Summary
यह पेपर डीसेल्युलराइज्ड कार्टिलेज एक्स्ट्रासेल्युलर मैट्रिक्स (डीसी-ईसीएम) हाइड्रोगेल के संश्लेषण के लिए एक नई विधि का परिचय देता है। डीसी-ईसीएम हाइड्रोगेल में उत्कृष्ट जैव-रासायनिकता है और सेल विकास के लिए एक बेहतर माइक्रोएन्वायरमेंट प्रदान करता है। इसलिए, वे आदर्श सेल स्काफोल्ड्स और जैविक वितरण प्रणाली हो सकते हैं।
Abstract
डीसेल्युलराइज्ड कार्टिलेज एक्स्ट्रासेल्युलर मैट्रिक्स (डीसी-ईसीएम) हाइड्रोगेल उनकी जैव-रासायनिकता और प्राकृतिक ऊतक गुणों की नकल करने की क्षमता के कारण ऊतक इंजीनियरिंग और पुनर्योजी चिकित्सा के लिए आशाजनक बायोमैटेरियल्स हैं। इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य डीसी-ईसीएम हाइड्रोगेल का उत्पादन करना है जो उपास्थि ऊतक के मूल ईसीएम की बारीकी से नकल करता है। प्रोटोकॉल में ईसीएम की संरचना और संरचना को संरक्षित करते हुए सेलुलर सामग्री को हटाने के लिए भौतिक और रासायनिक व्यवधान और एंजाइमेटिक पाचन का संयोजन शामिल है। डीसी-ईसीएम एक स्थिर और जैविक रूप से सक्रिय हाइड्रोगेल बनाने के लिए एक रासायनिक एजेंट का उपयोग करके क्रॉस-लिंक किया जाता है। डीसी-ईसीएम हाइड्रोगेल में उत्कृष्ट जैविक गतिविधि, स्थानिक संरचना और जैविक प्रेरण समारोह है, साथ ही साथ कम इम्युनोजेनेसिटी भी है। ये विशेषताएं सेल आसंजन, प्रसार, भेदभाव और प्रवासन को बढ़ावा देने और सेल विकास के लिए एक बेहतर माइक्रोएन्वायरमेंट बनाने के लिए फायदेमंद हैं। यह प्रोटोकॉल ऊतक इंजीनियरिंग के क्षेत्र में शोधकर्ताओं और चिकित्सकों के लिए एक मूल्यवान संसाधन प्रदान करता है। बायोमिमेटिक हाइड्रोगेल संभावित रूप से उपास्थि की मरम्मत और पुनर्जनन के लिए प्रभावी ऊतक इंजीनियरिंग रणनीतियों के विकास को बढ़ा सकते हैं।
Introduction
उपास्थि ऊतक इंजीनियरिंग एक तेजी से विकासशील क्षेत्र है जो क्षतिग्रस्त या रोगग्रस्त उपास्थि ऊतक1 को पुनर्जीवित करना चाहता है। इस क्षेत्र में एक महत्वपूर्ण चुनौती बायोमिमेटिक स्काफोल्ड्स का विकास है जो चोंड्रोसाइट्स के विकास और भेदभाव का समर्थन कर सकता है, उपास्थि2 के उत्पादन के लिए जिम्मेदार कोशिकाएं। उपास्थि ऊतक का ईसीएम चोंड्रोसाइट्स के व्यवहार को विनियमित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। डीसी-ईसीएम ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों के लिए एक प्रभावी मचानहै।
उपास्थि ऊतक से डीसी-ईसीएम का उत्पादन करने के लिए कई तकनीकों का विकास किया गया है, जिसमें रासायनिक, एंजाइमेटिक और भौतिक तरीके शामिल हैं। हालांकि, इन विधियों के परिणामस्वरूप अक्सर ईसीएम हाइड्रोगेल की पीढ़ी होती है जो अपर्याप्त रूप से बायोमिमेटिक होते हैं, जो ऊतकइंजीनियरिंग अनुप्रयोगों 4,5 में उपयोग के लिए उनकी क्षमता को सीमित करता है। इस प्रकार, डीसी-ईसीएम हाइड्रोगेल के उत्पादन के लिए अधिक प्रभावी विधि की आवश्यकता है।
इस तकनीक का विकास महत्वपूर्ण है क्योंकि यह बायोमिमेटिक स्काफोल्ड्स बनाने के लिए एक नया दृष्टिकोण प्रदान करके ऊतक इंजीनियरिंग के क्षेत्र को आगे बढ़ा सकता है जो ऊतक पुनर्जनन और मरम्मत का समर्थन कर सकता है। इसके अलावा, इस तकनीक को आसानी से अन्य ऊतकों से ईसीएम हाइड्रोगेल का उत्पादन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, जिससे इसके संभावित अनुप्रयोगों का विस्तार होता है।
