Summary
LFPI(Lateral Fluid Percussion Injury) 장치가 안정적으로 작동하려면 적절한 관리와 유지 관리가 필수적입니다. 여기에서는 LFPI 장치를 적절하게 청소, 충전 및 조립하는 방법과 최적의 결과를 위해 적절하게 유지 관리되는지 확인하는 방법을 보여줍니다.
Abstract
외상성 뇌 손상(TBI)은 매년 약 250만 건의 응급실 방문 및 입원을 차지하며 어린이와 청소년의 사망 및 장애의 주요 원인입니다. TBI는 머리에 가해지는 갑작스런 힘에 의해 발생하며 인간 TBI와 그 기본 메커니즘을 더 잘 이해하려면 실험적 부상 모델이 필요합니다. LFPI(Lateral Fluid Percussion Injury)는 출혈, 혈관 파괴, 신경학적 결손 및 뉴런 손실을 포함하여 LFPI와 비교하여 인간 TBI에서 발견되는 병리학적 변화의 유사성으로 인해 일반적으로 사용되는 손상 모델입니다. LFPI는 진자와 유체로 채워진 실린더를 사용하며, 후자는 한쪽 끝에 움직일 수 있는 피스톤이 있고 다른 쪽 끝에는 뻣뻣하고 유체가 채워진 튜브에 루어 잠금 연결이 있습니다. 동물의 준비에는 두개골 절제술을 수행하고 부위에 Luer 허브를 부착하는 것이 포함됩니다. 다음날, 부상 장치의 튜브가 동물의 두개골에있는 루어 허브에 연결되고 진자가 지정된 높이로 올라 갔다가 풀립니다. 진자와 피스톤의 충격은 압력 펄스를 생성하며, 이는 튜브를 통해 동물의 손상되지 않은 경막으로 전달되어 실험용 TBI를 생성합니다. 부상의 특성과 심각도는 장치의 상태에 따라 크게 다를 수 있으므로 LFPI 장치가 안정적으로 작동하려면 적절한 관리와 유지 관리가 필수적입니다. 여기에서는 LFPI 장치를 적절하게 청소, 충전 및 조립하는 방법과 최적의 결과를 위해 적절하게 유지 관리되는지 확인하는 방법을 보여줍니다.
Introduction
외상성 뇌 손상(TBI)은 머리에 가해지는 갑작스러운 힘으로 인해 발생합니다. 신체적 충격으로 인한 1차 부상 후, TBI 생존자는 일반적으로 초기 손상에 대한 생리적 반응과 관련된 인지 장애 및 신경학적 기능 장애를 포함한 2차 손상을 경험합니다1. 전 세계적으로 매년 약 6,900만 명이 TBI를 앓고 있는 것으로 추정된다 2. 미국에서만 매년 약 250만 건의 TBI 관련 응급실 방문 및 입원이 발생하며, TBI는 어린이와 청소년의 장애 및 사망의 주요 원인 중 하나입니다3. TBI는 경증, 중등도 또는 중증으로 분류할 수 있으며, 경증 TBI(mTBI)는 TBI 사례의 약 70%-90%를 차지한다4. 조직학적 및 인지적 TBI 병리는 손상 후 몇 분에서 몇 시간 이내에 발생할 수 있으며, TBI의 영향은 초기 손상 후 수개월에서 수년 동안 지속될 수 있다5.
실험 모델의 개발은 TBI의 효과와 기본 메커니즘을 이해하는 데 중요한 역할을 했습니다. 이러한 모델 중 하나인 LFPI(Lateral Fluid Percussion Injury)는 일반적으로 생체 내에서 TBI를 평가하는 데 사용됩니다. LFPI는 혈관 파괴, 출혈, 신경 세포 손실, 염증, 신경 교증 및 분자 교란을 포함하여 인간 TBI와 관련된 병리를 밀접하게 재현합니다 6,7,8. LFPI 기술은 만성 외상성 뇌병증과 같은 만성 신경퇴행성 질환뿐만 아니라 소아 TBI 모델링을 포함한 다양한 실험 응용 분야에 사용됩니다 9,10. LFPI는 부상의 중증도를 조절할 수 있는 실험 TBI의 잘 정의되고 재현 가능한 방법이다11. LFPI 장치에는 가중 해머가 있는 진자, 피스톤, 유체로 채워진 실린더, 압력 변환기, 디지털 오실로스코프, 동물의 두개골에 있는 허브에 부착되는 루어 잠금 장치가 있는 실린더 끝에 있는 작은 튜브 등 몇 가지 중요한 구성 요소가 있습니다(그림 1). LFPI는 진자를 피스톤으로 휘두르며 유체(탈기된 탈이온수 또는 식염수)를 통해 부착된 동물의 뇌로 압력파를 생성합니다. 이것은 두개내압을 증가시켜 TBI12의 기계적 특징과 생물학적 변화를 복제합니다. 또한 LFPI 실험에 사용된 동물은 장치의 유체 압력의 영향에 뇌를 노출시키기 위해 두개골 절제술을 받습니다.
