Summary
Este estudo demonstra a entrega de um traumatismo cranioencefálico repetitivo em camundongos e o implante simultâneo de uma janela craniana para posterior imagem intravital de um EGFP expresso por neurônio usando microscopia de dois fótons.
Abstract
O objetivo deste protocolo é demonstrar como visualizar longitudinalmente a expressão e localização de uma proteína de interesse dentro de tipos celulares específicos do cérebro de um animal, mediante exposição a estímulos exógenos. Aqui, a administração de um traumatismo cranioencefálico (TCE) fechado e o implante simultâneo de uma janela craniana para subsequentes imagens intravitais longitudinais em camundongos são mostrados. Camundongos são injetados intracranialmente com um vírus adenoassociado (AAV) expressando proteína fluorescente verde aumentada (EGFP) sob um promotor neuronal específico. Após 2 a 4 semanas, os camundongos são submetidos a um TCE repetitivo usando um dispositivo de queda de peso sobre o local de injeção do AAV. Dentro da mesma sessão cirúrgica, os camundongos são implantados com um cabeçote de metal e, em seguida, uma janela craniana de vidro sobre o local do TCE. A expressão e a localização celular do EGFP são examinadas usando um microscópio de dois fótons na mesma região cerebral exposta a trauma ao longo de meses.
Introduction
O traumatismo cranioencefálico (TCE), que pode resultar de lesões esportivas, colisões de veículos e combates militares, é um problema de saúde mundial. O TCE pode levar a déficits fisiológicos, cognitivos e comportamentais, além de incapacidade ou mortalidadeao longo da vida 1,2. A gravidade do TCE pode ser classificada em leve, moderada e grave, sendo a grande maioria TCE leve (75%-90%)3. É cada vez mais reconhecido que o TCE, particularmente as ocorrências repetitivas de TCE, pode promover degeneração neuronal e servir como fatores de risco para várias doenças neurodegenerativas, incluindo doença de Alzheimer (DA), esclerose lateral amiotrófica (ELA), demência frontotemporal (DFT) e encefalopatia traumática crônica (ETC)4,5,6. No entanto, os mecanismos moleculares subjacentes à neurodegeneração induzida por TCE permanecem obscuros e, portanto, representam uma área ativa de estudo. Para obter informações sobre como os neurônios respondem e se recuperam do TCE, um método para monitorar proteínas fluorescentemente marcadas de interesse, especificamente dentro dos neurônios, por imagens intravitais longitudinais em camundongos após TCE é descrito aqui.
Para tanto, este estudo mostra como combinar um procedimento cirúrgico para a administração de TCE de crânio fechado semelhante ao relatado anteriormente7,8, juntamente com um procedimento cirúrgico para implante de janela craniana para imagem intravital a jusante, como descrito por Goldey e cols.9. Notadamente, é inviável implantar uma janela craniana primeiro e, posteriormente, realizar um TCE na mesma região, pois o impacto da queda de peso que induz o TCE é suscetível de danificar a janela e causar danos irreparáveis ao camundongo. Portanto, esse protocolo foi desenhado para administrar o TCE e, em seguida, implantar a janela craniana diretamente sobre o local do impacto, tudo dentro da mesma sessão cirúrgica. Uma vantagem de combinar o TCE e o implante de janela craniana em uma única sessão cirúrgica é a redução do número de vezes que um camundongo é submetido à cirurgia. Além disso, permite monitorar a resposta imediata (ou seja, na escala de tempo de horas) ao TCE, em vez de implantar a janela em uma sessão cirúrgica posterior (ou seja, imagens iniciais iniciadas em uma escala de tempo de dias pós-TCE). A janela craniana e a plataforma de imagem intravital também oferecem vantagens sobre a monitorização de proteínas neuronais por métodos convencionais, como a imunomarcação de tecidos fixos. Por exemplo, menos camundongos são necessários para imagens intravitais, já que o mesmo camundongo pode ser estudado em vários pontos de tempo, em oposição a coortes separadas de camundongos necessárias para pontos de tempo discretos. Além disso, os mesmos neurônios podem ser monitorados ao longo do tempo, permitindo rastrear eventos biológicos ou patológicos específicos dentro da mesma célula.
Como prova de conceito, a expressão neurônio-específica da proteína fluorescente verde aumentada (EGFP) sob o promotor de sinapsina é demonstrada aqui10. Essa abordagem pode ser estendida para 1) diferentes tipos de células cerebrais utilizando outros promotores específicos de tipos celulares, como promotor de proteína básica de mielina (MBP) para oligodendrócitos e promotor de proteína glial fibrilar ácida (GFAP) para astrócitos11 , 2) diferentes proteínas-alvo de interesse pela fusão de seus genes com o gene EGFP e 3) co-expressão de múltiplas proteínas fundidas a diferentes fluoróforos. Aqui, o EGFP é embalado e expresso através da administração de vírus adenoassociado (AAV) através de uma injeção intracraniana. Um TCE de crânio fechado é administrado usando um dispositivo de queda de peso, seguido pelo implante de uma janela craniana. A visualização do EGFP neuronal é obtida através da janela craniana, usando microscopia de dois fótons para detectar a fluorescência do EGFP in vivo. Com o laser de dois fótons, é possível penetrar mais profundamente no tecido cortical com o mínimo de fotodano, permitindo repetidas imagens longitudinais das mesmas regiões corticais dentro de um camundongo individual por dias e até meses12,13,14,15. Em suma, essa abordagem de combinação de cirurgia de TCE com imagem intravital visa avançar no entendimento dos eventos moleculares que contribuem para a patologia da doença induzida por TCE16,17.
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Protocol
Todos os protocolos relacionados aos animais foram conduzidos de acordo com o Guide for the Care and Use of Laboratory Animals publicado pelo Comitê do National Research Council (US). Os protocolos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da University of Massachusetts Chan Medical School (UMMS) (Permit Number 202100057). Resumidamente, como mostra o esquema do estudo (Figura 1), o animal recebe uma injeção viral, um TCE, um implante de janela e, em seguida, imagens intravitais em uma sequência temporal.
NOTA: Os termos comerciais foram removidos. Consulte a Tabela de Materiais para o equipamento específico utilizado.
1. Injeção intracraniana de AAV com dispositivo estereotáxico
- AAV(PHP.eB)-Syn1-EGFP
- Use um título viral de 1 x 1013 genomas virais por mililitro (vg/mL). Syn1 refere-se a Synapsin1, que é um promotor neuronal específico que permite a expressão viral restrita em neurônios. O vírus pode ser preparado internamente ou terceirizado.
- Preparação para cirurgia de injeção estereotáxica para administração de AAV
- Tesoura regular de autoclave, paquímetro cirúrgico, tesoura de mola cirúrgica, pinça cirúrgica, pinça mosquiteira, gaze, aplicador com ponta de algodão e seringa de microlitro de vidro.
- Higienizar a área cirúrgica com etanol 75%. Expandir o pano cirúrgico estéril descartável para cobrir a região da cirurgia na plataforma estereotáxica.
NOTA: Para manter a temperatura corporal do animal durante a cirurgia de injeção, use um aparelho de aquecimento regulado por realimentação. - Pese e registre o peso corporal do mouse.
- Abra a válvula do tanque de oxigênio e ajuste o fluxo de oxigênio para 1,5 L/min. Abra o aparelho de anestesia e defina o valor do nível de isoflurano para três.
