Summary
Bu çalışma, farelere tekrarlayan bir travmatik beyin hasarının verilmesini ve iki foton mikroskobu kullanılarak nöron eksprese edilen bir EGFP'nin daha sonraki intravital görüntülemesi için bir kraniyal pencerenin eşzamanlı implantasyonunu göstermektedir.
Abstract
Bu protokolün amacı, eksojen uyaranlara maruz kaldıktan sonra, bir hayvanın beyninin belirli hücre tipleri içinde ilgilenilen bir proteinin ekspresyonunun ve lokalizasyonunun uzunlamasına nasıl görselleştirileceğini göstermektir. Burada, kapalı kafatası travmatik beyin hasarının (TBI) uygulanması ve farelerde müteakip uzunlamasına intravital görüntüleme için bir kraniyal pencerenin eşzamanlı implantasyonu gösterilmektedir. Farelere intrakraniyal olarak, nöronal spesifik bir promotör altında gelişmiş yeşil floresan proteini (EGFP) eksprese eden adeno-ilişkili bir virüs (AAV) enjekte edilir. 2 ila 4 hafta sonra, fareler, AAV enjeksiyon yeri üzerinde bir ağırlık düşürme cihazı kullanılarak tekrarlayan bir TBI'ya tabi tutulur. Aynı cerrahi seansta, farelere metal bir başlık ve daha sonra TBI etki bölgesi üzerine bir cam kraniyal pencere implante edilir. EGFP'nin ekspresyonu ve hücresel lokalizasyonu, aylar boyunca travmaya maruz kalan aynı beyin bölgesinde iki fotonlu bir mikroskop kullanılarak incelenir.
Introduction
Spor yaralanmaları, araç çarpışmaları ve askeri savaştan kaynaklanabilen travmatik beyin hasarı (TBI), dünya çapında bir sağlık sorunudur. TBH fizyolojik, bilişsel ve davranışsal eksikliklere ve yaşam boyu sakatlık veya mortaliteye yol açabilir 1,2. TBH şiddeti hafif, orta ve şiddetli olarak sınıflandırılabilir, büyük çoğunluğu hafif TBH'dir (%75-%90)3. TBH'nin, özellikle tekrarlayan TBH oluşumlarının, nöronal dejenerasyonu teşvik edebileceği ve Alzheimer hastalığı (AD), amyotrofik lateral skleroz (ALS), frontotemporal demans (FTD) ve kronik travmatik ensefalopati (CTE) dahil olmak üzere çeşitli nörodejeneratif hastalıklar için risk faktörleri olarak hizmet edebileceği giderek daha fazla kabul edilmektedir4,5,6. Bununla birlikte, TBH kaynaklı nörodejenerasyonun altında yatan moleküler mekanizmalar belirsizliğini korumaktadır ve bu nedenle aktif bir çalışma alanını temsil etmektedir. Nöronların TBH'ye nasıl tepki verdiği ve TBH'den nasıl kurtulduğu hakkında fikir edinmek için, TBH'den sonra farelerde uzunlamasına intravital görüntüleme ile, özellikle nöronlar içinde, floresan etiketli proteinlerin izlenmesi için bir yöntem burada açıklanmaktadır.
Bu amaçla, bu çalışma, daha öncebildirilenlere benzer kapalı kafatası TBH'sinin uygulanması için cerrahi bir prosedürün nasıl birleştirileceğini göstermektedir 7,8 Goldey ve ark.9 tarafından tanımlandığı gibi, aşağı akış intravital görüntüleme için bir kraniyal pencerenin implantasyonu için cerrahi bir prosedür. Özellikle, TBI'yı indükleyen ağırlık düşüşünün etkisinin pencereye zarar vermesi ve fareye onarılamaz bir zarar vermesi muhtemel olduğundan, önce bir kraniyal pencere implante etmek ve ardından aynı bölgede bir TBI gerçekleştirmek mümkün değildir. Bu nedenle, bu protokol TBH'yi uygulamak ve daha sonra kraniyal pencereyi doğrudan etki bölgesine implante etmek için tasarlanmıştır. Hem TBI hem de kraniyal pencere implantasyonunu tek bir cerrahi seansta birleştirmenin bir avantajı, bir farenin ameliyata maruz kalma sayısındaki azalmadır. Ayrıca, pencereyi daha sonraki bir cerrahi seansta implante etmek yerine (yani, TBI sonrası günlerin zaman ölçeğinde başlayan ilk görüntüleme) TBI'ya anında yanıtı (yani, saatlerin zaman ölçeğinde) izlemesine izin verir. Kraniyal pencere ve intravital görüntüleme platformu, sabit dokuların immün boyanması gibi geleneksel yöntemlerle nöronal proteinlerin izlenmesine göre de avantajlar sunar. Örneğin, intravital görüntüleme için daha az fare gerekir, çünkü aynı fare, ayrı zaman noktaları için gereken ayrı fare kohortlarının aksine, birden fazla zaman noktasında incelenebilir. Ayrıca, aynı nöronlar zaman içinde izlenebilir ve aynı hücre içindeki belirli biyolojik veya patolojik olayların izlenmesine izin verilir.
Kavramın bir kanıtı olarak, sinapsin promotörü altında gelişmiş yeşil floresan proteinin (EGFP) nörona özgü ekspresyonu burada gösterilmiştir10. Bu yaklaşım, 1) oligodendrositler için miyelin bazik protein (MBP) promotörü ve astrositler için glial fibriler asidik protein (GFAP) promotörü gibi diğer hücre tipine özgü promotörleri kullanarak farklı beyin hücresi tiplerine genişletilebilir11, 2) genlerini EGFP geni ile kaynaştırarak ilgilenilen farklı hedef proteinler ve 3) farklı floroforlara kaynaşmış çoklu proteinleri birlikte eksprese etmek. Burada EGFP, intrakraniyal enjeksiyon yoluyla adeno-ilişkili virüs (AAV) iletimi yoluyla paketlenir ve eksprese edilir. Kapalı bir kafatası TBI, bir ağırlık düşürme cihazı kullanılarak uygulanır ve ardından bir kraniyal pencerenin implantasyonu yapılır. Nöronal EGFP'nin görselleştirilmesi, in vivo EGFP floresansını tespit etmek için iki foton mikroskobu kullanılarak kraniyal pencereden elde edilir. İki fotonlu lazer ile, minimum foto hasarı ile kortikal dokuya daha derine nüfuz etmek mümkündür, bu da tek bir fare içinde aynı kortikal bölgelerin günlerce veaylara kadar tekrarlanan uzunlamasına görüntülenmesine izin verir 12,13,14,15. Özetle, TBH cerrahisini intravital görüntüleme ile birleştiren bu yaklaşım, TBH'nin neden olduğu hastalık patolojisine katkıda bulunan moleküler olayların anlaşılmasını ilerletmeyi amaçlamaktadır16,17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvanlarla ilgili tüm protokoller, Ulusal Araştırma Konseyi (ABD) Komitesi tarafından yayınlanan Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na uygun olarak yürütülmüştür. Protokoller, Massachusetts Üniversitesi Chan Tıp Fakültesi (UMMS) Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı (İzin Numarası 202100057). Kısaca, çalışma şemasında gösterildiği gibi (Şekil 1), hayvana bir virüs enjeksiyonu, bir TBI, bir pencere implantasyonu ve daha sonra bir zaman dizisinde intravital görüntüleme yapılır.
NOT: Ticari terimler kaldırılmıştır. Kullanılan özel ekipman için lütfen Malzeme Tablosuna bakın.
1. Stereotaksik bir cihaz kullanarak AAV'nin intrakraniyal enjeksiyonu
- AAV(PHP.eB)-Syn1-EGFP
- Mililitre başına 1 x 1013 viral genomdan oluşan bir viral titre kullanın (vg/mL). Syn1, nöronlarda kısıtlı viral ekspresyona izin veren nöronal spesifik bir promotor olan Synapsin1'i ifade eder. Virüs kurum içinde veya dışarıdan temin edilebilir.
- AAV uygulaması için stereotaksik enjeksiyon cerrahisine hazırlık
- Otoklav normal makas, cerrahi kumpas, cerrahi yaylı makas, cerrahi forseps, sivrisinek forseps, gazlı bez, pamuk uçlu aplikatör ve cam mikrolitre şırınga.
- Ameliyat bölgesini %75 etanol kullanarak sterilize edin. Tek kullanımlık steril cerrahi örtüyü, stereotaksik platformdaki ameliyat bölgesini kaplayacak şekilde genişletin.
NOT: Enjeksiyon ameliyatı sırasında hayvan vücut ısısını korumak için, geri besleme ayarlı bir ısıtma cihazı kullanın. - Fare vücut ağırlığını tartın ve kaydedin.
- Oksijen deposu valfini açın ve oksijen akışını 1,5 L/dk'ya ayarlayın. Anestezi makinesini açın ve izofluran seviye değerini üçe ayarlayın.
NOT: Bu adımda taşıyıcı gaz, oda havası veya %100 oksijen olabilir. - Fareyi indüksiyon odasına koyun ve tam anestezi elde etmek için 5 dakika bekletin.
- Fare tamamen uyuşturulduktan sonra (yani, kuyruk sıkışma refleksinin yokluğuyla birleştiğinde, yaklaşık 2 saniyede bir döngüde yavaş ama sabit solunum hızları), fareyi indüksiyon odasından çıkarın ve fare kafasını stereotaksik çerçeveye yerleştirin.
