Summary
Korrekt skötsel och underhåll är avgörande för att en lateral vätskeslagskada (LFPI) -enhet ska fungera tillförlitligt. Här visar vi hur du rengör, fyller och monterar en LFPI-enhet ordentligt och ser till att den underhålls tillräckligt för optimala resultat.
Abstract
Traumatisk hjärnskada (TBI) står för ungefär 2,5 miljoner akutbesök och sjukhusvistelser årligen och är en ledande orsak till dödsfall och funktionshinder hos barn och unga vuxna. TBI orsakas av en plötslig kraft som appliceras på huvudet och för att bättre förstå human TBI och dess underliggande mekanismer krävs experimentella skademodeller. Lateral fluid percussion injury (LFPI) är en vanlig skademodell på grund av likheter i de patologiska förändringar som finns i human TBI jämfört med LFPI, inklusive blödningar, vaskulär störning, neurologiska underskott och neuronförlust. LFPI använder en pendel och en vätskefylld cylinder, den senare har en rörlig kolv i ena änden och en Luer-låsanslutning till styva, vätskefyllda slangar i andra änden. Förberedelse av djuret innebär att man utför en kraniektomi och fäster ett Luer-nav över platsen. Nästa dag ansluts slangen från skadeanordningen till Luer-navet på djurets skalle och pendeln höjs till en viss höjd och släpps. Pendelns påverkan med kolven genererar en tryckpuls som överförs till djurets intakta dura mater via slangen och producerar experimentell TBI. Korrekt skötsel och underhåll är avgörande för att LFPI-enheten ska fungera tillförlitligt, eftersom skadans karaktär och svårighetsgrad kan variera kraftigt beroende på enhetens tillstånd. Här visar vi hur du rengör, fyller och monterar LFPI-enheten ordentligt och ser till att den underhålls tillräckligt för optimala resultat.
Introduction
Traumatisk hjärnskada (TBI) orsakas av en plötslig kraft som appliceras på huvudet. Efter primära skador till följd av den fysiska påverkan upplever TBI-överlevande ofta sekundära skador, inklusive kognitiva underskott och neurologiska dysfunktioner som är förknippade med fysiologiska svar på den initiala skadan1. Det uppskattas att ungefär 69 miljoner individer världen över lider av TBI årligen2. Bara i USA inträffar cirka 2,5 miljoner TBI-relaterade akutbesök och sjukhusvistelser varje år, vilket gör TBI till en av de främsta orsakerna till funktionshinder och död bland barn och unga vuxna3. TBI kan klassificeras som mild, måttlig eller svår, med mild TBI (mTBI) som står för cirka 70% -90% av TBI-fallen4. Histologisk och kognitiv TBI-patologi kan inträffa inom några minuter till timmar efter skada, och effekterna av TBI kan kvarstå i månader till år efter initial skada5.
Utvecklingen av experimentella modeller har varit avgörande för att förstå effekterna och underliggande mekanismer för TBI. En sådan modell, lateral fluid percussion injury (LFPI), används ofta för att bedöma TBI in vivo. LFPI reproducerar nära patologier associerade med human TBI, inklusive vaskulära störningar, blödningar, neuronal förlust, inflammation, glios och molekylära störningar 6,7,8. LFPI-tekniken används för en mängd olika experimentella tillämpningar, inklusive modellering av pediatrisk TBI, liksom kroniska neurodegenerativa tillstånd, såsom kronisk traumatisk encefalopati 9,10. LFPI är en väldefinierad och reproducerbar metod för experimentell TBI som gör det möjligt att justera skadans allvarlighetsgrad11. LFPI-enheten har flera viktiga komponenter, inklusive: en pendel med en viktad hammare, en kolv, en vätskefylld cylinder, en tryckgivare, ett digitalt oscilloskop och ett litet rör i slutet av cylindern med ett Luer-lås som fästs vid ett nav på djurets skalle (figur 1). LFPI fungerar genom att svänga pendeln i kolven, vilket skapar en våg av tryck genom vätskan (avgasat avjoniserat vatten eller saltlösning) in i hjärnan hos det bifogade djuret; Detta ökar det intrakraniella trycket och replikerar därmed de mekaniska egenskaperna och biologiska förändringarna av TBI12. Dessutom genomgår djur som används i LFPI-experiment en kraniektomi för att utsätta hjärnan för effekterna av enhetens vätsketryck.
