Summary
本文介绍了一种合成脱细胞软骨细胞外基质（DC-ECM）水凝胶的新方法。DC-ECM水凝胶具有优异的生物相容性，为细胞生长提供了优越的微环境。因此，它们可以成为理想的细胞支架和生物递送系统。
Abstract
脱细胞软骨细胞外基质（DC-ECM）水凝胶因其生物相容性和模仿天然组织特性的能力而成为组织工程和再生医学的有前途的生物材料。该协议旨在产生与软骨组织的天然ECM非常相似的DC-ECM水凝胶。该方案涉及物理和化学破坏以及酶消化的组合，以去除细胞物质，同时保留ECM的结构和组成。DC-ECM使用化学试剂交联，形成稳定且具有生物活性的水凝胶。DC-ECM水凝胶具有优异的生物活性、空间结构和生物诱导功能，以及低免疫原性。这些特性有利于促进细胞粘附、增殖、分化和迁移，并为细胞生长创造优越的微环境。该协议为组织工程领域的研究人员和临床医生提供了宝贵的资源。仿生水凝胶可以潜在地促进软骨修复和再生的有效组织工程策略的开发。
Introduction
软骨组织工程是一个快速发展的领域，旨在再生受损或患病的软骨组织1。该领域的一个关键挑战是开发仿生支架，该支架可以支持软骨细胞的生长和分化，软骨细胞是负责产生软骨的细胞2。软骨组织的ECM在调节软骨细胞的行为中起着关键作用。DC-ECM 是组织工程应用的有效支架3.
已经开发了许多技术来从软骨组织生产 DC-ECM，包括化学、酶和物理方法。然而，这些方法通常会导致产生不充分仿生的ECM水凝胶，这限制了它们在组织工程应用中的潜力4,5。因此，需要一种更有效的方法来生产DC-ECM水凝胶。
这项技术的发展很重要，因为它可以通过提供一种新方法来创建可以支持组织再生和修复的仿生支架来推进组织工程领域。此外，该技术可以很容易地适应从其他组织生产ECM水凝胶，从而扩大其潜在应用。
在更广泛的文献中，人们对使用 DC-ECM 作为组织工程应用的支架越来越感兴趣6。大量研究表明，DC-ECM 水凝胶在促进各种组织（包括软骨）的细胞生长和分化方面是有效的 7,8。因此，开发一种用于生产与软骨组织天然ECM非常相似的DC-ECM水凝胶的方案是对该领域的重大贡献。
本文提出的方案通过提供一种生产DC-ECM水凝胶的新方法来解决这一需求，该水凝胶与软骨组织的天然ECM非常相似。该方案涉及使软骨组织脱细胞，分离所得的ECM，并通过将ECM与生物相容性聚合物交联来产生水凝胶。由此产生的水凝胶在支持软骨细胞的生长和分化方面显示出有希望的结果。
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Protocol
本研究经浙江省同德医院伦理委员会批准。
1. DC-ECM水凝胶的制备
注：在这项研究中，软骨是从12个月大的巴马微型猪的膝关节中获得的，避免了骨组织的收集。
- 取收集的软骨，用手术刀将其块状切成1-2毫米3 块。
- 将 20 g 切碎的软骨放入 50 mL 离心管中，并加入 20 mL 低渗 Tris-HCl 缓冲液（10 mM Tris-HCl，pH 8.0）以完全浸没组织。将离心管置于-80°C冰箱中3小时，然后在37°C烘箱中放置3小时。重复冷冻和加热步骤六次。在此步骤中，不需要更换低渗Tris-HCl缓冲液。
- 使用涡旋混合器以1,000rpm的速度摇动离心管30秒。将不锈钢筛（孔径：~250μm）放在新的50mL离心管上。
- 将脱细胞的软骨缓慢倒入不锈钢筛中，用无菌PBS洗涤组织三次，并收集软骨。
- 加入10mL胰蛋白酶溶液（0.25%胰蛋白酶的PBS溶液），并将试管置于37°C的振荡器上24小时。在此期间，每4小时更换一次胰蛋白酶。使用不锈钢筛过滤悬浮液，并保存组织。胰蛋白酶可以在其中一个消化过程中过夜处理，这不会影响最终消化。
- 用高渗缓冲液（1.5M NaCl，50mM Tris-HCl，pH 7.6）洗涤胰蛋白酶消化组织。
- 加入10mL核酸酶溶液（50U / mL脱氧核糖核酸酶和1U / mL核糖核酸酶在10mM Tris-HCl，pH 7.5中），并将管置于37°C的振荡器上4小时。
- 取出核酸酶溶液，用无菌PBS洗涤软骨三次，加入低渗Tris-HCl溶液。将离心管放在振荡器上，并在室温（RT）下冲洗20小时。
- 除去低渗Tris-HCl溶液，用无菌PBS洗涤软骨三次，并加入1%Triton X-100溶液将组织浸没24小时。
- 除去Triton X-100溶液，用蒸馏水彻底冲洗脱细胞软骨3天，每12小时更换一次蒸馏水。
- 将软骨浸泡在过氧乙酸溶液（0.1%PAA在4%乙醇中）中4小时。除去过氧乙酸溶液，用无菌蒸馏水洗涤软骨三次。
- 将不锈钢筛（孔径：~250μm）放在50mL离心管上。将脱细胞的软骨慢慢倒入不锈钢筛中，并收集软骨。通过估计 DNA、胶原蛋白和糖胺聚糖 （GAG） 含量来测试软骨的脱细胞程度和基质保留。
