Summary
Yanal sıvı perküsyon yaralanması (LFPI) cihazının güvenilir bir şekilde çalışması için uygun bakım ve bakım şarttır. Burada, bir LFPI cihazının nasıl düzgün bir şekilde temizleneceğini, doldurulacağını ve monte edileceğini ve optimum sonuçlar için yeterli şekilde muhafaza edilmesini sağlıyoruz.
Abstract
Travmatik beyin hasarı (TBH), yılda yaklaşık 2,5 milyon acil servis ziyareti ve hastaneye yatışa neden olur ve çocuklarda ve genç erişkinlerde önde gelen bir ölüm ve sakatlık nedenidir. TBI, kafaya uygulanan ani bir kuvvetten kaynaklanır ve insan TBI'sını ve altında yatan mekanizmaları daha iyi anlamak için deneysel yaralanma modelleri gereklidir. Lateral sıvı perküsyon hasarı (LFPI), insan TBH'sinde LFPI'ye kıyasla bulunan patolojik değişikliklerdeki benzerlikler nedeniyle, kanamalar, vasküler bozulmalar, nörolojik defisitler ve nöron kaybı gibi yaygın olarak kullanılan bir yaralanma modelidir. LFPI, bir sarkaç ve sıvı dolu bir silindir kullanır, ikincisi bir ucunda hareketli bir pistona ve diğer ucunda sert, sıvı dolu borulara bir Luer kilit bağlantısına sahiptir. Hayvanın hazırlanması, bir kraniektomi yapılmasını ve bölgeye bir Luer göbeğinin takılmasını içerir. Ertesi gün, yaralanma cihazından gelen tüp, hayvanın kafatasındaki Luer göbeğine bağlanır ve sarkaç belirli bir yüksekliğe yükseltilir ve serbest bırakılır. Sarkaçların pistonla olan etkisi, boru aracılığıyla hayvanın sağlam dura materine iletilen ve deneysel TBI'yı üreten bir basınç darbesi üretir. LFPI cihazının güvenilir bir şekilde çalışması için uygun bakım ve bakım şarttır, çünkü yaralanmanın karakteri ve ciddiyeti cihazın durumuna bağlı olarak büyük ölçüde değişebilir. Burada, LFPI cihazının nasıl düzgün bir şekilde temizleneceğini, doldurulacağını ve monte edileceğini ve optimum sonuçlar için yeterli şekilde muhafaza edildiğinden emin olunacağını gösteriyoruz.
Introduction
Travmatik beyin hasarı (TBH), başa uygulanan ani bir kuvvetten kaynaklanır. Fiziksel etkiden kaynaklanan birincil yaralanmaları takiben, TBI mağdurları genellikle ilk yaralanmaya fizyolojik tepkilerle ilişkili bilişsel eksiklikler ve nörolojik işlev bozuklukları da dahil olmak üzere ikincil yaralanmalar yaşarlar1. Dünya çapında yaklaşık 69 milyon kişinin yılda yaklaşık 69 milyon kişinin TBI'dan muzdarip olduğu tahmin edilmektedir2. Sadece Amerika Birleşik Devletleri'nde, her yıl yaklaşık 2,5 milyon TBI ile ilişkili acil servis ziyareti ve hastaneye yatış meydana gelmekte ve TBI'yı çocuklar ve genç yetişkinler arasında önde gelen sakatlık ve ölüm nedenlerinden biri haline getirmektedir3. TBI hafif, orta veya şiddetli olarak sınıflandırılabilir, hafif TBI (mTBI) TBI vakalarının yaklaşık% 70-90'ını oluşturur4. Histolojik ve bilişsel TBH patolojisi yaralanmadan birkaç ila birkaç saat sonra ortaya çıkabilir ve TBI'nın etkileri ilk hasardan sonra aylarca veya yıllarca devam edebilir5.
