Summary
Cuidados e manutenção adequados são essenciais para que um dispositivo de lesão de percussão de fluido lateral (LFPI) funcione de forma confiável. Aqui, demonstramos como limpar, preencher e montar corretamente um dispositivo LFPI e garantir que ele seja mantido adequadamente para obter os melhores resultados.
Abstract
O traumatismo cranioencefálico (TCE) é responsável por cerca de 2,5 milhões de atendimentos de emergência e hospitalizações anualmente e é uma das principais causas de morte e incapacidade em crianças e adultos jovens. O TCE é causado por uma força súbita aplicada à cabeça e, para melhor compreensão do TCE humano e seus mecanismos subjacentes, modelos experimentais de lesão são necessários. A lesão da percussão lateral do fluido (LFPI) é um modelo de lesão comumente usado devido às semelhanças nas alterações patológicas encontradas no TCE humano em comparação com o LFPI, incluindo hemorragias, ruptura vascular, déficits neurológicos e perda de neurônios. A LFPI emprega um pêndulo e um cilindro cheio de fluido, este último com um pistão móvel em uma extremidade, e uma conexão de trava Luer para tubulação rígida e cheia de fluido na outra extremidade. A preparação do animal envolve a realização de uma craniectomia e a fixação de um cubo Luer sobre o local. No dia seguinte, a tubulação do dispositivo de lesão é conectada ao cubo Luer no crânio do animal e o pêndulo é elevado a uma altura especificada e liberado. O impacto do pêndulo com o pistão gera um pulso de pressão que é transmitido à dura-máter intacta do animal através da tubulação e produz o TCE experimental. Cuidados e manutenção adequados são essenciais para que o dispositivo LFPI funcione de forma confiável, pois o caráter e a gravidade da lesão podem variar muito dependendo da condição do dispositivo. Aqui, demonstramos como limpar, preencher e montar corretamente o dispositivo LFPI e garantir que ele seja mantido adequadamente para obter os melhores resultados.
Introduction
O traumatismo cranioencefálico (TCE) é causado por uma força súbita aplicada na cabeça. Após lesões primárias resultantes do impacto físico, os sobreviventes de TCE comumente experimentam lesões secundárias, incluindo déficits cognitivos e disfunções neurológicas que estão associadas às respostas fisiológicas à lesão inicial1. Estima-se que cerca de 69 milhões de indivíduos no mundo sofram de TCE anualmente2. Somente nos Estados Unidos, aproximadamente 2,5 milhões de atendimentos de emergência e hospitalizações por TCE ocorrem a cada ano, tornando o TCE uma das principais causas de incapacidade e morte entre crianças e adultosjovens3. O TCE pode ser classificado em leve, moderado ou grave, sendo o TCE leve (TCEm) responsável por aproximadamente 70%-90% dos casos deTCE4. A patologia histológica e cognitiva do TCE pode ocorrer dentro de minutos a horas após a lesão, e os efeitos do TCE podem persistir por meses a anos após a lesão inicial5.
O desenvolvimento de modelos experimentais tem sido fundamental para a compreensão dos efeitos e mecanismos subjacentes do TCE. Um desses modelos, a lesão por percussão lateral no fluido (LFPI), é comumente usado para avaliar o TCE in vivo. A ILPI reproduz de perto patologias associadas ao TCE humano, incluindo rupturas vasculares, hemorragias, perda neuronal, inflamação, gliose e distúrbios moleculares 6,7,8. A técnica de LFPI é utilizada para diversas aplicações experimentais, incluindo a modelagem do TCE pediátrico, bem como condições neurodegenerativas crônicas, como a encefalopatia traumáticacrônica9,10. A IFTL é um método bem definido e reprodutível de TCE experimental que permite ajustar a gravidade dalesão11. O dispositivo LFPI possui vários componentes importantes, entre eles: um pêndulo com martelo ponderado, um pistão, um cilindro cheio de líquido, um transdutor de pressão, um osciloscópio digital e um pequeno tubo na extremidade do cilindro com uma trava Luer que se prende a um cubo no crânio do animal (Figura 1). O LFPI funciona balançando o pêndulo no pistão, criando uma onda de pressão através do fluido (água deionizada desgaseificada ou soro fisiológico) no cérebro do animal anexado; isso aumenta a pressão intracraniana, replicando as características mecânicas e alterações biológicas do TCE12. Além disso, animais utilizados em experimentos de LFPI são submetidos a uma craniectomia para expor o cérebro ao impacto da pressão do fluido do dispositivo.