- 将脱细胞软骨放入研磨碗中，加入液氮，将脱细胞软骨研磨成粉末。取脱细胞软骨粉2g，加入0.5M乙酸80mL和胃蛋白酶20mg，消化24小时。以400× g 离心10分钟;弃去沉淀物，收集上清液（DC-ECM溶液）。
- 每孔倒入 1 mL DC-ECM 溶液到 6 孔板中。将 6 孔板放入冻干机中。冻结 DC-ECM 解决方案。一旦冷冻干燥机中的温度降至-40°C，打开真空泵，并将真空度保持在10Pa22小时。
- 取出冻干的DC-ECM溶液，将其置于离心管中，并储存在-20°C。 冻干DC-ECM溶液的最短储存期超过半年。
- 加入 1 mL 无菌蒸馏水，使 20 mg 冻干 DC-ECM 溶液溶解在离心管中。在室温下使用涡旋混合器以1,000rpm的速度摇动1分钟。 向DC-ECM溶液中加入1mg维生素B2（0.1%w / v），在37°C下孵育60分钟，并用紫外光（370nm，3.5mW / cm2）照射3分钟以形成水凝胶（DC-ECM水凝胶）。
2.脱细胞软骨的检测
- 脱细胞软骨的DNA含量检测
注意：使用DNEasy血液和组织试剂盒提取DNA。- 首先，在离心管中取 20 mg DC-ECM 软骨。通过涡旋振荡加入180μL缓冲液GTL和20μL蛋白酶K，并将软骨在56°C孵育4小时直至完全溶解。
- 使用涡旋混合器在室温下以1,000rpm的速度摇动离心管15秒。接下来，加入 200 μL 缓冲液 GL 和无水乙醇，并通过涡旋振动充分混合。在4°C下以6,000× g 的速度离心样品1分钟。
- 向吸附柱中加入500μL缓冲液GW1，并在4°C下以12,000× g 的速度离心样品1分钟。 向吸附柱中加入500μL缓冲液GW2，并在4°C下以20,000× g 离心1分钟。最后，向吸附柱中加入50μL灭菌水，并在4°C下以6,000× g 的速度离心1分钟以收集DNA溶液。使用分光光度计测定DNA含量。
- 脱细胞软骨中的胶原蛋白含量检测
- 为了检测脱细胞软骨中的胶原蛋白含量，使用羟脯氨酸作为胶原氨基酸标志物。在100°C下用5mL 6M盐酸酸化5mg脱细胞软骨20分钟，然后用5mL 6M氢氧化钠溶液中和。
- 通过用分光光度计测量样品在570nm处的吸光度来计算羟脯氨酸的含量。使用标准羟脯氨酸样品获得浓度吸收线性回归。
- 脱细胞软骨中的GAG含量检测
注：使用组织 GAG 比色定量检测试剂盒检测 DC-ECM 软骨中的 GAG 含量。试剂盒中提供了以下所有试剂。- 取 200 mg DC-ECM 软骨粉，涡旋振荡加入试剂 A 500 μL。将样品在4°C孵育16小时，然后以14,000× g 离心10分钟。
- 取试样溶液50 mL，涡旋振荡加高盐溶液（试剂B）50 μL和酸溶液（试剂C）50 μL。将样品孵育 10 分钟。
- 通过涡旋振荡加入 750 μL 染料溶液（试剂 D），并将样品在黑暗条件下孵育 30 分钟。将样品以14,000× g 离心10分钟，然后弃去上清液。
- 加入 1 μL 清洗液（试剂 E），并充分混合。将样品以14,000× g 离心10分钟，弃去上清液。
- 向样品中加入 1 μL 解离溶液（试剂 F），并充分混合。在黑暗条件下孵育样品30分钟。最后，使用600nm的分光光度计测定GAG含量。
- 扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）分析脱细胞软骨
- 比较脱细胞软骨和正常软骨组织。将样品置于2.5%戊二醛溶液中，在4°C下孵育过夜，然后用PBS洗涤三次。
- 将样品在1%OsO 4中固定1小时，然后用PBS洗涤3次。
- 通过依次浸入50%，70%，90%和100%乙醇以及100%丙酮中脱水15分钟。将样品置于六甲基二硅氮烷和乙醇（1：1）的混合溶液中15分钟，然后浸入纯六甲基二硅氮烷中15分钟。
- 将样品放入HCP-2干燥器中，然后使用液氮干燥。然后，使用溅射涂层在完全干燥的试样上涂上一层薄薄的金钯，并使用SEM成像。溅射镀膜以 120 W 的功率进行 5 min。实验在以下条件下进行：工作电压为15 kV，真空度低于5 x 10−5 Pa。
- 对于TEM分析，将样品置于无水丙酮和树脂（1：1）的混合物中1小时，然后将无水丙酮和树脂（1：3）的混合物中放置3小时。然后，将样品放入树脂中过夜。
- 将样品置于包埋的培养基填充胶囊中，并在70°C下加热9小时。
- 包埋后，使用超细切片机将标本切成70nm薄片，并放置在铜网上。
- 将 20 μL 醋酸铀酰染色溶液移液到铜网上，并在室温下染色 15 分钟，用蒸馏水轻轻洗涤网片两次，除去染色溶液。