Rutinunderhåll och övervakning är nödvändigt för att säkerställa att LFPI-enheten fungerar korrekt. Följande metoder är avgörande för att förhindra införande av förorenande luftbubblor i enheten. Här demonstrerar vi metoder för att rengöra, fylla och montera LFPI-enheten ordentligt. Vi kommer också att diskutera oscilloskoputgångar och musrätningstider som sätt att bekräfta LFPI: s livskraft.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Rengöring av LFPI-cylindern
- Lossa försiktigt sprutorna som är fästa vid givarhuset och påfyllningsporten samt kabeln som är ansluten till tryckgivaren (se figur 1 för en schematisk bild av komponenter i den skadade enheten).
- Var försiktig så att du inte tappar cylindern, skruva loss handknapparna på baksidan av enheten från cylinderklämmorna för att frigöra cylindern.
- Ta bort kolven i änden av cylindern, givaren, givarhuset och kolvens O-ringar.
- Töm vätska ur cylindern.
- Tillsätt milt rengöringsmedel, t.ex. diskmedel, i cylindern och skrubba lätt med en skål eller flaskborste13.
- För att säkerställa att allt tvättmedel sköljs av, fyll cylindern helt med vatten och skölj noggrant.
2. Avgasning av vätskan som används för att fylla cylindern
- Använd en vakuumpump för att avgasa vätskan innan du fyller på cylindern för att förhindra bildandet av nya bubblor och absorbera befintliga bubblor.
OBS: Cirka 1,5 L vätska kommer att behövas för att fylla cylindern, även om avgasning cirka 2 L kommer att lämna en liten tillförsel för att ersätta eventuell vätska som förlorats under användning och testning.
OBS: Husdammsugare är för svaga för att effektivt avgasa vätskan. Vakuumet måste kunna producera ett tryck på 25-28 inHg. - Tillsätt en omrörningsstång till vätskan och placera vätskebehållaren på en omrörningsplatta. Omrörning av vätskan under avgasningsprocessen hjälper till att stimulera bubbling och frisättning av gas. Omrörning förhindrar också en stor plötslig ökning av bubbling.
OBS: Avgasningsprocessen bör vara över när mycket få bubblor produceras; Detta inträffar efter ungefär 45 minuter.
3. Återmontering av LFPI-enheten
- Applicera ett tunt lager vaselin på kolvkolven.
- Fäst kolven med kolven utskjutande ca 32 mm från cylinder14.
OBS: Luft fastnar ofta vid kolven före den ledande O-ringen. För att bli av med denna överflödiga luft, vrid kolven medan du flyttar den in och ut för att arbeta ut luften ur detta gap. - Applicera ett tunt lager vaselin på de andra O-ringarna också och fäst dem på cylindern, med undantag för O-ringen på påfyllningsporten.
- Linda teflontejp två gånger runt givarens trådar.
4. Påfyllning av LFPI-enheten och fastsättning på basen
- Anslut en 10 ml spruta fylld med avgasad vätska och fri från luftbubblor till Luer-låsnavet på givarhuset.
- Håll givaren med den gängade änden pekande uppåt och fyll brunnen helt inuti givarens gängade område med avgasvätskan med en 10 ml spruta. Målet här är att fylla givaren väl utan att införa några luftbubblor. Var försiktig så att du inte skadar det känsliga membranet i botten av givarbrunnen.
- Med cylindern placerad i en vinkel för att förhindra att luft kommer in i givarhuset igen, fäst givarhuset på cylindern13 och använd en skiftnyckel för att dra åt den ordentligt.