- Anestezi tüpü burun konisini farenin burnunun üzerine yerleştirin.
- Ameliyatın sonuna kadar 1 L / dak akış hızında taşıyıcı gaz ile% 1.5 izofluran kullanarak anesteziyi sürdürün. Nefes frekansını periyodik olarak kontrol edin ve uygun anesteziyi değerlendirmek için ameliyat boyunca en az 15 dakikada bir kuyruk veya ayak parmağı tutturun. İstenilen anestezi derinliğini korumak için izofluran konsantrasyonunu uygun şekilde ayarlayın.
- Bir mikrolitrelik şırıngayı (10 μL) virüs çözeltisiyle doldurun. Ardından, şırıngayı stereotaksik cihazın uygun mikroenjektör pompasına sabitleyin.
- Enjeksiyon ameliyatı
- Tek kullanımlık bir insülin şırıngası kullanarak buprenorfin (deri altından 1 mg/kg) uygulayın ve farenin gözlerine kayganlaştırıcı oftalmik merhem uygulayın.
- Normal makasla düzelterek başın üstündeki kafa derisindeki saçları çıkarın 1.
- Saç derisini gazlı bez ve pamuk uçlu aplikatörlerle temizleyin. Cildi önce %75 etanol ve ardından betadin kullanarak dezenfekte edin. Bunu üç kez tekrarlayın (yani, etanol ve ardından betadin), son betadin uygulamasını ciltte bırakın.
- Farenin tamamen uyuşturulduğundan emin olmak için anestezik derinliği tekrar kontrol edin (yani, kuyruk sıkışma refleksinin yokluğuyla birlikte yaklaşık 2 saniyede bir döngüde yavaş ama sabit solunum hızları). Sağ parietal kafatasını ortaya çıkarmak için orta hat boyunca normal makas 2 kullanarak ~ 1 cm'lik bir kesi yapın ve pamuk uçlu bir aplikatör kullanarak periosteumu çıkarın.
- Bu koordinatlarda bir işaretleyici kalem kullanarak kafatası üzerinde iki noktayı işaretleyin: A noktası: Bregma'nın 2,5 mm arkası ve sağ hemisfer üzerinde orta hattın 1 mm laterali; B noktası: Sağ hemisfer üzerinde Bregma'nın 2,5 mm posterior ve orta hattın 2 mm lateral.
- İnce bir EF4 karbür uçlu bir elektrikli diş matkabı kullanarak işaretli koordinatlarda kafatasına dikkatlice iki delik açın.
NOT: Beyin dokusuna zarar vermemeye dikkat edin. - Mikrolitre şırınga iğne ucunu orta hattın 1 mm yanal olan kafatası deliğine hizalamak için stereotaksik çerçeveyi ayarlayın.
- Beyin yüzeyine dokunmak için şırınga iğnesini indirin ve ardından bu konumu sıfır noktası olarak ayarlayın (z ekseni için). İğne ucunu beyin korteksine 0,5 mm derinliğe indirin ve 1 μL virüs solüsyonunu 200 nL/dk hızında yavaşça infüze edin.
- Solüsyonun geri akışını önlemek için iğneyi geri çekmeden önce virüs solüsyonu beyin dokusuna tamamen enjekte edildikten sonra 5 dakika bekleyin.
- Şırınga iğnesini yavaşça geri çekin. Enjeksiyonu diğer bölgede tekrarlayın. Kesi steril, emilmeyen bir cerrahi dikiş (6-0 gauge) ile dikilmelidir.
- Hayvan hala anestezi altındayken ameliyattan sonra sefazolin [500 mg / kg (333 mg / mL, genellikle ~ 45 μL), kas içi] ve meloksikam (5 mg / kg, deri altı) uygulayın.
- Fareyi stereotaksik çerçeveden serbest bırakın ve anesteziyi durdurun. Fareyi bir ısıtma battaniyesinin üzerindeki temiz bir kafese yerleştirin ve hayvanı yürüyene kadar izleyin (yaklaşık 15 dakika). Ardından, ev kafesine aktarın.
- İlk buprenorfin enjeksiyonundan sonra sırasıyla 8 saat, 16 saat ve 24 saatte buprenorfin (1 mg/kg, deri altı) ve meloksikam (5 mg/kg, deri altı) uygulayın.
NOT: Virüs enjeksiyonundan 2-4 hafta sonra, fareye AAV enjeksiyonu ile aynı bölgede TBI ve kraniyal pencere implantasyonu yapılır.
2. Tekrarlayan bir TBI indüksiyonunun uygulanması
NOT: TBI parametreleri, TBI etkisinin bir kez iletildiği önceki raporlara 7,8 göre ayarlanmıştır. Buradaki protokol, toplam etki sayısını 10'a çıkarmak dışında aynı parametreyi uygular.
- TBI ekipmanı
- Şekil 2B'de gösterildiği gibi, kapalı kafatası TBI'nın (Şekil 2A) sağ taraftaki fare kafasına uygulanması için özel olarak oluşturulmuş taşınabilir bir cihaz kullanın.
- Ameliyat öncesi hazırlık
- Normal makas, cerrahi kumpas, cerrahi yaylı makas, cerrahi forseps, sivrisinek forseps, baş direği parçaları, gazlı bez ve pamuk uçlu aplikatörler dahil olmak üzere otoklav cerrahi ekipmanı.
- Ameliyattan 2 saat önce farenin vücut ağırlığını tartın ve kaydedin. Kraniyal pencere implantasyonu sırasında beyin ödemini en aza indirmek için, bir insülin şırıngası kullanarak kuadriseps kasına 4.8 mg / kg [2 mg / mL, genellikle ~ 70 μl (iki bölgeye enjekte edilmesi gerekir)] dozunda deksametazon sodyum fosfat enjekte edin. Deksametazon enjeksiyonundan sonra, ancak TBI ameliyatına başlamadan önce, cam pencereleri daha sonra kullanmak üzere adım 3.1'de belirtildiği gibi hazırlayın.
- Cerrahi aşamayı ve TBI ekipmanını %75 etanol kullanarak dezenfekte edin ve tek kullanımlık steril cerrahi örtüyü stereotaksik platformda ameliyat aşamasını kapsayacak şekilde genişletin. Hedef sıcaklığı 37 °C'ye ayarlayarak ısıtma cihazını ve sıcaklık monitörünü açın.
- Oksijen deposu valfini açın ve oksijen akışını 1,5 L/dk'ya ayarlayın. Anestezi makinesini açın ve izofluran seviye değerini üçe ayarlayın.
NOT: %100 saf oksijen, hayvanın TBI etkilerinden kurtulmasına yardımcı olabilir. - Fareyi indüksiyon odasına koyun ve tam anestezi elde etmek için 5 dakika bekletin.
- Fare tamamen uyuşturulduktan sonra (yani, kuyruk sıkışma refleksinin yokluğuyla birleştiğinde, yaklaşık 2 saniyede bir döngüde yavaş ama sabit solunum hızları), fareyi indüksiyon odasından çıkarın ve fare kafasını stereotaksik çerçeveye yerleştirin.
- Anestezi tüpü burun konisini farenin burnunun üzerine yerleştirin.
- Ameliyatın sonuna kadar 1 L / dak akış hızında% 100 saf oksijen ile karıştırılmış% 1.5 izofluran kullanarak anesteziyi sürdürün. Nefes frekansını periyodik olarak kontrol edin ve uygun anesteziyi değerlendirmek için ameliyat boyunca en az 15 dakikada bir kuyruk veya ayak parmağı tutturun. İstenilen anestezi derinliğini korumak için izofluran konsantrasyonunu uygun şekilde ayarlayın.
- TBI ameliyatı
- Tek kullanımlık insülin şırıngaları kullanarak buprenorfin (deri altından 1 mg/kg) uygulayın ve farenin gözlerine oftalmik merhem sürün.
- Makasla 1 düzelterek ve ardından 1 dakika boyunca tüy dökücü madde uygulayarak tüyleri başın üstünden alın.
DİKKAT: Tüy dökücü ajan ürününü cildi tahriş edici olduğu için kafa derisine 3 dakikadan fazla uygulamayın. Farenin gözlerine herhangi bir tüy dökücü madde bulaştırmaktan kaçının. - Gazlı bez ve pamuk uçlu aplikatörler uygulayarak kafa derisini temizleyin. Ardından, önce %75 etanol ve ardından betadin kullanarak cildi dezenfekte edin. Bunu üç kez tekrarlayın (yani, etanol ve ardından betadin), son betadin uygulamasını ciltte bırakın.
- Farenin tamamen uyuşturulduğundan emin olmak için anestezik derinliği tekrar kontrol edin (yani, kuyruk sıkışma refleksinin yokluğuyla birlikte yaklaşık 2 saniyede bir döngüde yavaş ama sabit solunum hızları). Cerrahi forseps 3 ile cilt örtülür ve gözlerden yaklaşık 3 mm geriden başlayarak 12-15 mm uzunluğunda orta hat kesisi yapılır.
- Yaylı makas 2 kullanarak kafatasının sol ve sağ yarım küresindeki cildi çıkarın.
- Kafatası açığa çıktığında, steril pamuk uçlu bir aplikatörle hafifçe ovalayarak ve steril salinle yıkayarak periosteumu çıkarın.
