono fondamentali per ridurre la possibilità di formazione di bolle d'aria nel dispositivo LFPI. I passaggi 3.4-3.9 evidenziano l'importanza di rimuovere i gas persistenti nel dispositivo prima di eseguire lesioni. È interessante notare che, dopo aver riassemblato il dispositivo di lesione, la visibilità sia nel trasduttore di pressione che al centro della porta di riempimento è limitata; Pertanto, queste aree richiedono particolare attenzione quando si verifica la formazione di bolle d'aria dopo aver riempito il cilindro.
Questa procedura è specificamente adattata al dispositivo LFPI realizzato da Custom Design & Fabrication Inc. Potrebbero essere necessarie piccole modifiche al protocollo quando si utilizzano dispositivi LFPI prodotti da altre società.
La pulizia e il rimontaggio di un dispositivo LFPI richiedono tempo e attenzione, ma sono fondamentali per produrre lesioni costanti. Evitare le bolle d'aria è particolarmente importante, in quanto può aiutare a ridurre i risultati difettosi e limitare la necessità di eseguire ulteriori esperimenti.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarato.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare Custom Design & Fabrication Inc. per la loro assistenza tecnica e supporto. Questo lavoro è stato finanziato dalle sovvenzioni del National Institutes of Health R01NS120099-01A1 e R37HD059288-19.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 - 10 mL syringes with Luer lock capability | Ensures that needle is secure and reduces possible leaks of fluid | ||
| Degassed fluid | Helps to reduce air bubble formation during injury procedure | ||
| Fluid Percussion Injury (FPI) device (Model 01-B) | Custom Designs & Fabrications Inc. | N/A | Injury device used to model TBI in rodents |
| Mild detergent | Allows to thoroughly clean the LFPI cylinder | ||
| Petroleum Jelly | Used as a water-repellent and protects LFPI device form rust | ||
| Teflon tape | Helps with tight seal of pipe joints on the LFPI device | ||
| *Materials other than the LFPI device can be purchased from any reliable company. |
References
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