Summary
Riktig pleie og vedlikehold er avgjørende for at en lateral fluid perkusjonsskade (LFPI) enhet skal fungere pålitelig. Her demonstrerer vi hvordan du rengjør, fyller og monterer en LFPI-enhet på riktig måte, og sørger for at den vedlikeholdes tilstrekkelig for optimale resultater.
Abstract
Traumatisk hjerneskade (TBI) står for omtrent 2,5 millioner beredskapsbesøk og sykehusinnleggelser årlig og er en ledende årsak til død og funksjonshemming hos barn og unge voksne. TBI er forårsaket av en plutselig kraft påført hodet, og for bedre å forstå menneskelig TBI og dens underliggende mekanismer, er eksperimentelle skademodeller nødvendige. Lateral væskeperkusjonsskade (LFPI) er en vanlig skademodell på grunn av likheter i de patologiske endringene som finnes i human TBI sammenlignet med LFPI, inkludert blødninger, vaskulær forstyrrelse, nevrologiske underskudd og nevrontap. LFPI benytter en pendel og en væskefylt sylinder, sistnevnte har et bevegelig stempel i den ene enden, og en Luer-låsforbindelse til stive, væskefylte slanger i den andre enden. Forberedelse av dyret innebærer å utføre en kraniektomi og feste et Luer-nav over stedet. Neste dag er slangen fra skadeanordningen koblet til Luer-navet på dyrets skalle og pendelen heves til en spesifisert høyde og frigjøres. Virkningen av pendelen med stempelet genererer en trykkpuls som overføres til dyrets intakte dura mater via slangen og produserer den eksperimentelle TBI. Riktig pleie og vedlikehold er avgjørende for at LFPI-enheten skal fungere pålitelig, da skadens karakter og alvorlighetsgrad kan variere sterkt avhengig av enhetens tilstand. Her demonstrerer vi hvordan du rengjør, fyller og monterer LFPI-enheten riktig, og sørger for at den vedlikeholdes tilstrekkelig for optimale resultater.
Introduction
Traumatisk hjerneskade (TBI) er forårsaket av en plutselig kraft påført hodet. Etter primære skader som følge av den fysiske påvirkningen, opplever TBI-overlevende ofte sekundære skader, inkludert kognitive underskudd og nevrologiske dysfunksjoner som er forbundet med fysiologiske responser på den første skaden1. Det er anslått at omtrent 69 millioner individer over hele verden lider av TBI årlig2. I USA alene forekommer omtrent 2.5 millioner TBI-relaterte beredskapsbesøk og sykehusinnleggelser hvert år, noe som gjør TBI til en av de viktigste årsakene til funksjonshemming og død blant barn og unge voksne3. TBI kan klassifiseres som mild, moderat eller alvorlig, med mild TBI (mTBI) som står for omtrent 70% -90% av TBI-tilfellene4. Histologisk og kognitiv TBI-patologi kan oppstå i løpet av minutter til timer etter skade, og effekten av TBI kan vedvare i måneder til år etter første skade5.
Utviklingen av eksperimentelle modeller har vært medvirkende til å forstå effekter og underliggende mekanismer av TBI. En slik modell, lateral fluid percussion injury (LFPI), brukes ofte til å vurdere TBI in vivo. LFPI reproduserer nøye patologier assosiert med human TBI, inkludert vaskulære forstyrrelser, blødninger, nevrontap, betennelse, gliose og molekylære forstyrrelser 6,7,8. LFPI-teknikken brukes til et mangfoldig sett med eksperimentelle applikasjoner, inkludert modellering av pediatrisk TBI, samt kroniske nevrodegenerative tilstander, som kronisk traumatisk encefalopati 9,10. LFPI er en veldefinert og reproduserbar metode for eksperimentell TBI som gjør det mulig å justere alvorlighetsgraden av skaden11. LFPI-enheten har flere viktige komponenter, inkludert: en pendel med en vekthammer, et stempel, en væskefylt sylinder, en trykktransduser, et digitalt oscilloskop og et lite rør på enden av sylinderen med en Luer-lås som festes til et nav på dyrets skalle (figur 1). LFPI virker ved å svinge pendelen inn i stempelet, og skaper en bølge av trykk gjennom væsken (avgasset avionisert vann eller saltvann) inn i hjernen til det vedlagte dyret; Dette øker intrakranielt trykk, og replikerer dermed de mekaniske egenskapene og biologiske endringene i TBI12. I tillegg gjennomgår dyr som brukes i LFPI-eksperimenter en kraniektomi for å utsette hjernen for virkningen av væsketrykket til enheten.