Deneysel modellerin geliştirilmesi, TBH'nin etkilerini ve altında yatan mekanizmaları anlamada etkili olmuştur. Böyle bir model, lateral sıvı perküsyon yaralanması (LFPI), TBI'yı in vivo olarak değerlendirmek için yaygın olarak kullanılır. LFPI, vasküler bozulmalar, kanamalar, nöronal kayıplar, inflamasyon, gliyoz ve moleküler bozukluklar dahil olmak üzere insan TBI ile ilişkili patolojileri yakından üretir 6,7,8. LFPI tekniği, pediatrik TBI'nın modellenmesinin yanı sıra kronik travmatik ensefalopati 9,10 gibi kronik nörodejeneratif durumlar da dahil olmak üzere çeşitli deneysel uygulamalar için kullanılır. LFPI, yaralanmanın ciddiyetinin ayarlanmasına izin veren iyi tanımlanmış ve tekrarlanabilir bir deneysel TBI yöntemidir11. LFPI cihazı, aşağıdakiler de dahil olmak üzere birkaç önemli bileşene sahiptir: ağırlıklı çekiçli bir sarkaç, bir piston, sıvı dolu bir silindir, bir basınç dönüştürücüsü, bir dijital osiloskop ve silindirin sonunda, hayvanın kafatasındaki bir göbeğe bağlanan bir Luer kilidi olan küçük bir tüp (Şekil 1). LFPI, sarkacı pistona sallayarak, sıvıdan (gazdan arındırılmış deiyonize su veya tuzlu su) bağlı hayvanın beynine bir basınç dalgası oluşturarak çalışır; Bu, kafa içi basıncı arttırır, böylece TBI12'nin mekanik özelliklerini ve biyolojik değişikliklerini çoğaltır. Ek olarak, LFPI deneylerinde kullanılan hayvanlar, beyni cihazın sıvı basıncının etkisine maruz bırakmak için bir kraniektomi geçirir.
LFPI cihazının doğru şekilde çalıştığından emin olmak için rutin bakım ve izleme gereklidir. Aşağıdaki yöntemler, kirletici hava kabarcıklarının cihaza girmesini önlemede hayati öneme sahiptir. Burada, LFPI cihazını düzgün bir şekilde temizlemek, doldurmak ve monte etmek için yöntemler gösteriyoruz. Ayrıca, LFPI'nin uygulanabilirliğini doğrulamanın yolları olarak osiloskop çıkışlarını ve fare sağlama sürelerini de tartışacağız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. LFPI silindirinin temizlenmesi
- Transdüser mahfazasına ve dolum portuna bağlı şırıngaları ve ayrıca basınç dönüştürücüsüne bağlı kabloyu dikkatlice çıkarın (yaralanma cihazı bileşenlerinin şeması için Şekil 1'e bakın).
- Silindiri düşürmemeye dikkat ederken, silindiri serbest bırakmak için cihazın arkasındaki el düğmelerini silindir kelepçelerinden sökün.
- Silindirin, dönüştürücünün, dönüştürücü muhafazasının ve piston O-segmanlarının sonundaki pistonu çıkarın.
- Sıvıyı silindirden boşaltın.
- Silindire bulaşık deterjanı gibi hafif deterjan ekleyin ve bir bulaşık veya şişe fırçası kullanarak hafifçe ovalayın13.
- Tüm deterjanın durulandığından emin olmak için, silindiri tamamen suyla doldurun ve iyice durulayın.
2. Silindiri doldurmak için kullanılan sıvının gazını giderme
- Yeni kabarcıkların oluşumunu önlemek ve mevcut kabarcıkları emmek için silindiri yeniden doldurmadan önce sıvının gazını gidermek için bir vakum pompası kullanın.
NOT: Silindiri doldurmak için yaklaşık 1,5 L sıvı gerekecektir, ancak yaklaşık 2 L'lik gazın giderilmesi, kullanım ve test sırasında kaybedilen sıvının yerine koymak için küçük bir besleme bırakacaktır.
NOT: Ev tipi vakumlar, sıvının gazını etkili bir şekilde gidermek için çok zayıftır. Vakum, 25-28 inHg'lik bir basınç üretebilmelidir. - Sıvıya bir karıştırma çubuğu ekleyin ve sıvı kabını bir karıştırma plakasına yerleştirin. Gaz giderme işlemi sırasında sıvının karıştırılması, kabarcıklanmayı ve gaz salınımını uyarmaya yardımcı olur. Karıştırma ayrıca kabarcıklanmada büyük bir ani artışı önler.