साहित्य के व्यापक निकाय में, ऊतकइंजीनियरिंग अनुप्रयोगों के लिए एक मचान के रूप में डीसी-ईसीएम का उपयोग करने में रुचि बढ़ रही है। कई अध्ययनों ने उपास्थि 7,8 सहित विभिन्न ऊतकों में सेल विकास और भेदभाव को बढ़ावा देने में डीसी-ईसीएम हाइड्रोगेल की प्रभावशीलता का प्रदर्शन किया है। इसलिए, डीसी-ईसीएम हाइड्रोगेल के उत्पादन के लिए एक प्रोटोकॉल का विकास जो उपास्थि ऊतक के प्राकृतिक ईसीएम की बारीकी से नकल करता है, क्षेत्र में एक महत्वपूर्ण योगदान है।
इस पेपर में प्रस्तुत प्रोटोकॉल डीसी-ईसीएम हाइड्रोगेल के उत्पादन के लिए एक नई विधि प्रदान करके इस आवश्यकता को संबोधित करता है जो उपास्थि ऊतक के प्राकृतिक ईसीएम की बारीकी से नकल करता है। प्रोटोकॉल में उपास्थि ऊतक को विघटित करना, परिणामस्वरूप ईसीएम को अलग करना और ईसीएम को जैव-संगत बहुलक के साथ क्रॉस-लिंक करके एक हाइड्रोगेल बनाना शामिल है। परिणामी हाइड्रोगेल ने चोंड्रोसाइट्स के विकास और भेदभाव का समर्थन करने में आशाजनक परिणाम दिखाए हैं।
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Protocol
इस अध्ययन को झेजियांग प्रांत के टोंगडे अस्पताल की आचार समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था।
1. डीसी-ईसीएम हाइड्रोगेल की तैयारी
नोट: इस अध्ययन में, हड्डी के ऊतकों के संग्रह से बचते हुए, 12 महीने के बामा लघु सूअरों के घुटने के जोड़ों से उपास्थि प्राप्त की गई थी।
- एकत्रित उपास्थि लें, और इसे ब्लॉक करें और स्केलपेल के साथ 1-2 मिमी3 टुकड़ों में काट लें।
- 50 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 20 ग्राम कीमा कार्टिलेज रखें, और ऊतक को पूरी तरह से जलमग्न करने के लिए 20 एमएल हाइपोटोनिक ट्रिस-एचसीएल बफर (10 एमएम ट्रिस-एचसीएल, पीएच 8.0) जोड़ें। सेंट्रीफ्यूज ट्यूब को 3 घंटे के लिए -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में रखें और फिर 3 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस ओवन में रखें। ठंड और हीटिंग चरण को छह बार दोहराएं। इस चरण में, हाइपोटोनिक ट्रिस-एचसीएल बफर को प्रतिस्थापन की आवश्यकता नहीं है।
- 1,000 आरपीएम की गति से भंवर मिक्सर का उपयोग करके सेंट्रीफ्यूज ट्यूब को 30 सेकंड के लिए हिलाएं। एक नए 50 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब पर एक स्टेनलेस-स्टील चलनी (छिद्र आकार: ~ 250 μm) रखें।
- धीरे-धीरे डीसेल्युलराइज्ड कार्टिलेज को स्टेनलेस-स्टील छलनी में डालें, ऊतक को बाँझ पीबीएस के साथ तीन बार धोएं, और उपास्थि को इकट्ठा करें।
- ट्रिप्सिन समाधान के 10 एमएल (पीबीएस में 0.25% ट्रिप्सिन) जोड़ें, और ट्यूब को 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर शेकर पर रखें। इस अवधि के दौरान, हर 4 घंटे में ट्रिप्सिन बदलें। स्टेनलेस-स्टील छलनी का उपयोग करके निलंबन को फ़िल्टर करें, और ऊतक को संरक्षित करें। पाचन प्रक्रियाओं में से एक के दौरान ट्रिप्सिन का रात भर इलाज किया जा सकता है, और यह अंतिम पाचन को प्रभावित नहीं करेगा।