A manutenção e o monitoramento de rotina são necessários para garantir que o dispositivo LFPI esteja funcionando com precisão. Os seguintes métodos são vitais para evitar a introdução de bolhas de ar contaminantes no dispositivo. Aqui, demonstramos métodos para limpar, preencher e montar corretamente o dispositivo LFPI. Também discutiremos as saídas do osciloscópio e os tempos de retificação do mouse como formas de confirmar a viabilidade do LFPI.
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Protocol
1. Limpeza do cilindro LFPI
- Retire cuidadosamente as seringas conectadas à carcaça do transdutor e à porta de enchimento, bem como o cabo conectado ao transdutor de pressão (consulte a Figura 1 para um esquema dos componentes do dispositivo de lesão).
- Tomando cuidado para não soltar o cilindro, desaparafuse os botões de mão na parte de trás do dispositivo das braçadeiras do cilindro para liberar o cilindro.
- Remova o pistão na extremidade do cilindro, do transdutor, da carcaça do transdutor e dos anéis O do êmbolo.
- Escorra o líquido para fora do cilindro.
- Adicione detergente neutro, como detergente para lavar louça, ao cilindro e esfregue levemente com uma escova de prato ou garrafa13.
- Para garantir que todo o detergente seja enxaguado, encha completamente o cilindro com água e enxágue completamente.
2. Desgaseificação do fluido usado para encher o cilindro
- Use uma bomba de vácuo para desgaseificar o fluido antes de reabastecer o cilindro para evitar a formação de novas bolhas e absorver as bolhas existentes.
NOTA: Aproximadamente 1,5 L de fluido será necessário para encher o cilindro, embora a desgaseificação de aproximadamente 2 L deixe um pequeno suprimento para repor qualquer fluido perdido durante o uso e teste.
NOTA: Os aspiradores domésticos são muito fracos para desgaseificar eficazmente o fluido. O vácuo deve ser capaz de produzir uma pressão de 25-28 inHg. - Adicione uma barra de agitação ao líquido e coloque o recipiente de líquido em um prato agitado. Agitar o fluido durante o processo de desgaseificação ajuda a estimular o borbulhamento e a liberação de gás. A agitação também evita um grande aumento súbito do borbulhamento.
NOTA: O processo de desgaseificação deve terminar quando muito poucas bolhas estão sendo produzidas; Isso ocorre após aproximadamente 45 min.
3. Remontagem do dispositivo LFPI
- Aplique uma fina camada de vaselina no êmbolo do pistão.
- Fixe o êmbolo do pistão com o êmbolo saliente a aproximadamente 32 mm do cilindro14.
NOTA: O ar frequentemente fica preso no êmbolo antes do O-ring principal. Para se livrar desse excesso de ar, torça o êmbolo enquanto o move para dentro e para fora para trabalhar o ar para fora dessa lacuna. - Aplique também uma fina camada de vaselina nos outros O-rings e fixe-os ao cilindro, com exceção do O-ring na porta de enchimento.
- Enrole a fita de teflon duas vezes ao redor dos fios do transdutor.
4. Reabastecer o dispositivo LFPI e encaixar na base
- Conecte uma seringa de 10 mL cheia de fluido desgaseificado e livre de bolhas de ar ao cubo Luer lock na carcaça do transdutor.
- Segure o transdutor com a extremidade rosqueada voltada para cima e preencha completamente o poço dentro da região rosqueada do transdutor com o fluido desgaseificado usando uma seringa de 10 mL. O objetivo aqui é encher bem o transdutor sem introduzir bolhas de ar. Tenha cuidado para não danificar bem a membrana delicada na parte inferior do transdutor.
- Com o cilindro colocado em um ângulo para evitar que o ar volte a entrar na carcaça do transdutor, conecte a carcaça do transdutor ao cilindro13 e use uma chave para apertá-lo confortavelmente.
- Remova a tampa da porta de enchimento e do cilindro quando o fluido desgaseificado atingir aproximadamente 2/3 da capacidade do cilindro.
- Coloque o cilindro horizontalmente e termine de enchê-lo com fluido desgaseificado.