- Ta bort locket från påfyllningsporten och cylindern när avgasvätskan når ungefär 2/3 av cylindervolymen.
- Placera cylindern horisontellt och fyll cylindern med avgasad vätska.
OBS: För att undvika bildandet av luftbubblor rekommenderas att hälla vätskan långsamt14. - Sätt tillbaka locket vid påfyllningsporten och stäng alla kranar.
- Manipulera cylindern för att arbeta eventuella luftbubblor till påfyllningsporten14.
- Öppna kranen på påfyllningsporten och injicera vätska med sprutan på givarhuset för att tvinga ut eventuella luftbubblor ur port14.
- Kontrollera hela enheten och se till att det inte finns några luftbubblor.
- Tillsätt en 10 ml spruta fylld med avgasad vätska i Luer-låsnavet på påfyllningslocket.
- Sätt tillbaka cylindern på basen med hjälp av handskruvarna.
- Se till att cylindern är horisontell och i linje med mitten av den viktade hammaren på pendeln.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi testade effekterna av luftbubbelförorening i en LFPI-enhet på vågformsbildning. Vi injicerade luftbubblor i enheten och jämförde oscilloskoputgångarna med oscilloskopdata som samlats in från en icke-förorenad LFPI-enhet. Förhållandena var följande: icke-förorenad, injektion av 5 ml luft, injektion av 10 ml luft och injektion av 15 ml luft. Vi höll pendeln på en jämn höjd för alla stötar under alla förhållanden, och vi utförde 15 slag per tillstånd.
Vid utförande av en skada eller testning av LFPI-enheten bör tryckvågformen på oscilloskopet visa en enda, skarp topp (figur 2A). Närvaron av luftbubblor i enheten kommer att resultera i en vågform med flera korta toppar (figur 2B), vilket indikerar bubblor som måste tas bort. Efter att ha monterat enheten igen och före varje skadesession rekommenderar vi också att du utför fyra till fem testdroppar (ingen mus ansluten) med pendeln för att säkerställa att enheten fungerar upprepade gånger. Förutom oegentligheter i tryckvågformen kan beteendeförändringar efter skada / sham LFPI också vara en indikation på om enheten fungerar korrekt. Skadade möss bör ha förlängda rätningsreflextider efter LFPI jämfört med skenmöss, och dessa tider bör övervakas och registreras. Rätta tider som antingen är för långa eller för korta kan vara en indikation på felaktig montering och/eller rengöring av enheten15. Liknande symtom kan också uppträda gradvis i en enhet som har rengjorts och fyllts ordentligt (troligen på grund av långsam ackumulering av bubblor under rutinmässig användning), vilket indikerar att det är dags att upprepa rengöringen och påfyllningen. Schemaläggning av förebyggande underhåll en gång var 6:e månad kan bidra till att säkerställa konsekvent prestanda för LFPI-enheten.
Som framgår av tabell 1 förändrade närvaron av luftbubblor vågformens spänning jämfört med en helt fylld, icke-förorenad LFPI-enhet. Att öka storleken på luftbubblan minskade gradvis vågens spänning, vilket indikeras av oscilloskoputgångarna.
