Summary
側流性パーカッション損傷(LFPI)デバイスが確実に機能するためには、適切なケアとメンテナンスが不可欠です。ここでは、LFPIデバイスを適切に洗浄、充填、組み立て、および最適な結果を得るために適切に維持する方法を示します。
Abstract
外傷性脳損傷(TBI)は、年間約250万件の緊急治療室への訪問と入院を占めており、子供と若年成人の死と障害の主な原因です。TBIは頭部に突然の力が加わったことによって引き起こされ、ヒトのTBIとその根底にあるメカニズムをよりよく理解するためには、実験的な損傷モデルが必要です。側液パーカッション損傷(LFPI)は、出血、血管破壊、神経学的欠損、ニューロン喪失など、LFPIと比較してヒトTBIに見られる病理学的変化が類似しているため、一般的に使用される損傷モデルです。LFPIは振り子と流体充填シリンダーを採用しており、後者は一方の端に可動ピストンを持ち、もう一方の端に剛性のある流体充填チューブへのルアーロック接続を備えています。動物の準備には、頭蓋切除術を行い、その部位にルアーハブを取り付けることが含まれます。翌日、損傷装置からのチューブが動物の頭蓋骨のルアーハブに接続され、振り子が指定された高さまで持ち上げられて解放されます。振り子とピストンの衝撃は、チューブ を介して 動物の無傷の硬膜に伝達される圧力パルスを生成し、実験的なTBIを生成します。怪我の特徴と重症度はデバイスの状態によって大きく異なる可能性があるため、LFPIデバイスが確実に機能するためには、適切なケアとメンテナンスが不可欠です。ここでは、LFPIデバイスを適切にクリーニング、充填、および組み立てる方法を示し、最適な結果を得るために適切に維持されるようにします。
Introduction
外傷性脳損傷(TBI)は、頭に突然の力が加えられることによって引き起こされます。身体的衝撃に起因する一次損傷に続いて、TBI生存者は一般的に、最初の損傷に対する生理学的反応に関連する認知障害や神経学的機能障害を含む二次損傷を経験します1。世界中で年間約6,900万人がTBIに苦しんでいると推定されています2。米国だけでも、毎年約250万件のTBI関連の緊急治療室への訪問と入院が発生しており、TBIは子供と若年成人の障害と死亡の主な原因の1つになっています3。TBIは軽度、中等度、または重度に分類でき、軽度のTBI(mTBI)がTBI症例の約70%〜90%を占めています4。組織学的および認知的TBIの病理は、損傷から数分から数時間以内に発生する可能性があり、TBIの影響は最初の損傷後数か月から数年持続する可能性があります5。
実験モデルの開発は、TBIの効果とその根底にあるメカニズムを理解するのに役立ちました。そのようなモデルの1つである側液パーカッション損傷(LFPI)は、in vivoでTBIを評価するために一般的に使用されます。LFPIは、血管破壊、出血、ニューロン喪失、炎症、神経膠症、分子障害など、ヒトTBIに関連する病状を厳密に再現します6,7,8。LFPI技術は、小児TBIや慢性外傷性脳症などの慢性神経変性状態のモデリングなど、さまざまな実験アプリケーションに使用されます9,10。LFPIは、損傷の重症度を調整することを可能にする実験的TBIの明確に定義された再現可能な方法です11。LFPIデバイスには、加重ハンマー付き振り子、ピストン、流体充填シリンダー、圧力トランスデューサー、デジタルオシロスコープ、動物の頭蓋骨のハブに取り付けるルアーロック付きのシリンダーの端にある小さなチューブなど、いくつかの重要なコンポーネントがあります(図1)。LFPIは、振り子をピストンに振り、液体(脱気された脱イオン水または生理食塩水)を介して付着した動物の脳に圧力の波を発生させることによって機能します。これにより頭蓋内圧が上昇し、TBI12の機械的特徴と生物学的変化が再現されます。さらに、LFPI実験で使用される動物は、脳を装置の流体圧力の影響にさらすために頭蓋切除術を受ける。
LFPIデバイスが正確に機能していることを確認するには、定期的なメンテナンスと監視が必要です。次の方法は、デバイスへの汚染気泡の導入を防ぐために不可欠です。ここでは、LFPIデバイスを適切に洗浄、充填、および組み立てる方法を示します。また、LFPIの実行可能性を確認する方法として、オシロスコープの出力とマウスの右設定時間についても説明します。
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Protocol
1.LFPIシリンダーのクリーニング
