Summary
Questo studio dimostra la somministrazione di una lesione cerebrale traumatica ripetitiva ai topi e l'impianto simultaneo di una finestra cranica per il successivo imaging intravitale di un EGFP espresso da neuroni utilizzando la microscopia a due fotoni.
Abstract
L'obiettivo di questo protocollo è quello di dimostrare come visualizzare longitudinalmente l'espressione e la localizzazione di una proteina di interesse all'interno di specifici tipi di cellule del cervello di un animale, in seguito all'esposizione a stimoli esogeni. Qui, viene mostrata la somministrazione di una lesione cerebrale traumatica a cranio chiuso (TBI) e l'impianto simultaneo di una finestra cranica per il successivo imaging intravitale longitudinale nei topi. Ai topi viene iniettato per via intracranica un virus adeno-associato (AAV) che esprime una proteina fluorescente verde potenziata (EGFP) sotto un promotore neuronale specifico. Dopo 2-4 settimane, i topi vengono sottoposti a un trauma cranico ripetitivo utilizzando un dispositivo di caduta del peso sopra la posizione di iniezione dell'AAV. All'interno della stessa sessione chirurgica, ai topi viene impiantato un palo di metallo e quindi una finestra cranica di vetro sopra il sito di impatto del trauma cranico. L'espressione e la localizzazione cellulare dell'EGFP vengono esaminate utilizzando un microscopio a due fotoni nella stessa regione del cervello esposta a traumi nel corso di mesi.
Introduction
La lesione cerebrale traumatica (TBI), che può derivare da lesioni sportive, collisioni di veicoli e combattimenti militari, è un problema di salute in tutto il mondo. Il trauma cranico può portare a deficit fisiologici, cognitivi e comportamentali e disabilità o mortalità permanente 1,2. La gravità del trauma cranico può essere classificata come lieve, moderata e grave, la stragrande maggioranza dei quali è un trauma cranico lieve (75%-90%)3. È sempre più riconosciuto che il trauma cranico, in particolare le occorrenze ripetitive di trauma cranico, possono promuovere la degenerazione neuronale e fungere da fattori di rischio per diverse malattie neurodegenerative, tra cui il morbo di Alzheimer (AD), la sclerosi laterale amiotrofica (SLA), la demenza frontotemporale (FTD) e l'encefalopatia traumatica cronica (CTE)4,5,6. Tuttavia, i meccanismi molecolari alla base della neurodegenerazione indotta da TBI rimangono poco chiari e rappresentano quindi un'area di studio attiva. Per ottenere informazioni su come i neuroni rispondono e si riprendono dal trauma cranico, viene descritto un metodo per il monitoraggio delle proteine di interesse marcate con fluorescenza, in particolare all'interno dei neuroni, mediante imaging intravitale longitudinale nei topi dopo trauma cranico.
A tal fine, questo studio mostra come combinare una procedura chirurgica per la somministrazione di un trauma cranico a cranio chiuso simile a quella precedentemente riportata7,8, insieme a una procedura chirurgica per l'impianto di una finestra cranica per l'imaging intravitale a valle, come descritto da Goldey et al9. In particolare, non è possibile impiantare prima una finestra cranica e successivamente eseguire un trauma cranico nella stessa regione, poiché l'impatto della caduta di peso che induce il trauma cranico rischia di danneggiare la finestra e causare danni irreparabili al topo. Pertanto, questo protocollo è stato progettato per somministrare il trauma cranico e quindi impiantare la finestra cranica direttamente sul sito di impatto, il tutto all'interno della stessa sessione chirurgica. Un vantaggio della combinazione del trauma cranico e dell'impianto della finestra cranica in un'unica sessione chirurgica è la riduzione del numero di volte in cui un topo viene sottoposto a intervento chirurgico. Inoltre, consente di monitorare la risposta immediata (cioè sulla scala temporale di ore) al trauma cranico, invece di impiantare la finestra in una sessione chirurgica successiva (cioè l'imaging iniziale che inizia su una scala temporale di giorni dopo il trauma cranico). La finestra cranica e la piattaforma di imaging intravitale offrono anche vantaggi rispetto al monitoraggio delle proteine neuronali con metodi convenzionali come l'immunocolorazione dei tessuti fissi. Ad esempio, sono necessari meno topi per l'imaging intravitale, poiché lo stesso topo può essere studiato in più punti temporali, al contrario di coorti separate di topi necessarie per punti temporali discreti. Inoltre, gli stessi neuroni possono essere monitorati nel tempo, consentendo di tracciare specifici eventi biologici o patologici all'interno della stessa cellula.
Come prova di concetto, l'espressione neurone-specifica della proteina fluorescente verde potenziata (EGFP) sotto il promotore della sinapsina è dimostrata qui10. Questo approccio può essere esteso a 1) diversi tipi di cellule cerebrali utilizzando altri promotori specifici del tipo di cellula, come il promotore della proteina basica della mielina (MBP) per gli oligodendrociti e il promotore della proteina acida fibrillare gliale (GFAP) per gli astrociti11, 2) diverse proteine bersaglio di interesse fondendo i loro geni con il gene EGFP e 3) co-esprimendo più proteine fuse a diversi fluorofori. In questo caso, l'EGFP viene confezionato ed espresso tramite la somministrazione di virus adeno-associati (AAV) attraverso un'iniezione intracranica. Un trauma cranico a cranio chiuso viene somministrato utilizzando un dispositivo per la riduzione del peso, seguito dall'impianto di una finestra cranica. La visualizzazione dell'EGFP neuronale si ottiene attraverso la finestra cranica, utilizzando la microscopia a due fotoni per rilevare la fluorescenza dell'EGFP in vivo. Con il laser a due fotoni, è possibile penetrare più in profondità nel tessuto corticale con un fotodanno minimo, consentendo l'imaging longitudinale ripetuto delle stesse regioni corticali all'interno di un singolo topo per giorni e fino a mesi12,13,14,15. In sintesi, questo approccio di combinazione di un intervento chirurgico per trauma cranico con l'imaging intravitale mira a far progredire la comprensione degli eventi molecolari che contribuiscono alla patologia della malattia indotta da trauma cranico16,17.
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Protocol
Tutti i protocolli relativi agli animali sono stati condotti in conformità con la Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio pubblicata dal Comitato del Consiglio Nazionale delle Ricerche (USA). I protocolli sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee della Chan Medical School (UMMS) dell'Università del Massachusetts (numero di permesso 202100057). In breve, come mostrato nello schema di studio (Figura 1), l'animale riceve un'iniezione virale, un trauma cranico, un impianto di finestre e quindi un imaging intravitale in una sequenza temporale.
NOTA: I termini commerciali sono stati rimossi. Si prega di fare riferimento alla Tabella dei materiali per l'attrezzatura specifica utilizzata.
1. Iniezione intracranica di AAV utilizzando un dispositivo stereotassico
- AAV(PHP.eB)-Syn1-EGFP
- Utilizzare un titolo virale di 1 x 1013 genomi virali per millilitro (vg/mL). Syn1 si riferisce a Synapsin1, che è un promotore neuronale specifico che consente una limitata espressione virale nei neuroni. Il virus può essere preparato internamente o esternalizzato.
- Preparazione per l'intervento chirurgico di iniezione stereotassica per la somministrazione di AAV
- Forbici normali in autoclave, un calibro chirurgico, forbici chirurgiche a molla, pinze chirurgiche, pinze per zanzare, garze, un applicatore con punta in cotone e una siringa da microlitri di vetro.
- Sanificare l'area chirurgica utilizzando etanolo al 75%. Espandere il telo chirurgico sterile monouso per coprire la regione chirurgica sulla piattaforma stereotassica.
NOTA: Per mantenere la temperatura corporea dell'animale durante l'intervento chirurgico di iniezione, utilizzare un apparecchio di riscaldamento regolato con feedback. - Pesare e registrare il peso corporeo del topo.
- Aprire la valvola della bombola dell'ossigeno e regolare il flusso di ossigeno a 1,5 L/min. Aprire la macchina per anestesia e impostare il valore del livello di isoflurano su tre.