NOTA: O gás transportador pode ser ar ambiente ou 100% de oxigênio nesta etapa. - Coloque o rato na câmara de indução e deixe-o permanecer durante 5 minutos para obter anestesia total.
- Uma vez que o mouse esteja totalmente anestesiado (ou seja, taxas de respiração lentas, mas constantes, de aproximadamente um ciclo por 2 s, juntamente com a ausência de um reflexo de pinça na cauda), remova o mouse da câmara de indução e coloque a cabeça do mouse no quadro estereotáxico.
- Coloque o cone do nariz da tubulação de anestesia sobre o focinho do rato.
- Manter a anestesia com isoflurano a 1,5%, com gás carreador a 1 L/min até o final da cirurgia. Verifique periodicamente a frequência respiratória e dê uma pinça na cauda ou nos dedos dos pés pelo menos a cada 15 minutos durante toda a cirurgia para avaliar a anestesia apropriada. Ajustar a concentração de isoflurano conforme apropriado para manter a profundidade de anestesia desejada.
- Encha uma seringa de microlitro (10 μL) com a solução de vírus. Em seguida, fixe a seringa na bomba microinjetora correspondente do dispositivo estereotáxico.
- Cirurgia de injeção
- Administrar buprenorfina (1 mg/kg, por via subcutânea) utilizando uma seringa de insulina descartável e aplicar pomada oftálmica lubrificante nos olhos do rato.
- Retire o cabelo do couro cabeludo no topo da cabeça, aparando com tesoura regular 1.
- Limpe a pele do couro cabeludo com gaze e aplicadores com ponta de algodão. Desinfete a pele usando etanol 75% primeiro e depois betadina. Repita isso três vezes (ou seja, etanol seguido de betadina), deixando a aplicação final de betadina na pele.
- Verifique novamente a profundidade anestésica para garantir que o mouse esteja totalmente anestesiado (ou seja, taxas respiratórias lentas, mas constantes, de aproximadamente um ciclo por 2 s, juntamente com a ausência de um reflexo de pinça na cauda). Faça uma incisão de ~1 cm usando tesoura regular 2 ao longo da linha média para expor o crânio parietal direito e remova o periósteo usando um aplicador com ponta de algodão.
- Marque dois pontos do crânio com caneta marcadora nestas coordenadas: ponto A: 2,5 mm posterior ao Bregma e 1 mm lateral à linha média sobre o hemisfério direito; ponto B: 2,5 mm posterior ao Bregma e 2 mm lateral à linha média sobre o hemisfério direito.
- Faça cuidadosamente dois furos através do crânio nas coordenadas marcadas usando uma broca dental elétrica com uma broca fina de carboneto EF4.
NOTA: Tenha cuidado para não danificar o tecido cerebral. - Ajuste a armação estereotáxica para alinhar a ponta da agulha da seringa de microlitro ao orifício do crânio que está 1 mm lateral à linha média.
- Abaixe a agulha da seringa para tocar a superfície do cérebro e, em seguida, defina esse local como o ponto zero (para o eixo z). Abaixe a ponta da agulha no córtex cerebral até uma profundidade de 0,5 mm e infunda lentamente 1 μL da solução viral a uma velocidade de 200 nL/min.
- Aguarde 5 minutos após a solução de vírus ser completamente injetada no tecido cerebral antes de retirar a agulha para evitar o refluxo da solução.
- Retire lentamente a agulha da seringa. Repita a injeção no outro local. Sutura da incisão com sutura cirúrgica estéril e inabsorvível (calibre 6-0).
- Administrar cefazolina [500 mg/kg (333 mg/mL, geralmente ~45 μL), por via intramuscular] e meloxicam (5 mg/kg, por via subcutânea) após a cirurgia enquanto o animal ainda estiver anestesiado.
- Solte o mouse do quadro estereotáxico e interrompa a anestesia. Coloque o rato em uma gaiola limpa acima de uma manta de aquecimento e monitore o animal até que ele esteja deambulando (aproximadamente 15 min). Em seguida, transfira para a gaiola de casa.
- Administrar novamente buprenorfina (1 mg/kg, por via subcutânea) e meloxicam (5 mg/kg, por via subcutânea) às 8 h, 16 h e 24 h, respectivamente, após a primeira injeção de buprenorfina.
NOTA: Em 2-4 semanas após a injeção do vírus, o camundongo recebe TCE e implante de janela craniana no mesmo local que a injeção de AAV.
2. Administração de uma indução de TCE repetitivo
NOTA: Os parâmetros do TCE são ajustados a partir de relatórios anteriores7,8, nos quais o impacto do TCE foi entregue uma vez. O protocolo aqui aplica o mesmo parâmetro, exceto aumentando o número total de impacto para 10.
- Equipamento TBI
- Use um dispositivo portátil personalizado para a administração de um TCE de crânio fechado (Figura 2A) na cabeça do mouse do lado direito, conforme indicado na Figura 2B.
- Preparo antes da cirurgia
- Equipamento para cirurgia de autoclave, incluindo tesoura comum, paquímetro cirúrgico, tesoura de mola cirúrgica, pinça cirúrgica, pinça de mosquito, cabeceira, gaze e aplicadores com ponta de algodão.
- Pesar e registrar o peso corporal do camundongo 2 h antes da cirurgia. Para minimizar o edema cerebral durante o implante da janela craniana, injetar fosfato sódico de dexametasona na dose de 4,8 mg/kg [2 mg/mL, geralmente ~70 μl (necessidade de injeção em dois locais)] no músculo quadríceps usando uma seringa de insulina. Após a injeção de dexametasona, mas antes de iniciar a cirurgia de TCE, prepare as janelas de vidro conforme indicado no passo 3.1 para uso posterior.
- Desinfetar o estádio cirúrgico e o equipamento de TCE com etanol 75% e expandir o pano cirúrgico estéril descartável para cobrir o estágio cirúrgico na plataforma estereotáxica. Ligue o aparelho de aquecimento e o monitor de temperatura, ajustando a temperatura alvo para 37 °C.
- Abra a válvula do tanque de oxigênio e ajuste o fluxo de oxigênio para 1,5 L/min. Abra o aparelho de anestesia e defina o valor do nível de isoflurano para três.
NOTA: O oxigênio 100% puro pode ajudar o animal a sobreviver aos impactos do TCE. - Coloque o rato na câmara de indução e deixe-o permanecer durante 5 minutos para obter anestesia total.
- Uma vez que o mouse esteja totalmente anestesiado (ou seja, taxas de respiração lentas, mas constantes, de aproximadamente um ciclo por 2 s, juntamente com a ausência de um reflexo de pinça na cauda), remova o mouse da câmara de indução e coloque a cabeça do mouse no quadro estereotáxico.
- Coloque o cone do nariz da tubulação de anestesia sobre o focinho do rato.
- Manter a anestesia com isoflurano a 1,5% misturado com oxigênio puro a 100% com fluxo de 1 L/min até o final da cirurgia. Verifique periodicamente a frequência respiratória e dê uma pinça na cauda ou nos dedos dos pés pelo menos a cada 15 minutos durante toda a cirurgia para avaliar a anestesia apropriada. Ajustar a concentração de isoflurano conforme apropriado para manter a profundidade de anestesia desejada.
- Cirurgia de TCE
- Administrar buprenorfina (1 mg/kg, por via subcutânea) utilizando seringas de insulina descartáveis e aplicar pomada oftálmica nos olhos do rato.