LFPI 장치가 정확하게 작동하는지 확인하려면 일상적인 유지 관리 및 모니터링이 필요합니다. 다음 방법은 오염된 기포가 장치에 유입되는 것을 방지하는 데 중요합니다. 여기에서는 LFPI 장치를 적절하게 청소, 채우기 및 조립하는 방법을 보여줍니다. 또한 LFPI의 실행 가능성을 확인하는 방법으로 오실로스코프 출력과 마우스 오른쪽 조정 시간에 대해서도 논의할 것입니다.
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Protocol
1. LFPI 실린더 청소
- 트랜스듀서 하우징과 충전 포트에 부착된 주사기와 압력 트랜스듀서에 연결된 케이블을 조심스럽게 분리합니다(부상 장치 구성 요소의 개략도는 그림 1 참조).
- 실린더를 떨어뜨리지 않도록 주의하면서 실린더 cl에서 장치 뒷면의 손잡이를 풉니다.amps를 눌러 실린더를 분리합니다.
- 실린더 끝에서 피스톤, 변환기, 변환기 하우징 및 플런저 O-링을 제거합니다.
- 실린더에서 유체를 배출하십시오.
- 식기 세척 세제와 같은 중성 세제를 실린더에 넣고 접시나 병 브러시13을 사용하여 가볍게 문지릅니다.
- 모든 세제를 헹구려면 실린더에 물을 완전히 채우고 철저히 헹굽니다.
2. 실린더를 채우는 데 사용되는 유체의 가스 제거
- 실린더를 다시 채우기 전에 진공 펌프를 사용하여 유체의 가스를 제거하여 새로운 기포의 형성을 방지하고 기존 기포를 흡수하십시오.
알림: 실린더를 채우려면 약 1.5L의 유체가 필요하지만 약 2L의 가스를 제거하면 사용 및 테스트 중에 손실된 유체를 교체하기 위한 소량의 공급이 남게 됩니다.
알림: 집 진공 청소기는 너무 약해서 유체의 가스를 효과적으로 제거할 수 없습니다. 진공은 25-28inHg의 압력을 생성할 수 있어야 합니다. - 유체에 교반 막대를 추가하고 유체 용기를 교반 플레이트에 놓습니다. 탈기 과정에서 유체를 교반하면 버블링과 가스 방출을 자극하는 데 도움이 됩니다. 교반은 또한 기포의 갑작스런 증가를 방지합니다.
알림: 기포가 거의 생성되지 않을 때 탈기 과정이 끝나야 합니다. 이것은 약 45분 후에 발생합니다.
3. LFPI 장치의 재조립
- 피스톤 플런저에 바셀린을 얇게 바르십시오.
- 실린더32에서 약 14mm 돌출된 플런저로 피스톤 플런저를 부착합니다.
알림: 공기는 앞쪽 O-링 앞의 플런저에 자주 갇힙니다. 이 과도한 공기를 제거하려면 플런저를 안팎으로 움직이면서 비틀어 이 틈에서 공기를 빼내십시오. - 다른 O-링에도 바셀린을 얇게 바르고 충전 포트의 O-링을 제외하고 실린더에 부착합니다.
- 테프론 테이프를 변환기의 나사산 주위에 두 번 감습니다.
4. LFPI 장치 리필 및 베이스에 부착
- 가스가 제거되고 기포가 없는 10mL 주사기를 변환기 하우징의 Luer 잠금 허브에 연결합니다.
- 나사산 끝이 위쪽을 향하도록 변환기를 잡고 10mL 주사기를 사용하여 탈기된 유체로 변환기의 나사산 영역 내부의 웰을 완전히 채웁니다. 여기서 목표는 기포가 유입되지 않고 변환기를 잘 채우는 것입니다. 변환기 웰 하단의 섬세한 멤브레인이 손상되지 않도록 주의하십시오.
- 공기가 변환기 하우징으로 다시 들어가는 것을 방지하기 위해 실린더를 비스듬히 배치한 상태에서 변환기 하우징을 실린더(13 )에 부착하고 렌치를 사용하여 꼭 맞게 조입니다.
- 탈기된 유체가 실린더 용량의 약 2/3에 도달하면 충전 포트와 실린더에서 캡을 제거합니다.
- 실린더를 수평으로 놓고 실린더에 탈기된 유체를 채우는 작업을 마칩니다.
