Summary
Die richtige Pflege und Wartung sind für die zuverlässige Funktion eines LFPI-Geräts (Lateral Fluid Percussion Injury) unerlässlich. Hier zeigen wir, wie man ein LFPI-Gerät richtig reinigt, füllt und zusammenbaut und sicherstellt, dass es für optimale Ergebnisse angemessen gewartet wird.
Abstract
Schädel-Hirn-Trauma (SHT) ist jährlich für etwa 2,5 Millionen Besuche in der Notaufnahme und Krankenhausaufenthalte verantwortlich und eine der Hauptursachen für Tod und Behinderung bei Kindern und jungen Erwachsenen. SHT wird durch eine plötzliche Krafteinwirkung auf den Kopf verursacht, und um das menschliche SHT und die zugrunde liegenden Mechanismen besser zu verstehen, sind experimentelle Verletzungsmodelle erforderlich. Die laterale Flüssigkeitsperkussionsverletzung (LFPI) ist ein häufig verwendetes Verletzungsmodell, da die pathologischen Veränderungen beim menschlichen SHT im Vergleich zum LFPI ähnlich sind, einschließlich Blutungen, Gefäßstörungen, neurologischer Defizite und Neuronenverlust. LFPI verwendet ein Pendel und einen flüssigkeitsgefüllten Zylinder, wobei letzterer an einem Ende einen beweglichen Kolben und am anderen Ende eine Luer-Lock-Verbindung zu steifen, flüssigkeitsgefüllten Schläuchen hat. Die Vorbereitung des Tieres umfasst die Durchführung einer Kraniektomie und das Anbringen eines Luer-Hubs über der Stelle. Am nächsten Tag wird der Schlauch des Verletzungsgeräts mit dem Luer-Hub am Schädel des Tieres verbunden und das Pendel auf eine bestimmte Höhe angehoben und losgelassen. Durch den Aufprall des Pendels auf den Kolben wird ein Druckimpuls erzeugt, der über den Schlauch auf die intakte Dura mater des Tieres übertragen wird und das experimentelle SHT erzeugt. Die richtige Pflege und Wartung ist für die zuverlässige Funktion des LFPI-Geräts unerlässlich, da die Art und Schwere der Verletzung je nach Zustand des Geräts stark variieren kann. Hier zeigen wir, wie man das LFPI-Gerät richtig reinigt, füllt und zusammenbaut und sicherstellt, dass es für optimale Ergebnisse angemessen gewartet wird.
Introduction
Ein Schädel-Hirn-Trauma (SHT) wird durch eine plötzliche Krafteinwirkung auf den Kopf verursacht. Nach primären Verletzungen, die auf den körperlichen Aufprall zurückzuführen sind, erleiden SHT-Überlebende häufig sekundäre Verletzungen, einschließlich kognitiver Defizite und neurologischer Dysfunktionen, die mit physiologischen Reaktionen auf die ursprüngliche Verletzung verbunden sind1. Es wird geschätzt, dass jährlich etwa 69 Millionen Menschen weltweit an SHT leiden2. Allein in den Vereinigten Staaten kommt es jedes Jahr zu etwa 2,5 Millionen SHT-bedingten Besuchen in der Notaufnahme und zu Krankenhauseinweisungen, was SHT zu einer der Hauptursachen für Behinderungen und Todesfälle bei Kindern und jungen Erwachsenen macht3. SHT kann als leicht, mittelschwer oder schwer eingestuft werden, wobei ein leichtes SHT (mSHT) etwa 70 % bis 90 % der SHT-Fälle ausmacht4. Eine histologische und kognitive SHT-Pathologie kann innerhalb von Minuten bis Stunden nach der Verletzung auftreten, und die Auswirkungen des SHT können Monate bis Jahre nach der ersten Schädigung anhalten5.