- Retire o cabelo do topo da cabeça aparando com tesoura 1 e, em seguida, aplicando agente depilatório por 1 min.
CUIDADO: Não aplique o produto depilatório por mais de 3 min no couro cabeludo, pois é irritante para a pele. Evite colocar qualquer agente depilatório nos olhos do rato. - Limpe a pele do couro cabeludo aplicando gaze e aplicadores com ponta de algodão. Em seguida, desinfete a pele, usando etanol 75% primeiro e depois betadina. Repita isso três vezes (ou seja, etanol seguido de betadina), deixando a aplicação final de betadina na pele.
- Verifique novamente a profundidade anestésica para garantir que o mouse esteja totalmente anestesiado (ou seja, taxas respiratórias lentas, mas constantes, de aproximadamente um ciclo por 2 s, juntamente com a ausência de um reflexo de pinça na cauda). Tenda a pele com pinça cirúrgica 3 e, fazer uma incisão mediana de 12-15 mm de comprimento iniciando aproximadamente 3 mm posterior aos olhos.
- Excisar a pele sobre os hemisférios esquerdo e direito do crânio usando tesoura de mola 2.
- Uma vez exposto o crânio, remova o periósteo esfregando suavemente com um aplicador estéril com ponta de algodão e lavando com soro fisiológico estéril.
- Inspecione visualmente a condição do crânio para garantir que ele esteja intacto, exceto pelos dois pequenos orifícios, que foram feitos para a cirurgia de injeção de vírus anterior.
- Secar a área do crânio e marcar o local do TCE nas seguintes coordenadas: 2,5 mm posterior ao Bregma e 2 mm lateral da sutura sagital à direita (Figura 2B).
- Remova rapidamente o mouse do quadro estereotáxico e coloque a cabeça na almofada do buffer sob o dispositivo TBI.
- Alinhe a ponta do pêndulo com o local de impacto marcado.
- Levante a coluna de metal puxando a corda de nylon presa a 15 cm acima da cabeça do mouse e, em seguida, solte-a, permitindo que o peso caia livremente sobre a haste do transdutor, que está em contato com a parte superior do crânio no local do TCE. Não toque na cabeça do mouse ao causar o impacto do TCE.
- Mova o mouse sobre a manta de aquecimento e coloque-o de costas enquanto monitora o estado respiratório.
- Uma vez que o camundongo se ajeita de uma posição supina para uma posição prona, coloque o camundongo na câmara de indução de isoflurano por ~5 min com isoflurano a 3% misturado com oxigênio 100% puro a uma taxa de fluxo de 1,5 L/min.
- Uma vez que o rato esteja totalmente sedado (ou seja, taxas de respiração lentas, mas constantes, de aproximadamente um ciclo por 2 s, juntamente com a ausência de um reflexo de pinça na cauda), repita os passos 2.3.9-2.3.14 para obter um total de 10 impactos.
NOTA: Dez impactos do TCE induziram fenótipo robusto com baixa mortalidade em camundongos em nosso estudo (dados ainda não publicados). Os parâmetros podem ser ajustados para atingir uma gravidade diferente da lesão cerebral, aumentando ou diminuindo o número de impactos e/ou a altura a partir da qual o peso é liberado. Todos os parâmetros estão sujeitos à aprovação da IACUC local. - Verifique o crânio sob um microscópio cirúrgico e remova o camundongo do estudo se ocorreu uma fratura no crânio.
- Para uma cirurgia simulada, siga os mesmos procedimentos descritos acima, incluindo a colocação do animal sob o impactor, mas sem entregar os impactos do TCE.
- Depois que o camundongo se ajeitar de uma posição supina para uma posição prona após o impacto do10º TCE, coloque o camundongo na câmara de indução de isoflurano por ~5 min. Siga os passos 2.2.6-2.2.8 para colocar a cabeça do mouse na estrutura estereotáxica para a cirurgia de implante de janela craniana descrita abaixo.
3. Cirurgia de implante de janela craniana
NOTA: As etapas de implantação da janela craniana abaixo foram adotadas por Goldey et al.9, e suas especificações do cabeçote e do poço de imagem foram aplicadas aqui.
- Preparação de janelas
NOTA: Conclua a preparação da janela na etapa 2.2.2 antes de iniciar a cirurgia de TCE. A janela é feita de duas lamínulas redondas de vidro (uma de 3 mm e outra de 5 mm de diâmetro, como indicado pela Figura 2C) que são unidas por adesivo óptico transparente, conforme descrito abaixo.- Higienizar as tampas de vidro submergindo-as em etanol 75% por 15 min. Retire as tampas de vidro do etanol e deixe-as secar em uma superfície estéril (ou seja, a tampa de uma placa estéril de 24 poços) por ~10 min.
- Encha uma seringa de insulina com cola óptica transparente, evitando a formação de bolhas. Sob o microscópio 1 (Tabela de Materiais) com aumento de 0,67x, coloque uma pequena gota (~1 μL) de cola óptica no centro da lamínula de 5 mm. Em seguida, coloque imediatamente a lamínula de 3 mm por cima e centralize-a com a lamínula de 5 mm.
- Aplique pressão suavemente usando pinças finas para espalhar a cola uniformemente. Descarte a janela de vidro se uma bolha ou parede se formar ao redor da tampa de 3 mm.
- Para curar a cola, coloque as lamínulas em uma caixa UV por 150 s a uma potência de 20 x 100 μJ/cm2. Verifique se as duas lamínulas estão firmemente ligadas, usando a pinça 4 para empurrar suavemente a lateral do deslizamento de 3 mm. Se a tampa se mover, coloque-a de volta na caixa UV por mais 60 s. Guarde a janela de vidro em uma placa estéril de 24 poços para uso posterior.
- Áspero a superfície do crânio.
NOTA: A partir de agora, execute todas as etapas da seção 3 sob um microscópio cirúrgico. Comece com 10x e ajuste para a ampliação desejada.- Perfure suave e lentamente a superfície do crânio usando uma broca de carboneto FG4 a uma velocidade de rotor baixa (ou seja, número de saída definido como ~1-2) para remover o periósteo restante e criar uma superfície craniana áspera, de modo que o cimento dental se ligue firmemente ao crânio. Um bisturi também pode ser usado aqui em vez de uma broca como alternativa.
- Use soro fisiológico para limpar e limpar a poeira óssea da superfície do crânio.
- Separe os músculos.
OBS: A separação muscular serve para aumentar a área de superfície do osso craniano exposto que servirá como ponto de contato para o cimento dentário, garantindo assim a integridade estrutural do implante. Esta etapa de separação muscular geralmente expõe ~3 mm da placa temporal do crânio.- Aproximadamente 5 mm posterior ao olho, onde está localizada a sutura que conecta o crânio parietal e temporal, insira suavemente as pontas finas fechadas (pinça #5/45) para separar os músculos laterais do crânio e mova suavemente as pontas fechadas no sentido posterior até a sutura lambdoide.
- Separe os músculos laterais do lado onde ocorrerá a implantação da janela craniana.
OBS: Cuidado para não separar os músculos muito próximos ao olho, para evitar lesar a artéria oftálmica; caso contrário, pode ocorrer sangramento grave e persistente. Não separe os músculos do osso occipital, pois o camundongo precisa que esses músculos levantem a cabeça. - Lave os detritos do sítio cirúrgico com soro fisiológico e seque a área com gaze. Espuma de gel pode ser aplicada no local cirúrgico para parar o sangramento.