NOTA: Il gas di trasporto può essere aria ambiente o ossigeno al 100% in questa fase. - Metti il mouse nella camera di induzione e lascialo riposare per 5 minuti per ottenere l'anestesia completa.
- Una volta che il topo è completamente anestetizzato (cioè, frequenze respiratorie lente ma costanti a circa un ciclo ogni 2 s, insieme all'assenza di un riflesso di pizzicamento della coda), rimuovere il topo dalla camera di induzione e posizionare la testa del topo nel telaio stereotassico.
- Posiziona il cono del tubo dell'anestesia sul muso del topo.
- Mantenere l'anestesia utilizzando isoflurano all'1,5%, con gas di trasporto a una portata di 1 L/min fino alla fine dell'intervento. Controllare periodicamente la frequenza del respiro e dare un pizzico alla coda o alle dita dei piedi almeno ogni 15 minuti durante l'intervento chirurgico per valutare l'anestesia appropriata. Regolare la concentrazione di isoflurano in modo appropriato per mantenere la profondità di anestesia desiderata.
- Riempire una siringa da microlitri (10 μL) con la soluzione virale. Quindi, fissare la siringa sulla pompa microiniettore abbinata del dispositivo stereotassico.
- Chirurgia iniettiva
- Somministrare buprenorfina (1 mg/kg, per via sottocutanea) utilizzando una siringa da insulina monouso e applicare unguento oftalmico lubrificante sugli occhi del topo.
- Rimuovere i capelli dal cuoio capelluto sulla sommità della testa tagliandoli con le normali forbici 1.
- Pulire la pelle del cuoio capelluto con garze e applicatori con punta di cotone. Disinfettare la pelle utilizzando prima etanolo al 75% e poi betadine. Ripeti l'operazione tre volte (cioè etanolo seguito da betadine), lasciando l'applicazione finale di betadine sulla pelle.
- Ricontrollare la profondità dell'anestetico per assicurarsi che il topo sia completamente anestetizzato (cioè, frequenze respiratorie lente ma costanti a circa un ciclo ogni 2 s, insieme all'assenza di un riflesso di pizzicamento della coda). Eseguire un'incisione di ~ 1 cm utilizzando le normali forbici 2 lungo la linea mediana per esporre il cranio parietale destro e rimuovere il periostio utilizzando un applicatore con punta di cotone.
- Segnare due punti sul cranio con un pennarello in corrispondenza di queste coordinate: punto A: 2,5 mm posteriormente al Bregma e 1 mm lateralmente alla linea mediana sopra l'emisfero destro; punto B: 2,5 mm posteriormente al Bregma e 2 mm lateralmente alla linea mediana sopra l'emisfero destro.
- Praticare con cautela due fori attraverso il cranio alle coordinate contrassegnate utilizzando un trapano dentale elettrico con una punta in metallo duro EF4 fine.
NOTA: Fare attenzione a non danneggiare il tessuto cerebrale. - Regolare la cornice stereotassica per allineare la punta dell'ago della siringa da microlitri al foro del cranio che si trova 1 mm lateralmente alla linea mediana.
- Abbassare l'ago della siringa in modo che tocchi la superficie cerebrale, quindi impostare tale posizione come punto zero (per l'asse z). Abbassare la punta dell'ago nella corteccia cerebrale a una profondità di 0,5 mm e infondere lentamente 1 μL della soluzione virale a una velocità di 200 nL/min.
- Attendere 5 minuti dopo che la soluzione virale è stata completamente iniettata nel tessuto cerebrale prima di estrarre l'ago per evitare il riflusso della soluzione.
- Estrarre lentamente l'ago della siringa. Ripeta l'iniezione nell'altro sito. Suturare l'incisione con una sutura chirurgica sterile e non assorbibile (calibro 6-0).
- Somministrare cefazolina [500 mg/kg (333 mg/mL, di solito ~45 μL), per via intramuscolare] e meloxicam (5 mg/kg, per via sottocutanea) dopo l'intervento chirurgico mentre l'animale è ancora anestetizzato.
- Rilasciare il topo dalla cornice stereotassica e interrompere l'anestesia. Metti il topo in una gabbia pulita sopra una coperta riscaldante e monitora l'animale fino a quando non è in grado di deambulare (circa 15 minuti). Quindi, trasferisci nella gabbia di casa.
- Somministrare nuovamente buprenorfina (1 mg/kg, per via sottocutanea) e meloxicam (5 mg/kg, per via sottocutanea) rispettivamente a 8 ore, 16 ore e 24 ore, dopo la prima iniezione di buprenorfina.
NOTA: A 2-4 settimane dall'iniezione del virus, il topo riceve un trauma cranico e l'impianto di una finestra cranica nello stesso sito dell'iniezione di AAV.
2. Somministrazione di un'induzione ripetitiva del trauma cranico
NOTA: I parametri del TBI sono regolati dai precedenti report7,8, in cui l'impatto del TBI è stato consegnato una volta. Il protocollo applica lo stesso parametro, ad eccezione dell'aumento del numero di impatto totale a 10.
- Attrezzatura per trauma cranico
- Utilizzare un dispositivo portatile personalizzato per la somministrazione di un trauma cranico a cranio chiuso (Figura 2A) sulla testa del topo sul lato destro, come indicato nella Figura 2B.
- Preparazione prima dell'intervento chirurgico
- Attrezzatura chirurgica in autoclave, tra cui forbici normali, calibro chirurgico, forbici chirurgiche a molla, pinze chirurgiche, pinze per zanzare, pezzi di testa, garze e applicatori con punta di cotone.
- Pesare e registrare il peso corporeo del topo 2 ore prima dell'intervento. Per ridurre al minimo l'edema cerebrale durante l'impianto della finestra cranica, iniettare desametasone fosfato di sodio alla dose di 4,8 mg/kg [2 mg/mL, di solito ~70 μl (è necessario iniettare in due siti)] nel muscolo quadricipite utilizzando una siringa da insulina. Dopo l'iniezione di desametasone, ma prima di iniziare l'intervento chirurgico di trauma cranico, preparare le finestre di vetro come indicato al punto 3.1 per un uso successivo.
- Disinfettare la fase chirurgica e l'attrezzatura per il trauma cranico utilizzando etanolo al 75% ed espandere il telo chirurgico sterile monouso per coprire la fase chirurgica sulla piattaforma stereotassica. Accendere l'apparecchio di riscaldamento e il monitor della temperatura, impostando la temperatura target a 37 °C.
- Aprire la valvola della bombola dell'ossigeno e regolare il flusso di ossigeno a 1,5 L/min. Aprire la macchina per anestesia e impostare il valore del livello di isoflurano su tre.
NOTA: L'ossigeno puro al 100% può aiutare l'animale a sopravvivere agli impatti del trauma cranico. - Metti il mouse nella camera di induzione e lascialo riposare per 5 minuti per ottenere l'anestesia completa.
- Una volta che il topo è completamente anestetizzato (cioè, frequenze respiratorie lente ma costanti a circa un ciclo ogni 2 s, insieme all'assenza di un riflesso di pizzicamento della coda), rimuovere il topo dalla camera di induzione e posizionare la testa del topo nel telaio stereotassico.
- Posiziona il cono del tubo dell'anestesia sul muso del topo.
- Mantenere l'anestesia utilizzando isoflurano all'1,5% miscelato con ossigeno puro al 100% a una portata di 1 L/min fino alla fine dell'intervento. Controllare periodicamente la frequenza del respiro e dare un pizzico alla coda o alle dita dei piedi almeno ogni 15 minuti durante l'intervento chirurgico per valutare l'anestesia appropriata. Regolare la concentrazione di isoflurano in modo appropriato per mantenere la profondità di anestesia desiderata.
- Chirurgia del trauma cranico
- Somministrare buprenorfina (1 mg/kg, per via sottocutanea) utilizzando siringhe da insulina monouso e applicare unguento oftalmico sugli occhi del topo.
- Rimuovere i capelli dalla parte superiore della testa tagliandoli con le forbici 1, quindi applicando l'agente depilatorio per 1 minuto.
