Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

הדמיה תוך חיונית של ביטוי חלבון פלואורסצנטי בעכברים עם פגיעה מוחית טראומטית בגולגולת סגורה וחלון גולגולת באמצעות מיקרוסקופ דו-פוטוני

Published: April 21, 2023 doi: 10.3791/64701
Automatic Translation
1,2, 3, 1, 3, 1
1Department of Neurology, University of Massachusetts Chan Medical School, 2Department of Neurosurgery, The First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, 3Department of Neurobiology, University of Massachusetts Chan Medical School

Summary

מחקר זה מדגים העברה של פגיעה מוחית טראומטית חוזרת ונשנית לעכברים והשתלה סימולטנית של חלון גולגולתי לצורך הדמיה תוך-חיונית עוקבת של EGFP המתבטא בנוירונים באמצעות מיקרוסקופ של שני פוטונים.

Abstract

מטרת פרוטוקול זה היא להדגים כיצד לדמיין לאורך זמן את הביטוי והלוקליזציה של חלבון מעניין בתוך סוגי תאים ספציפיים במוחו של בעל חיים, בעת חשיפה לגירויים אקסוגניים. כאן מוצג ניהול של פגיעה מוחית טראומטית בגולגולת סגורה (TBI) והשתלה סימולטנית של חלון גולגולתי לצורך הדמיה תוך-חיונית אורכית עוקבת בעכברים. עכברים מוזרקים תוך גולגולתית עם וירוס הקשור לאדנו (AAV) המבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר (EGFP) תחת מקדם ספציפי לנוירונים. לאחר 2 עד 4 שבועות, העכברים עוברים TBI חוזר ונשנה באמצעות מכשיר ירידה במשקל מעל מיקום הזרקת AAV. באותו ניתוח משתילים את העכברים עמוד ראש מתכתי ולאחר מכן חלון גולגולת זכוכית מעל אתר הפגיעה בפגיעה מוחית טראומטית. הביטוי והמיקום התאי של EGFP נבדקים באמצעות מיקרוסקופ של שני פוטונים באותו אזור במוח שנחשף לטראומה במשך חודשים.

Introduction

פגיעה מוחית טראומטית (TBI), שיכולה לנבוע מפציעות ספורט, התנגשויות בכלי רכב ולחימה צבאית, היא דאגה בריאותית עולמית. פגיעה מוחית טראומטית יכולה להוביל לליקויים פיזיולוגיים, קוגניטיביים והתנהגותיים, ולנכות או תמותה לכל החיים 1,2. חומרת TBI יכולה להיות מסווגת כקלה, בינונית וחמורה, כאשר הרוב המכריע הוא TBI קל (75%-90%)3. יותר ויותר מכירים בכך שפגיעה מוחית טראומטית, במיוחד התרחשויות חוזרות ונשנות של TBI, יכולה לקדם ניוון עצבי ולשמש כגורמי סיכון למספר מחלות נוירודגנרטיביות, כולל מחלת אלצהיימר (AD), טרשת אמיוטרופית צידית (ALS), דמנציה פרונטוטמפורלית (FTD) ואנצפלופתיה טראומטית כרונית (CTE)4,5,6. עם זאת, המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס ניוון עצבי הנגרם על-ידי TBI עדיין אינם ברורים, ולכן הם מייצגים תחום מחקר פעיל. כדי לקבל תובנה לגבי האופן שבו תאי עצב מגיבים לפגיעה מוחית טראומטית ומתאוששים ממנה, שיטה לניטור חלבונים בעלי תיוג פלואורסצנטי של עניין, במיוחד בתוך תאי עצב, באמצעות הדמיה תוך-חיונית אורכית בעכברים לאחר TBI מתוארת כאן.

לשם כך, מחקר זה מראה כיצד לשלב הליך כירורגי למתן TBI בגולגולת סגורה הדומה למה שדווח בעבר7,8, יחד עם הליך כירורגי להשתלת חלון גולגולתי לדימות תוך חיוני במורד הזרם, כפי שתואר על ידי Goldey et al9. יש לציין כי אין זה ריאלי להשתיל תחילה חלון גולגולתי ולאחר מכן לבצע TBI באותו אזור, שכן ההשפעה של ירידת המשקל שגורמת לפגיעה מוחית טראומטית עלולה לפגוע בחלון ולגרום נזק בלתי הפיך לעכבר. לכן, פרוטוקול זה תוכנן לנהל את הפגיעה המוחית טראומטית ולאחר מכן להשתיל את חלון הגולגולת ישירות מעל אתר הפגיעה, והכל באותו מפגש כירורגי. יתרון בשילוב של TBI והשתלת חלון גולגולתי בפגישה כירורגית אחת הוא הפחתה במספר הפעמים שעכבר נתון לניתוח. יתר על כן, היא מאפשרת לאדם לעקוב אחר התגובה המיידית (כלומר, על ציר הזמן של שעות) לפגיעה מוחית טראומטית, בניגוד להשתלת החלון בפגישה כירורגית מאוחרת יותר (כלומר, הדמיה ראשונית שמתחילה בסקאלת זמן של ימים לאחר TBI). חלון הגולגולת ופלטפורמת הדימות התוך חיונית מציעים גם יתרונות על פני ניטור חלבונים עצביים בשיטות קונבנציונליות כגון צביעה חיסונית של רקמות קבועות. לדוגמה, פחות עכברים נדרשים לדימות תוך-חיוני, מכיוון שניתן לחקור את אותו עכבר במספר נקודות זמן, בניגוד לקבוצות נפרדות של עכברים הדרושות לנקודות זמן נפרדות. יתר על כן, אותם נוירונים יכולים להיות מנוטרים לאורך זמן, המאפשר אחד לעקוב אחר אירועים ביולוגיים או פתולוגיים ספציפיים בתוך אותו תא.

כהוכחת היתכנות, הביטוי הספציפי לנוירון של חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר (EGFP) תחת מקדם הסינפסינים מודגם כאן10. גישה זו יכולה להיות מורחבת ל 1) סוגים שונים של תאי מוח על ידי שימוש במקדמים ספציפיים אחרים לסוג התא, כגון מקדם חלבון בסיסי מיאלין (MBP) עבור אוליגודנדרוציטים ומקדם חלבון גליה פיברילרי חומצי (GFAP) עבור אסטרוציטים11, 2) חלבוני מטרה שונים בעלי עניין על ידי מיזוג הגנים שלהם עם הגן EGFP, ו -3) ביטוי משותף של חלבונים מרובים המאוחים לפלואורופורים שונים. כאן, EGFP נארז ומתבטא באמצעות משלוח וירוס הקשור אדנו (AAV) באמצעות זריקה תוך גולגולתית. TBI בעל גולגולת סגורה מנוהל באמצעות מכשיר לירידה במשקל, ואחריו השתלה של חלון גולגולתי. הדמיה של EGFP עצבי מושגת דרך חלון הגולגולת, באמצעות מיקרוסקופ שני פוטונים כדי לזהות פלואורסצנטיות EGFP in vivo. עם לייזר שני פוטונים, ניתן לחדור עמוק יותר לתוך רקמת קליפת המוח עם נזק פוטוגרפי מינימלי, המאפשר הדמיה אורכית חוזרת ונשנית של אותם אזורים בקליפת המוח בתוך עכבר בודד במשך ימים ועד חודשים12,13,14,15. לסיכום, גישה זו של שילוב ניתוח TBI עם הדמיה תוך-חיונית שואפת לקדם את ההבנה של האירועים המולקולריים התורמים לפתולוגיה של מחלות המושרות על ידי TBI16,17.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הפרוטוקולים הקשורים לבעלי חיים נערכו בהתאם למדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה שפורסם על ידי ועדת המועצה הלאומית למחקר (ארה"ב). הפרוטוקולים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של בית הספר לרפואה של אוניברסיטת מסצ'וסטס צ'אן (UMMS) (היתר מספר 202100057). בקצרה, כפי שניתן לראות בסכמת המחקר (איור 1), החיה מקבלת זריקת וירוס, TBI, השתלת חלון, ואז הדמיה תוך-חיונית ברצף זמן.

הערה: מונחים מסחריים הוסרו. עיין בטבלת החומרים עבור הציוד הספציפי שבו נעשה שימוש.