- Implante a cabeceira.
- Use um headpost de titânio feito sob medida (Figura 2D), descrito em uma publicação anterior9, para fixar a cabeça do mouse com segurança durante a realização da cirurgia de craniotomia e para imagens subsequentes de dois fótons.
- Use uma caneta marcador e um paquímetro cirúrgico para traçar a circunferência da craniotomia no crânio limpo e seco do lado direito. O ponto central do círculo traçado está 2,5 mm posterior ao Bregma e a 1,5 mm da sutura sagital no hemisfério direito. O diâmetro do círculo traçado é de cerca de 3,2-3,5 mm, ligeiramente maior do que a tampa de vidro de 3 mm. Certifique-se de que o círculo de craniotomia possa cobrir os locais de injeção do vírus (os dois orifícios feitos durante a injeção do vírus podem ser usados como referência) e o local do TCE.
- Solte a barra da orelha e gire a cabeça para que o plano da craniotomia fique perfeitamente horizontal e, em seguida, aperte a barra da orelha novamente.
- Use o bastão de madeira de um aplicador com ponta de algodão para adicionar duas pequenas gotas de supercola na borda frontal e traseira do poste da cabeça.
- Posicione a cabeceira de titânio sobre o centro da craniotomia e ajuste-a rapidamente para repousar no mesmo plano onde a janela craniana será implantada. Aplicar leve pressão até que a supercola esteja seca; Isso geralmente leva ~30 s.
- Prepare o cimento dental em uma placa de mistura de cerâmica pré-resfriada (ficando pelo menos 10 min em um freezer de -20 °C): misture 300 mg de cimento em pó, seis gotas de líquido de base rápida e uma gota de catalisador e, em seguida, mexa a mistura até misturar completamente (~15 vezes).
OBS: O cimento precisa ser pastoso. Se estiver muito fino, mexa um pouco mais de cimento em pó. Se estiver muito grosso, misture o líquido de base rápida uma gota de cada vez até obter uma consistência pastosa. - Aplique rapidamente uma quantidade generosa de mistura de cimento dental no perímetro externo da circunferência traçada e cubra qualquer superfície óssea exposta. No entanto, não cobrir o local da craniotomia. Deixe ~15 min para o cimento dental secar e endurecer antes de prosseguir.
- Solte a barra auricular e prenda o cabeçote à estrutura metálica para garantir que a cabeça seja estável para uma perfuração precisa ao longo da circunferência marcada da craniotomia. Se houver cimento sobre o local da craniotomia, use a broca de carboneto FG4 para perfurá-la e removê-la.
- Craniotomia
- Utilizar um paquímetro cirúrgico para verificar o diâmetro do círculo marcado, conforme definido no passo 3.4.2. Ajuste conforme necessário, para que a janela craniana se encaixe confortavelmente dentro da craniotomia.
- Usando uma broca odontológica elétrica, condicione e afine o crânio ao longo da parte externa do círculo marcado, usando um bit de carboneto FG4 primeiro (velocidade definida para uma de saída ~9-10). Isso cria uma "trilha" dentro da qual afinar o crânio.
CUIDADO: Para minimizar a lesão por calor e obter uma trilha suave, continue movendo a broca. Não perfure o mesmo local por mais de 2 s. - Periodicamente, pare de perfurar e irrige toda a área com soro fisiológico estéril, para reduzir o aquecimento da broca e lavar o pó ósseo.
- Continue a afinar o crânio usando um bit de carboneto FG1/4, conforme descrito na etapa 3.5.2, até que o crânio fique fino e transparente.
NOTA: Usar duas mãos para segurar a broca pode facilitar o controle da broca e evitar a inserção da broca no cérebro. - Complete o afinamento do crânio usando um bit de carboneto EF4. Quando ocorre uma fissura entre o retalho ósseo e o osso craniano circundante, às vezes há uma liberação de líquido cefalorraquidiano (LCR), indicando que o crânio foi completamente perfurado.
- Continue afinando e perfurando o resto do crânio ao longo da trilha. Evite perfurar o ponto onde uma vasculatura óbvia cruza sob o crânio para evitar sangramento.
- Insira uma ponta de pinça fina (pinça 1) ~0,5 mm através do local rachado e levante o retalho ósseo suavemente para cima sem recuar o cérebro subjacente.
- Após a retirada do retalho ósseo, irrigar a área da craniotomia com soro fisiológico. A superfície cerebral poderia ser 1-2 mm mais alta que a borda da craniotomia.
- A partir desta etapa, cubra sempre o cérebro exposto com soro fisiológico para proteger o tecido cerebral.
- Pode ocorrer sangramento ao levantar o retalho ósseo nos locais originais de injeção do AAV devido à adesão tecidual e ao crescimento da vasculatura após a cirurgia de injeção. Se isso acontecer, pressione suavemente o local com um aplicador de algodão seco por ~2 min (ou mais, conforme necessário). A espuma de gel pode ser usada para parar o sangramento. Não use produtos químicos ou pinças de aquecimento para parar o sangramento, pois isso pode causar lesões.
- Use a pinça 1 para remover suavemente a matéria aracnoide visível.
- Janela de vidro do implante
- Use a pinça cirúrgica 2 para pegar a janela de vidro estéril, com a tampa de vidro de 3 mm voltada para baixo. Coloque e ajuste a janela de vidro acima do local da craniotomia para garantir que a janela possa se encaixar perfeitamente na borda da craniotomia. A tampa de vidro de 5 mm está na parte superior.
- Prepare o cimento dental da seguinte forma: combine 100 mg de cimento em pó, duas gotas de líquido de base rápida e uma gota de catalisador. Mexa a mistura até misturar completamente (~15 vezes). Aguarde ~6 min até que o cimento fique pastoso e grosso. Se o cimento for demasiado fino, pode infiltrar-se no espaço sob a janela no passo 3.6.4 e obscurecer a janela.
- Enquanto espera que o cimento se torne pastoso e espesso, aplique uma quantidade adequada de pressão na janela através de um manipulador estereotáxico, para verificar se o crânio pode entrar em contato seguro e firmemente com a janela de vidro. Certifique-se de que o líquido de cimento dentário do passo 3.6.4 não atingirá o espaço sob o vidro e, assim, obscurecerá a janela.
- Use uma escova aplicadora de precisão ajustável para adicionar uma pequena quantidade de cimento ao lado da borda da janela para selar a janela de vidro com o crânio. Aguarde ~10 min para deixar o cimento secar completamente e, em seguida, solte e remova suavemente o manipulador acima da janela. A partir desta etapa, são necessárias ~4 h para terminar os impactos dos 10 TCE e implantar o cabeçote e a janela craniana.
- Corte o cimento dentário usando a broca dental com uma broca de metal duro FG4 se houver excesso de cimento cobrindo a janela.
NOTA: O excesso de cimento ao redor da janela pode impedir que as lentes objetivas de dois fótons se aproximem da superfície da janela.
- Implantando bem a imagem
NOTA: Um poço de imagem (Figura 2D) é um anel de borracha com um diâmetro externo de ~1,6 cm, que corresponde à superfície superior da cabeceira e retém água acima da janela craniana para imagens de dois fótons.- Após o término do implante da janela, perfure os restos de cimento dentário na superfície superior do poste e limpe a área com gaze cirúrgica úmida. Deixe a área secar por ~3 min.