- Önceki virüs enjeksiyon ameliyatı için yapılmış iki küçük delik dışında, sağlam olduğundan emin olmak için kafatasının durumunu görsel olarak inceleyin.
- Kafatası bölgesini kurutun ve TBI etki bölgesini aşağıdaki koordinatlarda işaretleyin: Bregma'nın 2.5 mm posterior ve sagital sütürden sağa doğru 2 mm lateral (Şekil 2B).
- Fareyi stereotaksik çerçeveden hızla çıkarın ve kafayı TBI cihazının altındaki tampon yastığına yerleştirin.
- Çarpma tertibatı ucunu işaretli çarpma alanıyla hizalayın.
- Bağlı naylon ipi fare kafasının 15 cm yukarısına çekerek metal sütunu kaldırın ve ardından serbest bırakın, ağırlığın TBI bölgesindeki kafatası tepesi ile temas halinde olan dönüştürücü çubuğun üzerine serbestçe düşmesine izin verin. TBI etkisini verirken fare kafasına dokunmayın.
- Fareyi ısıtma battaniyesinin üzerine getirin ve solunum durumunu izlerken sırt üstü yatırın.
- Fare sırtüstü pozisyondan yüzüstü pozisyona geçtiğinde, fareyi 1,5 L/dk akış hızında %100 saf oksijenle karıştırılmış %3 izofluran ile ~5 dakika boyunca izofluran indüksiyon odasına yerleştirin.
- Fare tamamen sakinleştiğinde (yani, kuyruk sıkışma refleksinin yokluğuyla birleştiğinde, yaklaşık 2 saniyede bir döngüde yavaş ama sabit solunum hızları), toplam 10 darbe elde etmek için 2.3.9-2.3.14 adımlarını tekrarlayın.
NOT: Çalışmamızda on TBI etkisinin düşük fare mortalitesi ile sağlam fenotipi indüklediği bulunmuştur (veriler henüz yayınlanmamıştır). Parametreler, darbe sayısını ve / veya ağırlığın serbest bırakıldığı yüksekliği artırarak veya azaltarak farklı bir beyin hasarı şiddeti elde etmek için ayarlanabilir. Tüm parametreler yerel IACUC'un onayına tabidir. - Kafatasını cerrahi mikroskop altında kontrol edin ve kafatası kırığı meydana gelirse fareyi çalışmadan çıkarın.
- Sahte bir ameliyat için, hayvanın çarpma tertibatının altına yerleştirilmesi de dahil olmak üzere yukarıda açıklanan prosedürlerin aynısını izleyin, ancak TBI etkilerini sağlamadan.
- Fare, 10. TBI etkisini takiben sırtüstü pozisyondan yüzüstü pozisyona geçtikten sonra, fareyi ~ 5 dakika boyunca izofluran indüksiyon odasına yerleştirin. Aşağıda açıklanan kraniyal pencere implantasyon ameliyatı için fare kafasını stereotaksik çerçeveye yerleştirmek için 2.2.6-2.2.8 adımlarını izleyin.
3. Kraniyal pencere implantasyon cerrahisi
NOT: Aşağıdaki kraniyal pencere implantasyon adımları Goldey ve ark.9'dan alınmıştır ve bunların başlık ve görüntüleme kuyusu spesifikasyonları burada uygulanmıştır.
- Pencere hazırlığı
NOT: TBI ameliyatına başlamadan önce adım 2.2.2'deki pencere hazırlığını tamamlayın. Pencere, aşağıda açıklandığı gibi şeffaf optik yapıştırıcı ile birleştirilen iki yuvarlak cam lamelden ( Şekil 2C'de gösterildiği gibi biri 3 mm ve diğeri 5 mm çapında) yapılmıştır.- Cam lamelleri 15 dakika boyunca %75 etanole batırarak sterilize edin. Cam lamelleri etanolden çıkarın ve steril bir yüzeyde (yani steril 24 oyuklu bir plakanın kapağında) ~ 10 dakika kurumaya bırakın.
- Kabarcık oluşumunu önlerken bir insülin şırıngasını şeffaf optik yapıştırıcı ile doldurun. 0,67x büyütmede mikroskop 1 (Malzeme Tablosu) altında, 5 mm'lik lamellerin ortasına küçük bir damla (~1 μL) optik yapıştırıcı koyun. Ardından, 3 mm'lik lamel hemen üstüne yerleştirin ve 5 mm'lik lamel ile ortalayın.
- Yapıştırıcıyı eşit şekilde yaymak için ince forseps kullanarak hafifçe basınç uygulayın. 3 mm'lik kapak kaymasının etrafında bir kabarcık veya duvar oluşursa cam pencereyi atın.
- Yapıştırıcıyı sertleştirmek için, lamelleri 20 x 100 μJ/cm2 gücünde 150 s boyunca bir UV kutusuna yerleştirin. 4 mm'lik kaymanın kenarını hafifçe dürtmek için forseps 3 kullanarak iki lamellerin güvenli bir şekilde bağlandığını kontrol edin. Lamel hareket ederse, 60 saniye daha UV kutusuna geri koyun. Cam pencereyi daha sonra kullanmak üzere 24 oyuklu steril bir plakada saklayın.
- Kafatası yüzeyini pürüzlendirin.
NOT: Bundan sonra, bölüm 3'teki tüm adımları cerrahi mikroskop altında gerçekleştirin. 10x ile başlayın ve istediğiniz büyütmeye ayarlayın.- Kalan periosteumu çıkarmak ve diş çimentosu kafatasına güvenli bir şekilde bağlanacak şekilde pürüzlü bir kafatası yüzeyi oluşturmak için düşük rotor hızında (yani çıkış numarası ~1-2 olarak ayarlanmış) bir FG4 karbür uç kullanarak kafatasının yüzeyini nazikçe ve yavaşça delin. Burada alternatif olarak matkap yerine neşter de kullanılabilir.
- Kafatası yüzeyindeki kemik tozunu temizlemek ve temizlemek için salin kullanın.
- Kasları ayırın.
NOT: Kas ayrımı, diş çimentosu için bir temas noktası görevi görecek olan açıkta kalan kafatası kemiğinin yüzey alanını arttırmaya ve böylece implantın yapısal bütünlüğünü sağlamaya hizmet eder. Bu kas ayırma aşaması genellikle temporal kafatası plakasının ~3 mm'sini ortaya çıkarır.- Parietal ve temporal kafatasını birbirine bağlayan sütürün bulunduğu gözün yaklaşık 5 mm arkasında, lateral kasları kafatasından ayırmak için kapalı ince uçları (#5/45 forseps) nazikçe yerleştirin ve kapalı uçları Lambdoid sütürün sonuna kadar nazikçe arka yönde hareket ettirin.
- Kraniyal pencerenin implantasyonunun gerçekleşeceği taraftaki yan kasları ayırın.
NOT: Oftalmik artere zarar vermemek için göze çok yakın kasları ayırmamaya dikkat edin; Aksi takdirde şiddetli ve kalıcı kanamalar meydana gelebilir. Farenin başını kaldırması için bu kaslara ihtiyaç duyduğundan, kasları oksipital kemikten ayırmayın. - Tuzlu su kullanarak ameliyat bölgesindeki kalıntıları yıkayın ve alanı gazlı bezle kurulayın. Kanamayı durdurmak için ameliyat bölgesine jel köpük uygulanabilir.
- Kafa direğini implante edin.
- Kraniyotomi ameliyatını gerçekleştirirken fare kafasını güvenli bir şekilde sabitlemek ve sonraki iki fotonlu görüntüleme için önceki bir yayın2'da açıklanan özel yapım bir titanyum başlık (Şekil 9D) kullanın.
- Sağ taraftaki temiz ve kuru kafatasında kraniotominin çevresini izlemek için bir işaretleyici kalem ve cerrahi kumpas kullanın. İzlenen dairenin merkez noktası Bregma'nın 2.5 mm gerisinde ve sağ hemisferde sagital sütürden 1.5 mm uzaktadır. İzlenen dairenin çapı yaklaşık 3,2-3,5 mm'dir ve 3 mm'lik cam lamelden biraz daha büyüktür. Kraniyotomi çemberinin virüs enjeksiyon bölgelerini (virüs enjekte edilirken açılan iki delik referans olarak kullanılabilir) ve TBI bölgesini kapsayabildiğinden emin olun.
- Kulak çubuğunu gevşetin ve kafayı kraniotomi düzlemi tamamen yatay olacak şekilde döndürün ve ardından kulak çubuğunu tekrar sıkın.
- Baş direğinin ön ve arka kenarına iki küçük damla süper yapıştırıcı eklemek için pamuk uçlu bir aplikatörün tahta çubuğunu kullanın.
- Titanyum kafa direğini kraniotominin merkezine yerleştirin ve kraniyal pencerenin implante edileceği yerle aynı düzlemde duracak şekilde hızlı bir şekilde ayarlayın. Süper yapıştırıcı kuruyana kadar hafif basınç uygulayın; Bu genellikle ~30 s sürer.
- Diş çimentosu önceden soğutulmuş bir seramik karıştırma kabında hazırlayın (-20 °C dondurucuda en az 10 dakika kalın): 300 mg çimento tozu, altı damla hızlı baz sıvı ve bir damla katalizörü birleştirin ve ardından karışımı iyice karışana kadar karıştırın (~15 kez).