- ट्रिप्सिनयुक्त ऊतक को हाइपरटोनिक बफर (1.5 एम एनएसीएल, 50 एमएम ट्रिस-एचसीएल, पीएच 7.6) के साथ धोएं।
- 10 एमएल न्यूक्लियस घोल (50 यू / एमएल डीऑक्सीराइबोन्यूक्लिज़ और 1 यू / एमएल राइबोन्यूक्लिज़ को 10 एमएम ट्रिस-एचसीएल, पीएच 7.5 में जोड़ें), और ट्यूब को 4 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर शेकर पर रखें।
- न्यूक्लियस समाधान को हटा दें, उपास्थि को बाँझ पीबीएस के साथ तीन बार धोएं, और हाइपोटोनिक ट्रिस-एचसीएल समाधान जोड़ें। सेंट्रीफ्यूज ट्यूब को शेकर पर रखें, और कमरे के तापमान (आरटी) पर 20 घंटे के लिए कुल्ला करें।
- हाइपोटोनिक ट्रिस-एचसीएल समाधान को हटा दें, उपास्थि को बाँझ पीबीएस के साथ तीन बार धोएं, और 24 घंटे के लिए ऊतक को जलमग्न करने के लिए 1% ट्राइटन एक्स -100 समाधान जोड़ें।
- ट्राइटन एक्स -100 समाधान को हटा दें, और 3 दिनों के लिए आसुत पानी के साथ डिसेल्यूलराइज्ड कार्टिलेज को अच्छी तरह से कुल्ला करें, हर 12 घंटे में आसुत पानी को बदलें।
- कार्टिलेज को पेरासिटिक एसिड घोल (4% इथेनॉल में 0.1% पीएए) में 4 घंटे के लिए भिगोदें। पेरासिटिक एसिड के घोल को हटा दें, और कार्टिलेज को बाँझ आसुत जल से तीन बार धोएं।
- स्टेनलेस-स्टील चलनी (छिद्र आकार: ~ 250 μm) को 50 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब पर रखें। धीरे-धीरे डीसेल्युलराइज्ड कार्टिलेज को स्टेनलेस-स्टील की छलनी में डालें, और उपास्थि को इकट्ठा करें। डीएनए, कोलेजन और ग्लाइकोसामिनोग्लाइकन (जीएजी) सामग्री का अनुमान लगाकर उपास्थि के विकोशिकीयकरण और मैट्रिक्स प्रतिधारण की डिग्री का परीक्षण करें।
- डीसेल्युलराइज्ड कार्टिलेज को पीसने के कटोरे में डालें, तरल नाइट्रोजन जोड़ें, और पाउडर बनाने के लिए डीसेल्युलराइज्ड कार्टिलेज को पीस लें। डीसेल्युलराइज्ड कार्टिलेज पाउडर के 2 ग्राम लें, 0.5 एम एसिटिक एसिड और 20 मिलीग्राम पेप्सिन के 80 एमएल जोड़ें, और 24 घंटे के लिए पचाएं। 10 मिनट के लिए 400 x g पर सेंट्रीफ्यूज; तलछट को त्याग दें, और सतह पर तैरनेवाला समाधान (डीसी-ईसीएम समाधान) एकत्र करें।
- डीसी-ईसीएम घोल के 1 मिलीलीटर को 6-वेल प्लेटों में विभाजित करें। 6-वेल प्लेटों को एक लियोफिलाइज़र में रखें। DC-ECM समाधान को फ्रीज करें। एक बार फ्रीज-ड्रायर में तापमान -40 डिग्री सेल्सियस तक गिर जाने के बाद, वैक्यूम पंप चालू करें, और वैक्यूम डिग्री को 22 घंटे के लिए 10 पीए पर बनाए रखें।
- फ्रीज-सूखे डीसी-ईसीएम समाधान को बाहर निकालें, इसे सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में रखें, और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। फ्रीज-सूखे डीसी-ईसीएम समाधान की न्यूनतम भंडारण अवधि आधे वर्ष से अधिक है।
- सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 20 मिलीग्राम फ्रीज-सूखे डीसी-ईसीएम समाधान को भंग करने के लिए बाँझ आसुत जल के 1 मिलीलीटर जोड़ें। आरटी पर 1,000 आरपीएम की गति से एक भंवर मिक्सर का उपयोग करके 1 मिनट के लिए हिलाएं। डीसी-ईसीएम समाधान में 1 मिलीग्राम विटामिन बी 2 (0.1% डब्ल्यू / वी) जोड़ें, 60 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें, और हाइड्रोगेल (डीसी-ईसीएम हाइड्रोजेल) बनाने के लिए 3 मिनट के लिए यूवी प्रकाश (370 एनएम, 3.5 एमडब्ल्यू / सेमी2) के साथ विकिरणित करें।