- トランスデューサハウジングと充填ポートに取り付けられているシリンジ、および圧力トランスデューサに接続されているケーブルを慎重に取り外します(損傷装置コンポーネントの概略図については 、図1 を参照してください)。
- シリンダーを落とさないように注意しながら、デバイスの背面にあるハンドノブをシリンダーclから緩めますamp シリンダーを解放します。
- シリンダー、トランスデューサー、トランスデューサーハウジング、プランジャーOリングの端にあるピストンを取り外します。
- シリンダーから液体を排出します。
- 食器用洗剤などの中性洗剤をシリンダーに加え、食器用またはボトルブラシ13を使用して軽くこすります。
- すべての洗剤を確実に洗い流すには、シリンダーを完全に水で満たし、完全にすすいでください。
2.シリンダーの充填に使用される液体の脱気
- シリンダーを補充する前に真空ポンプを使用して液体を脱気し、新しい気泡の形成を防ぎ、既存の気泡を吸収します。
注意: シリンダーを満たすには約1.5Lの液体が必要ですが、約2 Lの脱気により、使用およびテスト中に失われた液体を交換するための少量の供給が残ります。
注意: 家の掃除機は弱すぎて、液体を効果的に脱気することはできません。真空は25-28 inHgの圧力を作り出すことができなければなりません。 - 流体に攪拌子を追加し、流体容器を攪拌プレートに置きます。脱気プロセス中に流体を攪拌すると、バブリングとガスの放出を刺激するのに役立ちます。攪拌はまた、泡立ちの大幅な急激な増加を防ぎます。
注意: 気泡がほとんど発生していないときに脱気プロセスが終了する必要があります。これは約45分後に発生します。
3. LFPIデバイスの再組み立て
- ピストンプランジャーにワセリンの薄層を適用します。
- シリンダ14から約32mm突出したプランジャでピストンプランジャを取り付ける。
注意: 空気は、先頭のOリングの前のプランジャーに頻繁に閉じ込められます。この余分な空気を取り除くには、プランジャーを出し入れしながらひねって、この隙間から空気を取り除きます。 - ワセリンの薄層を他のOリングにも塗布し、充填ポートのOリングを除いてシリンダーに取り付けます。
- テフロンテープをトランスデューサーのネジ山に2回巻き付けます。
4.LFPIデバイスとベースへのアタッチメントを補充します
- 気泡のない脱気液で満たされた10 mLシリンジを、トランスデューサーハウジングのルアーロックハブに接続します。
- ねじの端を上に向けて探触子を持ち、10 mLシリンジを使用して、探触子のねじ領域内のウェルに脱気液を完全に満たします。ここでの目標は、気泡を導入せずに探触子を十分に充填することです。トランスデューサーの下部にある繊細な膜をよく損傷しないように注意してください。
- トランスデューサハウジングに空気が再入らないようにシリンダを斜めに配置した状態で、トランスデューサハウジングをシリンダ13 に取り付け、レンチを使用してぴったりと締めます。
- 脱気された流体がシリンダー容量の約2/3に達したら、充填ポートとシリンダーからキャップを取り外します。
- シリンダーを水平に置き、脱気液でシリンダーを満たします。
注意: 気泡の形成を避けるために、液体をゆっくりと注ぐことをお勧めします14。 - 充填ポートのキャップを元に戻し、すべての活栓を閉じます。
- 充填口14に任意の気泡が働くようにシリンダを操作する。
- 充填ポートの活栓を開き、トランスデューサハウジングのシリンジを使用して流体を注入し、気泡をポート14から押し出します。
- デバイス全体を検査し、気泡がないことを確認します。
- 脱気液で満たされた10mLシリンジを充填キャップのルアーロックハブに追加します。
- 手ねじを使用してシリンダーをベースに取り付け直します。
- シリンダーが水平で、振り子の加重ハンマーの中心と揃っていることを確認します。
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Representative Results
LFPIデバイスの気泡汚染が波形形成に及ぼす影響をテストしました。デバイスに気泡を注入し、オシロスコープの出力を汚染されていないLFPIデバイスから収集されたオシロスコープのデータと比較しました。条件は、非汚染、5mLの空気の注入、10mLの空気の注入、および15mLの空気の注入であった。すべての条件のすべての衝撃に対して振り子を一定の高さに保ち、条件ごとに15回の衝撃を実行しました。