OBS: Para evitar a formação de bolhas de ar, recomenda-se despejar o líquido lentamente14. - Substitua a tampa na porta de enchimento e feche todas as torneiras.
- Manipule o cilindro para trabalhar quaisquer bolhas de ar até a porta de enchimento14.
- Abra a torneira na porta de enchimento e injete fluido usando a seringa na carcaça do transdutor para forçar quaisquer bolhas de ar para fora da porta14.
- Inspecione todo o dispositivo e certifique-se de que não há bolhas de ar.
- Adicione uma seringa de 10 mL cheia de líquido desgaseificado ao cubo Luer lock na tampa de enchimento.
- Reconecte o cilindro à base usando os parafusos manuais.
- Certifique-se de que o cilindro esteja horizontal e alinhado com o centro do martelo pesado no pêndulo.
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Representative Results
Testamos os efeitos da contaminação por bolhas de ar em um dispositivo LFPI na formação de formas de onda. Injetamos bolhas de ar no dispositivo e comparamos as saídas do osciloscópio com os dados do osciloscópio coletados de um dispositivo LFPI não contaminado. As condições foram: não contaminado, injeção de 5 mL de ar, injeção de 10 mL de ar e injeção de 15 mL de ar. Mantivemos o pêndulo em uma altura consistente para todos os impactos para todas as condições e realizamos 15 impactos por condição.
Ao realizar uma lesão ou testar o dispositivo LFPI, a forma de onda de pressão no osciloscópio deve mostrar um único pico agudo (Figura 2A). A presença de bolhas de ar no aparelho resultará em uma forma de onda com vários picos curtos (Figura 2B), indicando bolhas que precisam ser removidas. Depois de remontar o dispositivo, e antes de qualquer sessão de lesão, também recomendamos a realização de quatro a cinco gotas de teste (sem mouse conectado) com o pêndulo para garantir que o dispositivo esteja funcionando repetidamente. Além das irregularidades na forma de onda de pressão, mudanças comportamentais após lesão/LFPI simulada também podem ser indicativas de se o dispositivo está funcionando corretamente. Camundongos lesionados devem ter tempos prolongados de reflexo de retificação após a IFTL em comparação com camundongos sham, e esses tempos devem ser monitorados e registrados. Tempos de correção muito longos ou muito curtos podem ser um indício de montagem e/ou limpeza inadequada do dispositivo15. Sintomas semelhantes também podem aparecer gradualmente em um dispositivo que foi devidamente limpo e preenchido (provavelmente devido ao acúmulo lento de bolhas durante o uso rotineiro), indicando que é hora de repetir a limpeza e reabastecimento. Agendar a manutenção preventiva uma vez a cada 6 meses pode ajudar a garantir o desempenho consistente do dispositivo LFPI.
Como pode ser observado na Tabela 1, a presença de bolhas de ar alterou a tensão da forma de onda quando comparada a um dispositivo LFPI totalmente preenchido e não contaminado. O aumento do tamanho da bolha de ar diminuiu gradualmente a tensão da onda, como indicado pelas saídas do osciloscópio.
Figura 1: Esquema do dispositivo de IFTL e craniectomia lateral realizada previamente à lesão. Este dispositivo é usado para reproduzir TCEs sem fratura de crânio em modelos animais, causando deslocamento e/ou deformação do cérebro devido ao aumento da pressão intercraniana. Criado com Biorender.com. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Monitoração da saída do transdutor de pressão para avaliar a manutenção do dispositivo LFPI e o estado funcional13. (A) Imagem representativa da forma de onda de pressão produzida por um dispositivo LFPI devidamente limpo e em funcionamento. (B) Imagem de amostra de uma forma de onda de pressão indicando a presença de contaminação por bolhas de ar. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Imagem representativa das saídas do osciloscópio para as quatro condições. (A,B,C,D) As saídas do osciloscópio para os não contaminados, 5 mL de injeção de ar, 10 mL de injeção de ar e 15 mL de injeção de ar, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Condição de contaminação por bolhas de ar | |||||
| Dispositivo LFPI preenchido e não contaminado | 5 mL de ar total injetado | 10 mL de ar total injetado | 15 mL de ar total injetado | ||
| Saída de forma de onda (mV) | 240 | 218 | 230 | 218 | |
| 234 | 222 | 226 | 220 | ||
| 240 | 228 | 226 | 220 | ||
| 244 | 226 | 228 | 218 | ||
| 246 | 228 | 230 | 218 | ||
| 248 | 232 | 226 | 220 | ||
| 248 | 230 | 226 | 220 | ||
| 250 | 230 | 228 | 220 | ||
| 248 | 232 | 228 | 224 | ||
| 252 | 232 | 228 | 222 | ||
| 250 | 232 | 226 | 220 | ||
| 250 | 230 | 228 | 222 | ||
| 252 | 230 | 228 | 222 | ||
| 252 | 232 | 228 | 220 | ||
| Saída média da forma de onda (mV) | 246.7 | 228.7 | 227.6 | 220.3 | |
Tabela 1: Saídas de tensão do osciloscópio do grupo controle não contaminado em comparação com condições contaminadas. Testes t pareados foram realizados entre as condições não contaminadas e cada condição contaminada. Todas as condições contaminadas foram significativamente reduzidas quando comparadas às condições não contaminadas (p < 0,0001).