2. विकोशिकीय उपास्थि का पता लगाना
- "डीसेल्युलराइज्ड कार्टिलेज की डीएनए सामग्री का पता लगाना"।
नोट: DNEAasi रक्त और ऊतक किट का उपयोग कर डीएनए निकालें।- सबसे पहले, एक सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 20 मिलीग्राम डीसी-ईसीएम उपास्थि लें। भंवर दोलन द्वारा 180 μL बफर GTL और 20 μL प्रोटीनेस K जोड़ें, और उपास्थि को 4 घंटे के लिए 56 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें जब तक कि यह पूरी तरह से घुल न जाए।
- आरटी पर 1,000 आरपीएम की गति से भंवर मिक्सर का उपयोग करके सेंट्रीफ्यूज ट्यूब को 15 सेकंड के लिए हिलाएं। इसके बाद, बफर जीएल और निर्जल इथेनॉल के 200 μL जोड़ें, और भंवर कंपन द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं। 4 डिग्री सेल्सियस पर 6,000 x g की गति से 1 मिनट के लिए नमूने को सेंट्रीफ्यूज करें।
- सोखना कॉलम में बफर जीडब्ल्यू 1 के 500 μL जोड़ें, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 12,000 x g की गति से 1 मिनट के लिए नमूने को सेंट्रीफ्यूज करें। सोखना कॉलम में बफर जीडब्ल्यू 2 के 500 μL जोड़ें, और 1 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 20,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें। अंत में, सोखना स्तंभ में 50 μL निष्फल पानी जोड़ें, और डीएनए समाधान एकत्र करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 6,000 x g की गति से 1 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज करें। स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके डीएनए सामग्री निर्धारित करें।
- डीसेल्युलराइज्ड कार्टिलेज में कोलेजन सामग्री का पता लगाना
- डीसेल्युलराइज्ड कार्टिलेज में कोलेजन सामग्री का पता लगाने के लिए, कोलेजन अमीनो एसिड मार्कर के रूप में हाइड्रॉक्सीप्रोलाइन का उपयोग करें। 20 मिनट के लिए 100 डिग्री सेल्सियस पर 6 एम हाइड्रोक्लोरिक एसिड के 5 मिलीलीटर के साथ 5 मिलीग्राम डीसेल्युलराइज्ड कार्टिलेज को अम्लीय करें, और फिर इसे 6 एम सोडियम हाइड्रॉक्साइड समाधान के 5 एमएल के साथ बेअसर करें।
- स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के साथ 570 एनएम पर नमूने के अवशोषण को मापकर हाइड्रॉक्सीप्रोलाइन की सामग्री की गणना करें। मानक हाइड्रॉक्सीप्रोलाइन नमूने का उपयोग करके एकाग्रता-अवशोषण रैखिक प्रतिगमन प्राप्त करें।
- डीसेल्यूलराइज्ड कार्टिलेज में जीएजी सामग्री का पता लगाना।
नोट: डीसी-ईसीएम उपास्थि में जीएजी सामग्री का पता एक ऊतक जीएजी कलरिमेट्रिक मात्रात्मक पहचान किट का उपयोग करके लगाया गया था। नीचे दिए गए सभी अभिकर्मक किट में उपलब्ध हैं।- 200 मिलीग्राम डीसी-ईसीएम कार्टिलेज पाउडर लें, और भंवर दोलन द्वारा अभिकर्मक ए के 500 μL जोड़ें। 16 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूने को इनक्यूबेट करें, और फिर 10 मिनट के लिए 14,000 एक्स जी पर सेंट्रीफ्यूज करें।
- नमूना समाधान के 50 मिलीलीटर लें, और भंवर दोलन द्वारा 50 μL उच्च नमक समाधान (अभिकर्मक बी) और 50 μL एसिड समाधान (अभिकर्मक सी) जोड़ें। 10 मिनट के लिए नमूने को इनक्यूबेट करें।