- 然后，将 20 μL 柠檬酸铅染色溶液移液到铜网上，并在室温下染色 15 分钟，用蒸馏水洗涤网片 3 次。
- 将铜网放在衬有滤纸的干净培养皿上。风干后，使用TEM拍摄切片。探头向下施加500 nN的力，以1 Hz的速率扫描，弹性常数（k值）为40 Nm-1。测得探针尖端的半径为8 nm。
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Representative Results
为了制备更好的DC-ECM软骨水凝胶，我们研究并回顾了以前的文献，并在脱细胞率、免疫原性和机械功能方面比较了各种脱细胞方案9。
在此基础上，我们制备了DC-ECM软骨水凝胶，并探讨了径向取向提取基质/间充质干细胞外泌体生物墨水治疗骨软骨缺损的效果。结果表明，DC-ECM软骨水凝胶具有较低的免疫原性，可以增强细胞迁移，促进软骨修复10。
近年来，我们优化了DC-ECM软骨的制备。我们使用上述实验步骤制备脱细胞软骨。结果表明，与天然软骨相比，脱细胞软骨中的DNA含量被消除（p < 0.001， 图1A）。羟脯氨酸测试表明，天然软骨和脱细胞软骨之间的胶原蛋白含量相似（p = 0.48， 图1B）。DMMB测定表明，与天然软骨相比，糖胺聚糖在脱细胞软骨中保留良好（p = 0.68， 图1C）。此外，SEM和TEM用于观察DC-ECM的超微结构（图1D）。
为了制备DC-ECM水凝胶，将冻干的DC-ECM溶液溶解至终浓度为2wt%。此外，将DC-ECM溶液与VB2混合，然后进行UVA（370nm）诱导的交联（图2A）。我们将DC-ECM溶液和DC-ECM水凝胶放入微量离心管中（图2B）。当管子倒置时，管中的水凝胶没有流到底部，这是凝胶化的迹象。基于胶原蛋白自组装的DC-ECM溶液在37°C下没有交联剂的凝胶时间约为15分钟（图2C）。测试了DC-ECM溶液和水凝胶的粘度和动态模量。我们发现DC-ECM水凝胶的溶液粘度高于DC-ECM溶液，并且较高的剪切速率与较低的溶液粘度相关（图2D）。此外，DC-ECM溶液和水凝胶的储能模量都远高于损耗模量，表明它们都具有凝胶而不是液体的特性（图2E）。值得注意的是，在交联和冷冻干燥后，用SEM测量的DC-ECM溶液和DC-ECM水凝胶的孔径从137.672μm减小到37.936μm（p < 0.00195，图2F，G）。
图 1：脱细胞软骨的制备和表征。将脱细胞软骨与天然软骨进行比较。（空调）DNA、胶原蛋白和糖胺聚糖 （GAG） 含量的定量。n = 5，***p < 0.001（学生 t 检验）。所有实验至少进行三次。（D） 用 SEM 和 TEM 拍摄的天然软骨和脱细胞软骨的微观结构。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2：DC-ECM 水凝胶的制备和表征。 在紫外光下，DC-ECM溶液与VB2交联，形成DC-ECM水凝胶。（A）DC-ECM水凝胶的分子结构和合成。比较了DC-ECM溶液和DC-ECM水凝胶的外观、表征和力学性能。（B） 微量离心管中DC-ECM溶液和DC-ECM水凝胶的图像。（C）DC-ECM水凝胶和DC-ECM/VB2水凝胶的凝胶化时间。n = 3， ***p < 0.001（学生 t 检验）。（D） DC-ECM溶液和DC-ECM水凝胶的粘度和（E）动态模量。（F）DC-ECM溶液和水凝胶的微观结构（低倍率和高倍率）。比例尺 = 100 μm。 （G） DC-ECM 溶液和水凝胶的孔径。n = 5， ***p < 0.001（学生 t 检验）。所有实验至少进行三次。 请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
该方案为制备脱细胞软骨细胞外基质水凝胶提供了一种系统的方法，其紧密模拟软骨组织的天然ECM。该方案涉及物理、化学和酶促破坏的组合，以去除细胞物质，同时保留 ECM 的结构和组成。该协议的关键步骤包括调整脱细胞时间和方法，并确保完全脱细胞。
与其他现有的组织工程和再生医学方法相比，该协议具有几个优点。DC-ECM水凝胶具有优异的生物活性、空间结构和生物诱导功能，以及低免疫原性，这些特性有利于促进细胞粘附、增殖、分化和迁移11。DC-ECM水凝胶还可用于药物递送和软骨缺损治疗12。
可以对该协议进行的一项修改是使用不同的交联剂来增强水凝胶的机械性能。例如，纳米金属材料可用于改善水凝胶13的机械性能。此外，可以优化核黄素的浓度和暴露于紫外线的时间，以控制水凝胶的抗压强度和拉伸强度。
尽管具有许多优点，但这种技术有一些应考虑的局限性。一个局限性是脱细胞过程可能对ECM造成一些损害，导致其机械性能的变化14。另一个局限性是脱细胞过程可能无法完全去除所有抗原物质，从而导致潜在的免疫反应15。此外，需要注意的是，本文中描述的方案是特定于软骨组织的，其他类型的组织可能需要调整脱细胞方法。