Rutinemessig vedlikehold og overvåking er nødvendig for å sikre at LFPI-enheten fungerer nøyaktig. Følgende metoder er avgjørende for å forhindre innføring av forurensende luftbobler i enheten. Her demonstrerer vi metoder for å rengjøre, fylle og montere LFPI-enheten ordentlig. Vi vil også diskutere oscilloskoputganger og muserettingstider som måter å bekrefte levedyktigheten til LFPI.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Rengjøring av LFPI-sylinderen
- Ta forsiktig av sprøytene som er festet til svingerhuset og påfyllingsporten, samt kabelen som er koblet til trykktransduseren (se figur 1 for et skjema over komponenter i skadeanordningen).
- Mens du er forsiktig så du ikke mister sylinderen, skru av håndknappene på baksiden av enheten fra sylinderklemmene for å frigjøre sylinderen.
- Fjern stempelet på enden av sylinderen, svingeren, svingerhuset og stempelets O-ringer.
- Tøm væske ut av sylinderen.
- Tilsett mildt vaskemiddel, for eksempel oppvaskmiddel, i sylinderen og skrubb lett med en tallerken- eller flaskebørste13.
- For å sikre at alt vaskemiddelet skylles av, fyll sylinderen helt med vann og skyll grundig.
2. Avgassing av væsken som brukes til å fylle sylinderen
- Bruk en vakuumpumpe til å avfette væsken før du fyller på sylinderen for å forhindre dannelse av nye bobler og absorbere eksisterende bobler.
MERK: Omtrent 1,5 liter væske vil være nødvendig for å fylle sylinderen, selv om avgassing ca. 2 L vil etterlate en liten tilførsel for å erstatte væske som går tapt under bruk og testing.
MERK: Husstøvsugere er for svake til å effektivt avfette væsken. Vakuumet må kunne produsere et trykk på 25-28 inHg. - Tilsett en rørestang i væsken og legg væskebeholderen på en rørplate. Omrøring av væsken under avgassingsprosessen bidrar til å stimulere boblende og frigjøring av gass. Omrøring forhindrer også en stor plutselig økning i boblende.
MERK: Avgassingsprosessen bør være over når svært få bobler blir produsert; Dette skjer etter ca. 45 min.
3. Montering av LFPI-enheten på nytt
- Påfør et tynt lag petroleumjell på stempelstempelet.
- Fest stempelstempelet med stempelet utstikkende ca. 32 mm fra sylinderen14.
MERK: Luft blir ofte fanget ved stempelet før den ledende O-ringen. For å bli kvitt denne overflødige luften, vri stempelet mens du beveger det inn og ut for å jobbe luften ut av dette gapet. - Påfør også et tynt lag vaselin på de andre O-ringene og fest dem til sylinderen, med unntak av O-ringen på påfyllingsporten.
- Fest teflonbånd to ganger rundt svingerens tråder.
4. Påfyll av LFPI-enheten og vedlegg til basen
- Koble en 10 ml sprøyte fylt med avgasset væske uten luftbobler til Luer-låsnavet på svingerhuset.
- Hold transduseren med den gjengede enden pekende oppover, og fyll brønnen helt inne i transduserens gjengede område med avgasset væske ved hjelp av en 10 ml sprøyte. Målet her er å fylle svingeren godt uten å introdusere luftbobler. Vær forsiktig så du ikke skader den delikate membranen i bunnen av transduseren godt.
- Med sylinderen plassert i en vinkel for å forhindre at luft kommer inn i svingerhuset igjen, fest transduserhuset til sylinderen13 og bruk en skiftenøkkel for å stramme den tett.