NOT: Çimentonun macun kıvamında olması gerekir. Çok inceyse, biraz daha çimento tozu ile karıştırın. Çok kalınsa, macun kıvamına gelene kadar hızlı baz sıvıyı her seferinde bir damla karıştırın. - İzlenen çevrenin dış çevresine hızlı bir şekilde bol miktarda diş çimentosu karışımı uygulayın ve açıkta kalan kemik yüzeyini örtün. Bununla birlikte, kraniotomi bölgesini kapsamayın. Devam etmeden önce diş çimentosunun kuruması ve sertleşmesi için ~ 15 dakika bekleyin.
- İşaretli kraniyotomi çevresi boyunca hassas delme için başlığın sabit olduğundan emin olmak için kulak çubuğunu serbest bırakın ve kafa direğini metal çerçeveye sabitleyin. Kraniyotomi bölgesi üzerinde çimento varsa, delmek ve çıkarmak için FG4 karbür ucunu kullanın.
- Kraniyotomi
- Adım 3.4.2'de tanımlandığı gibi işaretli dairenin çapını doğrulamak için bir cerrahi kumpas kullanın. Kraniyal pencere kraniyotominin içine tam oturacak şekilde gerektiği gibi ayarlayın.
- Elektrikli bir diş matkabı kullanarak, önce bir FG4 karbür ucu kullanarak kafatasını işaretli dairenin dışı boyunca aşındırın ve inceltin (hız ~9-10 çıkışına ayarlanmıştır). Bu, kafatasını inceltmek için bir "iz" oluşturur.
DİKKAT: Isı yaralanmasını en aza indirmek ve düzgün bir iz elde etmek için matkap ucunu hareket ettirmeye devam edin. Aynı yeri 2 saniyeden fazla delmeyin. - Matkaptan kaynaklanan ısınmayı azaltmak ve kemik tozunu yıkamak için periyodik olarak delmeyi durdurun ve tüm alanı steril tuzlu su ile sulayın.
- Kafatası kağıt inceliğinde ve şeffaf olana kadar adım 3.5.2'de açıklandığı gibi bir FG1/4 karbür uç kullanarak kafatasını inceltmeye devam edin.
NOT: Matkabı tutmak için iki elinizi kullanmak, matkabı kontrol etmeyi kolaylaştırabilir ve matkap ucunun beyne girmesini önleyebilir. - Bir EF4 karbür uç kullanarak kafatası inceltme işlemini tamamlayın. Kemik flebi ile çevresindeki kafatası kemiği arasında bir çatlak oluştuğunda, bazen kafatasının tamamen delindiğini gösteren bir beyin omurilik sıvısı (BOS) salınımı olur.
- Pist boyunca kafatasının geri kalanını inceltmeye ve delmeye devam edin. Kanamayı önlemek için bariz bir damar sisteminin kafatasının altından geçtiği noktayı delmekten kaçının.
- İnce bir forseps ucu (forseps 1) ~ 0.5 mm çatlak yerden sokun ve alttaki beyni girintilemeden kemik flebini hafifçe yukarı doğru kaldırın.
- Kemik flebi çıkarıldıktan sonra, kraniotomi bölgesini tuzlu su ile yıkayın. Beyin yüzeyi kraniyotomi kenarından 1-2 mm daha yüksek olabilir.
- Bu adımdan başlayarak, beyin dokusunu korumak için açıkta kalan beyni daima tuzlu su ile örtün.
- Enjeksiyon ameliyatından sonra doku yapışması ve damar sistemi büyümesi nedeniyle orijinal AAV enjeksiyon bölgelerinde kemik flebi kaldırılırken kanama meydana gelebilir. Böyle bir durumda, bölgeye kuru pamuk uçlu bir aplikatörle ~ 2 dakika (veya gerektiğinde daha uzun) hafifçe bastırın. Kanamayı durdurmak için jel köpük kullanılabilir. Kanamayı durdurmak için kimyasallar veya ısıtma forseps kullanmayın, çünkü bu yaralanmaya neden olabilir.
- Görünür araknoid maddeyi nazikçe çıkarmak için forseps 1'i kullanın.
- İmplant cam pencere
- 3 mm'lik cam lamel aşağı bakacak şekilde steril cam pencereyi almak için cerrahi forseps 2'yi kullanın. Pencerenin kraniyotomi kenarına tam olarak oturduğundan emin olmak için cam pencereyi kraniyotomi bölgesinin üzerine yerleştirin ve ayarlayın. 5 mm'lik cam lamel üsttedir.
- Diş çimentosunu şu şekilde hazırlayın: 100 mg çimento tozu, iki damla hızlı baz sıvı ve bir damla katalizörü birleştirin. Karışımı iyice karışana kadar karıştırın (~ 15 kez). Çimento macun kıvamına gelene ve kalınlaşana kadar ~6 dakika bekleyin. Çimento çok inceyse, adım 3.6.4'te pencerenin altındaki boşluğa sızabilir ve pencereyi gizleyebilir.
- Çimentonun macun kıvamına gelmesini ve kalınlaşmasını beklerken, kafatasının cam pencereye güvenli ve sıkı bir şekilde temas edip etmediğini kontrol etmek için stereotaksik bir manipülatör aracılığıyla pencereye yeterli miktarda basınç uygulayın. Adım 3.6.4'teki diş çimentosu sıvısının camın altındaki boşluğa ulaşmadığından ve böylece pencereyi gizlemediğinden emin olun.
- Cam pencereyi kafatası ile kapatmak için pencere kenarının yanına az miktarda çimento eklemek için ayarlanabilir bir hassas aplikatör fırçası kullanın. Çimentonun tamamen kuruması için ~ 10 dakika bekleyin ve ardından manipülatörü pencerenin üzerinde yavaşça serbest bırakın ve çıkarın. Bu adımdan itibaren, 10 TBI darbesinin bitmesi ve kafa direğinin ve kafatası penceresinin implante edilmesi ~4 saat sürer.
- Pencereyi kaplayan fazla çimento varsa, FG4 karbür uçlu diş matkabını kullanarak diş çimentosunu kesin.
NOT: Pencerenin etrafındaki aşırı çimento, iki fotonlu objektif merceklerinin pencere yüzeyine yaklaşmasını engelleyebilir.
- Görüntülemenin iyi implante edilmesi
NOT: Bir görüntüleme kuyusu (Şekil 2D), dış çapı ~1.6 cm olan, başlık direğinin üst yüzeyine uyan ve iki fotonlu görüntüleme için kafatası penceresinin üzerinde su tutan kauçuk bir halkadır.- Pencere implantasyonu tamamlandıktan sonra, baş direğinin üst yüzeyindeki diş çimentosu kalıntılarını delin ve ıslak cerrahi gazlı bez kullanarak alanı temizleyin. Alanın ~3 dakika kurumasını bekleyin.
- Az miktarda süper yapıştırıcıyı daldırmak ve baş direğinin üst yüzeyine yapıştırmak için pamuk uçlu bir aplikatör kullanın. Lastik halkayı hızlı bir şekilde baş direğine yerleştirin. Baş direği ile yakın teması sağlamak için lastik halkaya ~2 dakika orta basınç uygulayın. Süper yapıştırıcıyı idareli kullanın, aksi takdirde cam pencereye yapışabilir ve iki fotonlu görüntülemeyi gizleyebilir.
- Analjezik ve antibiyotik uygulaması
- Görüntülemeyi iyice implante ettikten hemen sonra, ancak izofluranı kesmeden önce, tek kullanımlık insülin şırıngaları kullanarak sefazolin [500 mg / kg (333 mg / mL, genellikle ~ 45 μL), kas içi] ve meloksikam (5 mg / kg, deri altı) uygulayın.
- İlaç uygulamasından sonra, anesteziyi durdurun, fareyi stereotaksik çerçeveden serbest bırakın ve fareyi bir ısıtma battaniyesinin üzerindeki ev kafesine geri koyun.
- Fareyi ambulatuvar olana kadar ~ 15 dakika yakından izleyin.
NOT: Diğer farelerin kauçuk görüntüleme kuyusunu ısırabilecekleri için fareleri ayrı ayrı barındırın. Ad libitum'a erişim için kafesteki fareye yakın yiyecek ve su jeli sağlayın. - Buprenorfin (1 mg / kg, deri altında) ve meloksikam (5 mg / kg, deri altında) önceki dozdan sonra her 8 saatte bir kraniyal pencere implantasyon ameliyatından 48 saat sonrasına kadar tekrar uygulayın.
4. İntravital iki fotonlu görüntüleme
- İntravital görüntüleme için ayarlanabilir tutarlı çoklu foton lazer ve 20x büyütme objektifi (NA 1.0; suya daldırma) ile donatılmış mikroskop 2'yi (Malzeme Tablosu) kullanın18. EGFP sinyali için kullanılan filtre "BP 500-550" dir.
- Kafa içi pencere faresini intravital görüntüleme için hazırlayın.
- Ameliyat gününden başlayarak (0. gün olarak belirlenen), TBI sonrası tasarlanan zaman noktalarında iki fotonlu görüntüleme gerçekleştirin. Kraniyal pencere faresini anestezi indüksiyon odasına yerleştirin ve 5 dakika boyunca 1,5 L/dk akış hızında taşıyıcı gazla karıştırılmış %3 izofluran uygulayın.