- भंवर दोलन द्वारा डाई समाधान (अभिकर्मक डी) के 750 μL जोड़ें, और अंधेरे परिस्थितियों में 30 मिनट के लिए नमूने को इनक्यूबेट करें। 10 मिनट के लिए 14,000 x g पर नमूने को सेंट्रीफ्यूज करें, और फिर सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें।
- 1 μL सफाई समाधान (अभिकर्मक E) जोड़ें, और अच्छी तरह मिलाएँ। 10 मिनट के लिए 14,000 x g पर नमूने को सेंट्रीफ्यूज करें, और सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें।
- नमूने में 1 μL पृथक्करण समाधान (अभिकर्मक F) जोड़ें, और अच्छी तरह मिलाएं। अंधेरे परिस्थितियों में 30 मिनट के लिए नमूने को इनक्यूबेट करें। अंत में, 600 एनएम पर स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके जीएजी सामग्री निर्धारित करें।
- स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (एसईएम) और ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (टीईएम) डीसेल्युलराइज्ड कार्टिलेज का विश्लेषण
- विकोशिकीय उपास्थि और सामान्य उपास्थि ऊतक की तुलना करें। नमूने को 2.5% ग्लूटार्ल्डिहाइड समाधान में रखें, रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें और फिर पीबीएस से तीन बार धो लें।
- नमूने को 1 घंटे के लिए 1% ओएसओ 4 में ठीक करें, और फिर पीबीएस के साथ तीन बार धो लें।
- 50%, 70%, 90%, और 100% इथेनॉल में अनुक्रमिक विसर्जन द्वारा नमूने को निर्जलित करें, साथ ही प्रत्येक 15 मिनट के लिए 100% एसीटोन। नमूने को 15 मिनट के लिए हेक्सामेथिलडिसिलाज़ेन और इथेनॉल (1: 1) के मिश्रित घोल में रखें, इसके बाद 15 मिनट के लिए शुद्ध हेक्सामेथिलडिसिलाज़ेन में विसर्जन करें।
- नमूने को एचसीपी -2 ड्रायर में रखें, और फिर तरल नाइट्रोजन का उपयोग करके सुखाएं। फिर, पूरी तरह से सूखे नमूने को स्पटर कोटिंग का उपयोग करके सोने-पैलेडियम की एक पतली परत के साथ कोट करें, और एसईएम का उपयोग करके छवि बनाएं। स्पटर कोटिंग 5 मिनट के लिए 120 डब्ल्यू की शक्ति पर की गई थी। प्रयोग निम्नलिखित स्थितियों के तहत किया गया था: 15 केवी का एक कामकाजी वोल्टेज, और 5 x 10−5 पीए से कम वैक्यूम डिग्री।
- टीईएम विश्लेषण के लिए, नमूने को 1 घंटे के लिए निर्जल एसीटोन और राल (1: 1) के मिश्रण में रखें, इसके बाद 3 घंटे के लिए निर्जल एसीटोन और राल (1: 3) का मिश्रण करें। फिर, नमूने को राल में रात भर रखें।
- नमूने को मध्यम से भरे कैप्सूल एम्बेड करने में रखें, और 9 घंटे के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करें।
- एम्बेड करने के बाद, एक अल्ट्राफाइन माइक्रोटोम का उपयोग करके नमूने को 70 एनएम पतले स्लाइस में काट लें, और तांबे की जाली पर रखें।
- पाइपेट 20 μL यूरिनल एसीटेट घोल को तांबे की जाली पर चिपकाएं, और आरटी पर 15 मिनट के लिए दाग दें। आसुत जल के साथ जाल को दो बार धीरे से धोकर धुंधला घोल हटा दें।
- फिर, तांबे की जाली पर 20 μL लेड साइट्रेट घोल डालें, और आरटी पर 15 मिनट के लिए दाग दें। आसुत जल से जाल को तीन बार धोएं।
- तांबे की जाली को फिल्टर पेपर के साथ पंक्तिबद्ध एक साफ पेट्री डिश पर रखें। हवा में सुखाने के बाद, टीईएम का उपयोग करके अनुभागों की तस्वीर लें। जांच को 500 nN के नीचे की ओर बल के साथ लागू किया गया था, 1 हर्ट्ज की दर से स्कैन किया गया था, और इसमें 40 एनएम -1 का लोचदार स्थिरांक (के-मान) था। जांच टिप की त्रिज्या 8 एनएम मापी गई थी।