1. הזרקה תוך גולגולתית של AAV באמצעות מכשיר סטריאוטקסי

  1. AAV(PHP.eB)-Syn1-EGFP
    1. השתמש titer ויראלי של 1 x 1013 גנומים נגיפיים למיליליטר (vg / mL). Syn1 מתייחס ל-Synapsin1, שהוא פרומוטור ספציפי לנוירונים המאפשר ביטוי נגיפי מוגבל בנוירונים. ניתן להכין את הנגיף בתוך החברה או במיקור חוץ.
  2. הכנה לניתוח הזרקה סטריאוטקסית למתן AAV
    1. מספריים רגילים אוטוקלאבים, קליפר כירורגי, מספריים קפיציים כירורגיים, מלקחיים כירורגיים, מלקחיים נגד יתושים, גזה, מוליך כותנה ומזרק מיקרוליטר זכוכית.
    2. יש לחטא את אזור הניתוח באמצעות אתנול 75%. הרחב את הווילונות הכירורגיים הסטריליים החד פעמיים כדי לכסות את אזור הניתוח על הפלטפורמה הסטריאוטקסית.
      הערה: כדי לשמור על טמפרטורת הגוף של בעלי החיים במהלך ניתוח ההזרקה, השתמש במכשיר חימום מווסת משוב.
    3. שקול ורשום את משקל גוף העכבר.
    4. פתח את שסתום מיכל החמצן וכוונן את זרימת החמצן ל- 1.5 ליטר לדקה. פתח את מכונת ההרדמה והגדר את ערך רמת האיזופלורן לשלוש.
      הערה: גז המוביל יכול להיות אוויר בחדר או 100% חמצן בשלב זה.
    5. הכנס את העכבר לתא האינדוקציה ותן לו להישאר במשך 5 דקות כדי להשיג הרדמה מלאה.
    6. לאחר שהעכבר מורדם לחלוטין (כלומר, קצב נשימה איטי אך יציב בערך מחזור אחד לכל 2 שניות, יחד עם היעדר רפלקס צביטת זנב), הסר את העכבר מתא ההשראה והנח את ראש העכבר במסגרת הסטריאוטקסית.
    7. הניחו את חרוט האף של צינור ההרדמה מעל חוטמו של העכבר.
    8. יש להקפיד על הרדמה באמצעות איזופלורן 1.5%, עם גז נשא בקצב זרימה של 1 ליטר/דקה עד סוף הניתוח. בדוק מעת לעת את תדירות הנשימה, וספק צביטת זנב או בוהן לפחות כל 15 דקות במהלך הניתוח כדי להעריך הרדמה מתאימה. התאם את ריכוז האיזופלורן לפי הצורך כדי לשמור על עומק ההרדמה הרצוי.
    9. מלא מזרק מיקרוליטר (10 μL) עם פתרון הנגיף. לאחר מכן, קבע את המזרק על משאבת המיקרו-מזרק התואמת של המכשיר הסטריאוטקסי.
  3. ניתוח הזרקה
    1. יש לתת בופרנורפין (1 מ"ג/ק"ג, תת עורית) באמצעות מזרק אינסולין חד פעמי ולמרוח משחת עיניים סיכה על עיני העכבר.
    2. הסר את השיער מהקרקפת על גבי הראש על ידי חיתוך עם מספריים רגילים 1.
    3. נקו את עור הקרקפת עם אפליקטורים עם גזה וכותנה. יש לחטא את העור באמצעות אתנול 75% תחילה ולאחר מכן בטאדין. חזור על פעולה זו שלוש פעמים (כלומר, אתנול ואחריו betadine), משאיר את היישום הסופי של betadine על העור.
    4. בדוק שוב את עומק ההרדמה כדי לוודא שהעכבר מורדם לחלוטין (כלומר, קצב נשימה איטי אך יציב בערך מחזור אחד לכל 2 שניות, יחד עם היעדר רפלקס צביטת זנב). בצע חתך ~ 1 ס"מ באמצעות מספריים רגילים 2 לאורך קו האמצע כדי לחשוף את הגולגולת הקודקודית הימנית, והסר את periosteum באמצעות מוליך כותנה.
    5. סמן שתי נקודות על הגולגולת באמצעות עט טוש בקואורדינטות הבאות: נקודה A: 2.5 מ"מ אחורית לברגמה ו 1 מ"מ לרוחב לקו האמצע מעל ההמיספרה הימנית; נקודה B: 2.5 מ"מ אחורית לברגמה ו-2 מ"מ צידית לקו האמצע מעל ההמיספרה הימנית.
    6. קדח בזהירות שני חורים דרך הגולגולת בקואורדינטות המסומנות באמצעות מקדחה דנטלית חשמלית עם ביט קרביד EF4 עדין.
      הערה: היזהר לא לפגוע ברקמת המוח.
    7. התאם את המסגרת הסטריאוטקסית כדי ליישר את קצה מחט מזרק המיקרוליטר לחור הגולגולת שהוא 1 מ"מ לרוחב לקו האמצע.
    8. הורידו את מחט המזרק כדי לגעת בפני השטח של המוח, ואז הגדירו את המיקום הזה כנקודת האפס (עבור ציר z). הורידו את קצה המחט לקליפת המוח לעומק של 0.5 מ"מ, והזריקו לאט 1 מיקרוליטר של תמיסת הנגיף במהירות של 200 nL/min.
    9. המתן 5 דקות לאחר שתמיסת הנגיף מוזרקת לחלוטין לרקמת המוח לפני משיכת המחט כדי למנוע זרימה חוזרת של התמיסה.
    10. למשוך לאט את מחט מזרק. חזור על ההזרקה באתר השני. תפרו את החתך בתפר כירורגי סטרילי שאינו נספג (מד 6-0).
    11. יש לתת cefazolin [500 מ"ג / ק"ג (333 מ"ג / מ"ל, בדרך כלל ~ 45 μL), תוך שרירית], ו meloxicam (5 מ"ג / ק"ג, תת עורית) לאחר ניתוח כאשר החיה עדיין מורדמת.
    12. שחררו את העכבר מהמסגרת הסטריאוטקסית והפסיקו את ההרדמה. הניחו את העכבר בכלוב נקי מעל שמיכת חימום, והשגיחו על בעל החיים עד שהוא אמבולטורי (כ-15 דקות). לאחר מכן, להעביר לכלוב הביתי.
    13. מתן buprenorphine (1 מ"ג / ק"ג, תת עורית) ו meloxicam (5 מ"ג / ק"ג, תת עורית) שוב ב 8 שעות, 16 שעות, ו 24 שעות, בהתאמה, לאחר הזרקת buprenorphine הראשון.
      הערה: 2-4 שבועות לאחר הזרקת הנגיף, העכבר מקבל TBI והשתלת חלון גולגולתי באותו אתר כמו הזרקת AAV.

2. מתן אינדוקציה חוזרת של פגיעה מוחית טראומטית

הערה: הפרמטרים של TBI מותאמים מדוחות קודמים7,8, שבהם השפעת TBI נמסרה פעם אחת. הפרוטוקול כאן מחיל את אותו פרמטר, למעט הגדלת מספר ההשפעה הכולל ל -10.

  1. ציוד TBI
    1. השתמשו במכשיר נייד שנבנה במיוחד לניהול TBI בעל גולגולת סגורה (איור 2A) לראש העכבר בצד ימין, כפי שמצוין באיור 2B.
  2. הכנה לפני ניתוח
    1. ציוד לניתוחי אוטוקלאב, כולל מספריים רגילים, קליפר כירורגי, מספריים קפיציים כירורגיים, מלקחיים כירורגיים, מלקחיים נגד יתושים, חתיכות עמוד ראש, גזה ומוליכי כותנה.
    2. לשקול ולרשום את משקל הגוף של העכבר 2 שעות לפני הניתוח. כדי למזער בצקת במוח במהלך השתלת חלון גולגולתי, הזריקו דקסמטזון נתרן פוספט במינון של 4.8 מ"ג/ק"ג [2 מ"ג/מ"ל, בדרך כלל ~70 מיקרוליטר (צריך להזריק בשני אתרים)] לשריר הארבע ראשי באמצעות מזרק אינסולין. לאחר הזרקת דקסמתזון, אך לפני תחילת ניתוח TBI, הכינו את חלונות הזכוכית כפי שמצוין בשלב 3.1 לשימוש מאוחר יותר.
    3. יש לחטא את השלב הכירורגי ואת ציוד ה-TBI באמצעות אתנול 75%, ולהרחיב את הווילונות הכירורגיים הסטריליים החד-פעמיים כדי לכסות את שלב הניתוח בפלטפורמה הסטריאוטקסית. הפעל את מכשיר החימום ואת צג הטמפרטורה וקבע את טמפרטורת היעד ל -37 מעלות צלזיוס.
    4. פתח את שסתום מיכל החמצן וכוונן את זרימת החמצן ל- 1.5 ליטר לדקה. פתח את מכונת ההרדמה והגדר את ערך רמת האיזופלורן לשלוש.
      הערה: 100% חמצן טהור יכול לעזור לחיה לשרוד את השפעות TBI.
    5. הכנס את העכבר לתא האינדוקציה ותן לו להישאר במשך 5 דקות כדי להשיג הרדמה מלאה.
    6. לאחר שהעכבר מורדם לחלוטין (כלומר, קצב נשימה איטי אך יציב בערך מחזור אחד לכל 2 שניות, יחד עם היעדר רפלקס צביטת זנב), הסר את העכבר מתא ההשראה והנח את ראש העכבר במסגרת הסטריאוטקסית.
    7. הניחו את חרוט האף של צינור ההרדמה מעל חוטמו של העכבר.
    8. יש להקפיד על הרדמה באמצעות 1.5% איזופלורן מעורבב עם 100% חמצן טהור בקצב זרימה של 1 ליטר/דקה עד סוף הניתוח. בדוק מעת לעת את תדירות הנשימה, וספק צביטת זנב או בוהן לפחות כל 15 דקות במהלך הניתוח כדי להעריך הרדמה מתאימה. התאם את ריכוז האיזופלורן לפי הצורך כדי לשמור על עומק ההרדמה הרצוי.
  3. ניתוח TBI
    1. יש לתת בופרנורפין (1 מ"ג/ק"ג, תת עורית) באמצעות מזרקי אינסולין חד פעמיים ולמרוח משחה אופתלמית על עיני העכבר.
    2. הסר את השיער מהחלק העליון של הראש על ידי חיתוך עם מספריים 1, ולאחר מכן מריחת סוכן depilatory במשך 1 דקות.
      אזהרה: אין למרוח את המוצר מסיר השיער במשך יותר מ-3 דקות על הקרקפת, מכיוון שהוא מגרה את העור. הימנע מקבל כל חומר depilatory על העיניים של העכבר.
    3. נקו את עור הקרקפת על ידי מריחת גזה ואפליקטורים עם קצוות כותנה. לאחר מכן, לחטא את העור, באמצעות אתנול 75% תחילה ולאחר מכן betadine. חזור על פעולה זו שלוש פעמים (כלומר, אתנול ואחריו betadine), משאיר את היישום הסופי של betadine על העור.
    4. בדוק שוב את עומק ההרדמה כדי לוודא שהעכבר מורדם לחלוטין (כלומר, קצב נשימה איטי אך יציב בערך מחזור אחד לכל 2 שניות, יחד עם היעדר רפלקס צביטת זנב). מלקחיים את העור במלקחיים כירורגיים 3, ומבצעים חתך בקו האמצע באורך 12-15 מ"מ החל מכ-3 מ"מ אחורי מהעיניים.
    5. הבלו את העור על ההמיספרה השמאלית והימנית של הגולגולת באמצעות מספריים קפיץ 2.
    6. לאחר חשיפת הגולגולת, הסירו את הפריאוסטאום על ידי שפשוף עדין עם מוליך סטרילי עם קצוות כותנה ושטיפה במי מלח סטריליים.
    7. בדוק חזותית את מצב הגולגולת כדי לוודא שהיא שלמה, למעט שני חורים קטנים, שנעשו עבור ניתוח הזרקת הנגיף הקודם.
    8. יבשו את אזור הגולגולת וסמנו את אתר הפגיעה TBI בקואורדינטות הבאות: 2.5 מ"מ אחורי לברגמה ו-2 מ"מ רוחבי מתפר הקשת מימין (איור 2B).
    9. הסר במהירות את העכבר מהמסגרת הסטריאוטקסית והנח את הראש על כרית החיץ מתחת להתקן TBI.
    10. ישר את קצה המשפיע לאתר ההשפעה המסומן.
    11. הרימו את עמוד המתכת על ידי משיכת חוט הניילון הקשור לגובה של 15 ס"מ מעל ראש העכבר ואז שחררו אותו, מה שמאפשר למשקולת ליפול בחופשיות על מוט המתמר, שנמצא במגע עם ראש הגולגולת באתר TBI. אל תיגע בראש העכבר בעת פגיעת TBI.
    12. העבירו את העכבר על שמיכת החימום, והניחו אותו על גבו תוך מעקב אחר מצב הנשימה.
    13. ברגע שהעכבר מעביר את עצמו ממצב שכיבה למצב נוטה, הכנס את העכבר לתא השראת איזופלורן למשך ~5 דקות עם 3% איזופלורן מעורבב עם 100% חמצן טהור בקצב זרימה של 1.5 ליטר לדקה.
    14. ברגע שהעכבר מורדם לחלוטין (כלומר, קצב נשימה איטי אך יציב בערך מחזור אחד לכל 2 שניות, יחד עם היעדר רפלקס צביטת זנב), חזור על שלבים 2.3.9-2.3.14 כדי להשיג סך של 10 פגיעות.
      הערה: עשר השפעות TBI נמצאו כגורמות לפנוטיפ חזק עם תמותת עכברים נמוכה במחקר שלנו (הנתונים טרם פורסמו). ניתן להתאים את הפרמטרים כדי להשיג חומרה שונה של פגיעה מוחית על ידי הגדלה או הקטנה של מספר הפגיעות ו / או הגובה שממנו המשקל משתחרר. כל הפרמטרים כפופים לאישור IACUC המקומי.
    15. בדוק את הגולגולת תחת מיקרוסקופ כירורגי, והסר את העכבר מהמחקר אם התרחש שבר בגולגולת.
    16. עבור ניתוח דמה, בצע את אותם הליכים שתוארו לעיל, כולל מיקום של בעל החיים מתחת למשפיע, אך מבלי לספק את ההשפעות של TBI.
    17. לאחר שהעכבר מעביר את עצמו ממצב שכיבה למצב נוטה בעקבות פגיעת TBIהעשירית , הכנס את העכבר לתא ההשראה של איזופלורן למשך ~5 דקות. בצע את שלבים 2.2.6-2.2.8 כדי למקם את ראש העכבר על המסגרת הסטריאוטקסית עבור ניתוח השתלת חלון הגולגולת המתואר להלן.