NOT: Taşıyıcı gaz, oda havası veya %100 oksijen olabilir. - Fare tamamen uyuşturulduktan sonra (yani, kuyruk sıkışma refleksinin yokluğuyla birleştiğinde, yaklaşık 2 saniyede bir döngüde yavaş ama sabit solunum hızları), fareyi indüksiyon odasından çıkarın ve kafa direğini hızlı bir şekilde bir brakete sıkıştırın. Farenin gövdesini, braketle donatılmış yuvarlak bir plastik plaka (19 cm çapında) üzerine koyun.
NOT: İntravital görüntüleme sırasında ısı desteği sağlamak için farenin gövdesinin altına elle ısıtılan bir ped yerleştirildi. - Farenin gözlerine kayganlaştırıcı oftalmik merhem sürün ve anestezi tüpü burun konisini farenin burnunun üzerine yerleştirin. 1 L / dak akış hızında taşıyıcı gaz ile% 1.5 izofluran kullanarak anesteziyi koruyun.
- Nefes frekansını periyodik olarak kontrol edin ve uygun anesteziyi değerlendirmek için görüntüleme boyunca en az 15 dakikada bir kuyruk veya ayak parmağını sıkıştırın. İstenilen anestezi derinliğini korumak için izofluran konsantrasyonunu uygun şekilde ayarlayın.
- Kafatası penceresinin doğrudan iki fotonlu objektif merceğinin altında olduğundan emin olmak için fare kafasını hizalayın. Kafatası penceresinin üzerindeki görüntülemeye biraz su ekleyin. Hedefi suya batırılacak şekilde indirin.
- Ameliyat gününden başlayarak (0. gün olarak belirlenen), TBI sonrası tasarlanan zaman noktalarında iki fotonlu görüntüleme gerçekleştirin. Kraniyal pencere faresini anestezi indüksiyon odasına yerleştirin ve 5 dakika boyunca 1,5 L/dk akış hızında taşıyıcı gazla karıştırılmış %3 izofluran uygulayın.
- İntrakraniyal pencere farelerinin intravital görüntülemesi
- Dürbün cıva lambasını açın. Beyni önce oküler yoldan epifloresan ile görüntüleyin.
NOT: Damar sistemi siyah görünür. Pencerenin temiz olduğu bir alan seçin. Epifloresansı kapatın, EGFP sinyali için lazer dalga boyunu 860 nm'ye ayarlayın ve optimum (yani parlak ancak doygun olmayan) sinyal için lazer ayarını yapın. - Tarama modunu Çerçeve ve çizgi adımını 1 olarak ayarlayın. Ortalama sayısını 16'ya, bit derinliğini 8 bit'e, modu Çizgi'ye ve yöntemi Ortalama olarak ayarlayın.
- Sonraki uzunlamasına görüntüleme için aynı beyin bölgesini görüntülemek için vaskülatür modelini bir "referans haritası" olarak kullanın. Şekil 3A'da gösterildiği gibi, kortikal vaskülatürün bir z-yığını modunda 10 μm'lik bir düzlem boyunca baskın olduğu üç düzlem için yüzeysel seviyeyi (meningeal yüzeyden 100 μm'den daha az katman I) görüntüleyin.
- Şekil 3A'da gösterildiği gibi, düzlemler arası aralık 10 μm ve tarama hızı 8 olan bir z-yığını modu aracılığıyla derin seviyede (katman IV ve V, yüzeysel seviyeden ~400 μm daha derin) altı düzlemi görüntüleyin.
- Görüntülemeyi bitirdikten sonra (fare başına ~ 20 dakika), anesteziyi durdurun, fareyi çerçevelerden serbest bırakın ve bir ısıtma battaniyesinin üzerindeki ev kafesine geri koyun. Fareyi ambulatuvar olana kadar art arda izleyin, bu genellikle ~ 7 dakika sürer.
- TBI ameliyatından 0, 1 hafta ve 4 ay sonra fareyi uzunlamasına görüntüleyin.
- Dürbün cıva lambasını açın. Beyni önce oküler yoldan epifloresan ile görüntüleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokol için kavram kanıtı olarak, AAV-Syn1-EGFP eksprese eden viral partiküller, 3 aylıkken erkek TDP-43 Q331K /Q331K farelerinin (C57BL / 6J arka planı) 19 beyin korteksine enjekte edildi. Yabani tip C57BL/6J hayvanların da kullanılabileceği belirtilmektedir, ancak bu çalışma TDP-43Q331K/Q331K farelerinde gerçekleştirilmiştir çünkü laboratuvar nörodejeneratif hastalık araştırmalarına odaklanmıştır. AAV enjeksiyonundan 4 hafta sonra TBI ameliyatı yapıldı. Aynı cerrahi ortamda, kafa direği ve kraniyal pencere implante edildi. Fare, TBI ameliyatından 0. günde, 1 haftada ve 4 ayda iki fotonlu bir mikroskop kullanılarak seri olarak görüntülendi (Şekil 1). Genel olarak, enjeksiyon ameliyatı ~ 30 dakika sürdü ve TBI ameliyatı fare başına ~ 1 saat sürdü. TBI ameliyatı sırasında, fareler, ilk darbelere kıyasla, sonraki darbelerden sonra kendilerini sırtüstü pozisyondan yüzüstü pozisyona getirmek için genellikle daha uzun bir süreye ihtiyaç duydular. Örneğin, bir farenin ilk darbeden sonra konumunu düzeltmesi 2 dakikaya ihtiyaç duyabilir, ancak 10. darbeden sonra konumunu düzeltmek için 10 dakikaya ihtiyacı olabilir. Kraniyal pencere implantasyon ameliyatı için, tüm adımları gerçekleştirmek için genellikle ~ 3 saat gerekliydi, ancak kalıcı kanama meydana gelirse gerekenden daha uzun sürdü. İki fotonlu görüntüleme, tüm görüntüleri elde etmek için genellikle fare başına 20 dakika gerektirir. EGFP ekspresyonu olan üç fareyi içeren mevcut çalışma için, hayvanlar kafatası kırığı kanıtı göstermedi, ameliyat sırasında veya ameliyattan 4 ay sonrasına kadar ölmediler. Hem morbidite hem de kafatası kırığı oranı %0 idi. Bu, benzer bir TBH indükleme modelinde nispeten düşük (%<10) mortalite oranı ile tutarlıdır, ancak kraniyal pencere implantıolmadan 7,8.
Şekil 2B'de gösterildiği gibi, sağ taraftaki fare kafasına TBI darbeleri iletmek içindaha önce 7,8 bildirilen bir ağırlık düşürme cihazı (Şekil 2A) kullanıldı. Şeffaf bir plastik tüp (Şekil 2A'da no. 5; 60 cm uzunluğunda ve 1.4 cm iç çapında) metal bir brakete güvenli ve dikey olarak kenetlendi ve dikey boruya plastik bir çarpma kolonu (Şekil 2A'da no. 7; 10 cm uzunluğunda ve 1.3 cm çapında, 2 mm çapında düz yuvarlak uçlu) yerleştirildi. 50 g'lık bir metal ağırlık (Şekil 2A'da 6 numara) çarpma tertibatının üzerine yerleştirildi ve bir naylon ip ile bağlandı (Şekil 2A'da 4 numara). Darbe enerjisini tamponlamak ve emmek için fare kafasının altına bir tampon yastığı (Şekil 2A'da no. 8; 9 cm x 9 cm x 1 cm [uzunluk x genişlik x derinlik] polietilen köpük ve pamuklu gazlı bezden yapılmıştır) yerleştirildi.
Kafatası penceresi, optik yapıştırıcı ile birleştirilmiş iki cam lamelden yapılmıştır (Şekil 2C), 3 mm çapındaki cam lamel ise beyin yüzeyine temas eden taraftır. İki fotonlu görüntüleme, beyin yüzeyinden iki farklı derinlikte gerçekleştirildi (Şekil 3A): 1) kortikal vaskülatürün bol olduğu ve siyah görünen, ancak seyrek EGFP pozitif hücre gövdelerine sahip nispeten büyük bir lümen çapına sahip olduğu yüzeysel bir seviye; ve 2) damar sisteminin seyrek olduğu ve birçok EGFP pozitif hücrenin görülebildiği küçük bir lümen çapına sahip olduğu daha derin bir seviye.
Ameliyattan ~ 4 saat sonra (gün 0), yüzeysel seviyede (tabaka I, meningeal yüzeyden 100 μm'den az) 10 μm aralıklarla üç düzlemde iki foton görüntüleme gerçekleştirildi, ilk olarak vaskülatürün siyah göründüğü ( Şekil 3B'de kesikli kırmızı çizgilerle gösterilir) ve orijinal görüntüleme bölgesini bulmak için bir sonraki görüntüleme seansı için bir referans haritası olarak kullanıldı. Bu yüzeysel düzeyde, kortikal vaskülatür ve nöronal süreçler gözlenebilen baskın yapılar iken, EGFP pozitif hücre gövdeleri seyrekti. Yüzeysel düzeyde görüntülemeden sonra, odak, EGFP pozitif nöronal hücre gövdelerini görüntülemek için kortekse (katman IV ve V) yüzeysel seviyeden daha derin, ~ 400 μm aşağı doğru ayarlandı. Görüntüler, 10 μm aralıklarla altı düzlemde elde edildi. EGFP protein ekspresyonu, Şekil 3C'de gösterildiği gibi hücre gövdesi boyunca dağınık bir şekilde dağıldı. Hücre gövdelerinin dışında, aksonlar veya dendritler içinde zamanla oluşan EGFP inklüzyonları temsil edebilen bazı EGFP punktalarının ara sıra ortaya çıkması olmuştur. Bu protokol, post-mortem dokuların histolojik analizi ile tanımlanabilen, enjeksiyon bölgesini çevreleyen ~ 2-3 mm AAV-SYN1-EGFP ekspresyonu ile sonuçlanır.