ATTENZIONE: Non applicare il prodotto depilatorio per più di 3 minuti sul cuoio capelluto, in quanto irritante per la pelle. Evitare di far entrare qualsiasi agente depilatorio sugli occhi del topo. - Pulisci la pelle del cuoio capelluto applicando garze e applicatori con punta di cotone. Quindi, disinfettare la pelle, utilizzando prima etanolo al 75% e poi betadine. Ripeti l'operazione tre volte (cioè etanolo seguito da betadine), lasciando l'applicazione finale di betadine sulla pelle.
- Ricontrollare la profondità dell'anestetico per assicurarsi che il topo sia completamente anestetizzato (cioè, frequenze respiratorie lente ma costanti a circa un ciclo ogni 2 s, insieme all'assenza di un riflesso di pizzicamento della coda). Coprire la pelle con una pinza chirurgica 3 ed eseguire un'incisione della linea mediana lunga 12-15 mm a partire da circa 3 mm posteriori dagli occhi.
- Asportare la pelle sull'emisfero sinistro e destro del cranio usando le forbici a molla 2.
- Una volta che il cranio è esposto, rimuovere il periostio strofinando delicatamente con un applicatore sterile con punta di cotone e sciacquando con soluzione fisiologica sterile.
- Ispezionare visivamente le condizioni del cranio per assicurarsi che sia intatto, ad eccezione dei due piccoli fori, che sono stati fatti per il precedente intervento chirurgico di iniezione del virus.
- Asciugare l'area del cranio e segnare il sito di impatto del trauma cranico alle seguenti coordinate: 2,5 mm posteriormente al Bregma e 2 mm lateralmente dalla sutura sagittale a destra (Figura 2B).
- Rimuovere rapidamente il mouse dal telaio stereotassico e posizionare la testa sul cuscino tampone sotto il dispositivo TBI.
- Allineare la punta del dispositivo d'urto con il punto d'impatto contrassegnato.
- Sollevare la colonna metallica tirando la corda di nylon legata a 15 cm sopra la testa del topo e poi rilasciarla, lasciando che il peso cada liberamente sull'asta del trasduttore, che è a contatto con la parte superiore del cranio nel sito del trauma cranico. Non toccare la testa del mouse durante l'impatto del trauma cranico.
- Sposta il mouse sulla coperta riscaldante e posizionalo sulla schiena mentre monitori lo stato della respirazione.
- Una volta che il topo si è spostato da una posizione supina a una posizione prona, posizionare il topo nella camera di induzione dell'isoflurano per ~5 minuti con isoflurano al 3% miscelato con ossigeno puro al 100% a una portata di 1,5 L/min.
- Una volta che il topo è completamente sedato (cioè con una frequenza respiratoria lenta ma costante a circa un ciclo ogni 2 s, insieme all'assenza di un riflesso di pizzicamento della coda), ripetere i passaggi 2.3.9-2.3.14 per ottenere un totale di 10 impatti.
NOTA: Nel nostro studio è stato riscontrato che dieci impatti del trauma cranico inducono un fenotipo robusto con bassa mortalità nei topi (dati non ancora pubblicati). I parametri possono essere regolati per ottenere una diversa gravità della lesione cerebrale aumentando o diminuendo il numero di impatti e/o l'altezza da cui viene rilasciato il peso. Tutti i parametri sono soggetti all'approvazione della IACUC locale. - Controllare il cranio al microscopio operatorio e rimuovere il topo dallo studio se si è verificata una frattura del cranio.
- Per un intervento chirurgico fittizio, seguire le stesse procedure descritte sopra, incluso il posizionamento dell'animale sotto il dispositivo d'impatto, ma senza fornire gli impatti del trauma cranico.
- Dopo che il topo si è spostato da una posizione supina a una posizione prona in seguito all'impatto del 10° TBI, posizionare il topo nella camera di induzione dell'isoflurano per ~5 minuti. Seguire i passaggi 2.2.6-2.2.8 per posizionare la testa del topo sul telaio stereotassico per l'intervento chirurgico di impianto della finestra cranica descritto di seguito.
3. Chirurgia dell'impianto della finestra cranica
NOTA: I passaggi per l'impianto della finestra cranica riportati di seguito sono stati adottati da Goldey et al.9 e qui sono state applicate le specifiche del copritesta e del pozzetto di imaging.
- Preparazione della finestra
NOTA: Completare la preparazione della finestra nel passaggio 2.2.2 prima di iniziare l'intervento chirurgico di trauma cranico. La finestra è costituita da due vetrini coprioggetti rotondi (uno di 3 mm e uno di 5 mm di diametro, come indicato dalla Figura 2C) uniti tra loro da un adesivo ottico trasparente, come descritto di seguito.- Igienizzare i vetrini immergendoli in etanolo al 75% per 15 min. Estrarre i vetrini coprioggetti dall'etanolo e lasciarli asciugare su una superficie sterile (ad esempio, il coperchio di una piastra sterile a 24 pozzetti) per ~10 minuti.
- Riempi una siringa da insulina con colla ottica trasparente evitando la formazione di bolle. Al microscopio 1 (Tabella dei materiali) con un ingrandimento di 0,67x, mettere una piccola goccia (~1 μL) di colla ottica al centro del vetrino coprioggetto da 5 mm. Quindi, posizionare immediatamente il vetrino coprioggetto da 3 mm sopra e centrarlo con il vetrino coprioggetto da 5 mm.
- Applicare delicatamente una pressione utilizzando una pinza fine per distribuire uniformemente la colla. Scartare la finestra di vetro se si forma una bolla o una parete attorno al vetrino coprioggetto da 3 mm.
- Per polimerizzare la colla, posizionare i vetrini coprioggetti in una scatola UV per 150 s a una potenza di 20 x 100 μJ/cm2. Verificare che i due vetrini coprioggetti siano saldamente incollati, utilizzando la pinza 4 per spingere delicatamente il lato del vetrino da 3 mm. Se il vetrino coprioggetto si muove, riposizionarlo nella scatola UV per altri 60 secondi. Conservare la finestra di vetro in una piastra sterile a 24 pozzetti per un uso successivo.
- Ruvido la superficie del cranio.
NOTA: Da qui in poi, eseguire tutti i passaggi del paragrafo 3 al microscopio operatorio. Inizia con 10x e regola l'ingrandimento desiderato.- Forare delicatamente e lentamente la superficie del cranio utilizzando una punta in metallo duro FG4 a bassa velocità del rotore (cioè con numero di uscita impostato su ~1-2) per rimuovere il periostio rimanente e creare una superficie cranica ruvida, in modo tale che il cemento dentale si leghi saldamente con il cranio. In alternativa, è possibile utilizzare anche un bisturi al posto di un trapano.
- Usa la soluzione salina per lavare e rimuovere la polvere ossea dalla superficie del cranio.
- Separa i muscoli.
NOTA: La separazione muscolare serve ad aumentare la superficie dell'osso cranico esposto che fungerà da punto di contatto per il cemento dentale, garantendo così l'integrità strutturale dell'impianto. Questa fase di separazione muscolare di solito espone ~ 3 mm della placca cranica temporale.- A circa 5 mm posteriormente all'occhio, dove si trova la sutura che collega il cranio parietale e temporale, inserire delicatamente le punte sottili chiuse (pinza #5/45) per separare i muscoli laterali dal cranio e spostare delicatamente le punte chiuse in direzione posteriore fino alla sutura lambdoide.
- Separare i muscoli laterali sul lato in cui si verificherà l'impianto della finestra cranica.
NOTA: Fare attenzione a non separare i muscoli troppo vicini all'occhio, per evitare di ferire l'arteria oftalmica; in caso contrario, possono verificarsi emorragie gravi e persistenti. Non separare i muscoli dall'osso occipitale, poiché il topo ha bisogno di questi muscoli per sollevare la testa. - Lavare via i detriti dal sito chirurgico con soluzione fisiologica e asciugare l'area con una garza. La schiuma di gel può essere applicata sul sito chirurgico per fermare l'emorragia.
- Impiantare il palo della testa.