- Fjern hetten fra påfyllingsporten og sylinderen når den avgassede væsken når omtrent 2/3 av sylinderkapasiteten.
- Plasser sylinderen horisontalt og fyll ferdig sylinderen med avgasset væske.
MERK: For å unngå dannelse av luftbobler anbefales det å helle væsken langsomt inn14. - Sett hetten på fylleporten igjen og lukk alle stoppekraner.
- Manipuler sylinderen til å arbeide med luftbobler til fylleporten14.
- Åpne stoppekranen på fylleporten og injiser væske ved hjelp av sprøyten på svingerhuset for å tvinge eventuelle luftbobler ut av port14.
- Inspiser hele enheten og sørg for at det ikke er luftbobler.
- Tilsett en 10 ml sprøyte fylt med avgasset væske til Luer-låsnavet på fyllehetten.
- Fest sylinderen til basen igjen ved hjelp av håndskruene.
- Forsikre deg om at sylinderen er horisontal og stilt opp med midten av den vektede hammeren på pendelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi testet effekten av luftbobleforurensning i en LFPI-enhet på bølgeformdannelse. Vi injiserte luftbobler i enheten og sammenlignet oscilloskoputgangene med oscilloskopdata samlet inn fra en ikke-forurenset LFPI-enhet. Forholdene var som følger: ikke-forurenset, injeksjon av 5 ml luft, injeksjon av 10 ml luft og injeksjon av 15 ml luft. Vi holdt pendelen i en konsistent høyde for alle støt for alle forhold, og vi utførte 15 støt per tilstand.
Når du utfører en skade eller tester LFPI-enheten, bør trykkbølgeformen på oscilloskopet vise en enkelt, skarp topp (figur 2A). Tilstedeværelsen av luftbobler i enheten vil resultere i en bølgeform med flere korte topper (figur 2B), noe som indikerer bobler som må fjernes. Etter at du har satt sammen enheten på nytt, og før en skadeøkt, anbefaler vi også å utføre fire til fem testfall (uten mus festet) med pendelen for å sikre at enheten fungerer gjentatte ganger. I tillegg til uregelmessigheter i trykkbølgeformen, kan atferdsendringer etter skade / sham LFPI også være en indikasjon på om enheten fungerer som den skal. Skadde mus bør ha forlenget rettingsreflekstider etter LFPI i forhold til skammus, og disse tidene bør overvåkes og registreres. Rettingstider som enten er for lange eller for korte, kan være en indikasjon på feil montering og/eller rengjøringav enheten 15. Lignende symptomer kan også vises gradvis i en enhet som har blitt ordentlig rengjort og fylt (sannsynligvis på grunn av langsom opphopning av bobler under rutinemessig bruk), noe som indikerer at det er på tide å gjenta rengjøring og påfylling. Planlegging av forebyggende vedlikehold én gang hver 6. måned kan bidra til å sikre jevn ytelse for LFPI-enheten.
Som vist i tabell 1, endret tilstedeværelsen av luftbobler spenningen til bølgeformen sammenlignet med en fullt fylt, ikke-forurenset LFPI-enhet. Å øke størrelsen på luftboblen reduserte gradvis spenningen til bølgen, som indikert av oscilloskoputgangene.