TBH'den 1 hafta ve 4 ay sonra, 0. gün zaman noktasında gözlenen vaskülatür paterni, aynı görüntüleme bölgesini bulmak için referans olarak kullanıldı (Şekil 3D, F). Şekil 3D,F'deki damar sistemi paterni, Şekil 3B'dekine benzer. TBI sonrası 1 hafta ve 4 ay için görüntüleme prosedürü, 0. gün zaman noktası için yukarıda tarif edilenle aynıydı ve daha önce olduğu gibi hücre gövdesi boyunca EGFP ekspresyonu tespit edildi (Şekil 3E, G). 0. ve 4. aylardaki floresan yoğunluğu hem yüzeysel hem de daha derin seviyelerde benzerdi. Bununla birlikte, 1 haftadaki floresan yoğunluğu, hem yüzeysel hem de derin seviyelerde 0. ve 4. aylardan daha düşüktü, bu da diğer TBI modelleri20 için bildirilen translasyonel baskıdan kaynaklanıyor olabilir. Özellikle, 0. gün zaman noktasına kıyasla 4 aydaki görüntülerin kalitesi, kraniyal pencerenin netliğini ve bütünlüğünü koruduğunu ve etkili intravital görüntüleme için ameliyattan 4 ay sonra viral ekspresyonun hala sağlam olduğunu göstermektedir. EGFP nispeten yaygın bir protein olarak ifade edildiğinden, EGFP ilgilenilen bir proteine kaynaştırıldığında floresan sinyalleri daha iyi çözülebilir ve sağduyulu olabilir.
Şekil 1: Bu intravital görüntüleme protokolü için zaman çizelgesi. Protokol virüs enjeksiyonu ile başlatılır. TBI ve kraniyal pencere ameliyatı, virüs enjeksiyonundan 2-4 hafta sonra aynı ameliyat seansında yapılır. İntravital görüntüleme TBH'den 4 ay sonra 0. günde, 1 haftada yapılır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: TBI cihazı, TBI etki alanı ve pencere hazırlığı için diyagramlar . (A) Ağırlık düşürme TBI cihazı için ekipman. 1: kaide, 2: braket, 3: ayarlanabilir kelepçe, 4: naylon ip, 5: ağırlık düşürme tüneli, 6: metal ağırlık sütunu (50 g), 7: çarpma tertibatı, 8: tampon yastığı. (B) Bregma'nın 2.5 mm posterior ve sagital sütürden sağa 2 mm lateral koordinatları ile virüs enjeksiyonu ve TBI etki bölgesinin bir şeması. (C) Cam pencereyi hazırlamak için bir şema. Çapı 3 mm ve 5 mm olan iki cam kapak astarı, optik yapıştırıcı kullanılarak birleştirilir. (D) Metal başlık ve görüntüleme kuyusunun resimleri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Görüntüleme düzlemlerinin şeması ve görüntü verileri . (A) Çoklu düzlemler, damar sisteminin bulunduğu yüzeysel düzeyde ve derin düzeyde görüntülenir. Görüntüler şu şekilde toplanır: kortikal vaskülatür ve nöronal süreçlerin baskın EGFP pozitif yapılar olduğu yüzeysel düzeyde üç düzlem ve EGFP pozitif hücre gövdelerinin baskın olarak gözlendiği derin düzeyde altı düzlem, komşu düzlemler arasında 10 μm'lik bir aralıkla. Her düzlem 425.10 μm x 425.10 μm boyutundadır. (B) 0. gün zaman noktasında yüzeysel düzeyde bir uçağın temsili görüntüsü. Kesikli kırmızı çizgiler, sonraki zaman noktaları için orijinal görüntüleme yerini bulmak için referans olarak kullanılabilecek damar sistemi taslağını gösterir. (C) TBI'dan hemen sonra 0. gün zaman noktasında derin seviyedeki bir uçağın temsili görüntüsü. (D) 1 haftalık zaman noktasında yüzeysel düzeyde bir uçağın temsili görüntüsü. Kesikli kırmızı çizgiler, Şekil 3B'deki 0. gündeki taslağa benzer şekilde damar sistemini gösterir ve iki fotonlu görüntülemenin TBI'dan 0. gün ve 1 hafta sonra benzer bir yerde gerçekleştirildiğini doğrular. (E) TBI sonrası 1 haftalık zaman noktasında derin düzeyde temsili görüntü. (F) B ve D ile aynı, TBI'dan 4 ay sonra. (G) TBI'dan 4 ay sonra C ve E ile aynı. Ölçek çubuğu: 50 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışmada, TBH'nin kortikal nöronlar üzerindeki etkilerini gözlemlemek için fare beyin korteksi (katman IV ve V) içindeki EGFP etiketli nöronların uzunlamasına görüntüleme analizi için AAV enjeksiyonu, TBI uygulaması ve kraniyal pencere implantasyonu olan bir başlık birleştirildi. Bu çalışma, burada seçilen TBI bölgesinin, hipokampusun üstünde, kraniyal pencerenin implantasyonu için nispeten düz ve geniş bir yüzey sağladığını belirtmektedir. Tersine, kafatası bu bölgenin önünde nispeten dardır ve bu nedenle kafa direğinin kafatasının yüzeyine etkili bir şekilde temas etmesini sağlamak zordur. Bu çalışmada sadece TDP-43Q331K/Q331K fare modeli kullanılmış olsa da, laboratuvarın ALS ve FTD19'a odaklanan araştırmaları göz önüne alındığında, bu protokol diğer fare suşlarının çoğuna uygulanabilir olmalıdır. Burada açıklandığı gibi nöronları etiketlemeye ek olarak, intravital görüntüleme için diğer hücre tiplerini etiketlemek için çeşitli stratejiler kullanılabilir. Bir yaklaşım, genetiği değiştirilmiş farelerde Cre-Lox rekombinasyon sistemini kullanarak genetik olarak kodlanmış floresan proteinleri hücreye özgü bir şekilde ifade etmektir21. Diğer bir yaklaşım, genetik olarak kodlanmış floresan proteinlerin hücreye özgü transdüksiyonu için belirli viral serotiplerin kullanılmasıdır. Beyinde istenilen yere intrakraniyal enjeksiyon yapılarak bölgeye özel doğum sağlanabilir. İntravital görüntüleme için viral transdüksiyon yoluyla hücreye özgü proteinlerin eksprese edilebilmesinin verimliliği ve kolaylığı, transgenik fare modelleri oluşturmaya göre bir avantajdır.
Ameliyat protokolleri için dikkatle gerçekleştirilmesi gereken çok sayıda kritik adım vardır. Protokolün başlangıcında virüs enjeksiyonu için kafatasına delikler açarken, kafatasının altındaki dokuya zarar vermemek için dikkatli olunması gerekir. Kafatası üzerinde delme sırasında doku hasarı meydana gelirse, yaralanma bölgesi çevresinde iltihaplanma, doku yapışması ve anjiyogenez olacak ve böylece kraniyal pencere implantasyonu için kraniyotomi sırasında kanama riskini artıracaktır. TBH'nin ağırlık düşürme cihazı ile uygulanması için, bu çalışma, TBI darbe kuvvetini tamponlamak ve böylece kafatası kırığı olasılığını azaltmak için fare kafasının altına bir yastık yerleştirdi. Dönme yönleri ve ivme üzerinde belirgin bir kafa hareketi gözlenmedi, bu da bu TBI modelinin nispeten düşük bir difüzyon aksonal yaralanma şansına sahip olduğu fikrini destekledi. İlginç bir şekilde, Foda ve ark. sıçanlarda kapalı kafatası TBI yaralanması oluşturmak için benzer bir ağırlık düşürme cihazı kullandılar ve sıçan kafasının altına daha büyük, yumuşak bir köpük yastık (12 cm kalınlığında) yerleştirildi, böylece hızlanma ile dönme yönündeki TBI darbe kuvvetine yanıt olarak kolayca hareket edebildi, böylece difüzyon aksonal yaralanmasına neden oldu22. Tüp kılavuzlu ağırlık düşüşü TBI modelinin avantajlarından biri, travmanın şiddetinin, ağırlık düşme yüksekliğini değiştirerek (yani, daha büyük bir kuvvet için daha yüksek bir yükseklik) ve/veya darbenin kaç kez verildiğini tekrarlayarak modüle edilebilmesidir. Örneğin, Flierl ve ark. farelerde TBH'yi indüklemek için mevcut çalışmaya benzer bir ağırlık düşürme cihazı kullandılar; metalin ağırlığı 333 g idi, bu da 2 cm yükseklikten düştüğünde hafif bir TBI ve 3 cm yükseklikten düştüğünde şiddetli bir TBI23 indükledi. Pencere implantasyonundan önceki kraniyotomi adımının da kafatasının altındaki beyin dokusuna zarar vermemek için dikkatli bir şekilde yapılması gerekir. Matkap ucunu periyodik olarak kafatası üzerinde farklı bir bölgeye hareket ettirmek, aynı noktada aşırı ısınmaya, doku hasarına ve kanamaya neden olabilecek aşırı delmeyi önlemeye yardımcı olur; Ayrıca, sık sık tuzlu su ile sulama yapmak da sondaj alanını soğutabilir. Cam pencereyi implante ederken, cam düzlemi kafatası yüzey düzlemine paralel olacak şekilde hizalamak önemlidir; Kafatasına oturan rahat bir pencere, diş çimentosu sıvısının pencere ile beyin arasındaki boşluğa sızmasını önler.