- Utilizzare un copricapo in titanio su misura (Figura 2D), descritto in una precedente pubblicazione9, per fissare saldamente la testa del topo durante l'esecuzione dell'intervento chirurgico di craniotomia e per il successivo imaging a due fotoni.
- Utilizzare un pennarello e un calibro chirurgico per tracciare la circonferenza della craniotomia sul cranio pulito e asciutto sul lato destro. Il punto centrale del cerchio tracciato si trova a 2,5 mm posteriormente al Bregma e a 1,5 mm dalla sutura sagittale nell'emisfero destro. Il diametro del cerchio tracciato è di circa 3,2-3,5 mm, leggermente più grande del vetrino coprioggetti da 3 mm. Assicurarsi che il cerchio della craniotomia possa coprire i siti di iniezione del virus (i due fori praticati durante l'iniezione del virus possono essere utilizzati come riferimento) e il sito del trauma cranico.
- Allentare la barra auricolare e ruotare la testa in modo che il piano della craniotomia sia perfettamente orizzontale, quindi serrare nuovamente la barra auricolare.
- Usa il bastoncino di legno di un applicatore con punta di cotone per aggiungere due piccole gocce di supercolla sul bordo anteriore e posteriore del palo.
- Posizionare il copricapo in titanio al centro della craniotomia e regolarlo rapidamente in modo che riposi all'interno dello stesso piano in cui verrà impiantata la finestra cranica. Applicare una leggera pressione fino a quando la supercolla non si è asciugata; Questo di solito richiede ~ 30 s.
- Preparare il cemento dentale in un piatto di miscelazione in ceramica preraffreddato (rimanendo almeno 10 minuti in un congelatore a -20 °C): unire 300 mg di polvere di cemento, sei gocce di liquido di base rapido e una goccia di catalizzatore, quindi mescolare la miscela fino a quando non è completamente miscelata (~15 volte).
NOTA: Il cemento deve essere pastoso. Se è troppo sottile, aggiungi un po' più di polvere di cemento. Se è troppo denso, incorporare il liquido di base rapido una goccia alla volta fino a ottenere una consistenza pastosa. - Applicare rapidamente una generosa quantità di miscela di cemento dentale sul perimetro esterno della circonferenza tracciata e coprire qualsiasi superficie ossea esposta. Tuttavia, non coprire il sito della craniotomia. Attendere ~15 minuti affinché il cemento dentale si asciughi e si indurisca prima di procedere.
- Rilasciare la barra auricolare e fissare il montante alla struttura metallica per garantire che la testa sia stabile per una perforazione precisa lungo la circonferenza craniotomica contrassegnata. Se c'è del cemento sopra il sito della craniotomia, utilizzare la punta in metallo duro FG4 per perforarlo e rimuoverlo.
- Craniotomia
- Utilizzare un calibro chirurgico per verificare il diametro del cerchio contrassegnato, come definito al punto 3.4.2. Regolare se necessario, in modo che la finestra cranica si adatti perfettamente all'interno della craniotomia.
- Utilizzando un trapano dentale elettrico, incidere e assottigliare il cranio lungo l'esterno del cerchio contrassegnato, utilizzando prima una punta in metallo duro FG4 (velocità impostata su un'uscita ~9-10). In questo modo si crea una "traccia" all'interno della quale assottigliare il cranio.
ATTENZIONE: Per ridurre al minimo le lesioni da calore e ottenere una pista liscia, continuare a muovere la punta del trapano. Non forare lo stesso punto per più di 2 s. - Periodicamente, interrompere la perforazione e irrigare l'intera area con soluzione fisiologica sterile, per ridurre il riscaldamento del trapano e per lavare via la polvere ossea.
- Continuare ad assottigliare il cranio utilizzando una punta in metallo duro FG1/4, come descritto al punto 3.5.2, fino a quando il cranio non è sottile come la carta e trasparente.
NOTA: L'uso di due mani per tenere il trapano può rendere più facile il controllo del trapano ed evitare di inserire la punta del trapano nel cervello. - Completare l'assottigliamento del cranio utilizzando una punta in metallo duro EF4. Quando si verifica una crepa tra il lembo osseo e l'osso cranico circostante, a volte si verifica un rilascio di liquido cerebrospinale (CSF), indicando che il cranio è stato completamente perforato.
- Continua a diradare e perforare il resto del cranio lungo la pista. Evitare di perforare il punto in cui un evidente sistema vascolare si incrocia sotto il cranio per evitare emorragie.
- Inserire una punta di pinza fine (pinza 1) ~0,5 mm attraverso il punto incrinato e sollevare delicatamente il lembo osseo verso l'alto senza intaccare il cervello sottostante.
- Dopo aver rimosso il lembo osseo, irrigare l'area della craniotomia con soluzione fisiologica. La superficie cerebrale potrebbe essere 1-2 mm più alta del bordo della craniotomia.
- A partire da questo passaggio, coprire sempre il cervello esposto con soluzione fisiologica per proteggere il tessuto cerebrale.
- Il sanguinamento può verificarsi quando si solleva il lembo osseo nei siti di iniezione originali dell'AAV a causa dell'adesione del tessuto e della crescita vascolare dopo l'intervento chirurgico di iniezione. In tal caso, premere delicatamente il sito con un applicatore con punta di cotone asciutto per ~ 2 minuti (o più a lungo se necessario). La schiuma di gel può essere utilizzata per fermare l'emorragia. Non utilizzare prodotti chimici o pinze riscaldanti per fermare l'emorragia, poiché ciò può causare lesioni.
- Utilizzare la pinza 1 per rimuovere delicatamente la materia aracnoidea visibile.
- Finestra di vetro dell'impianto
- Utilizzare la pinza chirurgica 2 per prelevare la finestra di vetro sterile, con il vetrino coprioggetti da 3 mm rivolto verso il basso. Posizionare e regolare la finestra di vetro sopra il sito della craniotomia per assicurarsi che la finestra possa adattarsi perfettamente al bordo della craniotomia. Il vetrino coprioggetti da 5 mm si trova sulla parte superiore.
- Preparare il cemento dentale come segue: unire 100 mg di polvere di cemento, due gocce di liquido a base rapida e una goccia di catalizzatore. Mescolare il composto fino a quando non sarà ben amalgamato (~15 volte). Attendere ~6 minuti fino a quando il cemento diventa pastoso e denso. Se il cemento è troppo sottile, potrebbe penetrare nello spazio sotto la finestra nel passaggio 3.6.4 e oscurare la finestra.
- In attesa che il cemento diventi pastoso e denso, applicare un'adeguata pressione alla finestra attraverso un manipolatore stereotassico, per verificare che il cranio possa entrare in contatto sicuro e stretto con la finestra di vetro. Assicurarsi che il liquido di cemento dentale al punto 3.6.4 non raggiunga lo spazio sotto il vetro e quindi oscuri la finestra.
- Usa un pennello applicatore di precisione regolabile per aggiungere una piccola quantità di cemento lungo il bordo della finestra per sigillare la finestra di vetro con il cranio. Attendere ~10 minuti per lasciare asciugare completamente il cemento, quindi rilasciare delicatamente e rimuovere il manipolatore sopra la finestra. A partire da questo passaggio, ci vogliono ~ 4 ore per completare i 10 impatti TBI e impiantare il copricapo e la finestra cranica.
- Tagliare il cemento dentale utilizzando il trapano dentale con una punta in metallo duro FG4 se c'è un eccesso di cemento che copre la finestra.
NOTA: Un eccesso di cemento intorno alla finestra può impedire alle lenti dell'obiettivo a due fotoni di avvicinarsi alla superficie della finestra.
- Impiantare il pozzetto di imaging
NOTA: Un pozzetto di imaging (Figura 2D) è un anello di gomma con un diametro esterno di ~1,6 cm, che corrisponde alla superficie superiore del palo della testa e trattiene l'acqua sopra la finestra cranica per l'imaging a due fotoni.- Dopo aver completato l'impianto della finestra, forare i detriti di cemento dentale sulla superficie superiore del palo della testa e pulire l'area utilizzando una garza chirurgica bagnata. Lasciare asciugare l'area per ~3 minuti.