3. ניתוח השתלת חלון גולגולתי

הערה: שלבי השתלת חלון הגולגולת להלן אומצו על ידי Goldey et al.9, והמפרט שלהם של עמוד הראש ובאר ההדמיה יושמו כאן.

  1. הכנת חלון
    הערה: השלם את הכנת החלון בשלב 2.2.2 לפני תחילת ניתוח TBI. החלון עשוי משני כיסויי זכוכית עגולים (אחד בקוטר 3 מ"מ ואחד בקוטר 5 מ"מ, כפי שניתן לראות באיור 2C) המחוברים יחד באמצעות דבק אופטי שקוף, כמתואר להלן.
    1. יש לחטא את כיסויי הזכוכית על ידי טבילתם באתנול 75% למשך 15 דקות. הוציאו את כיסויי הזכוכית מהאתנול והשאירו אותם להתייבש על משטח סטרילי (כלומר, מכסה של צלחת סטרילית בת 24 בארות) למשך ~10 דקות.
    2. מלאו מזרק אינסולין בדבק אופטי שקוף תוך הימנעות מהיווצרות בועות. תחת מיקרוסקופ 1 (טבלת חומרים) בהגדלה של 0.67x, הניחו טיפה קטנה (~1 μL) של דבק אופטי במרכז הכיסוי בקוטר 5 מ"מ. לאחר מכן, הניחו מיד את הכיסוי בקוטר 3 מ"מ למעלה, ומרכזו אותו עם הכיסוי בקוטר 5 מ"מ.
    3. הפעילו לחץ בעדינות באמצעות מלקחיים עדינים כדי לפזר את הדבק באופן שווה. השליכו את חלון הזכוכית אם נוצרת בועה או קיר סביב החלקת הכיסוי בקוטר 3 מ"מ.
    4. כדי לרפא את הדבק, הניחו את הכיסויים בקופסת UV למשך 150 שניות בעוצמה של 20 x 100 μJ / cm2. בדקו ששתי החלקות מלוכדות היטב, על ידי שימוש במלקחיים 4 כדי לדחוף בעדינות את הצד של החלקה בקוטר 3 מ"מ. אם הכיסוי זז, החזירו אותו לקופסת UV למשך 60 שניות נוספות. אחסנו את חלון הזכוכית בצלחת סטרילית בת 24 בארות לשימוש מאוחר יותר.
  2. מחוספס את פני הגולגולת.
    הערה: מכאן והלאה, בצע את כל השלבים בסעיף 3 תחת מיקרוסקופ כירורגי. התחל עם פי 10, והתאם להגדלה הרצויה.
    1. קדח בעדינות ובאיטיות את פני השטח של הגולגולת באמצעות ביט קרביד FG4 במהירות רוטור נמוכה (כלומר, מספר פלט מוגדר ל~1-2) כדי להסיר את הפריאוסטאום שנותר וליצור משטח גולגולת מחוספס, כך שהמלט הדנטלי נקשר היטב לגולגולת. ניתן להשתמש כאן גם באזמל במקום מקדחה כחלופה.
    2. השתמשו במי מלח כדי לשטוף ולנקות אבק עצמות מפני השטח של הגולגולת.
  3. להפריד את השרירים.
    הערה: הפרדת שרירים משמשת להגדלת שטח הפנים של עצם הגולגולת החשופה שתשמש כנקודת מגע לצמנט הדנטלי, ובכך מבטיחה שלמות מבנית של השתל. שלב הפרדת שרירים זה חושף בדרך כלל ~ 3 מ"מ של צלחת הגולגולת הטמפורלית.
    1. בערך 5 מ"מ אחורי לעין, שם ממוקם התפר המחבר בין הגולגולת הקודקודית והרקתית, הכנס בעדינות את הקצוות העדינים הסגורים (#5/45 מלקחיים) כדי להפריד את השרירים הרוחביים מהגולגולת, והזז בעדינות את הקצוות הסגורים בכיוון האחורי עד לתפר הלמבדואיד.
    2. להפריד את השרירים הרוחביים בצד שבו השתלת חלון הגולגולת תתרחש.
      הערה: היזהר לא להפריד את השרירים קרוב מדי לעין, כדי למנוע פגיעה בעורק העיניים; אחרת, דימום חמור ומתמשך עלול להתרחש. אין להפריד את השרירים מהעצם העורפית, מכיוון שהעכבר דורש משרירים אלה להרים את ראשו.
    3. לשטוף את הפסולת מאתר הניתוח באמצעות מלוחים ולייבש את האזור עם גזה. קצף ג'ל ניתן להחיל על האתר הכירורגי כדי לעצור את הדימום.
  4. השתילו את עמוד הראש.
    1. השתמשו במצב ראש עשוי טיטניום בהתאמה אישית (איור 2D), שתואר בפרסום קודם9, כדי לקבע את ראש העכבר בבטחה בזמן ביצוע ניתוח הקרניוטומיה, ולהדמיית שני פוטונים לאחר מכן.
    2. השתמש בעט טוש וקליפר כירורגי כדי לעקוב אחר היקף הקרניוטומיה על הגולגולת הנקייה והיבשה בצד ימין. נקודת המרכז של המעגל העוקב היא 2.5 מ"מ אחורית לברגמה ו-1.5 מ"מ מתפר הקשת בהמיספרה הימנית. קוטר המעגל העוקב הוא כ-3.2-3.5 מ"מ, מעט גדול יותר מכיסוי הזכוכית בקוטר 3 מ"מ. ודא שמעגל הקרניוטומיה יכול לכסות את אתרי הזרקת הנגיף (שני החורים שנוצרו בעת הזרקת הנגיף יכולים לשמש כהפניה) ואת אתר הפגיעה המוחית התומית.
    3. שחררו את מוט האוזן וסובבו את הראש כך שמישור הקרניוטומיה יהיה אופקי לחלוטין, ואז הדקו שוב את מוט האוזן.
    4. השתמשו במקל העץ של אפליקטור עם קצוות כותנה כדי להוסיף שתי טיפות קטנות של דבק-על לקצה הקדמי והאחורי של עמוד הראש.
    5. מקם את עמוד ראש הטיטניום מעל מרכז הקרניוטומיה, והתאם אותו במהירות כך שינוח באותו מישור שבו יושתל חלון הגולגולת. הפעל לחץ קל עד לייבוש דבק העל; זה בדרך כלל לוקח ~ 30 שניות.
    6. הכינו מלט דנטלי בכלי ערבוב קרמי מקורר מראש (שהו לפחות 10 דקות במקפיא של -20°C): ערבבו 300 מ"ג אבקת מלט, שש טיפות של נוזל בסיס מהיר וטיפה אחת של זרז, ולאחר מכן ערבבו את התערובת עד לערבוב יסודי (~15 פעמים).
      הערה: המלט צריך להיות בצק. אם הוא דק מדי, מערבבים פנימה עוד קצת אבקת מלט. אם הוא סמיך מדי, ערבבו פנימה נוזל בסיס מהיר, טיפה אחת בכל פעם, עד לקבלת מרקם בצק.
    7. יש למרוח במהירות כמות נדיבה של תערובת מלט דנטלי על ההיקף החיצוני של ההיקף המסומן, ולכסות כל משטח עצם חשוף. עם זאת, אין לכסות את האתר של craniotomy. אפשר ~ 15 דקות לצמנט הדנטלי להתייבש ולהתקשות לפני שתמשיך.
    8. שחררו את מוט האוזן והצמידו את עמוד הראש למסגרת המתכת כדי לוודא שהראש יציב לקידוח מדויק לאורך היקף הקרניוטומיה המסומן. אם יש מלט מעל אתר הקרניוטומיה, השתמש בסיבית הקרביד FG4 כדי לקדוח ולהסיר אותו.
  5. קרניוטומיה