TBI ameliyatından sonraki 0. günde pencere bulanıksa, ancak floresan sinyalleri tespit edilirse, diş çimentosu pencere ile beyin arasındaki boşluğa girmiş olabilir, böylece beyin yüzeyini kaplayan ve floresan emisyonunu gizleyen bir çimento tabakası oluşturmuş olabilir. Bu durumda, protokol adımı 3.5'te açıklanan delme yöntemi kullanılarak pencere ve diş çimentosu çıkarılabilir ve daha sonra Goldey ve ark.9 tarafından ayrıntılı olarak açıklandığı gibi orijinal bölgeye yeni bir cam pencere yerleştirilebilir. Uzunlamasına görüntüleme işlemi sırasında pencere sonraki bir aşamada bulanıklaşırsa, pencereyi pamuk uçlu bir aplikatörle hafifçe ovalayarak olası kalıntıları gidermeye çalışılabilir. Bu sorunu çözmezse, kemiğin ve cam pencerenin altındaki meninkslerin yeniden büyümesinden kaynaklanıyor olabilir. Bu durumda, yeniden büyümüş kemiği çıkarmak ve / veya cımbızı ayırmak ve meninksleri çıkarmak için pencere çıkarılabilir ve delinebilir, ardından Goldey ve ark.9 tarafından tarif edildiği gibi orijinal bölgeye yeni bir cam pencere yerleştirilebilir. Sonuçlarda gösterildiği gibi, EGFP ekspresyonu ve floresan, TBI sonrası ~ 4 aylık bir süre boyunca sağlamdır. TBI sonrası ilk hafta içinde floresan sinyalinde bir azalma beklenebilir, bu da muhtemelen küresel protein sentezinde geçici bir azalmaya neden olan TBI kaynaklı translasyonel baskılanmadan kaynaklanmaktadır20.
Yüksek görüntüleme kalitesini korumak ve çoklu düzlemlerde görüntüleme elde etmek için, fareler hareketi sınırlamak için izofluran anestezisi altındaydı. Bununla birlikte, anestezinin çalışma sonuçlarını etkileyebileceğini unutmamak önemlidir. Örneğin, izofluran anestezisi altındaki farelerin, uyanık farelere kıyasla fotohasara yanıt olarak farklı mikroglial aktivite sergilediği bildirilmiştir24. İki fotonlu görüntüleme için, tarama hızı ve sinyal ortalaması için tarama sayısı ("ortalama" altında "sayı" olarak ayarlanır) görüntü çözünürlüğünü belirleyebilen ana faktörlerdir. Çözünürlüğü optimize etmek için, tarama hızı düşürülebilir ve ortalama sayı artırılabilir, ancak daha yavaş bir hız ve daha yüksek ortalama sayı, belirli bir görüş alanı için görüntüleme süresini artırır ve fotoğraf ağartmasına neden olabilir. Bu çalışma, aynı hayvan üzerinde aynı beyin bölgesinde kronik uzun süreli görüntüleme yapmayı amaçlamaktadır. Yeterli çözünürlüğe ulaşırken olası foto ağartmayı önlemek için, ortalama 16 sayı ile 8 tarama hızında iki fotonlu görüntüleme gerçekleştirildi.
Kraniyotomi yapmak ve bir cam pencere yerleştirmek için alternatif bir yaklaşım, kafatasını şeffaf ve canlı görüntüleme için "kağıt inceliğinde" olacak şekilde inceltmektir25,26,27. İnce kafatası penceresi, kafatasının sağlamlığını koruyabilir ve böylece cerrahi operasyonun neden olduğu iltihaplanmayı önleyebilir. Bu nedenle, inflamasyonla ilgili belirteçlerle ve/veya nispeten daha kısa bir süre boyunca (yani, bildirildiği gibi ameliyattan ~ 14 gün sonra) canlı görüntüleme için ince kafatası penceresi yaklaşımı tercih edilebilir25). Kronik nörodejeneratif süreçlerin uzun süreli görüntülenmesi için (ör. burada tarif edildiği gibi 4 ay), TBH'nin aynı hayvan üzerindeki akut etkilerini değerlendirmenin yanı sıra, bir kraniotomi yöntemi ile implante edilmiş bir cam pencere kullanılması önerilir.
Giriş bölümünde bahsedildiği gibi, memeli beynindeki çeşitli biyolojik ve patolojik olayları incelemek için intravital görüntülemenin birkaç önemli avantajı vardır. Ancak, bu protokolün de bazı sınırlamaları vardır. Örneğin, contrecoup beyin hasarı, beyin kontüzyonunu veya hematomu, genellikle 28,29,30 bölgesine temas eden kuvvetin tersinden uzakta tanımlar. Bu çalışmada, TBI etkileri parietal loba iletildi; Kontrecoup yaralanması ventral olarak beklenen ve intravital görüntülemeye erişilemeyen bir durumdur. Histolojik bir analiz, kraniyal pencerenin kapsadığı etki bölgesi dışındaki ilgilenilen fenotipleri daha fazla incelemek için tamamlayıcı bir yaklaşım olarak kullanılabilir. Ek olarak, bazı proteinlerin eksojen aşırı ekspresyonu da toksisiteye veya patolojiye neden olabilir. Bu çalışmada, protein aşırı ekspresyonuna bağlı birikimleri temsil edebilecek bazı ara sıra EGFP punktaları gözlenmiştir. Bu nedenle, bu olasılığı ele almak için çalışma tasarımına bir negatif kontrol proteininin (örneğin, tek başına EGFP veya RFP) dahil edilmesi önerilir, özellikle de ilgilenilen protein punktat yapılar oluşturmaya eğilimliyse. Aynı anda çalışılabilecek proteinlerin sayısı, iki foton sisteminin lazerleri ve yetenekleri ile sınırlıdır. İki foton mikroskobu ile birden fazla floroforun (örneğin, EGFP, RFP, vb.) görüntülenmesi mümkün olabilir, ancak geleneksel geniş alan ve konfokal mikroskoplarla çoğullama yetenekleri genellikle tek bir doku örneğinde daha fazla proteinin analizine izin verir. Son olarak, ağırlık düşürme etkileri dışında, TBI hayvanı ile aynı prosedürleri alan sahte bir kontrolün dahil edilmesi önemlidir. Kraniyal pencere implantasyon cerrahisi invaziv bir ameliyattır ve TBI sürecini etkileyebilecek iltihaplanma ve kafa içi basıncın değişmesi gibi bazı lokal değişikliklere neden olabilir. Sahte bir kontrol, deneycinin cerrahi prosedürlere karşı etkiden kaynaklanan fenotipleri değerlendirmesine yardımcı olur.
Özetle, bu protokol, TBI'ya yanıt olarak özellikle fare beyin korteksinin nöronlarındaki proteinleri uzunlamasına görüntülemek için bir yöntem sunar. Bu protokol, TBH'ye yanıt olarak çeşitli hücreye özgü proteinlerin ekspresyonunu ve lokalizasyonunu analiz etmek için değiştirilebilir. Bu protokolün amacı, memeli beyninde TBH'nin acil ve uzun vadeli sonuçlarını incelemek için bir yaklaşım sağlamaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Herhangi bir çıkar çatışması beyan edilmez.