怪我をしたり、LFPIデバイスをテストしたりする場合、オシロスコープの圧力波形は単一の鋭いピークを示すはずです(図2A)。デバイス内に気泡が存在すると、いくつかの短いピークを持つ波形(図2B)が得られ、気泡を除去する必要があることを示します。デバイスを再組み立てした後、怪我のセッションの前に、振り子を使用して4〜5回のテストドロップ(マウスを取り付けない)を実行して、デバイスが繰り返し機能することを確認することもお勧めします。圧力波形の不規則性に加えて、損傷/偽LFPI後の行動の変化も、デバイスが適切に機能しているかどうかを示す可能性があります。負傷したマウスは、偽マウスと比較してLFPI後の右反射時間が延長されるべきであり、これらの時間は監視および記録されるべきである。右に時間が長すぎたり短すぎたりすると、デバイスの組み立てやクリーニングが不適切であることを示している可能性があります15。同様の症状は、適切に洗浄および充填されたデバイスでも徐々に現れる可能性があり(おそらく日常的な使用中に気泡がゆっくりと蓄積するため)、洗浄と補充を繰り返す時期であることを示しています。6か月ごとに予防保守をスケジュールすると、LFPIデバイスの一貫したパフォーマンスを確保するのに役立ちます。
表1に見られるように、気泡の存在は、完全に充填された汚染されていないLFPIデバイスと比較した場合、波形の電圧を変化させました。気泡のサイズを大きくすると、オシロスコープの出力で示されるように、波の電圧が徐々に低下します。
図1:損傷前に行われたLFPIデバイスと外側頭蓋切除術の概略図。 この装置は、頭蓋間圧の上昇により脳の変位や変形を引き起こすことにより、動物モデルで頭蓋骨骨折のないTBIを再現するために使用されます。Biorender.com で作成。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:LFPIデバイスのメンテナンスと機能ステータスを評価するための圧力トランスデューサの出力の監視13. (A)適切に洗浄され機能しているLFPIデバイスによって生成される圧力波形の代表的な画像。(B)気泡汚染の有無を示す圧力波形のサンプル画像。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:4つの条件すべてに対するオシロスコープ出力の代表画像 (A、B、C、D) オシロスコープの出力は、それぞれ非汚染、5 mLの空気注入、10 mLの空気注入、15 mLの空気注入に対応しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| 気泡汚染状態 | |||||
| 充填および汚染されていないLFPIデバイス | 5 mLの総空気注入 | 10 mLの総空気注入 | 15 mLの総空気注入 | ||
| 波形出力(mV) | 240 | 218 | 230 | 218 | |
| 234 | 222 | 226 | 220 | ||
| 240 | 228 | 226 | 220 | ||
| 244 | 226 | 228 | 218 | ||
| 246 | 228 | 230 | 218 | ||
| 248 | 232 | 226 | 220 | ||
| 248 | 230 | 226 | 220 | ||
| 250 | 230 | 228 | 220 | ||
| 248 | 232 | 228 | 224 | ||
| 252 | 232 | 228 | 222 | ||
| 250 | 232 | 226 | 220 | ||
| 250 | 230 | 228 | 222 | ||
| 252 | 230 | 228 | 222 | ||
| 252 | 232 | 228 | 220 | ||
| 平均波形出力(mV) | 246.7 | 228.7 | 227.6 | 220.3 | |
表1:汚染されていない対照群からのオシロスコープ電圧出力と汚染状態の比較。 対応のあるt検定は、非汚染条件と各汚染条件の間で実行されました。非汚染条件と比較すると、すべての汚染条件が有意に減少した(p < 0.0001)。
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Discussion
上記で概説した手法は、LFPIデバイスを適切に保守する方法を示しています。LFPIデバイスを正しく確実に機能させるには、定期的なクリーニングと監視が必要です。さらに、LFPI手順の侵襲性のために、実験動物の感染を防ぐために装置を徹底的に洗浄することが不可欠です。