- Use um aplicador com ponta de algodão para mergulhar uma pequena quantidade de supercola e cole-a na superfície superior da cabeceira. Coloque rapidamente o anel de borracha no cabeçote. Aplique pressão média no anel de borracha por ~2 min para garantir um contato próximo com o cabeçote. Use supercola com moderação, caso contrário, ela pode aderir à janela de vidro e obscurecer a imagem de dois fótons.
- Administração de analgésicos e antibióticos
- Imediatamente após o implante da imagem, mas antes da suspensão do isoflurano, administrar cefazolina [500 mg/kg (333 mg/mL, geralmente ~45 μL), por via intramuscular] e meloxicam (5 mg/kg, por via subcutânea) com seringas de insulina descartáveis.
- Após a administração da droga, interrompa a anestesia, solte o rato da estrutura estereotáxica e devolva o rato à sua gaiola doméstica, que está acima de uma manta de aquecimento.
- Monitore de perto o mouse por ~15 min até que ele esteja deambulando.
NOTA: Abrigar os ratos individualmente, pois eles podem morder bem a imagem de borracha de outros camundongos. Forneça gel de água e comida perto do rato na gaiola para acesso ad libitum. - Administrar novamente buprenorfina (1 mg/kg, por via subcutânea) e meloxicam (5 mg/kg, por via subcutânea) novamente a cada 8 h após a dose anterior até 48 h após a cirurgia de implante de janela craniana.
4. Imagem intravital de dois fótons
- Utilizar microscópio 2 (Tabela de Materiais), equipado com laser multifóton coerente sintonizável e objetiva de aumento de 20x (NA 1.0; imersão em água), para obtenção de imagens intravitais18. O filtro usado para o sinal EGFP é "BP 500-550".
- Prepare o mouse da janela craniana para imagens intravitais.
- A partir do dia da cirurgia (designado como dia 0), realizar imagens de dois fótons em momentos projetados pós-TCE. Coloque o mouse da janela craniana na câmara de indução da anestesia e administre isoflurano a 3% misturado com gás carreador a uma taxa de fluxo de 1,5 L/min por 5 minutos.
NOTA: O gás transportador pode ser ar ambiente ou 100% oxigênio. - Uma vez que o rato esteja totalmente anestesiado (ou seja, taxas respiratórias lentas, mas constantes, de aproximadamente um ciclo por 2 s, juntamente com a ausência de um reflexo de pinça na cauda), remova o rato da câmara de indução e prenda rapidamente o poste da cabeça a um suporte. Deixe o torso do mouse deitado em uma placa de plástico redonda (19 cm de diâmetro) que está equipada com o suporte.
NOTA: Uma almofada aquecida para a mão foi colocada sob o tronco do mouse para fornecer suporte térmico durante a aquisição de imagens intravitais. - Aplique pomada oftálmica lubrificante nos olhos do rato e coloque o cone do nariz da tubulação de anestesia sobre o focinho do rato. Manter a anestesia usando isoflurano a 1,5% com gás carreador a uma taxa de fluxo de 1 L/min.
- Verifique periodicamente a frequência respiratória e aplique uma pinça na cauda ou no dedo do pé pelo menos a cada 15 minutos durante toda a imagem para avaliar a anestesia apropriada. Ajustar a concentração de isoflurano conforme apropriado para manter a profundidade de anestesia desejada.
- Alinhe a cabeça do mouse para garantir que a janela craniana esteja diretamente abaixo da lente objetiva de dois fótons. Adicione um pouco de água na imagem bem acima da janela craniana. Abaixe a objetiva para que ela fique imersa na água.
- A partir do dia da cirurgia (designado como dia 0), realizar imagens de dois fótons em momentos projetados pós-TCE. Coloque o mouse da janela craniana na câmara de indução da anestesia e administre isoflurano a 3% misturado com gás carreador a uma taxa de fluxo de 1,5 L/min por 5 minutos.
- Imagem intravital de camundongos com janela intracraniana
- Ligue a lâmpada de mercúrio do escopo. Veja o cérebro com epifluorescência através da ocular primeiro.
NOTA: A vasculatura aparece preta. Selecione uma área onde a janela esteja limpa. Desligue a epifluorescência, ajuste o comprimento de onda do laser para 860 nm para o sinal EGFP e ajuste a configuração do laser para o sinal ideal (ou seja, brilhante, mas não saturado). - Defina o modo de varredura como Quadro e a etapa de linha como 1. Defina o número médio como 16, a profundidade de bits como 8 bits, o modo como Linha e o método como Média.
- Use o padrão de vasculatura como um "mapa de referência" para obter imagens da mesma região cerebral para imagens longitudinais subsequentes. Imagem do nível superficial (camada I, a menos de 100 μm da superfície meníngea) para três planos onde a vasculatura cortical domina através do modo z-stack, com intervalo interplano de 10 μm, conforme indicado na Figura 3A.
- Imagem de seis planos em nível profundo (camada IV e V, ~400 μm mais profundo que o nível superficial), através de um modo z-stack como indicado na Figura 3A, com intervalo interplano de 10 μm e velocidade de varredura de 8.
- Depois de terminar a imagem (~20 min por mouse), interrompa a anestesia, solte o mouse dos quadros e devolva-o à sua gaiola doméstica que está acima de uma manta de aquecimento. Monitore o mouse consecutivamente até que ele esteja deambulando, o que geralmente leva ~7 min.
- Imagem longitudinal do camundongo no dia 0, 1 semana e 4 meses após a cirurgia de TCE.
- Ligue a lâmpada de mercúrio do escopo. Veja o cérebro com epifluorescência através da ocular primeiro.
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Representative Results
Como prova de conceito para este protocolo, partículas virais expressando AAV-Syn1-EGFP foram injetadas no córtex cerebral de camundongos machos TDP-43 Q331K/Q331K (fundo C57BL/6J)19 com a idade de 3 meses. Nota-se que animais selvagens C57BL/6J também podem ser usados, no entanto, este estudo foi realizado em camundongos TDP-43 Q331K/Q331K porque o laboratório é focado na pesquisa de doenças neurodegenerativas. Uma cirurgia de TCE foi realizada 4 semanas após a injeção de AAV. Dentro do mesmo ambiente cirúrgico, foram implantados o cabeçote e a janela craniana. O camundongo foi fotografado em série usando um microscópio de dois fótons no dia 0, 1 semana e 4 meses após a cirurgia de TCE (Figura 1). Em geral, a cirurgia de injeção levou ~30 min, e a cirurgia de TCE levou ~1 h por rato. Durante a cirurgia de TCE, os camundongos geralmente necessitaram de um tempo maior para se corrigirem de uma posição supina para uma posição prona após impactos subsequentes, em comparação com os impactos iniciais. Por exemplo, um mouse pode ter exigido 2 min para corrigir sua posição após o primeiro impacto, mas precisou de 10 min para corrigir sua posição após o10º impacto. Para a cirurgia de implante de janela craniana, ~3 h era geralmente necessário para executar todas as etapas, mas levou mais tempo do que o necessário se ocorresse sangramento persistente. A aquisição de imagens com dois fótons geralmente requer 20 min por mouse para adquirir todas as imagens. Para o presente estudo envolvendo três camundongos com a expressão de EGFP, os animais não apresentaram evidência de fratura de crânio, nem morreram durante a cirurgia ou até 4 meses após a cirurgia. Tanto a morbidade quanto a taxa de fratura de crânio foram de 0%. Isso é consistente com a mortalidade relativamente baixa (<10%) em um modelo semelhante de indução de TCE, mas sem implante de janela craniana 7,8.