- Usa un applicatore con punta di cotone per immergere una piccola quantità di supercolla e incollarla sulla superficie superiore del palo. Posiziona rapidamente l'anello di gomma sul palo. Applicare una pressione media sull'anello di gomma per ~2 minuti per garantire uno stretto contatto con il palo della testa. Usa la supercolla con parsimonia, altrimenti può aderire alla finestra di vetro e oscurare l'imaging a due fotoni.
- Somministrazione di analgesici e antibiotici
- Immediatamente dopo aver impiantato il pozzetto di imaging, ma prima di interrompere l'isoflurano, somministrare cefazolina [500 mg/kg (333 mg/mL, di solito ~45 μL), per via intramuscolare] e meloxicam (5 mg/kg, per via sottocutanea) utilizzando siringhe da insulina monouso.
- Dopo la somministrazione del farmaco, interrompere l'anestesia, rilasciare il topo dal telaio stereotassico e riportare il topo nella sua gabbia di casa, che si trova sopra una coperta riscaldante.
- Monitorare attentamente il mouse per ~15 minuti fino a quando non è deambulante.
NOTA: Alloggiare i topi individualmente, poiché potrebbero mordere bene l'imaging di gomma di altri topi. Fornire cibo e acqua in gel vicino al topo nella gabbia per l'accesso ad libitum. - Somministrare nuovamente buprenorfina (1 mg/kg, per via sottocutanea) e meloxicam (5 mg/kg, per via sottocutanea) ogni 8 ore dopo la dose precedente fino a 48 ore dopo l'intervento chirurgico di impianto della finestra cranica.
4. Imaging intravitale a due fotoni
- Utilizzare il microscopio 2 (Tabella dei materiali), dotato di un laser multifotone coerente sintonizzabile e di un obiettivo con ingrandimento 20x (NA 1.0; immersione in acqua), per l'imaging intravitale18. Il filtro utilizzato per il segnale EGFP è "BP 500-550".
- Preparare il topo finestra cranica per l'imaging intravitale.
- A partire dal giorno dell'intervento chirurgico (designato come giorno 0), eseguire l'imaging a due fotoni in punti temporali progettati dopo il trauma cranico. Posizionare il topo finestra cranica nella camera di induzione dell'anestesia e somministrare isoflurano al 3% miscelato con gas di trasporto a una portata di 1,5 L/min per 5 minuti.
NOTA: Il gas di trasporto può essere aria ambiente o ossigeno al 100%. - Una volta che il mouse è completamente anestetizzato (cioè, una frequenza respiratoria lenta ma costante a circa un ciclo ogni 2 s, insieme all'assenza di un riflesso di pizzicamento della coda), rimuovere il mouse dalla camera di induzione e bloccare rapidamente il palo della testa a una staffa. Lascia che il busto del topo si appoggi su una piastra di plastica rotonda (19 cm di diametro) dotata di staffa.
NOTA: Un cuscinetto caldo per le mani è stato posizionato sotto il busto del mouse per fornire supporto termico durante l'imaging intravitale. - Applicare un unguento oftalmico lubrificante sugli occhi del topo e posizionare l'ogiva del tubo dell'anestesia sul muso del topo. Mantenere l'anestesia utilizzando isoflurano all'1,5% con gas di trasporto a una portata di 1 L/min.
- Controllare periodicamente la frequenza del respiro e dare un pizzico alla coda o alle dita dei piedi almeno ogni 15 minuti durante l'imaging per valutare l'anestesia appropriata. Regolare la concentrazione di isoflurano in modo appropriato per mantenere la profondità di anestesia desiderata.
- Allineare la testa del mouse per assicurarsi che la finestra cranica si trovi direttamente sotto la lente dell'obiettivo a due fotoni. Aggiungere un po' d'acqua nell'imaging ben al di sopra della finestra cranica. Abbassare l'obiettivo in modo che sia immerso nell'acqua.
- A partire dal giorno dell'intervento chirurgico (designato come giorno 0), eseguire l'imaging a due fotoni in punti temporali progettati dopo il trauma cranico. Posizionare il topo finestra cranica nella camera di induzione dell'anestesia e somministrare isoflurano al 3% miscelato con gas di trasporto a una portata di 1,5 L/min per 5 minuti.
- Imaging intravitale di topi finestra intracranica
- Accendere la lampada al mercurio del cannocchiale. Visualizza prima il cervello con l'epifluorescenza attraverso l'oculare.
NOTA: La vascolarizzazione appare nera. Selezionare un'area in cui la finestra è libera. Spegnere l'epifluorescenza, impostare la lunghezza d'onda del laser su 860 nm per il segnale EGFP e regolare l'impostazione del laser per un segnale ottimale (cioè luminoso ma non saturo). - Impostare la modalità di scansione su Fotogramma e il passo di linea su 1. Impostare il numero medio su 16, la profondità di bit su 8 bit, la modalità su Linea e il metodo su Media.
- Utilizzare il modello vascolare come "mappa di riferimento" per visualizzare la stessa regione cerebrale per la successiva imaging longitudinale. Visualizzare il livello superficiale (strato I, a meno di 100 μm dalla superficie meningea) per tre piani in cui la vascolarizzazione corticale domina attraverso una modalità z-stack, con un intervallo interpiano di 10 μm, come indicato nella Figura 3A.
- Immagine di sei piani a livello profondo (strato IV e V, ~400 μm più in profondità del livello superficiale), attraverso una modalità z-stack come indicato nella Figura 3A, con un intervallo tra i piani di 10 μm e una velocità di scansione di 8.
- Dopo aver terminato l'imaging (~20 minuti per topo), interrompere l'anestesia, rilasciare il topo dai telai e riportarlo nella gabbia di casa che si trova sopra una coperta riscaldante. Monitorare il topo consecutivamente fino a quando non è deambulante, il che di solito richiede ~ 7 minuti.
- Visualizzare longitudinalmente il topo al giorno 0, 1 settimana e 4 mesi dopo l'intervento chirurgico per trauma cranico.
- Accendere la lampada al mercurio del cannocchiale. Visualizza prima il cervello con l'epifluorescenza attraverso l'oculare.
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Representative Results
Come prova di concetto per questo protocollo, particelle virali che esprimono AAV-Syn1-EGFP sono state iniettate nella corteccia cerebrale di topi maschi TDP-43 Q331K/Q331K (sfondo C57BL/6J)19 all'età di 3 mesi. Si noti che possono essere utilizzati anche animali wild-type C57BL/6J, tuttavia questo studio è stato condotto su topi TDP-43 Q331K/Q331K perché il laboratorio è focalizzato sulla ricerca sulle malattie neurodegenerative. Un intervento chirurgico per trauma cranico è stato eseguito 4 settimane dopo l'iniezione di AAV. All'interno dello stesso contesto chirurgico, sono stati impiantati il copricapo e la finestra cranica. Il topo è stato sottoposto a imaging seriale utilizzando un microscopio a due fotoni al giorno 0, 1 settimana e 4 mesi dopo l'intervento chirurgico per trauma cranico (Figura 1). In generale, l'intervento chirurgico di iniezione è durato ~ 30 minuti e l'intervento chirurgico TBI ha richiesto ~ 1 ora per topo. Durante l'intervento chirurgico di trauma cranico, i topi hanno generalmente richiesto un periodo di tempo più lungo per passare da una posizione supina a una posizione prona dopo gli impatti successivi, rispetto agli impatti iniziali. Ad esempio, un topo potrebbe aver impiegato 2 minuti per raddrizzare la sua posizione dopo il primo impatto, ma 10 minuti per raddrizzare la sua posizione dopo il decimoimpatto. Per l'intervento chirurgico di impianto della finestra cranica, di solito erano necessarie ~ 3 ore per eseguire tutti i passaggi, ma richiedevano più tempo del necessario se si verificava un'emorragia persistente. L'imaging a due fotoni di solito richiedeva 20 minuti per topo per acquisire tutte le immagini. Per l'attuale studio che ha coinvolto tre topi con l'espressione di EGFP, gli animali non hanno mostrato evidenza di una frattura del cranio, né sono morti durante l'intervento chirurgico o fino a 4 mesi dopo l'intervento chirurgico. Sia la morbilità che il tasso di frattura del cranio erano dello 0%. Ciò è coerente con il tasso di mortalità relativamente basso (<10%) in un modello simile di induzione del trauma cranicoma senza un impianto di finestra cranica 7,8.