NOT: Çok az kabarcık üretildiğinde gaz giderme işlemi sona ermelidir; Bu yaklaşık 45 dakika sonra gerçekleşir.
3. LFPI cihazının yeniden montajı
- Piston pistonuna ince bir petrol jölesi tabakası uygulayın.
- Pistonlu pistonu, silindir14'ten yaklaşık 32 mm çıkıntı yapan pistonla takın.
NOT: Hava, önde gelen O-ring'den önce sık sık pistonda sıkışır. Bu fazla havadan kurtulmak için, havayı bu boşluktan çıkarmak için içeri ve dışarı hareket ettirirken pistonu döndürün. - Diğer O-ringlere de ince bir petrol jölesi tabakası uygulayın ve dolum portundaki O-ring hariç, bunları silindire takın.
- Teflon bandı dönüştürücünün dişlerinin etrafına iki kez sarın.
4. LFPI cihazının yeniden doldurulması ve tabana takılması
- Gazdan arındırılmış sıvı ile doldurulmuş ve hava kabarcıkları içermeyen 10 mL'lik bir şırıngayı dönüştürücü muhafazasındaki Luer kilit göbeğine bağlayın.
- Dönüştürücüyü, dişli ucu yukarı bakacak şekilde tutun ve dönüştürücünün dişli bölgesinin içindeki kuyuyu, 10 mL'lik bir şırınga kullanarak gazdan arındırılmış sıvı ile tamamen doldurun. Buradaki amaç, herhangi bir hava kabarcığı sokmadan dönüştürücüyü iyice doldurmaktır. Dönüştürücünün altındaki hassas membrana iyi zarar vermemeye dikkat edin.
- Silindir, havanın transdüser mahfazasına tekrar girmesini önleyecek bir açıyla yerleştirildiğinde, transdüser mahfazasını silindir13'e takın ve sıkıca sıkmak için bir anahtar kullanın.
- Gazdan arındırılmış sıvı silindir kapasitesinin yaklaşık 2/3'üne ulaştığında kapağı dolum portundan ve silindirden çıkarın.
- Silindiri yatay olarak yerleştirin ve silindiri gazdan arındırılmış sıvı ile doldurmayı bitirin.
NOT: Hava kabarcıklarının oluşumunu önlemek için, sıvının yavaşça dökülmesi önerilir14. - Dolum portundaki kapağı yerine takın ve tüm tapaları kapatın.
- Herhangi bir hava kabarcığını dolum portu14'e çalıştırmak için silindiri manipüle edin.
- Dolum portundaki stopcock'u açın ve herhangi bir hava kabarcığını port14'ten dışarı itmek için dönüştürücü muhafazasındaki şırıngayı kullanarak sıvı enjekte edin.
- Tüm cihazı inceleyin ve hava kabarcığı olmadığından emin olun.
- Dolum kapağındaki Luer kilit göbeğine gazdan arındırılmış sıvı ile doldurulmuş 10 mL'lik bir şırınga ekleyin.
- El vidalarını kullanarak silindiri tabana yeniden takın.
- Silindirin yatay olduğundan ve sarkaç üzerindeki ağırlıklı çekicin merkezi ile sıralandığından emin olun.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bir LFPI cihazındaki hava kabarcığı kontaminasyonunun dalga formu oluşumu üzerindeki etkilerini test ettik. Cihaza hava kabarcıkları enjekte ettik ve osiloskop çıkışlarını kirlenmemiş bir LFPI cihazından toplanan osiloskop verileriyle karşılaştırdık. Koşullar aşağıdaki gibiydi: kirlenmemiş, 5 mL hava enjeksiyonu, 10 mL hava enjeksiyonu ve 15 mL hava enjeksiyonu. Sarkaçları tüm koşullar için tüm darbeler için tutarlı bir yükseklikte tuttuk ve koşul başına 15 darbe gerçekleştirdik.