Acknowledgments
Massachusetts Üniversitesi Chan Tıp Fakültesi'nden Dr. Miguel Sena-Esteves'e AAV(PHP.eB)-Syn1-EGFP virüsünü hediye ettiği için ve Massachusetts Üniversitesi Chan Tıp Fakültesi'nden Debra Cameron'a farelerin kafatası taslağını çizdiği için teşekkür ederiz. Ayrıca Bosco, Schafer ve Henninger laboratuvarlarının mevcut ve geçmiş üyelerine önerileri ve destekleri için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Savunma Bakanlığı (W81XWH202071/PRARP) tarafından DAB, DS ve NH'ye finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adjustable Precision Applicator Brushes | Parkell | S379 | |
| BD insulin syringe | BD | NDC/HRI#08290-3284-38 | 5/16" x 31G |
| Betadine | Purdue | NDC67618-151-17 | including 7.5% povidone iodine |
| Buprenorphine | PAR Pharmaceutical | NDC 42023-179-05 | |
| Cefazolin | HIKMA Pharmaceutical | NDC 0143-9924-90 | |
| Ceramic Mixing Dish | Parkell | SKU: S387 | For dental cement preparation |
| Cotton Tipped Applicators | ZORO | catlog #: G9531702 | |
| Catalyst | Parkell | S371 | full name: "C" Universal TBB Catalyst |
| Dental cement powder | Parkell | S396 | Radiopaque L-Powder for C&B Metabond |
| Dental drill | Foredom | H.MH-130 | |
| Dental drill controller | Foredom | HP4-310 | |
| Dexamethasone | Phoenix | NDC 57319-519-05 | |
| EF4 carbide bit | Microcopy | Lot# C150113 | Head Dia/Lgth/mm 1.0/4.2 |
| Ethonal | Fisher Scientific | 04355223EA | 75% |
| FG1/4 carbide bit | Microcopy | Lot# C150413 | Head Dia/Lgth/mm 0.5/0.4 |
| FG4 carbide bit | Microcopy | Lot# C150309 | Head Dia/Lgth/mm 1.4/1.1 |
| Headpost | N/A | N/A | Custom-manufactured |
| Heating apparatus | CWE | TC-1000 Mouse | equiped with the stereotaxic instrument and be used while operating surgery |
| Heating blanket | CVS pharmacy | E12107 | extra heating device and be used after surgery |
| Isoflurane | Pivetal | NDC 46066-755-03 | |
| Isoflurane induction chamber | Vetequip | 89012-688 | induction chamber for short |
| Isoflurane volatilizing machine | Vetequip | 911103 | |
| Isoflurane volatilizing machine holder | Vetequip | 901801 | |
| Leica surgical microscope | Leica | LEICA 10450243 | |
| Lubricant ophthalmic ointment | Picetal | NDC 46066-753-55 | |
| Marker pen | Delasco | SMP-BK | |
| Meloxicam | Norbrook | NDC 55529-040-10 | |
| Microinjection pump and its controller | World Precision Instruments | micro4 and UMP3 | |
| Microliter syringe | Hamilton | Hamilton 80014 | 1701 RN, 10 μL gauge for syringe and 32 gauge for needle, 2 in, point style 3 |
| Mosquito forceps | CAROLINA | Item #:625314 | Stainless Steel, Curved, 5 in |
| Depilatory agent | McKesson Corporation | N/A | Nair Hair Aloe & Lanolin Hair Removal Lotion |
| Microscope 1 | Nikon | SMZ745 | Nikon microscope for cranial window preparation |
| Microscope 2 | Zeiss | LSM 7 MP | two-photon microscope |
| Multiphoton laser | Coherent | Chameleon Ultra II, Model: MRU X1, VERDI 18W | laser for two-photon microscopy |
| Non-absorbable surgical suture | Harvard Apparatus | catlog# 59-6860 | 6-0, with round needle |
| Norland Optical Adhesive 81 | Norland Products | NOA 81 | |
| No-Snag Needle Holder | CAROLINA | Item #: 567912 | |
| Quick base liquid | Parkell | S398 | "B" Quick Base For C&B Metabond |
| Regular scissor 1 | Eurostat | eurostat es5-300 | |
| Regular scissor 2 | World Precision Instruments | No. 501759-G | |
| Round cover glass 1 | Warner instruments | CS-5R Cat# 64-0700 | for 5 mm of diameter |
| Round cover glass 2 | Warner instruments | CS-3R Cat# 64-0720 | for 3 mm of diameter |
| Rubber rings | Orings-Online | Item # OO-014-70-50 | O-Rings |
| Saline | Bioworld | L19102411PR | |
| Spring scissor 1 | World Precision Instruments | No. 91500-09 | tip straight |
| Spring scissor 2 | World Precision Instruments | No. 91501-09 | tip curved |
| Stereotaxic platform | KOPF | Model 900LS | |
| Super glue | Henkel | Item #: 1647358 | |
| surgical Caliper | World Precision Instruments | No. 501200 | |
| Surgical forceps 1 | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | Catlog# 0508-5/45-PO | style 5/45, curved |
| Surgical forceps 2 | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | catlog# 0103-5-PO | style 5, straight |
| Surgical forceps 3 | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | catlog# 72912 | |
| Surgical forceps 4 | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | Catlog# 0508-5/45-PO | style 5/45, curved |
| Surgical gauze | ZORO | catlog #: G0593801 | |
| Surgical lamp | Leica | Leica KL300 LED | |
| UV box | Spectrolinker | XL-1000 | also called UV crosslinker |
| Vaporguard | Vetequip | 931401 | |
| Vetbond Tissue Adhesive | 3M Animal Care | Part Number:014006 |
References
- Bowman, K., Matney, C., Berwick, D. M. Improving traumatic brain injury care and research: a report from the National Academies of Sciences, Engineering, and Medicine. JAMA. 327 (5), 419-420 (2022).
- National Academies of Sciences, Engineering, and Medicine. Traumatic Brain Injury: A Roadmap for Accelerating Progress. , The National Academies Press. (2022).
- Xu, X., et al. Repetitive mild traumatic brain injury in mice triggers a slowly developing cascade of long-term and persistent behavioral deficits and pathological changes. Acta Neuropathologica Communications. 9 (1), 60 (2021).
- Chen-Plotkin, A. S., Lee, V. M. Y., Trojanowski, J. Q. TAR DNA-binding protein 43 in neurodegenerative disease. Nature Reviews Neurology. 6 (4), 211-220 (2010).
- Mackenzie, I. R., Rademakers, R., Neumann, M. TDP-43 and FUS in amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal dementia. The Lancet. Neurology. 9 (10), 995-1007 (2010).
- McKee, A. C., et al. The first NINDS/NIBIB consensus meeting to define neuropathological criteria for the diagnosis of chronic traumatic encephalopathy. Acta Neuropathologica. 131 (1), 75-86 (2016).
- Henninger, N., et al. Attenuated traumatic axonal injury and improved functional outcome after traumatic brain injury in mice lacking Sarm1. Brain. 139, 1094-1105 (2016).
- Bouley, J., Chung, D. Y., Ayata, C., Brown, R. H., Henninger, N. Cortical spreading depression denotes concussion injury. Journal of Neurotrauma. 36 (7), 1008-1017 (2019).
- Goldey, G. J., et al. Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice. Nature Protocols. 9 (11), 2515-2538 (2014).
- Kugler, S., et al. Neuron-specific expression of therapeutic proteins: evaluation of different cellular promoters in recombinant adenoviral vectors. Molecular and Cellular Neurosciences. 17 (1), 78-96 (2001).
- von Jonquieres, G., et al. Glial promoter selectivity following AAV-delivery to the immature brain. PLoS One. 8 (6), 65646 (2013).
- Trachtenberg, J. T., et al. Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420 (6917), 788-794 (2002).
- Mostany, R., et al. Altered synaptic dynamics during normal brain aging. The Journal of Neuroscience. 33 (9), 4094-4104 (2013).
- Yang, Q., Vazquez, A. L., Cui, X. T. Long-term in vivo two-photon imaging of the neuroinflammatory response to intracortical implants and micro-vessel disruptions in awake mice. Biomaterials. 276, 121060 (2021).
- Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (12), 7319-7324 (2003).
- Grutzendler, J., Gan, W. B. Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain. NeuroRx. 3 (4), 489-496 (2006).
- Isshiki, M., et al. Enhanced synapse remodelling as a common phenotype in mouse models of autism. Nature Communications. 5, 4742 (2014).
- Mondo, E., et al. A developmental analysis of juxtavascular microglia dynamics and interactions with the vasculature. The Journal of Neuroscience. 40 (34), 6503-6521 (2020).
- White, M. A., et al. TDP-43 gains function due to perturbed autoregulation in a Tardbp knock-in mouse model of ALS-FTD. Nature Neuroscience. 21 (4), 552-563 (2018).
- Chou, A., et al. Inhibition of the integrated stress response reverses cognitive deficits after traumatic brain injury. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (31), 6420-6426 (2017).
- Padmashri, R., Tyner, K., Dunaevsky, A. Implantation of a cranial window for repeated in vivo imaging in awake mice. Journal of Visualized Experiments. (172), e62633 (2021).
- Foda, M. A., Marmarou, A. A new model of diffuse brain injury in rats. Part II: Morphological characterization. Journal of Neurosurgery. 80 (2), 301-313 (1994).
- Flierl, M. A., et al. Mouse closed head injury model induced by a weight-drop device. Nature Protocols. 4 (9), 1328-1337 (2009).
- Sun, W., et al. In vivo two-photon imaging of anesthesia-specific alterations in microglial surveillance and photodamage-directed motility in mouse cortex. Frontiers in Neuroscience. 13, 421 (2019).
- Li, D., et al. A Through-Intact-Skull (TIS) chronic window technique for cortical structure and function observation in mice. eLight. 2 (1), 1-18 (2022).
- Paveliev, M., et al. Acute brain trauma in mice followed by longitudinal two-photon imaging. Journal of Visualized Experiments. (86), e51559 (2014).
- Han, X., et al. In vivo two-photon imaging reveals acute cerebral vascular spasm and microthrombosis after mild traumatic brain injury in mice. Frontiers in Neuroscience. 14, 210 (2020).
- Jang, S. H., Kwon, Y. H., Lee, S. J. Contrecoup injury of the prefronto-thalamic tract in a patient with mild traumatic brain injury: A case report. Medicine. 99 (32), 21601 (2020).
- Courville, C. B. The mechanism of coup-contrecoup injuries of the brain; a critical review of recent experimental studies in the light of clinical observations. Bulletin of the Los Angeles Neurological Society. 15 (2), 72-86 (1950).
- Drew, L. B., Drew, W. E. The contrecoup-coup phenomenon: a new understanding of the mechanism of closed head injury. Neurocritical Care. 1 (3), 385-390 (2004).