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Representative Results
एक बेहतर डीसी-ईसीएम कार्टिलेज हाइड्रोगेल तैयार करने के लिए, हमने पिछले साहित्य का अध्ययन और समीक्षा की और डीसेल्युलराइजेशन अनुपात, इम्युनोजेनेसिटी और यांत्रिक कार्यक्षमता9 के संदर्भ में विभिन्न डीसेलुलराइजेशन प्रोटोकॉल की तुलना की।
इस आधार पर, हमने डीसी-ईसीएम कार्टिलेज हाइड्रोगेल तैयार किया और ओस्टियोकॉन्ड्रल दोषों के इलाज में रेडियल रूप से उन्मुख एक्सट्रेक्टिव मैट्रिक्स / मेसेनकाइमल स्टेम सेल एक्सोसोम बायो-इंक के प्रभाव का पता लगाया। परिणामों से पता चला है कि डीसी-ईसीएम कार्टिलेज हाइड्रोगेल में कम इम्युनोजेनेसिटी थी और सेल माइग्रेशन को बढ़ा सकती है और कार्टिलेज की मरम्मतको बढ़ावा दे सकती है।
हाल के वर्षों में, हमने डीसी-ईसीएम उपास्थि की तैयारी को अनुकूलित किया है। हमने उपरोक्त प्रयोगात्मक चरणों का उपयोग करके विकोशिकीय उपास्थि तैयार की। परिणामों से पता चला कि देशी उपास्थि (पी < 0.001, चित्रा 1 ए) की तुलना में डीसेल्युलराइज्ड कार्टिलेज में डीएनए सामग्री समाप्त हो गई थी। हाइड्रॉक्सीप्रोलाइन परीक्षण ने संकेत दिया कि कोलेजन सामग्री देशी और विकोशिकीय उपास्थि (पी = 0.48, चित्रा 1 बी) के बीच समान थी। डीएमएमबी परख से पता चला है कि ग्लाइकोसामिनोग्लाइकन देशी उपास्थि (पी = 0.68, चित्रा 1 सी) की तुलना में डीसेल्युलराइज्ड कार्टिलेज में अच्छी तरह से बरकरार था। इसके अलावा, एसईएम और टीईएम का उपयोग डीसी-ईसीएम (चित्रा 1 डी) की अल्ट्रास्ट्रक्चर का निरीक्षण करने के लिए किया गया था।
डीसी-ईसीएम हाइड्रोगेल तैयार करने के लिए, फ्रीज-सूखे डीसी-ईसीएम समाधान को 2 डब्ल्यूटी% की अंतिम एकाग्रता के लिए घुलनशील किया गया था। इसके अलावा, डीसी-ईसीएम समाधान को वीबी 2 के साथ मिलाया गया था, इसके बाद यूवीए (370 एनएम) -प्रेरित क्रॉस-लिंकिंग (चित्रा 2 ए)। हमने डीसी-ईसीएम समाधान और डीसी-ईसीएम हाइड्रोगेल को माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों (चित्रा 2 बी) में रखा। जब ट्यूबों को उल्टा किया जाता था, तो ट्यूबों में हाइड्रोगेल नीचे की ओर नहीं बहता था, जो गेलेशन का संकेत था। क्रॉस-लिंकिंग एजेंट के बिना 37 डिग्री सेल्सियस पर कोलेजन स्व-असेंबली पर आधारित डीसी-ईसीएम समाधान के लिए गेलेशन समय लगभग 15 मिनट था (चित्रा 2 सी)। डीसी-ईसीएम समाधान और हाइड्रोगेल की चिपचिपाहट और गतिशील मापांक का परीक्षण किया गया था। हमने पाया कि डीसी-ईसीएम हाइड्रोगेल की समाधान चिपचिपाहट डीसी-ईसीएम समाधान की तुलना में अधिक थी, और उच्च कतरनी दर कम समाधान चिपचिपाहट (चित्रा 2 डी) से जुड़ी थी। इसके अलावा, डीसी-ईसीएम समाधान और हाइड्रोगेल दोनों का भंडारण मापांक हानि मापांक की तुलना में बहुत अधिक था, यह दर्शाता है कि उन दोनों में तरल के बजाय जेल के गुण थे (चित्रा 2 ई)। विशेष रूप से, क्रॉस-लिंकिंग और फ्रीज-सुखाने के बाद, एसईएम के साथ मापा गया डीसी-ईसीएम समाधान और डीसी-ईसीएम हाइड्रोगेल का छिद्र आकार 137.672 μm से घटकर 37.936 μm (p < 0.00195, चित्रा 2F, G) हो गया।