Um dispositivo de queda de peso (Figura 2A), previamente relatado7,8, foi usado para liberar o impacto do TCE na cabeça do mouse do lado direito, conforme indicado na Figura 2B. Um tubo plástico transparente (nº 5 na Figura 2A; 60 cm de comprimento e 1,4 cm de diâmetro interno) foi fixado de forma segura e vertical a um braquete metálico, e uma coluna pêndola plástica (nº 7 na Figura 2A; 10 cm de comprimento e 1,3 cm de diâmetro, com ponta redonda plana de 2 mm de diâmetro) foi colocada no tubo vertical. Um peso metálico de 50 g (nº 6 na Figura 2A) foi colocado acima do pêndulo e amarrado com uma corda de náilon (nº 4 na Figura 2A). Uma almofada tampão (nº 8 na Figura 2A; 9 cm x 9 cm x 1 cm [comprimento x largura x profundidade], feita de espuma de polietileno e gaze de algodão) foi colocada sob a cabeça do mouse para tamponar e absorver a energia do impacto.
A janela craniana era feita de duas lamínulas de vidro combinadas com adesivo óptico (Figura 2C), e a lamínula de vidro de 3 mm de diâmetro era o lado que tocava a superfície cerebral. A imagem de dois fótons foi realizada em duas profundidades diferentes (Figura 3A) da superfície cerebral: 1) um nível superficial onde a vasculatura cortical era abundante e tinha um diâmetro de lúmen relativamente grande que parecia preto, mas com corpos celulares positivos para EGFP esparsos; e 2) um nível mais profundo, onde a vasculatura era esparsa e tinha um pequeno diâmetro de luz, com muitas células positivas para EGFP visíveis.
Em ~4 h (dia 0) após a cirurgia, imagens de dois fótons foram realizadas em três planos, com intervalo de 10 μm no nível superficial (camada I, a menos de 100 μm da superfície meníngea), primeiro onde a vasculatura apareceu preta (indicada pelas linhas vermelhas tracejadas na Figura 3B), e foi usado como mapa de referência para a próxima sessão de imagem para localizar a região original da imagem. Nesse nível superficial, a vasculatura cortical e os processos neuronais foram as estruturas predominantes que puderam ser observadas, enquanto os corpos celulares positivos para EGFP foram escassos. Após a obtenção de imagens dentro do nível superficial, o foco foi ajustado para baixo em ~400 μm, mais profundo do que o nível superficial, no córtex (camadas IV e V) para obter imagens dos corpos celulares neuronais positivos para EGFP. As imagens foram adquiridas em seis planos, com intervalo de 10 μm. A expressão da proteína EGFP distribuiu-se difusamente por todo o corpo celular, conforme indicado na Figura 3C. Houve ocorrência ocasional de alguns pontos de EGFP fora dos corpos celulares, o que poderia representar inclusões de EGFP que se formaram ao longo do tempo dentro de axônios ou dendritos. Este protocolo resulta na expressão de AAV-SYN1-EGFP ~2-3 mm ao redor do local da injeção, que pode ser definida pela análise histológica de tecidos post-mortem.
Com 1 semana e 4 meses pós-TCE, o padrão de vasculatura observado no tempo 0 do dia foi utilizado como referência para localizar a mesma região de imagem (Figura 3D,F). O padrão de vasculatura na Figura 3D,F é semelhante ao da Figura 3B. O procedimento de imagem para 1 semana e 4 meses pós-TCE foi o mesmo descrito acima para o dia 0, e a expressão de EGFP foi detectada em todo o corpo celular como antes (Figura 3E,G). A intensidade da fluorescência nos dias 0 e 4 meses foi semelhante tanto no nível superficial quanto no profundo. Entretanto, a intensidade da fluorescência em 1 semana foi menor do que a dos dias 0 e 4 meses, tanto no nível superficial quanto no profundo, o que pode ser devido à repressão translacional relatada para outros modelos de TCE20. Notavelmente, a qualidade das imagens aos 4 meses em comparação com o ponto de tempo do dia 0 demonstra que a janela craniana manteve clareza e integridade, e que a expressão viral ainda é robusta 4 meses após a cirurgia para imagens intravitais eficazes. Como o EGFP se expressa como uma proteína relativamente difusa, os sinais de fluorescência podem ser melhor resolvidos e discretos quando o EGFP é fundido a uma proteína de interesse.
Figura 1: Linha do tempo para este protocolo de imagem intravital. O protocolo é iniciado com injeção do vírus. TCE e cirurgia de janela craniana são realizados dentro da mesma sessão de cirurgia em 2-4 semanas após a injeção do vírus. A imagem intravital é realizada no dia 0, 1 semana, 4 meses após o TCE. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Diagramas para o dispositivo de TCE, local de impacto do TCE e preparação da janela. (A) Equipamento para o dispositivo de TCE de queda de peso. 1: pedestal, 2: suporte, 3: braçadeira ajustável, 4: corda de nylon, 5: túnel de queda de peso, 6: coluna de peso de metal (50 g), 7: impactor, 8: almofada tampão. (B) Esquema da injeção do vírus e do local de impacto do TCE, com as coordenadas 2,5 mm posterior ao Bregma e 2 mm lateral da sutura sagital à direita. (C) Um esquema para preparar a janela de vidro. Duas lamínulas de tampa de vidro, de 3 mm e 5 mm de diâmetro, são combinadas usando adesivo óptico. (D) Fotos do cabeçote metálico e poço de imagem. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Esquema dos planos de imagem e dos dados da imagem. (A) Múltiplos planos são fotografados em um nível superficial onde a vasculatura está localizada e um nível profundo. As imagens são coletadas da seguinte forma: três planos no nível superficial, onde predominam as estruturas positivas para EGFP e na vasculatura cortical e seis planos no nível profundo, onde predominam corpos celulares positivos para EGFP, com intervalo de 10 μm entre os planos vizinhos. Cada plano tem um tamanho de 425,10 μm x 425,10 μm. (B) Imagem representativa de um plano no nível superficial no ponto de tempo do dia 0. As linhas vermelhas tracejadas indicam o contorno da vasculatura que pode ser usado como referência para localizar o local de imagem original para os pontos de tempo subsequentes. (C) Imagem representativa de um plano no nível profundo no ponto de tempo 0 do dia logo após o TCE. (D) Imagem representativa de um plano no nível superficial no ponto de tempo de 1 semana. As linhas vermelhas tracejadas denotam a vasculatura, semelhante ao contorno no dia 0 na Figura 3B, confirmando que a imagem de dois fótons foi realizada em local semelhante nos dias 0 e 1 semana após o TCE. (E) Imagem representativa no nível profundo no momento de 1 semana pós-TCE. (F) O mesmo que B e D, aos 4 meses pós-TCE. (G) O mesmo que C e E, aos 4 meses pós-TCE. Barra de escala: 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Neste estudo, a injeção de AAV, a administração de TCE e um cabeçote com implante de janela craniana foram combinados para análise de imagem longitudinal de neurônios marcados com EGFP dentro do córtex cerebral de camundongos (camadas IV e V) para observar os efeitos do TCE nos neurônios corticais. Este estudo observa que o local do TCE aqui escolhido, acima do hipocampo, fornece uma superfície relativamente plana e ampla para a implantação da janela craniana. Por outro lado, o crânio é relativamente estreito anteriormente a este local e, portanto, é difícil garantir que o poste da cabeça entre efetivamente em contato com a superfície do crânio. Enquanto apenas o modelo de camundongo TDP-43 Q331K/Q331K foi usado neste estudo, considerando as pesquisas do laboratório com foco em ELA e FTD19, este protocolo deve ser aplicável à maioria das outras linhagens de camundongos. Além de marcar neurônios como descrito aqui, várias estratégias podem ser usadas para marcar outros tipos de células para imagens intravitais. Uma abordagem é expressar as proteínas fluorescentes codificadas geneticamente de forma célula-específica, usando o sistema de recombinação Cre-Lox em camundongos geneticamente modificados21. Outra abordagem é empregar certos sorotipos virais para transdução célula-específica de proteínas fluorescentes codificadas geneticamente. A entrega sítio-específica pode ser obtida através da realização da injeção intracraniana no local desejado no cérebro. A eficiência e a facilidade com que se pode expressar proteínas células-específicas via transdução viral para imagens intravitais é uma vantagem sobre a criação de modelos transgênicos em camundongos.