Bir yaralanma gerçekleştirirken veya LFPI cihazını test ederken, osiloskop üzerindeki basınç dalga formu tek, keskin bir tepe noktası göstermelidir (Şekil 2A). Cihazdaki hava kabarcıklarının varlığı, çıkarılması gereken kabarcıkları gösteren birkaç kısa tepe noktasına sahip bir dalga formu ile sonuçlanacaktır (Şekil 2B). Cihazı yeniden monte ettikten sonra ve herhangi bir yaralanma seansından önce, cihazın tekrar tekrar çalıştığından emin olmak için sarkaçla dört ila beş test damlası (fare takılı değil) gerçekleştirmenizi öneririz. Basınç dalga formundaki düzensizliklere ek olarak, yaralanma / sahte LFPI sonrası davranış değişiklikleri de cihazın düzgün çalışıp çalışmadığının göstergesi olabilir. Yaralı fareler, sahte farelere kıyasla LFPI'den sonra uzun sağa dönüş refleks sürelerine sahip olmalı ve bu süreler izlenmeli ve kaydedilmelidir. Çok uzun veya çok kısa olan doğru süreler, yanlış cihaz montajının ve/veya temizliğinin bir göstergesi olabilir15. Benzer semptomlar, uygun şekilde temizlenmiş ve doldurulmuş bir cihazda da kademeli olarak ortaya çıkabilir (muhtemelen rutin kullanım sırasında kabarcıkların yavaş birikmesi nedeniyle), temizleme ve yeniden doldurmayı tekrarlama zamanının geldiğini gösterir. Her 6 ayda bir önleyici bakım planlamak, LFPI cihazının tutarlı performans göstermesini sağlamaya yardımcı olabilir.
Tablo 1'de görüldüğü gibi, hava kabarcıklarının varlığı, tamamen dolu, kirlenmemiş bir LFPI cihazına kıyasla dalga formunun voltajını değiştirdi. Hava kabarcığının boyutunun arttırılması, osiloskop çıkışları tarafından belirtildiği gibi, dalganın voltajını kademeli olarak azalttı.
Şekil 1: LFPI cihazının şeması ve yaralanmadan önce yapılan lateral kraniektomi. Bu cihaz, kafa içi basıncındaki artışa bağlı olarak beynin yer değiştirmesine ve / veya deformasyonuna neden olarak hayvan modellerinde kafatası kırığı olmayan TBI'ları çoğaltmak için kullanılır. Biorender.com ile oluşturuldu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: LFPI cihaz bakımını ve fonksiyonel durumunu değerlendirmek için basınç transdüseri çıkışının izlenmesi13. (A) Düzgün temizlenmiş ve çalışan bir LFPI cihazı tarafından üretilen basınç dalga formunun temsili görüntüsü. (B) Hava kabarcığı kontaminasyonunun varlığını gösteren bir basınç dalga formunun örnek görüntüsü. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Dört koşulun tümü için osiloskop çıkışlarının temsili görüntüsü . (A,B,C,D) Osiloskop, kirlenmemiş, sırasıyla 5 mL hava enjeksiyonu, 10 mL hava enjeksiyonu ve 15 mL hava enjeksiyonu için çıkış yapar. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
| Hava Kabarcığı Kontaminasyon Durumu | |||||
| Dolgulu ve Kirlenmemiş LFPI Cihazı | 5 mL Toplam Hava Enjeksiyonu | 10 mL Toplam Hava Enjeksiyonu | 15 mL Toplam Hava Enjeksiyonu | ||
| Dalga Formu Çıkışı (mV) | 240 | 218 | 230 | 218 | |
| 234 | 222 | 226 | 220 | ||
| 240 | 228 | 226 | 220 | ||
| 244 | 226 | 228 | 218 | ||
| 246 | 228 | 230 | 218 | ||
| 248 | 232 | 226 | 220 | ||
| 248 | 230 | 226 | 220 | ||
| 250 | 230 | 228 | 220 | ||
| 248 | 232 | 228 | 224 | ||
| 252 | 232 | 228 | 222 | ||
| 250 | 232 | 226 | 220 | ||
| 250 | 230 | 228 | 222 | ||