Die Entwicklung experimenteller Modelle hat maßgeblich dazu beigetragen, die Auswirkungen und zugrunde liegenden Mechanismen von SHT zu verstehen. Ein solches Modell, die laterale Flüssigkeitsperkussionsverletzung (LFPI), wird häufig zur Beurteilung von SHT in vivo verwendet. LFPI reproduziert Pathologien, die mit einem menschlichen SHT assoziiert sind, einschließlich Gefäßstörungen, Blutungen, neuronalem Verlust, Entzündungen, Gliose und molekularen Störungen 6,7,8. Die LFPI-Technik wird für eine Vielzahl von experimentellen Anwendungen eingesetzt, darunter die Modellierung von pädiatrischen SHT sowie chronischen neurodegenerativen Erkrankungen wie der chronischen traumatischen Enzephalopathie 9,10. LFPI ist eine gut definierte und reproduzierbare Methode des experimentellen SHT, mit der der Schweregrad der Verletzung angepasst werden kann11. Das LFPI-Gerät besteht aus mehreren wichtigen Komponenten, darunter: einem Pendel mit einem beschwerten Hammer, einem Kolben, einem flüssigkeitsgefüllten Zylinder, einem Druckwandler, einem digitalen Oszilloskop und einem kleinen Röhrchen am Ende des Zylinders mit einem Luer-Verschluss, der an einer Nabe am Schädel des Tieres befestigt wird (Abbildung 1). LFPI funktioniert, indem das Pendel in den Kolben geschwenkt wird, wodurch eine Druckwelle durch die Flüssigkeit (entgastes deionisiertes Wasser oder Kochsalzlösung) in das Gehirn des angehängten Tieres erzeugt wird. Dies erhöht den intrakraniellen Druck und repliziert so die mechanischen Merkmale und biologischen Veränderungen von SHT12. Darüber hinaus werden Tiere, die in LFPI-Experimenten verwendet werden, einer Kraniektomie unterzogen, um das Gehirn dem Einfluss des Flüssigkeitsdrucks des Geräts auszusetzen.
Routinemäßige Wartung und Überwachung sind erforderlich, um sicherzustellen, dass das LFPI-Gerät genau funktioniert. Die folgenden Methoden sind wichtig, um das Eindringen von kontaminierenden Luftblasen in das Gerät zu verhindern. Hier demonstrieren wir Methoden zum ordnungsgemäßen Reinigen, Befüllen und Zusammenbauen des LFPI-Geräts. Wir werden auch Oszilloskopausgänge und Mausaufrichtungszeiten diskutieren, um die Lebensfähigkeit des LFPI zu bestätigen.
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Protocol
1. Reinigen des LFPI-Zylinders
- Trennen Sie vorsichtig die Spritzen, die am Gehäuse und an der Einfüllöffnung des Messumformers befestigt sind, sowie das Kabel, das mit dem Druckaufnehmer verbunden ist (siehe Abbildung 1 für eine schematische Darstellung der Komponenten der Verletzungsvorrichtung).
- Achten Sie darauf, den Zylinder nicht fallen zu lassen, und lösen Sie die Handknöpfe auf der Rückseite des Geräts von den Zylinderklemmen, um den Zylinder zu befreien.
- Entfernen Sie den Kolben am Ende des Zylinders, des Wandlers, des Wandlergehäuses und der O-Ringe des Kolbens.
- Flüssigkeit aus dem Zylinder ablassen.
- Geben Sie ein mildes Reinigungsmittel, z. B. Geschirrspülmittel, in den Zylinder und schrubben Sie leicht mit einer Spül- oder Flaschenbürste13.
- Um sicherzustellen, dass das gesamte Reinigungsmittel abgespült wird, füllen Sie den Zylinder vollständig mit Wasser und spülen Sie ihn gründlich aus.
2. Entgasen der Flüssigkeit, die zum Befüllen des Zylinders verwendet wird
- Verwenden Sie eine Vakuumpumpe, um die Flüssigkeit zu entgasen, bevor Sie den Zylinder wieder befüllen, um die Bildung neuer Blasen zu verhindern und vorhandene Blasen zu absorbieren.
Anmerkungen: Zum Befüllen der Flasche werden ca. 1,5 l Flüssigkeit benötigt, obwohl beim Entgasen von ca. 2 l ein kleiner Vorrat verbleibt, um die während des Gebrauchs und der Tests verlorene Flüssigkeit zu ersetzen.
Anmerkungen: Hausstaubsauger sind zu schwach, um die Flüssigkeit effektiv zu entgasen. Das Vakuum muss in der Lage sein, einen Druck von 25-28 inHg zu erzeugen. - Geben Sie einen Rührstab in die Flüssigkeit und stellen Sie den Flüssigkeitsbehälter auf eine Rührplatte. Das Rühren der Flüssigkeit während des Entgasungsprozesses hilft, das Sprudeln und die Freisetzung von Gas anzuregen. Das Rühren verhindert auch eine große plötzliche Zunahme der Blasenbildung.
Anmerkungen: Der Entgasungsprozess sollte beendet sein, wenn nur noch sehr wenige Blasen erzeugt werden. Dies geschieht nach ca. 45 min.