就未来的应用而言，该协议可以进一步优化，以开发具有不同压缩和拉伸强度的DC-ECM水凝胶。此外，该技术可应用于其他组织，以开发用于组织工程和再生医学应用的仿生水凝胶。总体而言，本文中提出的方案为组织工程领域的研究人员和临床医生提供了宝贵的资源，并有可能促进软骨修复和再生的有效组织工程策略的开发。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
本工作由浙江省医药卫生科技计划（2019KY050）、浙江省中医药科技计划（2019ZA026）、浙江省重点研发计划（批准号：2020C03043）、浙江省中医药科技计划（2021ZQ021）和浙江省自然科学基金（LQ22H060007）资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M Tris-HCl, pH7.6 | Beyotime | ST776-100 mL | |
| 1 M Tris-HCl, pH8.0 | Beyotime | ST780-500 mL | |
| -80 °C Freezer | Eppendorf | F440340034 | |
| Deoxyribonuclease | Aladdin | D128600-80KU | |
| DNEasy Blood &Tissue Kit | Qiagen | No. 69506 | |
| GAG colorimetric quantitative detection kit | Shanghai Haling | HL19236.2 | |
| HCP-2 dryer | Hitachi | N/A | |
| Nanodrop8000 | Thermo Fisher | N/A | Spectrophotometer |
| PBS (10x) | Gibco | 70011044 | |
| Ribonuclease | Aladdin | R341325-100 mg | |
| Sigma500 | ZIESS | N/A | Scanning electron microscope |
| Spectra S | Thermo Fisher | N/A | Transmission electron microscope |
| Stainless steel sieve | SHXB-Z-1 | Shanghai Xinbu | |
| Triton X-100 | Beyotime | P0096-500 mL | |
| Trypsin | Gibco | 15050065 | |
| Ultraviolet lamp | Omnicure 2000 | N/A | |
| Vitamin B2 | Gibco | R4500-5G | |
| Vortex mixer | Shanghai Qiasen | 78HW-1 |
References
- Vega, S. L., Kwon, M. Y., Burdick, J. A. Recent advances in hydrogels for cartilage tissue engineering. European Cells & Materials. 33, 59-75 (2017).
- Yang, J., Zhang, Y. S., Yue, K., Khademhosseini, A. Cell-laden hydrogels for osteochondral and cartilage tissue engineering. Acta Biomaterialia. 57, 1-25 (2017).
- Bejleri, D., Davis, M. E. Decellularized extracellular matrix materials for cardiac repair and regeneration. Advanced Healthcare Materials. 8 (5), e1801217 (2019).
- Brown, M., Li, J., Moraes, C., Tabrizian, M., Li-Jessen, N. Y. K. Decellularized extracellular matrix: New promising and challenging biomaterials for regenerative medicine. Biomaterials. 289, 121786 (2022).