चित्रा 1: विकोशिकीय उपास्थि की तैयारी और लक्षण वर्णन। डीसेल्युलराइज्ड कार्टिलेज की तुलना देशी उपास्थि के साथ की गई थी। (A-C) डीएनए, कोलेजन और ग्लाइकोसामिनोग्लाइकन (जीएजी) सामग्री का परिमाणीकरण। n = 5, ***p < 0.001 (छात्र का टी-टेस्ट)। सभी प्रयोग कम से कम तीन बार किए गए थे। (डी) एसईएम और टीईएम के साथ फोटो खिंचवाने वाले देशी उपास्थि और विकोशिकीय उपास्थि की सूक्ष्म संरचनाएं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2: डीसी-ईसीएम हाइड्रोगेल की तैयारी और लक्षण वर्णन। पराबैंगनी प्रकाश के तहत, डीसी-ईसीएम समाधान और वीबी 2 क्रॉस-लिंक किए गए और डीसी-ईसीएम हाइड्रोगेल का गठन किया गया। (ए) डीसी-ईसीएम हाइड्रोगेल की अणु संरचनाएं और संश्लेषण। उपस्थिति, लक्षण वर्णन और यांत्रिक गुणों की तुलना डीसी-ईसीएम समाधान और डीसी-ईसीएम हाइड्रोगेल के बीच की गई थी। (बी) माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में डीसी-ईसीएम समाधान और डीसी-ईसीएम हाइड्रोगेल की छवियां। (सी) डीसी-ईसीएम हाइड्रोगेल और डीसी-ईसीएम/वीबी 2 हाइड्रोजेल का गेलेशन समय। n = 3, *** p < 0.001 (छात्र का टी-टेस्ट)। (डी) डीसी-ईसीएम समाधान और डीसी-ईसीएम हाइड्रोगेल की चिपचिपाहट और (ई) गतिशील मापांक। (एफ) डीसी-ईसीएम समाधान और हाइड्रोगेल (कम और उच्च आवर्धन) की सूक्ष्म संरचनाएं। स्केल बार = 100 μm. (G) DC-ECM समाधान और हाइड्रोगेल के छिद्र आकार। एन = 5, *** पी < 0.001 (छात्र का टी-टेस्ट)। सभी प्रयोग कम से कम तीन बार किए गए थे। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
यह प्रोटोकॉल विकोशिकीय उपास्थि बाह्य मैट्रिक्स हाइड्रोगेल की तैयारी के लिए एक व्यवस्थित दृष्टिकोण प्रदान करता है जो उपास्थि ऊतक के मूल ईसीएम की बारीकी से नकल करता है। प्रोटोकॉल में ईसीएम की संरचना और संरचना को संरक्षित करते हुए सेलुलर सामग्री को हटाने के लिए भौतिक, रासायनिक और एंजाइमेटिक व्यवधान का संयोजन शामिल है। प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण चरणों में डीसेल्युलराइजेशन समय और विधियों को समायोजित करना और पूर्ण डीसेलुलराइजेशन सुनिश्चित करना शामिल है।
ऊतक इंजीनियरिंग और पुनर्योजी चिकित्सा के लिए अन्य मौजूदा तरीकों की तुलना में, यह प्रोटोकॉल कई फायदे प्रदान करता है। डीसी-ईसीएम हाइड्रोगेल में उत्कृष्ट जैविक गतिविधि, स्थानिक संरचना और जैविक प्रेरण समारोह है, साथ ही साथ कम इम्युनोजेनेसिटी भी है, और ये विशेषताएं सेल आसंजन, प्रसार, भेदभाव और प्रवासनको बढ़ावा देने में फायदेमंद हैं। डीसी-ईसीएम हाइड्रोगेल का उपयोग दवा वितरण और उपास्थि दोष उपचारके लिए भी किया जा सकता है।
एक संशोधन जो इस प्रोटोकॉल में किया जा सकता है वह हाइड्रोगेल के यांत्रिक गुणों को बढ़ाने के लिए विभिन्न क्रॉस-लिंकिंग एजेंटों का उपयोग है। उदाहरण के लिए, हाइड्रोगेल13 के यांत्रिक गुणों को बेहतर बनाने के लिए नैनो-धातु सामग्री का उपयोग किया जा सकता है। इसके अलावा, राइबोफ्लेविन की एकाग्रता और यूवी प्रकाश के संपर्क समय को हाइड्रोगेल की संपीड़ित और तन्यता शक्तियों को नियंत्रित करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