3. Zusammenbau des LFPI-Gerätes
- Tragen Sie eine dünne Schicht Vaseline auf den Kolbenkolben auf.
- Befestigen Sie den Kolbenkolben so, dass der Kolben ca. 32 mm aus dem Zylinder14 herausragt.
Anmerkungen: Luft wird häufig am Kolben vor dem führenden O-Ring eingeschlossen. Um diese überschüssige Luft loszuwerden, drehen Sie den Kolben, während Sie ihn ein- und ausfahren, um die Luft aus diesem Spalt zu arbeiten. - Tragen Sie auch auf die anderen O-Ringe eine dünne Schicht Vaseline auf und befestigen Sie sie am Zylinder, mit Ausnahme des O-Rings an der Einfüllöffnung.
- Wickeln Sie Teflonband zweimal um die Gewinde des Schallkopfs.
4. LFPI-Gerät nachfüllen und an der Basis befestigen
- Schließen Sie eine 10-ml-Spritze, die mit entgaster Flüssigkeit gefüllt und frei von Luftblasen ist, an die Luer-Lock-Nabe am Schallkopfgehäuse an.
- Halten Sie den Schallkopf mit dem Gewindeende nach oben und füllen Sie die Vertiefung im Gewindebereich des Schallkopfs mit einer 10-ml-Spritze vollständig mit der entgasten Flüssigkeit. Ziel ist es, den Wandler gut zu füllen, ohne Luftblasen einzubringen. Achten Sie darauf, die empfindliche Membran an der Unterseite des Schallkopfschachts nicht zu beschädigen.
- Wenn der Zylinder schräg angeordnet ist, um zu verhindern, dass Luft wieder in das Wandlergehäuse eintritt, befestigen Sie das Wandlergehäuse am Zylinder13 und ziehen Sie es mit einem Schraubenschlüssel fest an.
- Entfernen Sie die Kappe von der Einfüllöffnung und dem Zylinder, sobald die entgaste Flüssigkeit etwa 2/3 des Flaschenvolumens erreicht hat.
- Stellen Sie den Zylinder waagerecht auf und füllen Sie den Zylinder mit entgaster Flüssigkeit.
Anmerkungen: Um die Bildung von Luftblasen zu vermeiden, wird empfohlen, die Flüssigkeit langsam einzufüllen14. - Setzen Sie die Kappe an der Einfüllöffnung wieder auf und schließen Sie alle Absperrhähne.
- Manipulieren Sie den Zylinder, um Luftblasen an die Einfüllöffnung14 zu bringen.
- Öffnen Sie den Absperrhahn an der Einfüllöffnung und injizieren Sie Flüssigkeit mit der Spritze am Wandlergehäuse, um Luftblasen aus der Öffnung14 zu drücken.
- Überprüfen Sie das gesamte Gerät und stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen vorhanden sind.
- Geben Sie eine 10-ml-Spritze, die mit entgaster Flüssigkeit gefüllt ist, in die Luer-Lock-Nabe am Fülldeckel.
- Befestigen Sie den Zylinder mit den Handschrauben wieder am Sockel.
- Achten Sie darauf, dass der Zylinder waagerecht steht und mit der Mitte des beschwerten Hammers auf dem Pendel ausgerichtet ist.
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Representative Results
Wir haben die Auswirkungen einer Luftblasenkontamination in einem LFPI-Gerät auf die Wellenformbildung getestet. Wir injizierten Luftblasen in das Gerät und verglichen die Oszilloskopausgänge mit Oszilloskopdaten, die von einem nicht kontaminierten LFPI-Gerät gesammelt wurden. Die Bedingungen waren wie folgt: nicht kontaminiert, Injektion von 5 ml Luft, Injektion von 10 ml Luft und Injektion von 15 ml Luft. Wir haben das Pendel für alle Stöße unter allen Bedingungen auf einer konstanten Höhe gehalten und 15 Stöße pro Bedingung durchgeführt.