デバイス内の気泡の形成を回避することは、最適な怪我と圧力波形を得るために重要です。気泡は脳に伝達される圧力パルスの特性を変化させ、一貫性のない損傷を引き起こし、臨床TBIを適切に再現することを困難にします。ここで収集された補足データは、気泡の汚染が衝撃によって生成される波の電圧を変化させることを示しています。 図3 に示すオシロスコープの出力は、圧力波に対する空気の影響を示すのに役立ちます。波形はそれほどシャープではなく、空気汚染が存在する場合は複数のピークがあります。LFPIデバイスの目標は、脳に単一の測定可能な流体パルスを提供することです。結果は、気泡が存在すると、複数のパルスが生成され、脳にどのような圧力がかかっているかを識別することが困難になることを示唆しています。
ここで採用されている技術は、ガスがデバイスに導入される可能性を減らし、および/またはそれにもかかわらず流体を汚染している可能性のあるガスの小さなポケットを除去するのに役立ちます。脱気流体を使用すると、気泡汚染のリスクが減少し、メンテナンス間隔13を延長できます。したがって、ステップ2で実行されるアクションは、LFPIデバイス内で気泡が形成される可能性を減らすために重要です。手順3.4〜3.9は、怪我をする前に、デバイス内の残留ガスを除去することの重要性を強調しています。損傷装置を再組み立てした後、圧力トランスデューサと充填ポートの中心の両方で視界が制限されることは注目に値します。したがって、これらの領域は、シリンダーを充填した後に気泡の形成をチェックするときに特に注意を必要とします。
この手順は、Custom Design & Fabrication Inc.が製造したLFPIデバイスに合わせて特別に調整されており、他社製のLFPIデバイスを使用する場合は、プロトコルのわずかな変更が必要になる場合があります。
LFPIデバイスのクリーニングと再組み立てには時間と注意が必要ですが、一貫した怪我をするための鍵です。気泡を避けることは、誤った結果を減らし、追加の実験を実行する必要性を制限するのに役立つため、特に重要です。
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Disclosures
利益相反は宣言されていません。
Acknowledgments
著者らは、Custom Design & Fabrication Inc.の技術支援とサポートに感謝したい。この研究は、国立衛生研究所の助成金R01NS120099-01A1およびR37HD059288-19によって資金提供されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 - 10 mL syringes with Luer lock capability | Ensures that needle is secure and reduces possible leaks of fluid | ||
| Degassed fluid | Helps to reduce air bubble formation during injury procedure | ||
| Fluid Percussion Injury (FPI) device (Model 01-B) | Custom Designs & Fabrications Inc. | N/A | Injury device used to model TBI in rodents |
| Mild detergent | Allows to thoroughly clean the LFPI cylinder | ||
| Petroleum Jelly | Used as a water-repellent and protects LFPI device form rust | ||
| Teflon tape | Helps with tight seal of pipe joints on the LFPI device | ||
| *Materials other than the LFPI device can be purchased from any reliable company. |
References
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