Para os protocolos cirúrgicos, há várias etapas críticas que precisam ser cuidadosamente realizadas. Ao fazer furos no crânio para injeção de vírus no início do protocolo, é preciso ter cuidado para não danificar o tecido abaixo do crânio. Se ocorrer dano tecidual durante a perfuração do crânio, haverá inflamação, adesão tecidual e angiogênese ao redor do local da lesão, aumentando assim o risco de sangramento durante a craniotomia para implante de janela craniana. Para a administração do TCE com o dispositivo de queda de peso, o presente estudo colocou uma almofada sob a cabeça do camundongo para tamponar a força de impacto do TCE e, assim, diminuir a chance de uma fratura de crânio. Não foram observados movimentos evidentes da cabeça nas direções de rotação e aceleração, apoiando a noção de que esse modelo de TCE tem uma chance relativamente baixa de lesão axonal por difusão. Curiosamente, e col. utilizaram um dispositivo semelhante de queda de peso para construir uma lesão de TCE de crânio fechado em ratos, e uma almofada de espuma maior e macia (12 cm de espessura) foi colocada sob a cabeça do rato para que ele pudesse se mover facilmente em resposta à força de impacto do TCE no sentido rotacional com aceleração, resultando em lesão axonal de difusão22. Uma das vantagens do modelo TCE de queda de peso guiado por tubo é que a gravidade do trauma pode ser modulada alterando-se a altura da queda de peso (isto é, uma altura maior para uma força maior) e/ou repetindo o número de vezes que o impacto é desferido. Flierl et al., por exemplo, utilizaram um dispositivo de queda de peso semelhante ao presente estudo para induzir TCE em camundongos; o peso do metal foi de 333 g, o que induziu TCE leve quando caído de uma altura de 2 cm e um TCE grave quando caiu de uma altura de 3 cm23. A etapa de craniotomia antes do implante da janela também precisa ser realizada com cuidado, para evitar danos ao tecido cerebral sob o crânio. Mover periodicamente a broca para uma região diferente no crânio ajuda a evitar o excesso de perfuração no mesmo local, o que pode resultar em aquecimento excessivo, danos nos tecidos e sangramento; Além disso, irrigar frequentemente com soro fisiológico também pode resfriar o local de perfuração. Ao implantar a janela de vidro, é importante alinhar o plano de vidro de forma que ele fique paralelo ao plano da superfície do crânio; Uma janela confortável dentro do crânio evita o vazamento do líquido de cimento dental no espaço entre a janela e o cérebro.
Se a janela estiver embaçada no dia 0 pós-TCE, mas sinais fluorescentes forem detectados, o cimento dentário pode ter entrado no espaço entre a janela e o cérebro, formando assim uma camada de cimento que cobre a superfície cerebral e obscurece a emissão de fluorescência. Nessa situação, pode-se retirar a janela e o cimento dentário utilizando o método de perfuração descrito no passo 3.5 do protocolo e, em seguida, implantar uma nova janela de vidro no local original, conforme descrito detalhadamente por Goldey et al.9. Se a janela ficar embaçada em um estágio subsequente durante o processo de imagem longitudinal, pode-se tentar remover possíveis detritos esfregando suavemente a janela com um aplicador com ponta de algodão. Se isso não resolver o problema, pode ser devido ao recrescimento do osso e das meninges sob a janela de vidro. Nesse caso, pode-se retirar a janela e a broca para remover o osso regenerado e/ou a pinça e remover as meninges, seguida da implantação de uma nova janela de vidro no local original, conforme descrito por Goldey et al.9. Como mostrado nos resultados, a expressão e fluorescência de EGFP é robusta ao longo de um curso de tempo de ~4 meses pós-TCE. Pode-se esperar uma diminuição do sinal de fluorescência na primeira semana pós-TCE, provavelmente devido à repressão translacional induzida pelo TCE, que causa uma redução temporária na síntese proteica global20.
Para manter a alta qualidade de imagem e obter imagens em múltiplos planos, camundongos foram submetidos à anestesia com isoflurano para limitar o movimento. No entanto, é importante ressaltar que a anestesia pode afetar os resultados do estudo. Por exemplo, foi relatado que camundongos sob anestesia com isoflurano exibem atividade microglial diferente em resposta ao fotodano em comparação com camundongos acordados24. Para imagens de dois fótons, a velocidade de varredura e o número de varreduras para a média do sinal (definido como "número", em "média") são os principais fatores que podem determinar a resolução da imagem. Para otimizar a resolução, pode-se reduzir a velocidade de digitalização e aumentar o número médio, no entanto, uma velocidade mais lenta e um número médio maior aumentam o tempo de imagem para um determinado campo de visão e podem causar clareamento fotográfico. O presente estudo tem como objetivo realizar exames crônicos de imagem a longo prazo no mesmo animal no mesmo local cerebral. Para evitar o potencial clareamento fotográfico e, ao mesmo tempo, alcançar resolução suficiente, imagens de dois fótons foram realizadas a uma velocidade de varredura de 8 com um número médio de 16.
Uma abordagem alternativa para a realização de craniotomia e implante de janela de vidro é o afinamento do crânio, na medida em que ele é transparente e "fino em papel" para imagens ao vivo25,26,27. A janela de crânio fino pode manter a integridade do crânio e, assim, evitar a inflamação induzida pela operação cirúrgica. Portanto, a abordagem da janela de crânio fino pode ser preferida para imagens ao vivo com marcadores relevantes para inflamação e/ou em um período de tempo relativamente mais curto (ou seja, ~14 dias após a cirurgia, como relatado25). Para exames de imagem de longo prazo (isto é, 4 meses, como descrito aqui) de processos neurodegenerativos crônicos, além de avaliar os efeitos agudos do TCE no mesmo animal, recomenda-se o uso de uma janela de vidro implantada por um método de craniotomia.