    1. השתמש בקליפר כירורגי כדי לאמת את קוטר העיגול המסומן, כפי שהוגדר בשלב 3.4.2. התאימו לפי הצורך, כך שחלון הגולגולת יתאים היטב בתוך הקרניוטומיה.
    2. באמצעות מקדחה דנטלית חשמלית, חורטים ומדללים את הגולגולת לאורך החלק החיצוני של העיגול המסומן, באמצעות סיבית קרביד FG4 תחילה (מהירות מוגדרת לפלט ~ 9-10). כך נוצר "מסלול" שבתוכו ניתן לדלל את הגולגולת.
      התראה: כדי למזער את פגיעת החום ולהשיג מסלול חלק, המשך להזיז את המקדחה. אין לקדוח באותו מקום במשך יותר מ-2 שניות.
    3. מעת לעת, להפסיק לקדוח ולהשקות את כל האזור עם מלוחים סטריליים, כדי להפחית את החימום מן המקדחה כדי לשטוף את אבק העצם.
    4. המשך לדלל את הגולגולת באמצעות ביט FG1/4 קרביד, כמתואר בשלב 3.5.2, עד שהגולגולת תהיה דקה ושקופה.
      הערה: שימוש בשתי ידיים כדי להחזיק את המקדחה יכול להקל על השליטה במקדח ולהימנע מהחדרת המקדחה למוח.
    5. השלם את דילול הגולגולת באמצעות ביט קרביד EF4. כאשר נוצר סדק בין דש העצם לבין עצם הגולגולת שמסביב, לעיתים יש שחרור של נוזל עמוד השדרה המוחי (CSF), המעיד על כך שהגולגולת נקדחה לחלוטין.
    6. ממשיכים לדלל ולקדוח דרך שאר הגולגולת לאורך המסילה. הימנע לקדוח דרך הנקודה שבה כלי דם ברור חוצה מתחת לגולגולת כדי למנוע דימום.
    7. הכנס קצה מלקחיים עדין (מלקחיים 1) ~ 0.5 מ"מ דרך המקום הסדוק, והרם את דש העצם בעדינות כלפי מעלה מבלי להסיט פנימה את המוח שמתחתיו.
    8. לאחר הסרת דש העצם, השקו את אזור הקרניוטומיה במי מלח. פני השטח של המוח יכולים להיות גבוהים ב-1-2 מ"מ מקצה הקרניוטומיה.
    9. החל משלב זה, תמיד לכסות את המוח החשוף עם מלוחים כדי להגן על רקמת המוח.
    10. דימום עלול להתרחש בעת הרמת דש העצם באתרי ההזרקה המקוריים של AAV עקב הידבקות הרקמה וצמיחת כלי הדם לאחר ניתוח ההזרקה. אם זה קורה, לחץ בעדינות על האתר עם מוליך כותנה יבש למשך ~2 דקות (או יותר לפי הצורך). ניתן להשתמש בקצף ג'ל כדי לעצור את הדימום. אין להשתמש בכימיקלים או במלקחיים לחימום כדי לעצור את הדימום, מכיוון שהדבר עלול לגרום לפציעה.
    11. השתמש במלקחיים 1 כדי להסיר בעדינות את החומר הארכנואיד הנראה לעין.
  6. חלון זכוכית להשתלה
    1. השתמש במלקחיים כירורגיים 2 כדי להרים את חלון הזכוכית הסטרילי, כאשר כיסוי הזכוכית 3 מ"מ פונה כלפי מטה. מקמו וכווננו את חלון הזכוכית מעל אתר הקרניוטומיה כדי לוודא שהחלון יכול להתאים היטב לקצה הקרניוטומיה. כיסוי הזכוכית בקוטר 5 מ"מ נמצא למעלה.
    2. הכינו צמנט דנטלי באופן הבא: ערבבו 100 מ"ג אבקת מלט, שתי טיפות נוזל בסיס מהיר וטיפה אחת של זרז. מערבבים את התערובת עד לערבוב יסודי (~ 15 פעמים). המתן ~ 6 דקות עד שהמלט הופך בצקי וסמיך. אם המלט דק מדי, הוא עלול לחלחל לחלל שמתחת לחלון בשלב 3.6.4 ולטשטש את החלון.
    3. בזמן ההמתנה שהמלט יהפוך לבצקי ועבה, הפעילו כמות מספקת של לחץ על החלון באמצעות מניפולטור סטריאוטקסי, כדי לבדוק שהגולגולת יכולה לבוא במגע בטוח והדוק עם חלון הזכוכית. יש לוודא שנוזל הצמנט הדנטלי בשלב 3.6.4 לא יגיע לחלל שמתחת לזכוכית ובכך יטשטש את החלון.
    4. השתמש במברשת אפליקטור מדויקת מתכווננת כדי להוסיף כמות קטנה של מלט לצד קצה החלון כדי לאטום את חלון הזכוכית עם הגולגולת. המתן ~ 10 דקות כדי לתת למלט להתייבש לחלוטין, ואז שחרר בעדינות והסר את המניפולטור מעל החלון. נכון לשלב זה, לוקח ~4 שעות לסיים את 10 פגיעות TBI ולהשתיל את עמוד הראש ואת חלון הגולגולת.
    5. חתוך את המלט הדנטלי באמצעות מקדחה דנטלית עם ביט קרביד FG4 אם יש עודף מלט המכסה את החלון.
      הערה: עודף מלט סביב החלון עלול למנוע מעדשות אובייקטיביות של שני פוטונים להתקרב לפני השטח של החלון.
  7. השתלת ההדמיה היטב
    הערה: באר הדמיה (איור 2D) היא טבעת גומי בקוטר חיצוני של ~1.6 ס"מ, התואמת את המשטח העליון של עמוד הראש ומחזיקה מים מעל חלון הגולגולת לצורך הדמיה של שני פוטונים.
    1. לאחר השלמת השתלת החלון, קדח את שאריות המלט הדנטלי על המשטח העליון של עמוד הראש, ונקה את האזור באמצעות גזה כירורגית רטובה. הניחו לאזור להתייבש למשך ~3 דקות.
    2. השתמשו באפליקטור עם קצוות כותנה כדי לטבול כמות קטנה של דבק-על ולהדביק אותו על המשטח העליון של עמוד הראש. הניחו במהירות את טבעת הגומי על עמוד הראש. הפעילו לחץ בינוני על טבעת הגומי למשך ~2 דקות כדי להבטיח מגע קרוב עם עמוד הראש. השתמשו בדבק-על במשורה, אחרת הוא עלול להיצמד לחלון הזכוכית ולטשטש את הדמיה של שני פוטונים.
  8. מתן משככי כאבים ואנטיביוטיקה
    1. מיד לאחר השתלת ההדמיה היטב, אך לפני הפסקת איזופלורן, יש לתת cefazolin [500 מ"ג/ק"ג (333 מ"ג/מ"ל, בדרך כלל ~45 μL), תוך שרירית], ומלוקסיקאם (5 מ"ג/ק"ג, תת עורית) באמצעות מזרקי אינסולין חד פעמיים.
    2. לאחר מתן תרופות, להפסיק את ההרדמה, לשחרר את העכבר מן המסגרת סטריאוטקסית, ולהחזיר את העכבר לכלוב הביתי שלו, אשר מעל שמיכת חימום.
    3. עקוב מקרוב אחר העכבר במשך ~ 15 דקות עד שהוא אמבולטורי.
      הערה: אחסנו את העכברים בנפרד, מכיוון שהם עלולים לנשוך היטב את הגומי של עכברים אחרים. ספק מזון וג'ל מים קרוב לעכבר בכלוב לגישה ל- ad libitum.
    4. מתן buprenorphine (1 מ"ג / ק"ג, תת עורית) ו meloxicam (5 מ"ג / ק"ג, תת עורית) שוב כל 8 שעות לאחר המינון הקודם עד 48 שעות לאחר ניתוח השתלת חלון הגולגולת.