Un dispositivo di caduta di peso (Figura 2A), che è stato precedentemente riportato7,8, è stato utilizzato per fornire impatti di trauma cranico sulla testa del topo sul lato destro, come indicato nella Figura 2B. Un tubo di plastica trasparente (n. 5 nella Figura 2A; 60 cm di lunghezza e 1,4 cm di diametro interno) è stato fissato saldamente e verticalmente a una staffa metallica, e una colonna di plastica (n. 7 nella Figura 2A; 10 cm di lunghezza e 1,3 cm di diametro, con una punta rotonda piatta di 2 mm di diametro) è stata posizionata nel tubo verticale. Un peso metallico di 50 g (n. 6 nella Figura 2A) è stato posizionato sopra l'impattatore e legato con una corda di nylon (n. 4 nella Figura 2A). Un cuscino tampone (n. 8 nella Figura 2A; 9 cm x 9 cm x 1 cm [lunghezza x larghezza x profondità], realizzato in schiuma di polietilene e garza di cotone) è stato posizionato sotto la testa del topo per tamponare e assorbire l'energia dell'impatto.
La finestra cranica era costituita da due vetrini coprioggetti combinati con adesivo ottico (Figura 2C) e il vetrino coprioggetti di 3 mm di diametro era il lato a contatto con la superficie cerebrale. L'imaging a due fotoni è stato effettuato a due diverse profondità (Figura 3A) dalla superficie cerebrale: 1) un livello superficiale in cui la vascolarizzazione corticale era abbondante e aveva un diametro del lume relativamente grande che appariva nero, ma con corpi cellulari EGFP positivi sparsi; e 2) un livello più profondo in cui la vascolarizzazione era rada e aveva un piccolo diametro del lume, con molte cellule positive all'EGFP visibili.
A ~4 ore (giorno 0) dopo l'intervento chirurgico, l'imaging a due fotoni è stato eseguito su tre piani, con un intervallo di 10 μm a livello superficiale (strato I, a meno di 100 μm dalla superficie meningea) prima dove la vascolarizzazione appariva nera (indicata dalle linee rosse tratteggiate nella Figura 3B), ed è stata utilizzata come mappa di riferimento per la successiva sessione di imaging per individuare la regione di imaging originale. A questo livello superficiale, la vascolarizzazione corticale e i processi neuronali erano le strutture predominanti che potevano essere osservate, mentre i corpi cellulari positivi all'EGFP erano sparsi. Dopo l'imaging all'interno del livello superficiale, la messa a fuoco è stata regolata verso il basso di ~ 400 μm, più in profondità del livello superficiale, nella corteccia (strato IV e V) per visualizzare i corpi cellulari neuronali positivi all'EGFP. Le immagini sono state acquisite all'interno di sei piani, con un intervallo di 10 μm. L'espressione della proteina EGFP è stata distribuita diffusamente in tutto il corpo cellulare, come indicato nella Figura 3C. C'è stata un'occasionale presenza di alcuni punti di EGFP al di fuori dei corpi cellulari, che potrebbero rappresentare inclusioni di EGFP che si sono formate nel tempo all'interno di assoni o dendriti. Questo protocollo determina l'espressione di AAV-SYN1-EGFP ~2-3 mm intorno al sito di iniezione, che può essere definita mediante analisi istologica dei tessuti post-mortem.
A 1 settimana e 4 mesi dopo il trauma cranico, il modello vascolare osservato al punto temporale del giorno 0 è stato utilizzato come riferimento per localizzare la stessa regione di imaging (Figura 3D,F). Il modello vascolare nella Figura 3D,F è simile a quello nella Figura 3B. La procedura di imaging per 1 settimana e 4 mesi dopo il trauma cranico è stata la stessa di quella descritta sopra per il punto temporale del giorno 0 e l'espressione di EGFP è stata rilevata in tutto il corpo cellulare come prima (Figura 3E,G). L'intensità della fluorescenza al giorno 0 e 4 mesi era simile sia a livello superficiale che profondo. Tuttavia, l'intensità della fluorescenza a 1 settimana era inferiore a quella del giorno 0 e 4 mesi sia a livello superficiale che profondo, il che potrebbe essere dovuto alla repressione traslazionale riportata per altri modelli di TBI20. In particolare, la qualità delle immagini a 4 mesi rispetto al punto temporale del giorno 0 dimostra che la finestra cranica ha mantenuto chiarezza e integrità e che l'espressione virale è ancora robusta 4 mesi dopo l'intervento chirurgico per un efficace imaging intravitale. Poiché l'EGFP si esprime come una proteina relativamente diffusa, i segnali di fluorescenza possono essere risolti meglio e discreti quando l'EGFP viene fuso con una proteina di interesse.
Figura 1: La sequenza temporale di questo protocollo di imaging intravitale. Il protocollo viene avviato con l'iniezione del virus. Il trauma cranico e la chirurgia della finestra cranica vengono eseguiti all'interno della stessa sessione chirurgica a 2-4 settimane dopo l'iniezione del virus. L'imaging intravitale viene eseguito al giorno 0, 1 settimana, 4 mesi dopo il trauma cranico. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Diagrammi per il dispositivo TBI, il sito di impatto TBI e la preparazione della finestra. (A) Attrezzatura per il dispositivo TBI a perdita di peso. 1: piedistallo, 2: staffa, 3: morsetto regolabile, 4: corda di nylon, 5: tunnel di caduta pesi, 6: colonna pesi in metallo (50 g), 7: impattatore, 8: cuscino tampone. (B) Uno schema dell'iniezione del virus e del sito di impatto del trauma cranico, con le coordinate 2,5 mm posteriormente al Bregma e 2 mm lateralmente dalla sutura sagittale a destra. (C) Uno schema per la preparazione della vetrata. Due vetrini di copertura, di 3 mm e 5 mm di diametro, vengono combinati con un adesivo ottico. (D) Immagini del palo della testa in metallo e del pozzo di imaging. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Schema dei piani di imaging e dei dati dell'immagine . (A) Più piani vengono visualizzati a un livello superficiale dove si trova la vascolarizzazione e a un livello profondo. Le immagini sono raccolte come segue: tre piani a livello superficiale, dove la vascolarizzazione corticale e i processi neuronali sono le strutture predominanti EGFP-positive, e sei piani a livello profondo, dove si osservano prevalentemente corpi cellulari EGFP-positivi, con un intervallo di 10 μm tra i piani vicini. Ogni piano ha una dimensione di 425,10 μm x 425,10 μm. (B) Immagine rappresentativa di un piano a livello superficiale nel punto temporale del giorno 0. Le linee rosse tratteggiate indicano il contorno della vascolarizzazione che può essere utilizzato come riferimento per individuare il luogo di imaging originale per i punti temporali successivi. (C) Immagine rappresentativa di un piano nel livello profondo al punto temporale del giorno 0 subito dopo il trauma cranico. (D) Immagine rappresentativa di un piano a livello superficiale al punto temporale di 1 settimana. Le linee rosse tratteggiate denotano la vascolarizzazione, simile al contorno del giorno 0 nella Figura 3B, confermando che l'imaging a due fotoni è stato effettuato in una posizione simile il giorno 0 e 1 settimana dopo il trauma cranico. (E) Immagine rappresentativa a livello profondo al punto temporale di 1 settimana dopo il trauma cranico. (F) Come B e D, a 4 mesi dopo il trauma cranico. (G) Come C ed E, a 4 mesi dopo il trauma cranico. Barra graduata: 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
In questo studio, l'iniezione di AAV, la somministrazione di TBI e un copricapo con impianto di finestra cranica sono stati combinati per l'analisi di imaging longitudinale dei neuroni marcati con EGFP all'interno della corteccia cerebrale del topo (strati IV e V) per osservare gli effetti del TBI sui neuroni corticali. Questo studio rileva che il sito del trauma cranico scelto qui, sopra l'ippocampo, fornisce una superficie relativamente piatta e ampia per l'impianto della finestra cranica. Al contrario, il cranio è relativamente stretto anteriormente a questo sito, e quindi è difficile garantire che il palo della testa entri effettivamente in contatto con la superficie del cranio. Sebbene in questo studio sia stato utilizzato solo il modello murino TDP-43 Q331K/Q331K , considerando la ricerca del laboratorio incentrata sulla SLA e sulla FTD19, questo protocollo dovrebbe essere applicabile alla maggior parte degli altri ceppi di topi. Oltre a marcare i neuroni come descritto qui, è possibile utilizzare varie strategie per marcare altri tipi di cellule per l'imaging intravitale. Un approccio consiste nell'esprimere le proteine fluorescenti geneticamente codificate in modo cellula-specifico, utilizzando il sistema di ricombinazione Cre-Lox in topi geneticamente modificati21. Un altro approccio consiste nell'impiegare alcuni sierotipi virali per la trasduzione cellulo-specifica di proteine fluorescenti geneticamente codificate. La somministrazione sito-specifica può essere ottenuta eseguendo l'iniezione intracranica nella posizione desiderata nel cervello. L'efficienza e la facilità con cui è possibile esprimere proteine cellulo-specifiche tramite trasduzione virale per l'imaging intravitale è un vantaggio rispetto alla creazione di modelli murini transgenici.