Como mencionado na introdução, existem várias vantagens notáveis da imagem intravital para o estudo de vários eventos biológicos e patológicos no cérebro de mamíferos. No entanto, existem algumas limitações desse protocolo também. Por exemplo, a lesão cerebral contrecoup descreve a contusão ou hematoma cerebral distante, geralmente oposto ao local de contato com a força28,29,30. No presente estudo, os impactos do TCE foram liberados para o lobo parietal; A lesão contrecoup seria esperada ventralmente e inacessível aos exames intravitais. Uma análise histológica poderia ser usada como uma abordagem complementar para examinar fenótipos de interesse fora do local de impacto coberto pela janela craniana. Além disso, a superexpressão exógena de certas proteínas também pode induzir toxicidade ou patologia. No presente estudo, alguns pontos ocasionais de EGFP foram observados, o que pode representar acúmulos devido à superexpressão proteica. Portanto, recomenda-se incluir uma proteína de controle negativo (por exemplo, EGFP ou RFP isoladamente) no desenho do estudo para abordar essa possibilidade, particularmente se a proteína de interesse for propensa a formar estruturas puntiformes. O número de proteínas que se pode estudar simultaneamente é limitado pelos lasers e capacidades do sistema de dois fótons. Pode ser possível obter imagens de mais de um fluoróforo (por exemplo, EGFP, RFP, etc.) por microscopia de dois fótons, embora as capacidades de multiplexação com microscópios convencionais de campo largo e confocais muitas vezes permitam análises de mais proteínas dentro de uma única amostra de tecido. Finalmente, é importante incluir um controle simulado que receba todos os mesmos procedimentos que o animal com TCE, exceto os impactos de queda de peso. A cirurgia de implante de janela craniana é uma operação invasiva e pode causar algumas alterações locais, como inflamação e pressão intracraniana alterada, que podem afetar o processo de TCE. Um controle simulado ajuda o experimentalista a avaliar fenótipos que são devidos ao impacto versus os procedimentos cirúrgicos.
Em resumo, este protocolo introduz um método para obter imagens longitudinais de proteínas especificamente nos neurônios do córtex cerebral de camundongos em resposta ao TCE. Este protocolo pode ser modificado para analisar a expressão e localização de várias proteínas célula-específicas em resposta ao TCE. O objetivo deste protocolo é fornecer uma abordagem para o estudo das consequências imediatas e de longo prazo do TCE no cérebro de mamíferos.
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Disclosures
Não são declarados conflitos de interesse.
Acknowledgments
Agradecemos ao Dr. Miguel Sena-Esteves, da University of Massachusetts Chan Medical School, por presentear o vírus AAV(PHP.eB)-Syn1-EGFP, e a Debra Cameron, da University of Massachusetts Chan Medical School, por desenhar o esboço do crânio de camundongos. Agradecemos também aos membros atuais e passados dos laboratórios Bosco, Schafer e Henninger por suas sugestões e apoio. Este trabalho foi financiado pelo Departamento de Defesa (W81XWH202071/PRARP) para DAB, DS e NH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adjustable Precision Applicator Brushes | Parkell | S379 | |
| BD insulin syringe | BD | NDC/HRI#08290-3284-38 | 5/16" x 31G |
| Betadine | Purdue | NDC67618-151-17 | including 7.5% povidone iodine |
| Buprenorphine | PAR Pharmaceutical | NDC 42023-179-05 | |
| Cefazolin | HIKMA Pharmaceutical | NDC 0143-9924-90 | |
| Ceramic Mixing Dish | Parkell | SKU: S387 | For dental cement preparation |
| Cotton Tipped Applicators | ZORO | catlog #: G9531702 | |
| Catalyst | Parkell | S371 | full name: "C" Universal TBB Catalyst |
| Dental cement powder | Parkell | S396 | Radiopaque L-Powder for C&B Metabond |
| Dental drill | Foredom | H.MH-130 | |
| Dental drill controller | Foredom | HP4-310 | |
| Dexamethasone | Phoenix | NDC 57319-519-05 | |
| EF4 carbide bit | Microcopy | Lot# C150113 | Head Dia/Lgth/mm 1.0/4.2 |
| Ethonal | Fisher Scientific | 04355223EA | 75% |
| FG1/4 carbide bit | Microcopy | Lot# C150413 | Head Dia/Lgth/mm 0.5/0.4 |
| FG4 carbide bit | Microcopy | Lot# C150309 | Head Dia/Lgth/mm 1.4/1.1 |
| Headpost | N/A | N/A | Custom-manufactured |
| Heating apparatus | CWE | TC-1000 Mouse | equiped with the stereotaxic instrument and be used while operating surgery |
| Heating blanket | CVS pharmacy | E12107 | extra heating device and be used after surgery |
| Isoflurane | Pivetal | NDC 46066-755-03 | |
| Isoflurane induction chamber | Vetequip | 89012-688 | induction chamber for short |
| Isoflurane volatilizing machine | Vetequip | 911103 | |
| Isoflurane volatilizing machine holder | Vetequip | 901801 | |
| Leica surgical microscope | Leica | LEICA 10450243 | |
| Lubricant ophthalmic ointment | Picetal | NDC 46066-753-55 | |
| Marker pen | Delasco | SMP-BK | |
| Meloxicam | Norbrook | NDC 55529-040-10 | |
| Microinjection pump and its controller | World Precision Instruments | micro4 and UMP3 | |
| Microliter syringe | Hamilton | Hamilton 80014 | 1701 RN, 10 μL gauge for syringe and 32 gauge for needle, 2 in, point style 3 |
| Mosquito forceps | CAROLINA | Item #:625314 | Stainless Steel, Curved, 5 in |
| Depilatory agent | McKesson Corporation | N/A | Nair Hair Aloe & Lanolin Hair Removal Lotion |
| Microscope 1 | Nikon | SMZ745 | Nikon microscope for cranial window preparation |
| Microscope 2 | Zeiss | LSM 7 MP | two-photon microscope |
| Multiphoton laser | Coherent | Chameleon Ultra II, Model: MRU X1, VERDI 18W | laser for two-photon microscopy |
| Non-absorbable surgical suture | Harvard Apparatus | catlog# 59-6860 | 6-0, with round needle |
| Norland Optical Adhesive 81 | Norland Products | NOA 81 | |
| No-Snag Needle Holder | CAROLINA | Item #: 567912 | |
| Quick base liquid | Parkell | S398 | "B" Quick Base For C&B Metabond |
| Regular scissor 1 | Eurostat | eurostat es5-300 | |
| Regular scissor 2 | World Precision Instruments | No. 501759-G | |
| Round cover glass 1 | Warner instruments | CS-5R Cat# 64-0700 | for 5 mm of diameter |
| Round cover glass 2 | Warner instruments | CS-3R Cat# 64-0720 | for 3 mm of diameter |
| Rubber rings | Orings-Online | Item # OO-014-70-50 | O-Rings |
| Saline | Bioworld | L19102411PR | |
| Spring scissor 1 | World Precision Instruments | No. 91500-09 | tip straight |
| Spring scissor 2 | World Precision Instruments | No. 91501-09 | tip curved |
| Stereotaxic platform | KOPF | Model 900LS | |
| Super glue | Henkel | Item #: 1647358 | |
| surgical Caliper | World Precision Instruments | No. 501200 | |
| Surgical forceps 1 | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | Catlog# 0508-5/45-PO | style 5/45, curved |
| Surgical forceps 2 | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | catlog# 0103-5-PO | style 5, straight |
| Surgical forceps 3 | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | catlog# 72912 | |
| Surgical forceps 4 | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | Catlog# 0508-5/45-PO | style 5/45, curved |
| Surgical gauze | ZORO | catlog #: G0593801 | |
| Surgical lamp | Leica | Leica KL300 LED | |
| UV box | Spectrolinker | XL-1000 | also called UV crosslinker |
| Vaporguard | Vetequip | 931401 | |
| Vetbond Tissue Adhesive | 3M Animal Care | Part Number:014006 |
References
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