4. הדמיה תוך-חיונית של שני פוטונים

  1. השתמש במיקרוסקופ 2 (טבלת חומרים), המצויד בלייזר רב-פוטוני קוהרנטי מתכוונן וביעד הגדלה פי 20 (NA 1.0; טבילה במים), לצורך הדמיה תוך-חיונית18. המסנן המשמש לאות EGFP הוא "BP 500-550".
  2. הכן את עכבר חלון הגולגולת להדמיה תוך חיונית.
    1. החל מיום הניתוח (המוגדר כיום 0), בצעו הדמיה של שני פוטונים בנקודות זמן מתוכננות לאחר TBI. הכניסו את עכבר חלון הגולגולת לתא השראת ההרדמה, ותנו 3% איזופלורן מעורבב עם גז נשא בקצב זרימה של 1.5 ליטר/דקה למשך 5 דקות.
      הערה: גז המוביל יכול להיות אוויר בחדר או 100% חמצן.
    2. ברגע שהעכבר מורדם לחלוטין (כלומר, קצב נשימה איטי אך יציב בערך מחזור אחד לכל 2 שניות, יחד עם היעדר רפלקס צביטת זנב), הסר את העכבר מתא האינדוקציה והצמיד במהירות את עמוד הראש לתושבת. הניחו לפלג הגוף העליון של העכבר להניח על צלחת פלסטיק עגולה (בקוטר 19 ס"מ) המצוידת בסוגר.
      הערה: כרית לחימום ידני הונחה מתחת לפלג הגוף העליון של העכבר כדי לספק תמיכה בחום במהלך הדמיה תוך חיונית.
    3. יש למרוח משחת עיניים עם חומר סיכה על עיני העכבר ולהניח את חרוט האף של צינור ההרדמה מעל חוטמו של העכבר. יש לשמור על הרדמה באמצעות איזופלורן 1.5% עם גז נשא בקצב זרימה של 1 ליטר/דקה.
    4. בדוק מעת לעת את תדירות הנשימה, וספק צביטת זנב או בוהן לפחות כל 15 דקות במהלך ההדמיה כדי להעריך הרדמה מתאימה. התאם את ריכוז האיזופלורן לפי הצורך כדי לשמור על עומק ההרדמה הרצוי.
    5. ישר את ראש העכבר כדי לוודא שחלון הגולגולת נמצא ישירות מתחת לעדשת האובייקט בעלת שני הפוטונים. הוסיפו מעט מים להדמיה הרבה מעל חלון הגולגולת. הנמיכו את המטרה כך שהיא תהיה שקועה במים.
  3. הדמיה תוך חיונית של עכברי חלון תוך גולגולתי
    1. הפעל את מנורת הכספית ההיקפית. ראה את המוח עם epifluorescence דרך העין הראשון.
      הערה: כלי הדם נראים שחורים. בחר אזור שבו החלון נקי. כבה את האפיפלואורסצנציה, הגדר את אורך גל הלייזר ל- 860 ננומטר עבור אות ה- EGFP, והתאם את הגדרת הלייזר לקבלת אות אופטימלי (כלומר, בהיר אך לא רווי).
    2. הגדר את מצב הסריקה ל- Frame ואת שלב הקו ל - 1. הגדר את המספר הממוצע ל- 16, את עומק הסיביות ל- 8 סיביות, את המצב כ- Line ואת השיטה כ - Mean.
    3. השתמש בתבנית כלי הדם כ"מפת ייחוס" כדי לצלם את אותו אזור במוח עבור הדמיה אורכית עוקבת. דמיינו את הרמה השטחית (שכבה I, פחות מ-100 מיקרומטר מפני השטח של קרום המוח) עבור שלושה מישורים שבהם כלי הדם בקליפת המוח שולטים דרך מצב ערימת z, עם מרווח בין-מישורי של 10 מיקרומטר, כפי שמצוין באיור 3A.
    4. תמונה של שישה מישורים ברמה עמוקה (שכבה IV ו-V, ~400 מיקרומטר עמוק יותר מהרמה השטחית), דרך מצב z stack כפי שמצוין באיור 3A, עם מרווח בין מישורים של 10 מיקרומטר ומהירות סריקה של 8.
    5. לאחר סיום ההדמיה (~20 דקות לעכבר), יש להפסיק את ההרדמה, לשחרר את העכבר מהמסגרות ולהחזירו לכלוב הביתי שלו שנמצא מעל שמיכת חימום. עקוב אחר העכבר ברציפות עד שהוא אמבולטורי, מה שבדרך כלל לוקח ~ 7 דקות.
    6. דמיינו את העכבר ביום 0, שבוע ו-4 חודשים לאחר ניתוח TBI.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כהוכחת היתכנות לפרוטוקול זה, חלקיקים נגיפיים המבטאים AAV-Syn1-EGFP הוזרקו לקליפת המוח של עכברי TDP-43Q331K/Q331K זכרים (רקע C57BL/6J)19 בגיל 3 חודשים. יצוין כי ניתן להשתמש גם בחיות בר מסוג C57BL/6J, אולם מחקר זה בוצע בעכברי TDP-43Q331K/Q331K מכיוון שהמעבדה מתמקדת במחקר מחלות נוירודגנרטיביות. ניתוח TBI בוצע 4 שבועות לאחר הזרקת AAV. באותה מסגרת כירורגית הושתלו עמוד הראש וחלון הגולגולת. העכבר צולם באופן סדרתי באמצעות מיקרוסקופ של שני פוטונים ביום 0, שבוע ו-4 חודשים לאחר ניתוח TBI (איור 1). באופן כללי, ניתוח ההזרקה ארך ~30 דקות, וניתוח TBI ארך ~1 שעות לעכבר. במהלך ניתוח TBI העכברים בדרך כלל נזקקו לפרק זמן ארוך יותר כדי להתיישב ממצב שכיבה למצב נוטה לאחר הפגיעות הבאות, בהשוואה לפגיעות הראשוניות. לדוגמה, ייתכן שלעכבר נדרשו 2 דקות כדי לתקן את מיקומו לאחר הפגיעה הראשונה, אך נדרשו 10 דקות כדי לתקן את מיקומו לאחר הפגיעההעשירית. עבור ניתוח השתלת חלון גולגולתי, ~ 3 שעות נדרשו בדרך כלל לבצע את כל השלבים, אך ארכו זמן רב מהנדרש אם התרחש דימום מתמשך. הדמיה של שני פוטונים דרשה בדרך כלל 20 דקות לכל עכבר כדי לקבל את כל התמונות. במחקר הנוכחי שכלל שלושה עכברים עם ביטוי של EGFP, החיות לא הראו עדות לשבר בגולגולת, וגם לא מתו במהלך הניתוח או עד 4 חודשים לאחר הניתוח. גם התחלואה וגם שיעור השברים בגולגולת היו 0%. זה עולה בקנה אחד עם שיעור התמותה הנמוך יחסית (<10%) במודל דומה של גרימת TBI אך ללא שתל חלון גולגולתי 7,8.

מכשיר ירידה במשקל (איור 2A), שדווח עליו בעבר7,8, שימש כדי להעביר פגיעות TBI על ראש העכבר בצד ימין, כפי שמצוין באיור 2B. צינור פלסטיק שקוף (מס' 5 באיור 2A; 60 ס"מ אורך וקוטר פנימי 1.4 ס"מ) הוצמד היטב ואנכית לתושבת מתכת, ועמוד השפעה מפלסטיק (מס' 7 באיור 2A; 10 ס"מ אורך וקוטר 1.3 ס"מ, עם קצה עגול שטוח בקוטר 2 מ"מ) הונח בצינור האנכי. משקולת מתכת של 50 גרם (מס' 6 באיור 2A) הונחה מעל הפוגע ונקשרה בחוט ניילון (מס' 4 באיור 2A). כרית חיץ (מס' 8 באיור 2A; 9 ס"מ x 9 ס"מ x 1 ס"מ [אורך x רוחב x עומק], עשויה קצף פוליאתילן וגזה כותנה) הונחה מתחת לראש העכבר כדי לחצוץ ולספוג את אנרגיית הפגיעה.

חלון הגולגולת היה עשוי משני כיסויי זכוכית משולבים בדבק אופטי (איור 2C), וכיסוי הזכוכית בקוטר 3 מ"מ היה הצד שנגע במשטח המוח. הדמיה של שני פוטונים בוצעה בשני עומקים שונים (איור 3A) מפני השטח של המוח: 1) רמה שטחית שבה כלי הדם בקליפת המוח היו שופעים והיו בעלי קוטר לומן גדול יחסית שנראה שחור, אך עם גופי תאים חיוביים דלילים מסוג EGFP; ו-2) רמה עמוקה יותר שבה כלי הדם היו דלילים ובעלי קוטר לומן קטן, עם תאים חיוביים רבים של EGFP גלויים.

בשעה ~4 שעות (יום 0) לאחר הניתוח, בוצעה הדמיה של שני פוטונים בשלושה מישורים, עם מרווח של 10 מיקרומטר ברמה השטחית (שכבה I, פחות מ-100 מיקרומטר מפני השטח של קרום המוח) במקום שבו כלי הדם נראו שחורים (מסומנים על-ידי הקווים האדומים המקווקווים באיור 3B), ושימשה כמפת ייחוס לסשן ההדמיה הבא לאיתור אזור ההדמיה המקורי. ברמה שטחית זו, כלי הדם בקליפת המוח והתהליכים העצביים היו המבנים השולטים שניתן היה לראות, בעוד שגופי התאים החיוביים של EGFP היו דלילים. לאחר הדמיה בתוך הרמה השטחית, המיקוד הותאם כלפי מטה ב~400 מיקרומטר, עמוק יותר מהרמה השטחית, לתוך קליפת המוח (שכבה IV ו-V) כדי לדמיין את גופי תאי העצב החיוביים ל-EGFP. התמונות נרכשו בתוך שישה מישורים, במרווח של 10 מיקרומטר. ביטוי חלבון EGFP התפזר באופן מפוזר בכל גוף התא, כפי שמצוין באיור 3C. מדי פעם התרחשו כמה EGFP puncta מחוץ לגופי התא, אשר יכלו לייצג תכלילי EGFP שנוצרו עם הזמן בתוך אקסונים או דנדריטים. פרוטוקול זה מביא לביטוי AAV-SYN1-EGFP ~ 2-3 מ"מ סביב אתר ההזרקה, אשר ניתן להגדיר על ידי ניתוח היסטולוגי של רקמות לאחר המוות.