Figur 1 Skjematisk fremstilling av LFPI-apparat og lateral kraniektomi utført før skade. Denne enheten brukes til å reprodusere TBI uten kraniebrudd i dyremodeller ved å forårsake forskyvning og / eller deformasjon av hjernen på grunn av økt interkranielt trykk. Laget med Biorender.com. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Overvåking av trykktransduserutgang for å vurdere vedlikehold og funksjonsstatus for LFPI-enheter13. (A) Representativt bilde av trykkbølgeformen produsert av en riktig rengjort og fungerende LFPI-enhet. (B) Eksempelbilde av en trykkbølgeform som indikerer tilstedeværelse av luftbobleforurensning. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Representativt bilde av oscilloskoputganger for alle fire tilstander . (A, B, C, D) Oscilloskoputgangene for henholdsvis ikke-forurenset, 5 ml luftinjeksjon, 10 ml luftinjeksjon og 15 ml luftinjeksjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Forurensning av luftbobler | |||||
| Fylt og ikke-forurenset LFPI-enhet | 5 ml total luftinjeksjon | 10 ml total luftinjeksjon | 15 ml total luftinjeksjon | ||
| Bølgeformutgang (mV) | 240 | 218 | 230 | 218 | |
| 234 | 222 | 226 | 220 | ||
| 240 | 228 | 226 | 220 | ||
| 244 | 226 | 228 | 218 | ||
| 246 | 228 | 230 | 218 | ||
| 248 | 232 | 226 | 220 | ||
| 248 | 230 | 226 | 220 | ||
| 250 | 230 | 228 | 220 | ||
| 248 | 232 | 228 | 224 | ||
| 252 | 232 | 228 | 222 | ||
| 250 | 232 | 226 | 220 | ||
| 250 | 230 | 228 | 222 | ||
| 252 | 230 | 228 | 222 | ||
| 252 | 232 | 228 | 220 | ||
| Gjennomsnittlig bølgeformutgang (mV) | 246.7 | 228.7 | 227.6 | 220.3 | |
Tabell 1: Oscilloskopspenningsutganger fra ikke-forurenset kontrollgruppe sammenlignet med forurensede forhold. Parvise t-tester ble utført mellom de ikke-forurensede tilstandene og hver forurenset tilstand. Alle forurensede tilstander ble signifikant redusert sammenlignet med ikke-forurensede tilstander (p < 0,0001).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Teknikkene som er skissert ovenfor, viser hvordan du vedlikeholder en LFPI-enhet på riktig måte. Rutinemessig rengjøring og overvåking er nødvendig for å holde LFPI-enheten i orden riktig og pålitelig. I tillegg, på grunn av den invasive karakteren av LFPI-prosedyren, er det viktig at enheten rengjøres grundig for å forhindre infeksjon av laboratoriedyr.
Å unngå dannelse av luftbobler i enheten er avgjørende for å oppnå optimale skader og trykkbølgeformer. Luftbobler endrer egenskapene til trykkpulsen som leveres til hjernen, forårsaker inkonsekvente skader og gjør det vanskelig å reprodusere kliniske TBIer på riktig måte. De supplerende dataene som samles inn her, viser at luftbobleforurensning endrer spenningen til bølgen som produseres av et nedslag. Oscilloskoputgangene vist i figur 3 bidrar til å illustrere effekten av luft på trykkbølger; Bølgeformene er ikke like skarpe og har i stedet flere topper når luftforurensning er tilstede. Målet med LFPI-enheten er å gi en enestående målbar væskepuls til hjernen; Resultatene tyder på at når luftbobler er tilstede, opprettes flere pulser, noe som gjør det vanskelig å skille hvilket trykk som blir brukt på hjernen.
Teknikkene som brukes her, reduserer sannsynligheten for at gasser blir introdusert i enheten og / eller bidrar til å fjerne små lommer med gass som likevel kan forurense væsken. Bruk av avgasset væske reduserer risikoen for luftboblekontaminering og kan forlenge vedlikeholdsintervallet13. Dermed er handlingene som utføres i trinn 2 kritiske for å redusere sjansen for luftbobledannelse i LFPI-enheten. Trinn 3.4-3.9 fremhever viktigheten av å fjerne dvelende gasser i enheten før du utfører skader. Det er bemerkelsesverdig at, etter montering av skadeanordningen, er synligheten i både trykktransduseren og midten av fyllingsporten begrenset; Dermed krever disse områdene spesiell oppmerksomhet når du kontrollerer luftbobledannelse etter fylling av sylinderen.
Denne prosedyren er spesielt skreddersydd for LFPI-enheten laget av Custom Design &; Fabrication Inc. Mindre endringer i protokollen kan være nødvendige når du bruker LFPI-enheter produsert av andre selskaper.