알림: 기포가 형성되지 않도록 유체를 천천히 붓는 것이 좋습니다14. - 주입 포트의 캡을 교체하고 모든 스톱콕을 닫습니다.
- 실린더를 조작하여 충전 포트(14)에 기포가 흐르도록 합니다.
- 충전 포트의 마개를 열고 변환기 하우징의 주사기를 사용하여 유체를 주입하여 포트14에서 기포를 강제로 빼냅니다.
- 전체 장치를 검사하고 기포가 없는지 확인하십시오.
- 탈기된 유체로 채워진 10mL 주사기를 충전 캡의 Luer 잠금 허브에 추가합니다.
- 손 나사를 사용하여 실린더를 베이스에 다시 부착합니다.
- 실린더가 수평이고 진자에 있는 가중 해머의 중심과 일직선이 되도록 합니다.
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Representative Results
우리는 LFPI 장치의 기포 오염이 파형 형성에 미치는 영향을 테스트했습니다. 장치에 기포를 주입하고 오실로스코프 출력을 오염되지 않은 LFPI 장치에서 수집한 오실로스코프 데이터와 비교했습니다. 조건은 다음과 같았다: 비오염, 공기 5 mL 주입, 공기 10 mL 주입, 공기 15 mL 주입. 우리는 모든 조건의 모든 충격에 대해 진자를 일정한 높이로 유지하고 조건당 15번의 충격을 수행했습니다.
손상을 수행하거나 LFPI 장치를 테스트할 때 오실로스코프의 압력 파형은 하나의 날카로운 피크를 보여야 합니다(그림 2A). 장치에 기포가 있으면 여러 개의 짧은 피크가 있는 파형이 생성되며(그림 2B), 이는 제거해야 하는 기포를 나타냅니다. 장치를 재조립한 후 부상 세션 전에 진자로 4-5번의 테스트 드롭(마우스를 부착하지 않음)을 수행하여 장치가 반복적으로 작동하는지 확인하는 것이 좋습니다. 압력 파형의 불규칙성 외에도 부상/가짜 LFPI 후 행동 변화는 장치가 제대로 작동하는지 여부를 나타낼 수도 있습니다. 부상당한 마우스는 가짜 마우스에 비해 LFPI 후 교정 반사 시간이 길어져야 하며 이 시간을 모니터링하고 기록해야 합니다. 너무 길거나 너무 짧은 정정 시간은 부적절한 장치 조립 및/또는 청소를 나타낼 수 있습니다(15). 적절하게 청소하고 채운 장치에서도 유사한 증상이 점진적으로 나타날 수 있으며(일상적인 사용 중에 기포가 천천히 축적되기 때문일 수 있음) 청소 및 리필을 반복해야 함을 나타냅니다. 6개월에 한 번씩 예방 유지보수를 예약하면 LFPI 장치의 일관된 성능을 보장하는 데 도움이 될 수 있습니다.
표 1에서 볼 수 있듯이 기포의 존재는 완전히 채워진 오염되지 않은 LFPI 장치와 비교할 때 파형의 전압을 변화시켰습니다. 기포의 크기를 늘리면 오실로스코프 출력에 표시된 것처럼 파동의 전압이 점차 감소합니다.
그림 1: 부상 전에 수행된 LFPI 장치 및 측면 두개골 절제술의 개략도. 이 장치는 두개간 압력의 증가로 인해 뇌의 변위 및/또는 변형을 일으켜 동물 모델에서 두개골 골절 없이 TBI를 재생하는 데 사용됩니다. Biorender.com 로 제작되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: LFPI 장치 유지보수 및 기능 상태를 평가하기 위한 압력 트랜스듀서 출력 모니터링13. (A) 적절하게 청소되고 작동하는 LFPI 장치에 의해 생성된 압력 파형의 대표 이미지. (B) 기포 오염의 존재를 나타내는 압력 파형의 샘플 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 네 가지 조건 모두에 대한 오실로스코프 출력의 대표 이미지. (A,B,C,D) 오실로스코프는 오염되지 않은 공기 주입, 각각 5mL의 공기 주입, 10mL의 공기 주입 및 15mL의 공기 주입을 출력합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 기포 오염 조건 | |||||
| 충전 및 비오염 LFPI 장치 | 총 공기 주입 5mL | 총 공기 주입 10mL | 총 공기 주입 15mL | ||
| 파형 출력(mV) | 240 | 218 | 230 | 218 | |
| 234 | 222 | 226 | 220 | ||
| 240 | 228 | 226 | 220 | ||
| 244 | 226 | 228 | 218 | ||
| 246 | 228 | 230 | 218 | ||
| 248 | 232 | 226 | 220 | ||
| 248 | 230 | 226 | 220 | ||
| 250 | 230 | 228 | 220 | ||
| 248 | 232 | 228 | 224 | ||
| 252 | 232 | 228 | 222 | ||
| 250 | 232 | 226 | 220 | ||
| 250 | 230 | 228 | 222 | ||
| 252 | 230 | 228 | 222 | ||
| 252 | 232 | 228 | 220 | ||
| 평균 파형 출력(mV) | 246.7 | 228.7 | 227.6 | 220.3 | |
표 1: 오염된 조건과 비교한 오염되지 않은 대조군의 오실로스코프 전압 출력. 오염되지 않은 조건과 각 오염 조건 사이에서 쌍체 t-검정을 수행했습니다. 모든 오염 조건은 오염되지 않은 조건과 비교하였을 때 유의하게 감소하였다(p < 0.0001).