- Barbulescu, G. I., et al. Decellularized extracellular matrix scaffolds for cardiovascular tissue engineering: Current techniques and challenges. International Journal of Molecular Sciences. 23 (21), 13040 (2022).
- Zhang, W., Du, A., Liu, S., Lv, M., Chen, S. Research progress in decellularized extracellular matrix-derived hydrogels. Regenerative Therapy. 18, 88-96 (2021).
- Zhu, W., et al. Cell-derived decellularized extracellular matrix scaffolds for articular cartilage repair. International Journal of Artificial Organs. 44 (4), 269-281 (2021).
- Li, T., Javed, R., Ao, Q. Xenogeneic decellularized extracellular matrix-based biomaterials for peripheral nerve repair and regeneration. Current Neuropharmacology. 19 (12), 2152-2163 (2021).
- Xia, C., et al. Decellularized cartilage as a prospective scaffold for cartilage repair. Materials Science & Engineering C-Materials for Biological Applications. 101, 588-595 (2019).
- Chen, P., et al. Desktop-stereolithography 3D printing of a radially oriented extracellular matrix/mesenchymal stem cell exosome bioink for osteochondral defect regeneration. Theranostics. 9 (9), 2439-2459 (2019).
- Saldin, L. T., Cramer, M. C., Velankar, S. S., White, L. J., Badylak, S. F. Extracellular matrix hydrogels from decellularized tissues: Structure and function. Acta Biomaterialia. 49, 1-15 (2017).
- Yuan, X., et al. Stem cell delivery in tissue-specific hydrogel enabled meniscal repair in an orthotopic rat model. Biomaterials. 132, 59-71 (2017).
- Zheng, L., et al. Intensified stiffness and photodynamic provocation in a collagen-based composite hydrogel drive chondrogenesis. Advanced Science. 6 (16), 1900099 (2019).
- Young, J. L., Holle, A. W., Spatz, J. P.Nanoscale and mechanical properties of the physiological cell-ECM microenvironment. Experimental Cell Research. 343 (1), 3-6 (2016).
- Abdolghafoorian, H., et al. Effect of heart valve decellularization on xenograft rejection. Experimental and Clinical Transplantation. 15 (3), 329-336 (2017).