Figur 1: Schematisk bild av LFPI-enheten och lateral kraniektomi utförd före skada. Denna enhet används för att reproducera TBI utan skallfraktur i djurmodeller genom att orsaka förskjutning och / eller deformation av hjärnan på grund av en ökning av interkraniellt tryck. Skapad med Biorender.com. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Övervakning av tryckgivarens utgång för att bedöma underhåll av LFPI-enheter och funktionsstatus13. (A) Representativ bild av tryckvågformen som produceras av en korrekt rengjord och fungerande LFPI-anordning. (B) Provbild av en tryckvågform som indikerar närvaron av luftbubbelförorening. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Representativ bild av oscilloskoputgångar för alla fyra förhållandena . (A,B,C,D) Oscilloskoputgångarna för icke-förorenade, 5 ml luftinsprutning, 10 ml luftinjektion respektive 15 ml luftinsprutning. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Tillstånd för luftbubbelförorening | |||||
| Fylld och icke-förorenad LFPI-enhet | 5 ml total luftinsprutning | 10 ml total luftinsprutning | 15 ml total luftinsprutning | ||
| Vågformsutgång (mV) | 240 | 218 | 230 | 218 | |
| 234 | 222 | 226 | 220 | ||
| 240 | 228 | 226 | 220 | ||
| 244 | 226 | 228 | 218 | ||
| 246 | 228 | 230 | 218 | ||
| 248 | 232 | 226 | 220 | ||
| 248 | 230 | 226 | 220 | ||
| 250 | 230 | 228 | 220 | ||
| 248 | 232 | 228 | 224 | ||
| 252 | 232 | 228 | 222 | ||
| 250 | 232 | 226 | 220 | ||
| 250 | 230 | 228 | 222 | ||
| 252 | 230 | 228 | 222 | ||
| 252 | 232 | 228 | 220 | ||
| Genomsnittlig vågformsutgång (mV) | 246.7 | 228.7 | 227.6 | 220.3 | |
Tabell 1: Oscilloskopspänningsutgångar från icke-förorenad kontrollgrupp jämfört med förorenade förhållanden. Parade t-tester utfördes mellan de icke-förorenade förhållandena och varje förorenat tillstånd. Alla förorenade förhållanden minskade signifikant jämfört med icke-kontaminerade förhållanden (p < 0,0001).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Teknikerna som beskrivs ovan visar hur man korrekt underhåller en LFPI-enhet. Rutinmässig rengöring och övervakning är nödvändig för att LFPI-enheten ska fungera korrekt och tillförlitligt. På grund av LFPI-förfarandets invasiva karaktär är det dessutom absolut nödvändigt att enheten rengörs noggrant för att förhindra infektion av laboratoriedjur.
Att undvika bildandet av luftbubblor i enheten är avgörande för att få optimala skador och tryckvågformer. Luftbubblor förändrar egenskaperna hos tryckpulsen som levereras till hjärnan, vilket orsakar inkonsekventa skador och gör det svårt att korrekt reproducera kliniska TBI. De kompletterande data som samlats in här visar att luftbubbelförorening förändrar spänningen hos vågen som produceras av en påverkan. Oscilloskoputgångarna som visas i figur 3 hjälper till att illustrera effekterna av luft på tryckvågor; Vågformerna är inte lika skarpa och har istället flera toppar när luftföroreningar förekommer. Målet med LFPI-enheten är att tillhandahålla en enda mätbar vätskepuls till hjärnan; Resultaten tyder på att när luftbubblor är närvarande skapas flera pulser, vilket gör det svårt att urskilja vilket tryck som appliceras på hjärnan.
De tekniker som används här minskar sannolikheten för att gaser införs i enheten och / eller hjälper till att ta bort små gasfickor som ändå kan förorena vätskan. Användning av avgasad vätska minskar risken för kontaminering av luftbubblor och kan förlänga underhållsintervallet13. Således är de åtgärder som utförs i steg 2 avgörande för att minska risken för luftbubbelbildning i LFPI-enheten. Steg 3.4-3.9 belyser vikten av att avlägsna kvarvarande gaser i enheten innan skador utförs. Det är anmärkningsvärt att efter återmontering av skadeanordningen är synligheten i både tryckgivaren och mitten av påfyllningsporten begränsad; Således kräver dessa områden särskild uppmärksamhet vid kontroll av luftbubbelbildning efter fyllning av cylindern.
Denna procedur är speciellt anpassad till LFPI-enheten tillverkad av Custom Design &; Fabrication Inc. Mindre ändringar av protokollet kan vara nödvändiga vid användning av LFPI-enheter tillverkade av andra företag.