Wenn Sie eine Verletzung durchführen oder das LFPI-Gerät testen, sollte die Druckwellenform auf dem Oszilloskop eine einzelne, scharfe Spitze aufweisen (Abbildung 2A). Das Vorhandensein von Luftblasen im Gerät führt zu einer Wellenform mit mehreren kurzen Spitzen (Abbildung 2B), die auf Blasen hinweist, die entfernt werden müssen. Nach dem Zusammenbau des Geräts und vor jeder Verletzungssitzung empfehlen wir außerdem, vier bis fünf Testtropfen (ohne Maus) mit dem Pendel durchzuführen, um sicherzustellen, dass das Gerät wiederholbar funktioniert. Neben Unregelmäßigkeiten in der Druckwellenform können auch Verhaltensänderungen nach einer Verletzung/Schein-LFPI ein Hinweis darauf sein, ob das Gerät ordnungsgemäß funktioniert. Verletzte Mäuse sollten im Vergleich zu Scheinmäusen verlängerte Aufrichtungsreflexzeiten nach LFPI haben, und diese Zeiten sollten überwacht und aufgezeichnet werden. Zu lange oder zu kurze Aufrichtzeiten können ein Hinweis auf eine unsachgemäße Montage und/oder Reinigung des Gerätssein 15. Ähnliche Symptome können auch allmählich bei einem Gerät auftreten, das ordnungsgemäß gereinigt und befüllt wurde (wahrscheinlich aufgrund der langsamen Ansammlung von Blasen während des routinemäßigen Gebrauchs), was darauf hinweist, dass es an der Zeit ist, die Reinigung und das Nachfüllen zu wiederholen. Die Planung einer vorbeugenden Wartung alle 6 Monate kann dazu beitragen, eine gleichbleibende Leistung des LFPI-Geräts sicherzustellen.
Wie in Tabelle 1 zu sehen ist, veränderte das Vorhandensein von Luftblasen die Spannung der Wellenform im Vergleich zu einem vollständig gefüllten, nicht kontaminierten LFPI-Gerät. Durch die Vergrößerung der Luftblase verringerte sich allmählich die Spannung der Welle, wie die Oszilloskopausgänge anzeigen.
Abbildung 1: Schematische Darstellung des LFPI-Geräts und der lateralen Kraniektomie, die vor der Verletzung durchgeführt wurde. Dieses Gerät wird verwendet, um SHT ohne Schädelbruch in Tiermodellen zu reproduzieren, indem es eine Verschiebung und/oder Verformung des Gehirns aufgrund eines Anstiegs des interkraniellen Drucks verursacht. Erstellt mit Biorender.com. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Überwachung des Druckaufnehmerausgangs zur Beurteilung der Wartung und des Funktionsstatus des LFPI-Geräts13. (A) Repräsentatives Bild der Druckwellenform, die von einem ordnungsgemäß gereinigten und funktionierenden LFPI-Gerät erzeugt wird. (B) Beispielbild einer Druckwellenform, die das Vorhandensein von Luftblasenverunreinigungen anzeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Repräsentatives Bild der Oszilloskopausgänge für alle vier Bedingungen . (A,B,C,D) Das Oszilloskop gibt für die nicht kontaminierten 5 ml Lufteinspritzung, 10 ml Lufteinspritzung bzw. 15 ml Lufteinspritzung aus. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| Kontamination durch Luftblasen | |||||
| Gefülltes und nicht kontaminiertes LFPI-Gerät | 5 ml eingespritzte Gesamtluft | 10 ml eingespritzte Gesamtluft | 15 ml eingespritzte Gesamtluft | ||
| Wellenform-Ausgang (mV) | 240 | 218 | 230 | 218 | |
| 234 | 222 | 226 | 220 | ||
| 240 | 228 | 226 | 220 | ||
| 244 | 226 | 228 | 218 | ||
| 246 | 228 | 230 | 218 | ||
| 248 | 232 | 226 | 220 | ||
| 248 | 230 | 226 | 220 | ||
| 250 | 230 | 228 | 220 | ||
| 248 | 232 | 228 | 224 | ||
| 252 | 232 | 228 | 222 | ||
| 250 | 232 | 226 | 220 | ||
| 250 | 230 | 228 | 222 | ||
| 252 | 230 | 228 | 222 | ||
| 252 | 232 | 228 | 220 | ||
| Durchschnittlicher Signalausgang (mV) | 246.7 | 228.7 | 227.6 | 220.3 | |
Tabelle 1: Oszilloskop-Spannungsausgänge aus nicht kontaminierter Kontrollgruppe im Vergleich zu kontaminierten Bedingungen. Es wurden gepaarte t-Tests zwischen den nicht kontaminierten Bedingungen und den einzelnen kontaminierten Bedingungen durchgeführt. Alle kontaminierten Bedingungen waren im Vergleich zu nicht kontaminierten Bedingungen signifikant verringert (p < 0,0001).