इसके कई फायदों के बावजूद, इस तकनीक की कुछ सीमाएं हैं जिन पर विचार किया जाना चाहिए। एक सीमा यह है कि विकोशिकीयकरण प्रक्रिया ईसीएम को कुछ नुकसान पहुंचा सकती है, जिससे इसकेयांत्रिक गुणों में परिवर्तन हो सकता है। एक और सीमा यह है कि डीसेलुलराइजेशन प्रक्रिया सभी एंटीजेनिक सामग्री को पूरी तरह से हटा नहीं सकती है, जिससे संभावित प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया15 हो सकती है। इसके अलावा, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि इस पेपर में वर्णित प्रोटोकॉल उपास्थि ऊतक के लिए विशिष्ट है, और अन्य प्रकार के ऊतकों को डीसेलुलराइजेशन विधि में समायोजन की आवश्यकता हो सकती है।
भविष्य के अनुप्रयोगों के संदर्भ में, इस प्रोटोकॉल को विभिन्न संपीड़ित और तन्यता शक्तियों के साथ डीसी-ईसीएम हाइड्रोगेल विकसित करने के लिए और अनुकूलित किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, इस तकनीक को ऊतक इंजीनियरिंग और पुनर्योजी चिकित्सा अनुप्रयोगों के लिए बायोमिमेटिक हाइड्रोगेल विकसित करने के लिए अन्य ऊतकों पर लागू किया जा सकता है। कुल मिलाकर, इस पेपर में प्रस्तुत प्रोटोकॉल ऊतक इंजीनियरिंग के क्षेत्र में शोधकर्ताओं और चिकित्सकों के लिए एक मूल्यवान संसाधन प्रदान करता है और उपास्थि की मरम्मत और पुनर्जनन के लिए प्रभावी ऊतक इंजीनियरिंग रणनीतियों के विकास को बढ़ाने की क्षमता रखता है।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
यह काम झेजियांग प्रांत की चिकित्सा और स्वास्थ्य प्रौद्योगिकी योजना (2019KY050), झेजियांग प्रांत की पारंपरिक चीनी चिकित्सा विज्ञान और प्रौद्योगिकी योजना (2019ZA026), झेजियांग प्रांत में प्रमुख अनुसंधान और विकास योजना (अनुदान संख्या 2020C03043), झेजियांग प्रांत की पारंपरिक चीनी चिकित्सा विज्ञान और प्रौद्योगिकी योजना (2021ZQ021), और झेजियांग प्रांतीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (LQ22H060007) द्वारा प्रायोजित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M Tris-HCl, pH7.6 | Beyotime | ST776-100 mL | |
| 1 M Tris-HCl, pH8.0 | Beyotime | ST780-500 mL | |
| -80 °C Freezer | Eppendorf | F440340034 | |
| Deoxyribonuclease | Aladdin | D128600-80KU | |
| DNEasy Blood &Tissue Kit | Qiagen | No. 69506 | |
| GAG colorimetric quantitative detection kit | Shanghai Haling | HL19236.2 | |
| HCP-2 dryer | Hitachi | N/A | |
| Nanodrop8000 | Thermo Fisher | N/A | Spectrophotometer |
| PBS (10x) | Gibco | 70011044 | |
| Ribonuclease | Aladdin | R341325-100 mg | |
| Sigma500 | ZIESS | N/A | Scanning electron microscope |
| Spectra S | Thermo Fisher | N/A | Transmission electron microscope |
| Stainless steel sieve | SHXB-Z-1 | Shanghai Xinbu | |
| Triton X-100 | Beyotime | P0096-500 mL | |
| Trypsin | Gibco | 15050065 | |
| Ultraviolet lamp | Omnicure 2000 | N/A | |
| Vitamin B2 | Gibco | R4500-5G | |
| Vortex mixer | Shanghai Qiasen | 78HW-1 |
References
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