Rengjøring og remontering av en LFPI-enhet krever tid og oppmerksomhet, men er nøkkelen til å produsere konsekvente skader. Å unngå luftbobler er spesielt viktig, da det kan bidra til å redusere feilresultater og begrense behovet for å utføre flere eksperimenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter oppgitt.
Acknowledgments
Forfatterne vil gjerne takke Custom Design &; Fabrication Inc. for teknisk assistanse og støtte. Dette arbeidet ble finansiert av National Institutes of Health tilskudd R01NS120099-01A1 og R37HD059288-19.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 - 10 mL syringes with Luer lock capability | Ensures that needle is secure and reduces possible leaks of fluid | ||
| Degassed fluid | Helps to reduce air bubble formation during injury procedure | ||
| Fluid Percussion Injury (FPI) device (Model 01-B) | Custom Designs & Fabrications Inc. | N/A | Injury device used to model TBI in rodents |
| Mild detergent | Allows to thoroughly clean the LFPI cylinder | ||
| Petroleum Jelly | Used as a water-repellent and protects LFPI device form rust | ||
| Teflon tape | Helps with tight seal of pipe joints on the LFPI device | ||
| *Materials other than the LFPI device can be purchased from any reliable company. |
References
- Centers for Disease Control and Prevention. Surveillance Report of Traumatic Brain Injury-related Emergency Department Visits, Hospitalizations, and Deaths. Centers for Disease Control and Prevention, U.S. Department of Health and Human Services. , https://www.cdc.gov/traumaticbraininjury/get_the_facts.html (2014).
- Dewan, M. C. Estimating the global incidence of traumatic brain injury. Journal of Neurosurgery. 130 (4), 1080-1097 (2018).
- National Center for Injury Prevention and Control; Division of Unintentional Injury Prevention. Traumatic Brain Injury in the United States: Epidemiology and Rehabilitation. , Centers for Disease Control and Prevention. Atlanta, GA. (2015).
- Holm, L., Cassidy, J. D., Carroll, L. J., Borg, J. Summary of the WHO Collaborating Centre for neurotrauma task force on mild traumatic brain injury. Journal of Rehabilitation Medicine. 37 (3), 137-141 (2005).
- Pavlovic, D., Pekic, S., Stojanovic, M., Popovic, V. Traumatic brain injury: neuropathological, neurocognitive and neurobehavioral sequelae. Pituitary. 22 (3), 270-282 (2019).
- Dixon, C. E. A fluid percussion model of experimental brain injury in the rat. Journal of Neurosurgery. 67 (1), 110-119 (1987).
- McIntosh, T. K. Traumatic brain injury in the rat: characterization of a lateral fluid-percussion model. Neuroscience. 28 (1), 233-244 (1989).
- Ma, X., Aravind, A., Pfister, B. J., Chandra, N., Haorah, J. Animal models of traumatic brain injury and assessment of injury severity. Molecular Neurobiology. 56 (8), 5332-5345 (2019).
- Nwafor, D. C. Pediatric traumatic brain injury: an update on preclinical models, clinical biomarkers, and the implications of cerebrovascular dysfunction. Journal of Central Nervous System Disease. 14, (2022).
- Turner, R. C. Modeling chronic traumatic encephalopathy: the way forward for future discovery. Frontiers in Neurology. 6, 223 (2015).
- Petersen, A., Soderstrom, M., Saha, B., Sharma, P. Animal models of traumatic brain injury: a review of pathophysiology to biomarkers and treatments. Experimental Brain Research. 239 (10), 2939-2950 (2021).
- Sullivan, H. G. Fluid-percussion model of mechanical brain injury in the cat. Journal of Neurosurgery. 45 (5), 521-534 (1976).
- Fluid Percussion Injury Model 01-B: General Operation. , Custom Design & Fabrication, Inc. Available from: http://www.cdf-products.com/ (2023).
- Fluid Percussion Injury Model 01-B: Assembly Instructions. , Custom Design & Fabrication, Inc. Available from: http://www.cdf-products.com/ (2023).
- Pernici, C. D. Longitudinal optical imaging technique to visualize progressive axonal damage after brain injury in mice reveals responses to different minocycline treatments. Scientific Reports. 10, 7815-78 (2020).