Per i protocolli chirurgici, ci sono diversi passaggi critici che devono essere eseguiti con attenzione. Quando si praticano fori sul cranio per l'iniezione del virus all'inizio del protocollo, è necessario fare attenzione a non danneggiare il tessuto sotto il cranio. Se si verifica un danno tissutale durante la perforazione del cranio, ci sarà infiammazione, adesione tissutale e angiogenesi intorno al sito della lesione, aumentando così il rischio di sanguinamento durante la craniotomia per l'impianto della finestra cranica. Per la somministrazione del trauma cranico con il dispositivo di caduta del peso, il presente studio ha posizionato un cuscino sotto la testa del topo per tamponare la forza d'impatto del trauma cranico e quindi ridurre la possibilità di una frattura del cranio. Non è stato osservato alcun movimento evidente della testa nelle direzioni di rotazione e nell'accelerazione, supportando l'idea che questo modello TBI abbia una probabilità relativamente bassa di danno assonale di diffusione. È interessante notare che Foda et al. hanno utilizzato un dispositivo di caduta del peso simile per costruire una lesione del trauma cranico chiuso sui ratti, e un cuscino di schiuma più grande e morbido (12 cm di spessore) è stato posizionato sotto la testa del ratto in modo che potesse muoversi facilmente in risposta alla forza d'impatto del trauma cranico sulla direzione di rotazione con accelerazione, provocando così una lesione assonale di diffusione22. Uno dei vantaggi del modello TBI di caduta del peso con guida del tubo è che la gravità del trauma può essere modulata modificando l'altezza di caduta del peso (cioè un'altezza maggiore per una forza maggiore) e/o ripetendo il numero di volte in cui viene erogato l'impatto. Ad esempio, Flierl et al. hanno utilizzato un dispositivo di riduzione del peso simile al presente studio per indurre il trauma cranico sui topi; il peso del metallo era di 333 g, il che ha indotto un lieve trauma cranico quando è caduto da un'altezza di 2 cm e un grave trauma cranico quando è caduto da un'altezza di 3 cm23. Anche la fase di craniotomia prima dell'impianto della finestra deve essere eseguita con attenzione, per evitare di danneggiare il tessuto cerebrale sotto il cranio. Spostare periodicamente la punta del trapano in una regione diversa del cranio aiuta a evitare di perforare eccessivamente nello stesso punto, che può causare un riscaldamento eccessivo, danni ai tessuti e sanguinamento; Inoltre, l'irrigazione frequente con soluzione fisiologica può anche raffreddare il sito di perforazione. Quando si impianta la finestra di vetro, è importante allineare il piano di vetro in modo che sia parallelo al piano della superficie del cranio; Una finestra aderente all'interno del cranio impedisce la fuoriuscita del liquido del cemento dentale nello spazio tra la finestra e il cervello.
Se la finestra è sfocata al giorno 0 dopo l'intervento chirurgico di trauma cranico, ma vengono rilevati segnali fluorescenti, il cemento dentale potrebbe essere entrato nello spazio tra la finestra e il cervello, formando così uno strato di cemento che copre la superficie cerebrale e oscura l'emissione di fluorescenza. In questa situazione, è possibile rimuovere la finestra e il cemento dentale utilizzando il metodo di perforazione descritto nella fase 3.5 del protocollo, e quindi impiantare una nuova finestra di vetro nel sito originale, come descritto in dettaglio da Goldey et al.9. Se la finestra diventa sfocata in una fase successiva durante il processo di imaging longitudinale, si può tentare di rimuovere potenziali detriti strofinando delicatamente la finestra con un applicatore con punta di cotone. Se questo non risolve il problema, potrebbe essere dovuto alla ricrescita dell'osso e delle meningi sotto la finestra di vetro. In questo caso, si può rimuovere la finestra e il trapano per rimuovere l'osso ricresciuto e/o la pinzetta e rimuovere le meningi, seguito dall'impianto di una nuova finestra di vetro nel sito originale, come descritto da Goldey et al.9. Come mostrato nei risultati, l'espressione e la fluorescenza di EGFP sono robuste in un corso di tempo di ~ 4 mesi dopo il trauma cranico. Ci si può aspettare una diminuzione del segnale di fluorescenza entro la prima settimana post-trauma cranico, che è probabilmente dovuta alla repressione traduzionale indotta dal trauma cranico che provoca una riduzione temporanea della sintesi proteica globale20.
Per mantenere un'elevata qualità dell'imaging e ottenere l'imaging su più piani, i topi sono stati sottoposti ad anestesia con isoflurano per limitare il movimento. Tuttavia, è importante notare che l'anestesia può influenzare i risultati dello studio. Ad esempio, è stato riportato che i topi sottoposti ad anestesia con isoflurano mostrano una diversa attività microgliale in risposta al fotodanneggiamento rispetto ai topi svegli24. Per l'imaging a due fotoni, la velocità di scansione e il numero di scansioni per la media del segnale (impostato come "numero", sotto "media") sono i fattori principali che possono determinare la risoluzione dell'immagine. Per ottimizzare la risoluzione, è possibile ridurre la velocità di scansione e aumentare il numero medio, tuttavia, una velocità più lenta e un numero medio più elevato aumentano il tempo di imaging per un particolare campo visivo e possono causare lo sbiancamento delle foto. Il presente studio mira a realizzare l'imaging cronico a lungo termine sullo stesso animale nella stessa posizione cerebrale. Per evitare il potenziale sbiancamento delle foto, ottenendo una risoluzione sufficiente, l'imaging a due fotoni è stato eseguito a una velocità di scansione di 8 con un numero medio di 16.
Un approccio alternativo all'esecuzione di una craniotomia e all'impianto di una finestra di vetro è quello di assottigliare il cranio, nella misura in cui è trasparente e "sottile come la carta" per l'imaging dal vivo25,26,27. La finestra del cranio sottile può mantenere l'integrità del cranio, ed evitare così l'infiammazione indotta dall'operazione chirurgica. Pertanto, l'approccio della finestra del cranio sottile può essere preferito per l'imaging dal vivo con marcatori rilevanti per l'infiammazione e/o per un periodo di tempo relativamente più breve (cioè, ~ 14 giorni dopo l'intervento chirurgico, come riportato25). Per l'imaging a lungo termine (cioè 4 mesi, come descritto qui) dei processi neurodegenerativi cronici, oltre a valutare gli effetti acuti del trauma cranico sullo stesso animale, si raccomanda di utilizzare una finestra di vetro impiantata con un metodo di craniotomia.