שבוע ו-4 חודשים לאחר TBI, תבנית כלי הדם שנצפתה ביום 0 שימשה כנקודת התייחסות לאיתור אותו אזור הדמיה (איור 3D,F). תבנית כלי הדם באיור 3D,F דומה לזו שבאיור 3B. הליך ההדמיה במשך שבוע ו-4 חודשים לאחר TBI היה זהה לזה שתואר לעיל עבור נקודת הזמן של יום 0, וביטוי EGFP זוהה בכל גוף התא כמו קודם לכן (איור 3E,G). עוצמת הפלואורסצנטיות ביום 0 ו -4 חודשים הייתה דומה הן ברמה השטחית והן ברמה העמוקה יותר. עם זאת, עוצמת הפלואורסצנטיות בשבוע אחד הייתה נמוכה יותר מזו של יום 0 ו-4 חודשים הן ברמה השטחית והן ברמה העמוקה, מה שיכול להיות בגלל הדיכוי התרגומי שדווח עבור מודלים אחרים של TBI20. יש לציין כי איכות התמונות לאחר 4 חודשים בהשוואה ליום 0 בנקודת הזמן מוכיחה כי חלון הגולגולת שמר על בהירות ושלמות, וכי הביטוי הנגיפי עדיין חזק 4 חודשים לאחר הניתוח לצורך הדמיה תוך חיונית יעילה. מכיוון ש-EGFP מתבטא כחלבון מפוזר יחסית, אותות הפלואורסצנטיות עשויים להיפתר טוב יותר ולהיות דיסקרטיים יותר כאשר EGFP מתמזג לחלבון מעניין.

Figure 1
איור 1: ציר הזמן של פרוטוקול הדמיה תוך-חיוני זה. הפרוטוקול מופעל עם הזרקת וירוסים. ניתוח TBI וניתוח חלון גולגולתי מבוצעים באותו ניתוח 2-4 שבועות לאחר הזרקת הנגיף. הדמיה תוך-חיונית מתבצעת ביום 0, שבוע, 4 חודשים לאחר TBI. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: דיאגרמות עבור התקן TBI, אתר פגיעה ב-TBI והכנת חלונות . (A) ציוד להתקן TBI לירידה במשקל. 1: כן, 2: סוגר, 3: מהדק מתכוונן, 4: חוט ניילון, 5: מנהרת הטלת משקל, 6: עמוד משקל מתכת (50 גרם), 7: משפיע, 8: כרית חיץ. (B) סכמה של הזרקת הנגיף ואתר פגיעת TBI, כאשר הקואורדינטות 2.5 מ"מ אחוריות לברגמה ו-2 מ"מ לרוחב מתפר הקשת מימין. (ג) סכמה להכנת חלון הזכוכית. שתי החלקות כיסוי זכוכית, בקוטר 3 מ"מ ו-5 מ"מ, משולבות באמצעות דבק אופטי. (D) תמונות של עמוד ראש המתכת ובאר הדמיה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: סכמה של מישורי הדמיה ונתוני התמונה. (A) מישורים מרובים מצולמים ברמה שטחית שבה נמצא כלי הדם וברמה עמוקה. התמונות נאספות באופן הבא: שלושה מישורים ברמה השטחית, כאשר כלי הדם בקליפת המוח והתהליכים העצביים הם המבנים החיוביים השולטים ב- EGFP, ושישה מישורים ברמה העמוקה, שם נצפים בעיקר גופי תאים חיוביים ל- EGFP, עם מרווח של 10 מיקרומטר בין המישורים השכנים. כל מישור הוא בגודל 425.10 מיקרומטר x 425.10 מיקרומטר. (B) תמונה מייצגת של מישור ברמה השטחית ביום 0 נקודת זמן. הקווים האדומים המקווקווים מציינים את מתאר כלי הדם שניתן להשתמש בו כהפניה לאיתור מקום ההדמיה המקורי לנקודות הזמן הבאות. (C) תמונה מייצגת של מישור ברמה העמוקה ביום 0 בנקודת זמן מיד לאחר TBI. (D) תמונה מייצגת של מישור ברמה השטחית בנקודת הזמן של שבוע אחד. הקווים האדומים המקווקווים מציינים את כלי הדם, בדומה לקו המתאר ביום 0 באיור 3B, מה שמאשר שההדמיה של שני פוטונים בוצעה במיקום דומה ביום 0 ושבוע לאחר TBI. (E) תמונה מייצגת ברמה העמוקה בנקודת הזמן של שבוע אחד לאחר TBI. (F) זהה ל-B ו-D, 4 חודשים לאחר TBI. (G) זהה ל-C ו-E, ב-4 חודשים לאחר TBI. סרגל קנה מידה: 50 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

במחקר זה, הזרקת AAV, מתן TBI ועמוד ראש עם השתלת חלון גולגולתי שולבו לצורך ניתוח הדמיה אורכית של תאי עצב המסומנים בתווית EGFP בתוך קליפת המוח של העכבר (שכבות IV ו-V) כדי לבחון את ההשפעות של TBI על נוירונים בקליפת המוח. מחקר זה מציין כי אתר TBI שנבחר כאן, מעל ההיפוקמפוס, מספק משטח שטוח ורחב יחסית להשתלת חלון הגולגולת. לעומת זאת, הגולגולת צרה יחסית קדמית לאתר זה, ולכן קשה להבטיח שעמוד הראש ייגע ביעילות בפני השטח של הגולגולת. בעוד שרק מודל העכבר TDP-43 Q331K/Q331K שימש במחקר זה, בהתחשב במחקר המעבדה המתמקד ב- ALS וב- FTD19, פרוטוקול זה אמור להיות ישים לרוב זני העכבר האחרים. בנוסף לתיוג תאי עצב כפי שמתואר כאן, ניתן להשתמש באסטרטגיות שונות כדי לתייג סוגי תאים אחרים לצורך הדמיה תוך-חיונית. גישה אחת היא לבטא את החלבונים הפלואורסצנטיים המקודדים גנטית באופן ספציפי לתא, באמצעות מערכת הרקומבינציה Cre-Lox בעכברים מהונדסים גנטית21. גישה אחרת היא להשתמש בסרוטיפים נגיפיים מסוימים להתמרה ספציפית לתא של חלבונים פלואורסצנטיים מקודדים גנטית. משלוח ספציפי לאתר יכול להיות מושג על ידי ביצוע הזרקה תוך גולגולתית במיקום הרצוי במוח. היעילות והקלות שבה ניתן לבטא חלבונים ספציפיים לתא באמצעות התמרה נגיפית לצורך הדמיה תוך-חיונית מהווים יתרון על פני יצירת מודלים של עכברים טרנסגניים.

עבור פרוטוקולי הניתוח, ישנם מספר שלבים קריטיים שיש לבצע בזהירות. כאשר קודחים חורים בגולגולת לצורך הזרקת וירוסים בתחילת הפרוטוקול, יש להיזהר מפגיעה ברקמה שמתחת לגולגולת. אם נגרם נזק לרקמות בעת קידוח הגולגולת, תהיה דלקת, הידבקות רקמות ואנגיוגנזה סביב אתר הפגיעה, ובכך יגבירו את הסיכון לדימום במהלך הקרניוטומיה להשתלת חלון גולגולתי. לצורך מתן TBI עם מכשיר הירידה במשקל, המחקר הנוכחי הציב כרית מתחת לראש העכבר כדי לאגור את כוח ההשפעה של TBI, ובכך להקטין את הסיכוי לשבר בגולגולת. לא נצפתה תנועת ראש ברורה על כיווני סיבוב ותאוצה, מה שתומך ברעיון שלמודל TBI זה יש סיכוי נמוך יחסית לפגיעה אקסונלית בדיפוזיה. באופן מעניין, Foda ועמיתיו השתמשו במכשיר ירידה דומה במשקל כדי לבנות פגיעה TBI בגולגולת סגורה על חולדות, וכרית קצף גדולה ורכה יותר (בעובי 12 ס"מ) הונחה מתחת לראש החולדה כך שהיא יכלה לנוע בקלות בתגובה לכוח ההשפעה של TBI על כיוון הסיבוב עם תאוצה, ובכך גרמה לפגיעה אקסונלית דיפוזיה22. אחד היתרונות של מודל TBI לירידה במשקל המנחה צינורית הוא שניתן לווסת את חומרת הטראומה על ידי שינוי גובה הירידה במשקל (כלומר, גובה גבוה יותר עבור כוח גדול יותר) ו/או חזרה על מספר הפעמים שהפגיעה מועברת. לדוגמה, Flierl ועמיתיו השתמשו במכשיר ירידה במשקל דומה למחקר הנוכחי כדי לגרום לפגיעה מוחית טראומטית בעכברים; משקל המתכת היה 333 גרם, מה שגרם לפגיעה מוחית טראומטית קלה כאשר נפלה מגובה של 2 ס"מ ולפגיעה מוחית טראומטית חמורה כאשר נפלה מגובה של 3 ס"מ23. שלב הקרניוטומיה לפני השתלת החלון צריך להתבצע גם בזהירות, כדי למנוע פגיעה ברקמת המוח מתחת לגולגולת. הזזת המקדחה מעת לעת לאזור אחר בגולגולת מסייעת למנוע קידוח יתר באותה נקודה, מה שעלול לגרום לחימום מוגזם, נזק לרקמות ודימום; יתר על כן, השקיה תכופה עם מלוחים יכול גם לקרר את אתר הקידוח. בעת השתלת חלון הזכוכית, חשוב ליישר את מישור הזכוכית כך שיהיה מקביל למישור פני הגולגולת; חלון צמוד בתוך הגולגולת מונע דליפה של נוזל המלט הדנטלי לחלל שבין החלון למוח.