| 252 | 230 | 228 | 222 | ||
| 252 | 232 | 228 | 220 | ||
| Ortalama Dalga Formu Çıkışı (mV) | 246.7 | 228.7 | 227.6 | 220.3 | |
Tablo 1: Kirlenmemiş kontrol grubundan osiloskop gerilim çıkışları, kontamine koşullara kıyasla. Kirlenmemiş koşullar ile kontamine olmuş her durum arasında eşleştirilmiş t-testleri yapıldı. Tüm kontamine koşullar, kontamine olmayan koşullara kıyasla anlamlı derecede azaldı (p < 0.0001).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Yukarıda özetlenen teknikler, bir LFPI cihazının nasıl düzgün bir şekilde korunacağını göstermektedir. LFPI cihazının doğru ve güvenilir bir şekilde çalışmasını sağlamak için rutin temizlik ve izleme gereklidir. Ek olarak, LFPI prosedürünün invaziv doğası nedeniyle, laboratuvar hayvanlarının enfeksiyonunu önlemek için cihazın iyice temizlenmesi zorunludur.
Cihazda hava kabarcıklarının oluşumundan kaçınmak, optimum yaralanmalar ve basınç dalga formları elde etmek için çok önemlidir. Hava kabarcıkları, beyne verilen basınç darbesinin özelliklerini değiştirerek tutarsız yaralanmalara neden olur ve klinik TBI'ların düzgün bir şekilde çoğaltılmasını zorlaştırır. Burada toplanan ek veriler, hava kabarcığı kontaminasyonunun bir darbe tarafından üretilen dalganın voltajını değiştirdiğini göstermektedir. Şekil 3'te gösterilen osiloskop çıkışları, havanın basınç dalgaları üzerindeki etkilerini göstermeye yardımcı olur; dalga formları o kadar keskin değildir ve bunun yerine hava kirliliği olduğunda birden fazla zirveye sahiptir. LFPI cihazının amacı, beyne tekil bir ölçülebilir sıvı darbesi sağlamaktır; Sonuçlar, hava kabarcıkları mevcut olduğunda, çoklu darbelerin oluşturulduğunu ve beyne hangi basıncın uygulandığını ayırt etmeyi zorlaştırdığını göstermektedir.
Burada kullanılan teknikler, gazların cihaza girme olasılığını azaltır ve / veya yine de sıvıyı kirletebilecek küçük gaz ceplerinin giderilmesine yardımcı olur. Gazdan arındırılmış sıvı kullanmak, hava kabarcığı kontaminasyonu riskini azaltır ve bakım aralığınıuzatabilir 13. Bu nedenle, adım 2'de gerçekleştirilen eylemler, LFPI cihazında hava kabarcığı oluşum olasılığını azaltmak için kritik öneme sahiptir. Adım 3.4-3.9, yaralanmaları gerçekleştirmeden önce cihazda kalan gazların çıkarılmasının önemini vurgulamaktadır. Yaralanma cihazını yeniden monte ettikten sonra, hem basınç dönüştürücüsünde hem de dolum portunun merkezinde görünürlüğün sınırlı olması dikkat çekicidir; Bu nedenle, silindiri doldurduktan sonra hava kabarcığı oluşumunu kontrol ederken bu alanlara özellikle dikkat edilmelidir.
Bu prosedür, Custom Design &; Fabrication Inc. tarafından yapılan LFPI cihazına özel olarak uyarlanmıştır. diğer şirketler tarafından üretilen LFPI cihazları kullanılırken protokolde küçük değişiklikler yapılması gerekebilir.
Bir LFPI cihazının temizlenmesi ve yeniden monte edilmesi zaman ve dikkat gerektirir, ancak tutarlı yaralanmalar üretmenin anahtarıdır. Hava kabarcıklarından kaçınmak, hatalı sonuçları azaltmaya ve ek deneyler yapma ihtiyacını sınırlamaya yardımcı olabileceğinden özellikle önemlidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Hiçbir çıkar çatışması beyan edilmedi.