Rengöring och återmontering av en LFPI-enhet kräver tid och uppmärksamhet, men är nyckeln till att producera konsekventa skador. Att undvika luftbubblor är särskilt viktigt, eftersom det kan bidra till att minska felaktiga resultat och begränsa behovet av att utföra ytterligare experiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklarerade.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Custom Design &; Fabrication Inc. för deras tekniska hjälp och support. Detta arbete finansierades av National Institutes of Health-bidragen R01NS120099-01A1 och R37HD059288-19.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 - 10 mL syringes with Luer lock capability | Ensures that needle is secure and reduces possible leaks of fluid | ||
| Degassed fluid | Helps to reduce air bubble formation during injury procedure | ||
| Fluid Percussion Injury (FPI) device (Model 01-B) | Custom Designs & Fabrications Inc. | N/A | Injury device used to model TBI in rodents |
| Mild detergent | Allows to thoroughly clean the LFPI cylinder | ||
| Petroleum Jelly | Used as a water-repellent and protects LFPI device form rust | ||
| Teflon tape | Helps with tight seal of pipe joints on the LFPI device | ||
| *Materials other than the LFPI device can be purchased from any reliable company. |
References
- Centers for Disease Control and Prevention. Surveillance Report of Traumatic Brain Injury-related Emergency Department Visits, Hospitalizations, and Deaths. Centers for Disease Control and Prevention, U.S. Department of Health and Human Services. , https://www.cdc.gov/traumaticbraininjury/get_the_facts.html (2014).
- Dewan, M. C. Estimating the global incidence of traumatic brain injury. Journal of Neurosurgery. 130 (4), 1080-1097 (2018).
- National Center for Injury Prevention and Control; Division of Unintentional Injury Prevention. Traumatic Brain Injury in the United States: Epidemiology and Rehabilitation. , Centers for Disease Control and Prevention. Atlanta, GA. (2015).
- Holm, L., Cassidy, J. D., Carroll, L. J., Borg, J. Summary of the WHO Collaborating Centre for neurotrauma task force on mild traumatic brain injury. Journal of Rehabilitation Medicine. 37 (3), 137-141 (2005).
- Pavlovic, D., Pekic, S., Stojanovic, M., Popovic, V. Traumatic brain injury: neuropathological, neurocognitive and neurobehavioral sequelae. Pituitary. 22 (3), 270-282 (2019).
- Dixon, C. E. A fluid percussion model of experimental brain injury in the rat. Journal of Neurosurgery. 67 (1), 110-119 (1987).
- McIntosh, T. K. Traumatic brain injury in the rat: characterization of a lateral fluid-percussion model. Neuroscience. 28 (1), 233-244 (1989).
- Ma, X., Aravind, A., Pfister, B. J., Chandra, N., Haorah, J. Animal models of traumatic brain injury and assessment of injury severity. Molecular Neurobiology. 56 (8), 5332-5345 (2019).
- Nwafor, D. C. Pediatric traumatic brain injury: an update on preclinical models, clinical biomarkers, and the implications of cerebrovascular dysfunction. Journal of Central Nervous System Disease. 14, (2022).
- Turner, R. C. Modeling chronic traumatic encephalopathy: the way forward for future discovery. Frontiers in Neurology. 6, 223 (2015).
- Petersen, A., Soderstrom, M., Saha, B., Sharma, P. Animal models of traumatic brain injury: a review of pathophysiology to biomarkers and treatments. Experimental Brain Research. 239 (10), 2939-2950 (2021).
- Sullivan, H. G. Fluid-percussion model of mechanical brain injury in the cat. Journal of Neurosurgery. 45 (5), 521-534 (1976).
- Fluid Percussion Injury Model 01-B: General Operation. , Custom Design & Fabrication, Inc. Available from: http://www.cdf-products.com/ (2023).
- Fluid Percussion Injury Model 01-B: Assembly Instructions. , Custom Design & Fabrication, Inc. Available from: http://www.cdf-products.com/ (2023).
- Pernici, C. D. Longitudinal optical imaging technique to visualize progressive axonal damage after brain injury in mice reveals responses to different minocycline treatments. Scientific Reports. 10, 7815-78 (2020).