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Discussion
Die oben beschriebenen Techniken zeigen, wie ein LFPI-Gerät ordnungsgemäß gewartet wird. Eine routinemäßige Reinigung und Überwachung ist erforderlich, damit das LFPI-Gerät ordnungsgemäß und zuverlässig funktioniert. Darüber hinaus ist es aufgrund des invasiven Charakters des LFPI-Verfahrens zwingend erforderlich, dass das Gerät gründlich gereinigt wird, um eine Infektion von Labortieren zu verhindern.
Die Vermeidung der Bildung von Luftblasen im Gerät ist entscheidend, um optimale Verletzungen und Druckwellenformen zu erhalten. Luftblasen verändern die Eigenschaften des Druckimpulses, der an das Gehirn abgegeben wird, was zu inkonsistenten Verletzungen führt und die ordnungsgemäße Reproduktion klinischer SHT erschwert. Die hier gesammelten ergänzenden Daten zeigen, dass die Kontamination durch Luftblasen die Spannung der durch einen Aufprall erzeugten Welle verändert. Die in Abbildung 3 gezeigten Oszilloskopausgänge veranschaulichen die Auswirkungen von Luft auf Druckwellen. Die Wellenformen sind nicht so scharf und haben stattdessen mehrere Spitzen, wenn Luftverschmutzung vorhanden ist. Das Ziel des LFPI-Geräts ist es, dem Gehirn einen einzigen messbaren Flüssigkeitsimpuls zur Verfügung zu stellen. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass bei Vorhandensein von Luftblasen mehrere Impulse erzeugt werden, was es schwierig macht, zu erkennen, welcher Druck auf das Gehirn ausgeübt wird.
Die hier eingesetzten Techniken verringern die Wahrscheinlichkeit, dass Gase in das Gerät gelangen, und/oder helfen, kleine Gastaschen zu entfernen, die die Flüssigkeit dennoch verunreinigen könnten. Die Verwendung von entgaster Flüssigkeit verringert das Risiko einer Verunreinigung durch Luftblasen und kann das Wartungsintervallverlängern 13. Daher sind die in Schritt 2 durchgeführten Aktionen entscheidend, um die Wahrscheinlichkeit der Bildung von Luftblasen im LFPI-Gerät zu verringern. In den Schritten 3.4-3.9 wird hervorgehoben, wie wichtig es ist, verbleibende Gase im Gerät zu entfernen, bevor Verletzungen durchgeführt werden. Es ist bemerkenswert, dass nach dem Zusammenbau der Verletzungsvorrichtung die Sicht sowohl im Druckaufnehmer als auch in der Mitte der Füllöffnung eingeschränkt ist. Daher müssen diese Bereiche besonders beachtet werden, wenn nach dem Befüllen des Zylinders auf Luftblasenbildung geprüft wird.
Dieses Verfahren ist speziell auf das LFPI-Gerät von Custom Design &; Fabrication Inc. zugeschnitten. Bei der Verwendung von LFPI-Geräten anderer Hersteller können geringfügige Änderungen am Protokoll erforderlich sein.
Die Reinigung und der Zusammenbau eines LFPI-Geräts erfordern Zeit und Aufmerksamkeit, sind aber der Schlüssel zu dauerhaften Verletzungen. Die Vermeidung von Luftblasen ist besonders wichtig, da sie dazu beitragen kann, fehlerhafte Ergebnisse zu reduzieren und die Notwendigkeit zusätzlicher Experimente zu begrenzen.
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Disclosures
Es wurden keine Interessenkonflikte erklärt.
Acknowledgments
Die Autoren bedanken sich bei Custom Design &; Fabrication Inc. für die technische Hilfe und Unterstützung. Diese Arbeit wurde durch die National Institutes of Health Grants R01NS120099-01A1 und R37HD059288-19 finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 - 10 mL syringes with Luer lock capability | Ensures that needle is secure and reduces possible leaks of fluid | ||
| Degassed fluid | Helps to reduce air bubble formation during injury procedure | ||
| Fluid Percussion Injury (FPI) device (Model 01-B) | Custom Designs & Fabrications Inc. | N/A | Injury device used to model TBI in rodents |
| Mild detergent | Allows to thoroughly clean the LFPI cylinder | ||
| Petroleum Jelly | Used as a water-repellent and protects LFPI device form rust | ||
| Teflon tape | Helps with tight seal of pipe joints on the LFPI device | ||
| *Materials other than the LFPI device can be purchased from any reliable company. |
References
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