Acknowledgments
Yazarlar, teknik yardım ve destekleri için Custom Design &; Fabrication Inc.'e teşekkür eder. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından finanse edilmiştir: R01NS120099-01A1 ve R37HD059288-19 hibeleri.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 - 10 mL syringes with Luer lock capability | Ensures that needle is secure and reduces possible leaks of fluid | ||
| Degassed fluid | Helps to reduce air bubble formation during injury procedure | ||
| Fluid Percussion Injury (FPI) device (Model 01-B) | Custom Designs & Fabrications Inc. | N/A | Injury device used to model TBI in rodents |
| Mild detergent | Allows to thoroughly clean the LFPI cylinder | ||
| Petroleum Jelly | Used as a water-repellent and protects LFPI device form rust | ||
| Teflon tape | Helps with tight seal of pipe joints on the LFPI device | ||
| *Materials other than the LFPI device can be purchased from any reliable company. |
References
- Centers for Disease Control and Prevention. Surveillance Report of Traumatic Brain Injury-related Emergency Department Visits, Hospitalizations, and Deaths. Centers for Disease Control and Prevention, U.S. Department of Health and Human Services. , https://www.cdc.gov/traumaticbraininjury/get_the_facts.html (2014).
- Dewan, M. C. Estimating the global incidence of traumatic brain injury. Journal of Neurosurgery. 130 (4), 1080-1097 (2018).
- National Center for Injury Prevention and Control; Division of Unintentional Injury Prevention. Traumatic Brain Injury in the United States: Epidemiology and Rehabilitation. , Centers for Disease Control and Prevention. Atlanta, GA. (2015).
- Holm, L., Cassidy, J. D., Carroll, L. J., Borg, J. Summary of the WHO Collaborating Centre for neurotrauma task force on mild traumatic brain injury. Journal of Rehabilitation Medicine. 37 (3), 137-141 (2005).
- Pavlovic, D., Pekic, S., Stojanovic, M., Popovic, V. Traumatic brain injury: neuropathological, neurocognitive and neurobehavioral sequelae. Pituitary. 22 (3), 270-282 (2019).
- Dixon, C. E. A fluid percussion model of experimental brain injury in the rat. Journal of Neurosurgery. 67 (1), 110-119 (1987).
- McIntosh, T. K. Traumatic brain injury in the rat: characterization of a lateral fluid-percussion model. Neuroscience. 28 (1), 233-244 (1989).
- Ma, X., Aravind, A., Pfister, B. J., Chandra, N., Haorah, J. Animal models of traumatic brain injury and assessment of injury severity. Molecular Neurobiology. 56 (8), 5332-5345 (2019).
- Nwafor, D. C. Pediatric traumatic brain injury: an update on preclinical models, clinical biomarkers, and the implications of cerebrovascular dysfunction. Journal of Central Nervous System Disease. 14, (2022).
- Turner, R. C. Modeling chronic traumatic encephalopathy: the way forward for future discovery. Frontiers in Neurology. 6, 223 (2015).
- Petersen, A., Soderstrom, M., Saha, B., Sharma, P. Animal models of traumatic brain injury: a review of pathophysiology to biomarkers and treatments. Experimental Brain Research. 239 (10), 2939-2950 (2021).
- Sullivan, H. G. Fluid-percussion model of mechanical brain injury in the cat. Journal of Neurosurgery. 45 (5), 521-534 (1976).
- Fluid Percussion Injury Model 01-B: General Operation. , Custom Design & Fabrication, Inc. Available from: http://www.cdf-products.com/ (2023).
- Fluid Percussion Injury Model 01-B: Assembly Instructions. , Custom Design & Fabrication, Inc. Available from: http://www.cdf-products.com/ (2023).
- Pernici, C. D. Longitudinal optical imaging technique to visualize progressive axonal damage after brain injury in mice reveals responses to different minocycline treatments. Scientific Reports. 10, 7815-78 (2020).