Come accennato nell'introduzione, ci sono diversi vantaggi notevoli dell'imaging intravitale per lo studio di vari eventi biologici e patologici nel cervello dei mammiferi. Tuttavia, ci sono anche alcune limitazioni di questo protocollo. Ad esempio, la lesione cerebrale contrecoup descrive la contusione cerebrale o l'ematoma distante, di solito opposto, dal sito di contatto della forza28,29,30. Nel presente studio, gli impatti del trauma cranico sono stati trasmessi al lobo parietale; La lesione da Contrecoup sarebbe prevista ventralmente e inaccessibile all'imaging intravitale. Un'analisi istologica potrebbe essere utilizzata come approccio complementare per esaminare ulteriormente i fenotipi di interesse al di fuori del sito di impatto coperto dalla finestra cranica. Inoltre, la sovraespressione esogena di alcune proteine può anche indurre tossicità o patologia. Nel presente studio, sono stati osservati alcuni punti occasionali di EGFP, che possono rappresentare accumuli dovuti alla sovraespressione proteica. Pertanto, si raccomanda di includere una proteina di controllo negativo (ad esempio, EGFP o RFP da soli) nel disegno dello studio per affrontare questa possibilità, in particolare se la proteina di interesse è incline a formare strutture puntiformi. Il numero di proteine che si possono studiare simultaneamente è limitato dai laser e dalle capacità del sistema a due fotoni. Potrebbe essere possibile visualizzare più di un fluoroforo (ad esempio, EGFP, RFP, ecc.) mediante microscopia a due fotoni, sebbene le capacità di multiplexing con microscopi convenzionali a campo largo e confocali spesso consentano l'analisi di più proteine all'interno di un singolo campione di tessuto. Infine, è importante includere un controllo fittizio che riceva tutte le stesse procedure dell'animale con trauma cranico, tranne gli impatti di caduta di peso. L'intervento chirurgico di impianto della finestra cranica è un'operazione invasiva e può causare alcuni cambiamenti locali, come l'infiammazione e l'alterazione della pressione intracranica, che potrebbero influenzare il processo di trauma cranico. Un controllo fittizio aiuta lo sperimentatore a valutare i fenotipi dovuti all'impatto rispetto alle procedure chirurgiche.
In sintesi, questo protocollo introduce un metodo per visualizzare longitudinalmente le proteine in modo specifico nei neuroni della corteccia cerebrale del topo in risposta al trauma cranico. Questo protocollo può essere modificato per analizzare l'espressione e la localizzazione di varie proteine cellulo-specifiche in risposta al trauma cranico. L'obiettivo di questo protocollo è quello di fornire un approccio per studiare le conseguenze immediate e a lungo termine del trauma cranico nel cervello dei mammiferi.
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Disclosures
Non vengono dichiarati conflitti di interesse.
Acknowledgments
Ringraziamo il Dr. Miguel Sena-Esteves della Chan Medical School dell'Università del Massachusetts per aver donato il virus AAV(PHP.eB)-Syn1-EGFP, e Debra Cameron della University of Massachusetts Chan Medical School per aver disegnato lo schizzo del cranio dei topi. Ringraziamo anche i membri attuali e passati dei laboratori Bosco, Schafer e Henninger per i loro suggerimenti e il loro supporto. Questo lavoro è stato finanziato dal Dipartimento della Difesa (W81XWH202071/PRARP) a DAB, DS e NH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adjustable Precision Applicator Brushes | Parkell | S379 | |
| BD insulin syringe | BD | NDC/HRI#08290-3284-38 | 5/16" x 31G |
| Betadine | Purdue | NDC67618-151-17 | including 7.5% povidone iodine |
| Buprenorphine | PAR Pharmaceutical | NDC 42023-179-05 | |
| Cefazolin | HIKMA Pharmaceutical | NDC 0143-9924-90 | |
| Ceramic Mixing Dish | Parkell | SKU: S387 | For dental cement preparation |
| Cotton Tipped Applicators | ZORO | catlog #: G9531702 | |
| Catalyst | Parkell | S371 | full name: "C" Universal TBB Catalyst |
| Dental cement powder | Parkell | S396 | Radiopaque L-Powder for C&B Metabond |
| Dental drill | Foredom | H.MH-130 | |
| Dental drill controller | Foredom | HP4-310 | |
| Dexamethasone | Phoenix | NDC 57319-519-05 | |
| EF4 carbide bit | Microcopy | Lot# C150113 | Head Dia/Lgth/mm 1.0/4.2 |
| Ethonal | Fisher Scientific | 04355223EA | 75% |
| FG1/4 carbide bit | Microcopy | Lot# C150413 | Head Dia/Lgth/mm 0.5/0.4 |
| FG4 carbide bit | Microcopy | Lot# C150309 | Head Dia/Lgth/mm 1.4/1.1 |
| Headpost | N/A | N/A | Custom-manufactured |
| Heating apparatus | CWE | TC-1000 Mouse | equiped with the stereotaxic instrument and be used while operating surgery |
| Heating blanket | CVS pharmacy | E12107 | extra heating device and be used after surgery |
| Isoflurane | Pivetal | NDC 46066-755-03 | |
| Isoflurane induction chamber | Vetequip | 89012-688 | induction chamber for short |
| Isoflurane volatilizing machine | Vetequip | 911103 | |
| Isoflurane volatilizing machine holder | Vetequip | 901801 | |
| Leica surgical microscope | Leica | LEICA 10450243 | |
| Lubricant ophthalmic ointment | Picetal | NDC 46066-753-55 | |
| Marker pen | Delasco | SMP-BK | |
| Meloxicam | Norbrook | NDC 55529-040-10 | |
| Microinjection pump and its controller | World Precision Instruments | micro4 and UMP3 | |
| Microliter syringe | Hamilton | Hamilton 80014 | 1701 RN, 10 μL gauge for syringe and 32 gauge for needle, 2 in, point style 3 |
| Mosquito forceps | CAROLINA | Item #:625314 | Stainless Steel, Curved, 5 in |
| Depilatory agent | McKesson Corporation | N/A | Nair Hair Aloe & Lanolin Hair Removal Lotion |
| Microscope 1 | Nikon | SMZ745 | Nikon microscope for cranial window preparation |
| Microscope 2 | Zeiss | LSM 7 MP | two-photon microscope |
| Multiphoton laser | Coherent | Chameleon Ultra II, Model: MRU X1, VERDI 18W | laser for two-photon microscopy |
| Non-absorbable surgical suture | Harvard Apparatus | catlog# 59-6860 | 6-0, with round needle |
| Norland Optical Adhesive 81 | Norland Products | NOA 81 | |
| No-Snag Needle Holder | CAROLINA | Item #: 567912 | |
| Quick base liquid | Parkell | S398 | "B" Quick Base For C&B Metabond |
| Regular scissor 1 | Eurostat | eurostat es5-300 | |
| Regular scissor 2 | World Precision Instruments | No. 501759-G | |
| Round cover glass 1 | Warner instruments | CS-5R Cat# 64-0700 | for 5 mm of diameter |
| Round cover glass 2 | Warner instruments | CS-3R Cat# 64-0720 | for 3 mm of diameter |
| Rubber rings | Orings-Online | Item # OO-014-70-50 | O-Rings |
| Saline | Bioworld | L19102411PR | |
| Spring scissor 1 | World Precision Instruments | No. 91500-09 | tip straight |
| Spring scissor 2 | World Precision Instruments | No. 91501-09 | tip curved |
| Stereotaxic platform | KOPF | Model 900LS | |
| Super glue | Henkel | Item #: 1647358 | |
| surgical Caliper | World Precision Instruments | No. 501200 | |
| Surgical forceps 1 | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | Catlog# 0508-5/45-PO | style 5/45, curved |
| Surgical forceps 2 | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | catlog# 0103-5-PO | style 5, straight |
| Surgical forceps 3 | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | catlog# 72912 | |
| Surgical forceps 4 | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | Catlog# 0508-5/45-PO | style 5/45, curved |
| Surgical gauze | ZORO | catlog #: G0593801 | |
| Surgical lamp | Leica | Leica KL300 LED | |
| UV box | Spectrolinker | XL-1000 | also called UV crosslinker |
| Vaporguard | Vetequip | 931401 | |
| Vetbond Tissue Adhesive | 3M Animal Care | Part Number:014006 |
References
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