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Discussion
As técnicas descritas acima demonstram como manter adequadamente um dispositivo LFPI. A limpeza e o monitoramento de rotina são necessários para manter o dispositivo LFPI funcionando corretamente e de forma confiável. Além disso, devido à natureza invasiva do procedimento de LFPI, é imperativo que o dispositivo seja cuidadosamente limpo para evitar a infecção de animais de laboratório.
Evitar a formação de bolhas de ar no dispositivo é crucial para obter lesões e formas de onda de pressão ideais. As bolhas de ar alteram as características do pulso de pressão entregue ao cérebro, causando lesões inconsistentes e dificultando a reprodução adequada dos TCEs clínicos. Os dados complementares aqui coletados mostram que a contaminação por bolhas de ar altera a tensão da onda produzida por um impacto. As saídas do osciloscópio mostradas na Figura 3 ajudam a ilustrar os efeitos do ar sobre as ondas de pressão; As formas de onda não são tão nítidas e, em vez disso, têm vários picos quando a contaminação do ar está presente. O objetivo do dispositivo LFPI é fornecer um pulso de fluido mensurável singular para o cérebro; Os resultados sugerem que, quando bolhas de ar estão presentes, múltiplos pulsos são criados, tornando difícil discernir qual pressão está sendo aplicada ao cérebro.
As técnicas empregadas aqui reduzem a probabilidade de gases serem introduzidos no dispositivo e/ou ajudam a remover quaisquer pequenas bolsas de gás que possam, no entanto, estar contaminando o fluido. O uso de fluido desgaseificado reduz o risco de contaminação por bolhas de ar e pode estender o intervalo de manutenção13. Assim, as ações realizadas na etapa 2 são fundamentais para reduzir a chance de formação de bolhas de ar no aparelho de LFPI. Os passos 3.4-3.9 destacam a importância da remoção dos gases remanescentes no dispositivo antes da realização de lesões. Vale ressaltar que, após a remontagem do dispositivo de lesão, a visibilidade tanto no transdutor de pressão quanto no centro do orifício de enchimento é limitada; Assim, essas áreas requerem atenção especial ao verificar a formação de bolhas de ar após o enchimento do cilindro.
Este procedimento é especificamente adaptado ao dispositivo LFPI feito pela Custom Design & Fabrication Inc.
Limpar e remontar um dispositivo LFPI requer tempo e atenção, mas é fundamental para produzir lesões consistentes. Evitar bolhas de ar é particularmente importante, pois pode ajudar a reduzir resultados defeituosos e limitar a necessidade de realizar experimentos adicionais.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer à Custom Design & Fabrication Inc. Este trabalho foi financiado pelos subsídios do National Institutes of Health R01NS120099-01A1 e R37HD059288-19.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 - 10 mL syringes with Luer lock capability | Ensures that needle is secure and reduces possible leaks of fluid | ||
| Degassed fluid | Helps to reduce air bubble formation during injury procedure | ||
| Fluid Percussion Injury (FPI) device (Model 01-B) | Custom Designs & Fabrications Inc. | N/A | Injury device used to model TBI in rodents |
| Mild detergent | Allows to thoroughly clean the LFPI cylinder | ||
| Petroleum Jelly | Used as a water-repellent and protects LFPI device form rust | ||
| Teflon tape | Helps with tight seal of pipe joints on the LFPI device | ||
| *Materials other than the LFPI device can be purchased from any reliable company. |
References
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