אם החלון מטושטש ביום 0 לאחר ניתוח TBI, אך אותות פלואורסצנטיים מזוהים, ייתכן שהמלט הדנטלי נכנס לחלל שבין החלון למוח, ובכך יצר שכבת מלט המכסה את פני השטח של המוח ומסתירה את הפלואורסצנטיות. במצב זה, ניתן להסיר את החלון ואת הצמנט הדנטלי בשיטת הקידוח המתוארת בפרוטוקול שלב 3.5, ולאחר מכן להשתיל חלון זכוכית חדש באתר המקורי, כפי שתואר בפירוט על ידי גולדי ואחרים.9. אם החלון הופך מטושטש בשלב מאוחר יותר בתהליך ההדמיה האורכית, ניתן לנסות להסיר לכלוך פוטנציאלי על ידי שפשוף עדין של החלון עם מוליך כותנה. אם זה לא פותר את הבעיה, זה יכול להיות בגלל צמיחה מחדש של העצם ואת קרומי המוח מתחת לחלון זכוכית. במקרה זה, ניתן להסיר את החלון ולקדוח כדי להסיר את העצם ו/או הפינצטה שגדלה מחדש ולהסיר את קרומי המוח, ולאחר מכן להשתיל חלון זכוכית חדש באתר המקורי, כפי שתואר על ידי גולדי ואחרים.9. כפי שניתן לראות בתוצאות, ביטוי EGFP ופלואורסצנטיות חזקים לאורך זמן של ~4 חודשים לאחר TBI. ניתן לצפות לירידה באות הפלואורסצנטי בשבוע הראשון שלאחר TBI, אשר ככל הנראה נובע מדיכוי תרגומי הנגרם על ידי TBI שגורם לירידה זמנית בסינתזת החלבונים הגלובלית20.

כדי לשמור על איכות הדמיה גבוהה ולהשיג הדמיה במספר מישורים, עכברים היו תחת הרדמה איזופלורנית כדי להגביל את התנועה. עם זאת, חשוב לציין כי הרדמה עשויה להשפיע על תוצאות המחקר. לדוגמה, דווח כי עכברים תחת הרדמה isoflurane מפגינים פעילות מיקרוגליאלית שונה בתגובה לנזק לאור בהשוואה לעכברים ערים24. עבור דימות של שני פוטונים, מהירות הסריקה ומספר הסריקות לחישוב ממוצע אות (מוגדר כ"מספר", תחת "ממוצע") הם הגורמים העיקריים שיכולים לקבוע את רזולוציית התמונה. כדי לייעל את הרזולוציה, ניתן להפחית את מהירות הסריקה ולהגדיל את המספר הממוצע, עם זאת, מהירות איטית יותר ומספר ממוצע גבוה יותר מאריכים את זמן ההדמיה עבור שדה ראייה מסוים ועלולים לגרום להלבנת תמונות. המחקר הנוכחי נועד לבצע הדמיה כרונית ארוכת טווח על אותו בעל חיים באותו מיקום במוח. כדי להימנע מהלבנת תמונות פוטנציאלית תוך השגת רזולוציה מספקת, בוצעה הדמיה של שני פוטונים במהירות סריקה של 8 עם מספר ממוצע של 16.

גישה חלופית לביצוע קרניוטומיה והשתלת חלון זכוכית היא לדלל את הגולגולת, במידה שהיא שקופה ו"דקה בנייר" להדמיה חיה25,26,27. חלון הגולגולת הדק יכול לשמור על שלמות הגולגולת, ובכך למנוע את הדלקת הנגרמת על ידי הפעולה הכירורגית. לכן, גישת חלון הגולגולת הדק עשויה להיות מועדפת להדמיה חיה עם סמנים רלוונטיים לדלקת ו / או על פני פרק זמן קצר יחסית (כלומר, ~ 14 ימים לאחר הניתוח, כפי שדווח25). לצורך הדמיה ארוכת טווח (כלומר, 4 חודשים, כמתואר כאן) של תהליכים נוירודגנרטיביים כרוניים, בנוסף להערכת ההשפעות החריפות של TBI על אותה חיה, מומלץ להשתמש בחלון זכוכית שהושתל בשיטת קרניוטומיה.

כפי שהוזכר במבוא, ישנם מספר יתרונות בולטים של הדמיה תוך חיונית לחקר אירועים ביולוגיים ופתולוגיים שונים במוח היונקים. עם זאת, יש גם כמה מגבלות של פרוטוקול זה. לדוגמה, פגיעה מוחית קונטרקופ מתארת את החבלה המוחית או ההמטומה המרוחקת, בדרך כלל הפוכה, מאתר יצירת הכוח 28,29,30. במחקר הנוכחי, השפעות TBI הועברו לאונה הקודקודית; פציעת קונטרקופ צפויה בגחון ואינה נגישה להדמיה תוך חיונית. ניתוח היסטולוגי יכול לשמש כגישה משלימה לבחינה נוספת של פנוטיפים בעלי עניין מחוץ לאתר הפגיעה המכוסה על ידי חלון הגולגולת. בנוסף, ביטוי יתר אקסוגני של חלבונים מסוימים עלול גם לגרום רעילות או פתולוגיה. במחקר הנוכחי נצפו מדי פעם פונקטה של EGFP, אשר עשויה לייצג הצטברות עקב ביטוי יתר של חלבונים. לכן, מומלץ לכלול חלבון בקרה שלילית (למשל, EGFP או RFP בלבד) בתכנון המחקר כדי להתמודד עם אפשרות זו, במיוחד אם החלבון המעניין נוטה ליצור מבני ניקוב. מספר החלבונים שניתן לחקור בו זמנית מוגבל על ידי הלייזרים והיכולות של מערכת שני הפוטונים. ייתכן שניתן יהיה לצלם יותר מפלואורופור אחד (למשל, EGFP, RFP וכו') במיקרוסקופ של שני פוטונים, אם כי יכולות ריבוב עם מיקרוסקופים קונפוניים קונבנציונליים בעלי שדה רחב מאפשרות לעתים קרובות ניתוח של חלבונים נוספים בתוך דגימת רקמה אחת. לבסוף, חשוב לכלול בקרת דמה שמקבלת את כל אותם הליכים כמו חיית TBI, למעט השפעות הירידה במשקל. ניתוח השתלת חלון גולגולת הוא ניתוח פולשני ויכול לגרום לשינויים מקומיים, כגון דלקת ולחץ תוך גולגולתי משתנה, שיכולים להשפיע על תהליך TBI. בקרת דמה מסייעת לנסיין להעריך פנוטיפים הנובעים מההשפעה לעומת ההליכים הכירורגיים.

לסיכום, פרוטוקול זה מציג שיטה להדמיה אורכית של חלבונים באופן ספציפי בתאי העצב של קליפת המוח של העכבר בתגובה לפגיעה מוחית טראומטית. פרוטוקול זה יכול להשתנות כדי לנתח את הביטוי והלוקליזציה של חלבונים ספציפיים לתאים שונים בתגובה לפגיעה מוחית טראומטית. מטרת פרוטוקול זה היא לספק גישה לחקר ההשלכות המיידיות וארוכות הטווח של פגיעה מוחית טראומטית במוח יונקים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

לא מוכרזים ניגודי עניינים.