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Discussion
위에서 설명한 기술은 LFPI 디바이스를 올바르게 유지 관리하는 방법을 보여줍니다. LFPI 장치가 정확하고 안정적으로 작동하도록 하려면 일상적인 청소 및 모니터링이 필요합니다. 또한 LFPI 절차의 침습적 특성으로 인해 실험실 동물의 감염을 방지하기 위해 장치를 철저히 세척해야 합니다.
장치에 기포가 형성되는 것을 방지하는 것은 최적의 부상 및 압력 파형을 얻는 데 중요합니다. 기포는 뇌에 전달되는 압력 펄스의 특성을 변경하여 일관되지 않은 부상을 유발하고 임상 TBI를 적절하게 재현하기 어렵게 만듭니다. 여기에 수집된 추가 데이터는 기포 오염이 충격에 의해 생성된 파동의 전압을 변경한다는 것을 보여줍니다. 그림 3 에 표시된 오실로스코프 출력은 압력파에 대한 공기의 영향을 설명하는 데 도움이 됩니다. 파형은 날카롭지 않고 대신 대기 오염이 있을 때 여러 피크가 있습니다. LFPI 장치의 목표는 뇌에 측정 가능한 단일 유체 펄스를 제공하는 것입니다. 결과는 기포가 존재할 때 여러 펄스가 생성되어 뇌에 어떤 압력이 가해지고 있는지 식별하기 어렵다는 것을 시사합니다.
여기에 사용된 기술은 가스가 장치에 유입될 가능성을 줄이거나 그럼에도 불구하고 유체를 오염시킬 수 있는 작은 가스 주머니를 제거하는 데 도움이 됩니다. 탈기된 유체를 사용하면 기포 오염 위험이 줄어들고 유지보수 간격이 연장될 수 있습니다13. 따라서 2단계에서 수행되는 작업은 LFPI 장치에서 기포 형성 가능성을 줄이는 데 중요합니다. 3.4-3.9단계는 부상을 입기 전에 장치에 남아 있는 가스를 제거하는 것의 중요성을 강조합니다. 부상 장치를 재조립한 후 압력 변환기와 충전 포트 중앙의 가시성이 제한된다는 점은 주목할 만합니다. 따라서 이러한 영역은 실린더를 채운 후 기포 형성을 확인할 때 특별한 주의가 필요합니다.
이 절차는 Custom Design & Fabrication Inc.에서 만든 LFPI 장치에 맞게 특별히 조정되었습니다. 다른 회사에서 제조한 LFPI 장치를 사용할 때 프로토콜에 대한 사소한 변경이 필요할 수 있습니다.
LFPI 장치를 청소하고 재조립하려면 시간과 주의가 필요하지만 지속적인 부상을 유발하는 데 중요합니다. 기포를 피하는 것은 잘못된 결과를 줄이고 추가 실험을 수행할 필요성을 제한하는 데 도움이 될 수 있으므로 특히 중요합니다.
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Disclosures
이해 상충이 선언되지 않았습니다.
Acknowledgments
저자는 기술 지원과 지원을 해주신 Custom Design & Fabrication Inc.에 감사드립니다. 이 작업은 국립 보건원 (National Institutes of Health)의 보조금 R01NS120099-01A1 및 R37HD059288-19의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 - 10 mL syringes with Luer lock capability | Ensures that needle is secure and reduces possible leaks of fluid | ||
| Degassed fluid | Helps to reduce air bubble formation during injury procedure | ||
| Fluid Percussion Injury (FPI) device (Model 01-B) | Custom Designs & Fabrications Inc. | N/A | Injury device used to model TBI in rodents |
| Mild detergent | Allows to thoroughly clean the LFPI cylinder | ||
| Petroleum Jelly | Used as a water-repellent and protects LFPI device form rust | ||
| Teflon tape | Helps with tight seal of pipe joints on the LFPI device | ||
| *Materials other than the LFPI device can be purchased from any reliable company. |
References
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