Acknowledgments

אנו מודים לד"ר מיגל סנה-אסטבס מבית הספר לרפואה של אוניברסיטת מסצ'וסטס צ'אן על הענקת נגיף AAV(PHP.eB)-Syn1-EGFP, ולדברה קמרון מבית הספר לרפואה של אוניברסיטת מסצ'וסטס צ'אן על ציור שרטוט גולגולת העכברים. אנו מודים גם לחברים בהווה ובעבר במעבדות בוסקו, שפר והנינגר על הצעותיהם ותמיכתם. עבודה זו מומנה על ידי משרד ההגנה (W81XWH202071/PRARP) ל-DAB, DS ו-NH.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adjustable Precision Applicator Brushes Parkell S379
BD insulin syringe BD NDC/HRI#08290-3284-38 5/16" x 31G
Betadine Purdue NDC67618-151-17 including 7.5% povidone iodine
Buprenorphine PAR Pharmaceutical NDC 42023-179-05
Cefazolin HIKMA Pharmaceutical NDC 0143-9924-90
Ceramic Mixing Dish Parkell SKU: S387 For dental cement preparation
Cotton Tipped Applicators ZORO catlog #: G9531702
Catalyst Parkell S371 full name: "C" Universal TBB Catalyst
Dental cement powder Parkell S396 Radiopaque L-Powder for C&B Metabond
Dental drill Foredom H.MH-130
Dental drill controller Foredom HP4-310
Dexamethasone Phoenix NDC 57319-519-05
EF4 carbide bit Microcopy Lot# C150113 Head Dia/Lgth/mm 1.0/4.2
Ethonal Fisher Scientific 04355223EA 75%
FG1/4 carbide bit Microcopy Lot# C150413 Head Dia/Lgth/mm 0.5/0.4
FG4 carbide bit Microcopy Lot# C150309 Head Dia/Lgth/mm 1.4/1.1
Headpost N/A N/A Custom-manufactured
Heating apparatus CWE TC-1000 Mouse equiped with the stereotaxic instrument and be used while operating surgery
Heating blanket CVS pharmacy E12107 extra heating device and be used after surgery
Isoflurane Pivetal NDC 46066-755-03
Isoflurane induction chamber Vetequip 89012-688 induction chamber for short
Isoflurane volatilizing machine Vetequip 911103
Isoflurane volatilizing machine holder Vetequip 901801
Leica surgical microscope Leica LEICA 10450243
Lubricant ophthalmic ointment Picetal NDC 46066-753-55
Marker pen Delasco SMP-BK
Meloxicam Norbrook NDC 55529-040-10
Microinjection pump and its controller World Precision Instruments micro4 and UMP3
Microliter syringe Hamilton Hamilton 80014 1701 RN, 10 μL gauge for syringe and 32 gauge for needle, 2 in, point style 3
Mosquito forceps CAROLINA Item #:625314 Stainless Steel, Curved, 5 in
Depilatory agent McKesson Corporation N/A Nair Hair Aloe & Lanolin Hair Removal Lotion
Microscope 1 Nikon SMZ745 Nikon microscope for cranial window preparation
Microscope 2 Zeiss LSM 7 MP two-photon microscope
Multiphoton laser Coherent Chameleon Ultra II, Model: MRU X1, VERDI 18W laser for two-photon microscopy
Non-absorbable surgical suture Harvard Apparatus catlog# 59-6860 6-0, with round needle
Norland Optical Adhesive 81 Norland Products NOA 81
No-Snag Needle Holder CAROLINA Item #: 567912
Quick base liquid Parkell S398 "B" Quick Base For C&B Metabond
Regular scissor 1 Eurostat eurostat es5-300
Regular scissor 2 World Precision Instruments No. 501759-G
Round cover glass 1 Warner instruments CS-5R Cat# 64-0700 for 5 mm of diameter
Round cover glass 2 Warner instruments CS-3R Cat# 64-0720 for 3 mm of diameter
Rubber rings Orings-Online Item # OO-014-70-50 O-Rings
Saline Bioworld L19102411PR
Spring scissor 1 World Precision Instruments No. 91500-09 tip straight
Spring scissor 2 World Precision Instruments No. 91501-09 tip curved
Stereotaxic platform KOPF Model 900LS
Super glue Henkel Item #: 1647358
surgical Caliper World Precision Instruments No. 501200
Surgical forceps 1 ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES Catlog# 0508-5/45-PO style 5/45, curved
Surgical forceps 2 ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES catlog# 0103-5-PO style 5, straight
Surgical forceps 3 ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES catlog# 72912
Surgical forceps 4 ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES Catlog# 0508-5/45-PO style 5/45, curved
Surgical gauze ZORO catlog #: G0593801
Surgical lamp Leica Leica KL300 LED
UV box Spectrolinker XL-1000 also called UV crosslinker
Vaporguard Vetequip 931401
Vetbond Tissue Adhesive 3M Animal Care Part Number:014006

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bowman, K., Matney, C., Berwick, D. M. Improving traumatic brain injury care and research: a report from the National Academies of Sciences, Engineering, and Medicine. JAMA. 327 (5), 419-420 (2022).
  2. National Academies of Sciences, Engineering, and Medicine. Traumatic Brain Injury: A Roadmap for Accelerating Progress. , The National Academies Press. (2022).
  3. Xu, X., et al. Repetitive mild traumatic brain injury in mice triggers a slowly developing cascade of long-term and persistent behavioral deficits and pathological changes. Acta Neuropathologica Communications. 9 (1), 60 (2021).
  4. Chen-Plotkin, A. S., Lee, V. M. Y., Trojanowski, J. Q. TAR DNA-binding protein 43 in neurodegenerative disease. Nature Reviews Neurology. 6 (4), 211-220 (2010).
  5. Mackenzie, I. R., Rademakers, R., Neumann, M. TDP-43 and FUS in amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal dementia. The Lancet. Neurology. 9 (10), 995-1007 (2010).
  6. McKee, A. C., et al. The first NINDS/NIBIB consensus meeting to define neuropathological criteria for the diagnosis of chronic traumatic encephalopathy. Acta Neuropathologica. 131 (1), 75-86 (2016).
  7. Henninger, N., et al. Attenuated traumatic axonal injury and improved functional outcome after traumatic brain injury in mice lacking Sarm1. Brain. 139, 1094-1105 (2016).
  8. Bouley, J., Chung, D. Y., Ayata, C., Brown, R. H., Henninger, N. Cortical spreading depression denotes concussion injury. Journal of Neurotrauma. 36 (7), 1008-1017 (2019).
  9. Goldey, G. J., et al. Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice. Nature Protocols. 9 (11), 2515-2538 (2014).
  10. Kugler, S., et al. Neuron-specific expression of therapeutic proteins: evaluation of different cellular promoters in recombinant adenoviral vectors. Molecular and Cellular Neurosciences. 17 (1), 78-96 (2001).
  11. von Jonquieres, G., et al. Glial promoter selectivity following AAV-delivery to the immature brain. PLoS One. 8 (6), 65646 (2013).
  12. Trachtenberg, J. T., et al. Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420 (6917), 788-794 (2002).
  13. Mostany, R., et al. Altered synaptic dynamics during normal brain aging. The Journal of Neuroscience. 33 (9), 4094-4104 (2013).
  14. Yang, Q., Vazquez, A. L., Cui, X. T. Long-term in vivo two-photon imaging of the neuroinflammatory response to intracortical implants and micro-vessel disruptions in awake mice. Biomaterials. 276, 121060 (2021).
  15. Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (12), 7319-7324 (2003).
  16. Grutzendler, J., Gan, W. B. Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain. NeuroRx. 3 (4), 489-496 (2006).
  17. Isshiki, M., et al. Enhanced synapse remodelling as a common phenotype in mouse models of autism. Nature Communications. 5, 4742 (2014).
  18. Mondo, E., et al. A developmental analysis of juxtavascular microglia dynamics and interactions with the vasculature. The Journal of Neuroscience. 40 (34), 6503-6521 (2020).
  19. White, M. A., et al. TDP-43 gains function due to perturbed autoregulation in a Tardbp knock-in mouse model of ALS-FTD. Nature Neuroscience. 21 (4), 552-563 (2018).
  20. Chou, A., et al. Inhibition of the integrated stress response reverses cognitive deficits after traumatic brain injury. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (31), 6420-6426 (2017).
  21. Padmashri, R., Tyner, K., Dunaevsky, A. Implantation of a cranial window for repeated in vivo imaging in awake mice. Journal of Visualized Experiments. (172), e62633 (2021).
  22. Foda, M. A., Marmarou, A. A new model of diffuse brain injury in rats. Part II: Morphological characterization. Journal of Neurosurgery. 80 (2), 301-313 (1994).
  23. Flierl, M. A., et al. Mouse closed head injury model induced by a weight-drop device. Nature Protocols. 4 (9), 1328-1337 (2009).
  24. Sun, W., et al. In vivo two-photon imaging of anesthesia-specific alterations in microglial surveillance and photodamage-directed motility in mouse cortex. Frontiers in Neuroscience. 13, 421 (2019).
  25. Li, D., et al. A Through-Intact-Skull (TIS) chronic window technique for cortical structure and function observation in mice. eLight. 2 (1), 1-18 (2022).
  26. Paveliev, M., et al. Acute brain trauma in mice followed by longitudinal two-photon imaging. Journal of Visualized Experiments. (86), e51559 (2014).
  27. Han, X., et al. In vivo two-photon imaging reveals acute cerebral vascular spasm and microthrombosis after mild traumatic brain injury in mice. Frontiers in Neuroscience. 14, 210 (2020).
  28. Jang, S. H., Kwon, Y. H., Lee, S. J. Contrecoup injury of the prefronto-thalamic tract in a patient with mild traumatic brain injury: A case report. Medicine. 99 (32), 21601 (2020).
  29. Courville, C. B. The mechanism of coup-contrecoup injuries of the brain; a critical review of recent experimental studies in the light of clinical observations. Bulletin of the Los Angeles Neurological Society. 15 (2), 72-86 (1950).
  30. Drew, L. B., Drew, W. E. The contrecoup-coup phenomenon: a new understanding of the mechanism of closed head injury. Neurocritical Care. 1 (3), 385-390 (2004).

Tags

הדמיה תוך חיונית ביטוי חלבון פלואורסצנטי עכברים פגיעה מוחית טראומטית בגולגולת סגורה חלון גולגולת מיקרוסקופ שני פוטונים חלבון מעניין גירויים אקסוגניים הזרקה תוך גולגולתית וירוס הקשור לאדנו (AAV) חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר (EGFP) מקדם ספציפי לנוירונים מכשיר ירידה במשקל עמוד ראש מתכת חלון גולגולת זכוכית ביטוי ולוקליזציה תאית הדמיה אורכית
הדמיה תוך חיונית של ביטוי חלבון פלואורסצנטי בעכברים עם פגיעה מוחית טראומטית בגולגולת סגורה וחלון גולגולת באמצעות מיקרוסקופ דו-פוטוני
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhong, J., Gunner, G., Henninger,… More

Zhong, J., Gunner, G., Henninger, N., Schafer, D. P., Bosco, D. A. Intravital Imaging of Fluorescent Protein Expression in Mice with a Closed-Skull Traumatic Brain Injury and Cranial Window Using a Two-Photon Microscope. J. Vis. Exp. (194), e64701, doi:10.3791/64701 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter