Summary
En este trabajo se presenta un nuevo método para la síntesis de hidrogeles de matriz extracelular de cartílago descelularizado (DC-ECM). Los hidrogeles DC-ECM tienen una excelente biocompatibilidad y proporcionan un microambiente superior para el crecimiento celular. Por lo tanto, pueden ser andamios celulares ideales y sistemas de administración biológica.
Abstract
Los hidrogeles de matriz extracelular de cartílago descelularizado (DC-ECM) son biomateriales prometedores para la ingeniería de tejidos y la medicina regenerativa debido a su biocompatibilidad y capacidad para imitar las propiedades naturales de los tejidos. Este protocolo tiene como objetivo producir hidrogeles DC-ECM que imiten de cerca la ECM nativa del tejido cartilaginoso. El protocolo implica una combinación de disrupción física y química y digestión enzimática para eliminar el material celular mientras se preserva la estructura y composición de la MEC. El DC-ECM se reticula utilizando un agente químico para formar un hidrogel estable y biológicamente activo. El hidrogel DC-ECM tiene una excelente actividad biológica, estructura espacial y función de inducción biológica, así como baja inmunogenicidad. Estas características son beneficiosas para promover la adhesión, proliferación, diferenciación y migración celular y para crear un microambiente superior para el crecimiento celular. Este protocolo proporciona un recurso valioso para investigadores y clínicos en el campo de la ingeniería de tejidos. Los hidrogeles biomiméticos pueden mejorar potencialmente el desarrollo de estrategias efectivas de ingeniería de tejidos para la reparación y regeneración del cartílago.
Introduction
La ingeniería de tejidos cartilaginosos es un campo en rápido desarrollo que busca regenerar el tejido cartilaginoso dañado o enfermo1. Un desafío clave en este campo es el desarrollo de andamios biomiméticos que puedan apoyar el crecimiento y la diferenciación de los condrocitos, las células responsables de la producción de cartílago2. La MEC del tejido cartilaginoso desempeña un papel fundamental en la regulación del comportamiento de los condrocitos. DC-ECM es un andamio eficaz para aplicaciones de ingeniería de tejidos3.
Se han desarrollado varias técnicas para producir DC-ECM a partir de tejido cartilaginoso, incluidos métodos químicos, enzimáticos y físicos. Sin embargo, estos métodos a menudo resultan en la generación de hidrogeles ECM que no son lo suficientemente biomiméticos, lo que limita su potencial para su uso en aplicaciones de ingeniería de tejidos 4,5. Por lo tanto, existe la necesidad de un método más eficaz para producir hidrogeles DC-ECM.
El desarrollo de esta técnica es importante porque puede avanzar en el campo de la ingeniería de tejidos al proporcionar un nuevo enfoque para crear andamios biomiméticos que puedan apoyar la regeneración y reparación de tejidos. Además, esta técnica podría adaptarse fácilmente para producir hidrogeles de MEC a partir de otros tejidos, ampliando así sus posibles aplicaciones.
En la bibliografía más amplia, ha habido un creciente interés en el uso de DC-ECM como andamio para aplicaciones de ingeniería de tejidos6. Numerosos estudios han demostrado la eficacia de los hidrogeles DC-ECM para promover el crecimiento celular y la diferenciación en diversos tejidos, incluido el cartílago 7,8. Por lo tanto, el desarrollo de un protocolo para producir hidrogeles DC-ECM que imitan de cerca la ECM natural del tejido cartilaginoso es una contribución significativa al campo.
El protocolo presentado en este artículo aborda esta necesidad al proporcionar un método novedoso para producir hidrogeles DC-ECM que imitan de cerca la ECM natural del tejido cartilaginoso. El protocolo consiste en descelularizar el tejido cartilaginoso, aislar la MEC resultante y crear un hidrogel mediante la reticulación de la MEC con un polímero biocompatible. El hidrogel resultante ha mostrado resultados prometedores en el apoyo al crecimiento y la diferenciación de los condrocitos.
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Protocol
Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Hospital Tongde de la provincia de Zhejiang.
1. Preparación del hidrogel DC-ECM
NOTA: En este estudio, el cartílago se obtuvo de las articulaciones de la rodilla de cerdos miniatura Bama de 12 meses de edad, evitando la recolección de tejido óseo.
- Tome el cartílago recolectado y bloquéelo y córtelo en1-2 mm 3 pedazos con un bisturí.
- Coloque 20 g del cartílago picado en un tubo de centrífuga de 50 ml y agregue 20 ml de tampón hipotónico Tris-HCl (10 mM de Tris-HCl, pH 8.0) para sumergir el tejido por completo. Coloque el tubo de centrífuga en un congelador a -80 °C durante 3 h y luego en un horno a 37 °C durante 3 h. Repita el paso de congelación y calentamiento seis veces. En este paso, el tampón hipotónico Tris-HCl no necesita ser reemplazado.
- Agite el tubo de centrífuga durante 30 s con un mezclador de vórtice a una velocidad de 1.000 rpm. Coloque un tamiz de acero inoxidable (tamaño de poro: ~250 μm) en un tubo de centrífuga nuevo de 50 ml.
- Decantar lentamente el cartílago descelularizado en el tamiz de acero inoxidable, lavar el tejido tres veces con PBS estéril y recoger el cartílago.
- Añadir 10 ml de solución de tripsina (tripsina al 0,25% en PBS) y colocar el tubo en un agitador a 37 °C durante 24 h. Durante este período, reemplace la tripsina cada 4 h. Filtre la suspensión con el tamiz de acero inoxidable y conserve el tejido. La tripsina se puede tratar durante la noche durante uno de los procesos de digestión, y esto no afectará la digestión final.
- Lavar el tejido tripsinizado con tampón hipertónico (1,5 M de NaCl, 50 mM de Tris-HCl, pH 7,6).
- Añadir 10 mL de solución de nucleasa (50 U/mL de desoxirribonucleasa y 1 U/mL de ribonucleasa en 10 mM de Tris-HCl, pH 7,5), y colocar el tubo en un agitador a 37 °C durante 4 h.
- Retire la solución de nucleasa, lave el cartílago tres veces con PBS estéril y agregue la solución hipotónica de Tris-HCl. Coloque el tubo de centrífuga en un agitador y enjuague durante 20 h a temperatura ambiente (RT).
- Retire la solución hipotónica de Tris-HCl, lave el cartílago tres veces con PBS estéril y agregue una solución de Triton X-100 al 1% para sumergir el tejido durante 24 h.
- Retire la solución de Triton X-100 y enjuague bien el cartílago descelularizado con agua destilada durante 3 días, cambiando el agua destilada cada 12 h.
- Remojar el cartílago en una solución de ácido peracético (PAA al 0,1% en etanol al 4%) durante 4 h. Retire la solución de ácido peracético y lave el cartílago tres veces con agua destilada estéril.
- Coloque el tamiz de acero inoxidable (tamaño de poro: ~250 μm) en un tubo de centrífuga de 50 ml. Decantar lentamente el cartílago descelularizado en el tamiz de acero inoxidable y recoger el cartílago. Probar el grado de descelularización y la retención de la matriz del cartílago estimando el contenido de ADN, colágeno y glicosaminoglicanos (GAG).
- Coloque el cartílago descelularizado en un recipiente para moler, agregue nitrógeno líquido y muela el cartílago descelularizado para formar un polvo. Tomar 2 g del cartílago descelularizado en polvo, añadir 80 mL de ácido acético 0,5 M y 20 mg de pepsina, y digerir durante 24 h. Centrifugar a 400 x g durante 10 min; deseche el sedimento y recoja la solución sobrenadante (solución DC-ECM).
- Decantar 1 ml de solución DC-ECM por pocillo en placas de 6 pocillos. Coloque las placas de 6 pocillos en un liofilizador. Congele la solución DC-ECM. Una vez que la temperatura en el liofilizador descienda a -40 °C, encienda la bomba de vacío y mantenga el grado de vacío a 10 Pa durante 22 h.
- Saque la solución de DC-ECM liofilizada, colóquela en tubos de centrífuga y guárdela a -20 °C. El período mínimo de almacenamiento de la solución DC-ECM liofilizada supera el medio año.
- Añadir 1 ml de agua destilada estéril para disolver 20 mg de solución de DC-ECM liofilizada en el tubo de centrífuga. Agitar durante 1 min con un mezclador de vórtice a una velocidad de 1.000 rpm a RT. Añadir 1 mg de vitamina B2 (0,1% p/v) a la solución DC-ECM, incubar a 37 °C durante 60 min e irradiar con luz UV (370 nm, 3,5 mW/cm2) durante 3 min para formar un hidrogel (hidrogel DC-ECM).
2. Detección de cartílago descelularizado
- Detección del contenido de ADN del cartílago descelularizado
NOTA: Extraiga el ADN con el kit de sangre y tejido DNEasy.- En primer lugar, tome 20 mg de cartílago DC-ECM en un tubo de centrífuga. Añadir 180 μL de tampón GTL y 20 μL de proteinasa K por oscilación de vórtice, e incubar el cartílago a 56 °C durante 4 h hasta que se disuelva por completo.
- Agite el tubo de centrífuga durante 15 s con un mezclador de vórtice a una velocidad de 1.000 rpm a RT. A continuación, agregue 200 μL de Buffer GL y etanol anhidro, y mezcle bien mediante vibración de vórtice. Centrifugar las muestras durante 1 min a una velocidad de 6.000 x g a 4 °C.
- Añadir 500 μL de tampón GW1 a la columna de adsorción y centrifugar las muestras durante 1 min a una velocidad de 12.000 x g a 4 °C. Añadir 500 μL de tampón GW2 a la columna de adsorción y centrifugar a 20.000 x g a 4 °C durante 1 min. Por último, añadir 50 μL de agua esterilizada a la columna de adsorción, y centrifugar durante 1 min a una velocidad de 6.000 x g a 4 °C para recoger la solución de ADN. Determinar el contenido de ADN utilizando un espectrofotómetro.
- Detección del contenido de colágeno en el cartílago descelularizado
- Para detectar el contenido de colágeno en el cartílago descelularizado, utilice hidroxiprolina como marcador de aminoácidos de colágeno. Acidificar 5 mg de cartílago descelularizado con 5 mL de ácido clorhídrico 6 M a 100 °C durante 20 min, y luego neutralizarlo con 5 mL de una solución de hidróxido de sodio 6 M.
- Calcule el contenido de hidroxiprolina midiendo la absorbancia de la muestra a 570 nm con un espectrofotómetro. Obtener una regresión lineal concentración-absorción utilizando la muestra estándar de hidroxiprolina.
- Detección del contenido de GAG en el cartílago descelularizado
NOTA: El contenido de GAG en el cartílago DC-ECM se detectó utilizando un kit de detección cuantitativa colorimétrica GAG tisular. Todos los reactivos a continuación están disponibles en el kit.- Tomar 200 mg de polvo de cartílago DC-ECM y añadir 500 μL de reactivo A por oscilación de vórtice. Incubar la muestra a 4 °C durante 16 h y, a continuación, centrifugar a 14.000 x g durante 10 min.
- Tome 50 ml de solución de muestra y agregue 50 μl de solución con alto contenido de sal (reactivo B) y 50 μl de solución ácida (reactivo C) por oscilación de vórtice. Incubar la muestra durante 10 min.
- Añadir 750 μL de solución de colorante (reactivo D) mediante oscilación de vórtice e incubar la muestra durante 30 min en condiciones de oscuridad. Centrifugar la muestra a 14.000 x g durante 10 minutos y luego desechar el sobrenadante.
- Agregue 1 μL de solución limpiadora (reactivo E) y mezcle bien. Centrifugar la muestra a 14.000 x g durante 10 min y desechar el sobrenadante.
- Agregue 1 μL de solución de disociación (reactivo F) a la muestra y mezcle bien. Incubar la muestra durante 30 minutos en condiciones de oscuridad. Por último, determine el contenido de GAG utilizando un espectrofotómetro a 600 nm.
- Análisis de microscopio electrónico de barrido (SEM) y microscopio electrónico de transmisión (TEM) del cartílago descelularizado
- Compare el cartílago descelularizado y el tejido cartilaginoso normal. Colocar la muestra en una solución de glutaraldehído al 2,5%, incubar a 4 °C durante la noche y luego lavar con PBS tres veces.
- Fijar la muestra en OsO4 al 1% durante 1 h y luego lavar tres veces con PBS.
- Deshidratar la muestra por inmersión secuencial en etanol al 50%, 70%, 90% y 100%, así como acetona al 100% durante 15 minutos cada una. Colocar la muestra en una solución mixta de hexametildisilazano y etanol (1:1) durante 15 min, seguida de inmersión en hexametildisilazano puro durante 15 min.
- Coloque la muestra en un secador HCP-2 y luego séquela con nitrógeno líquido. A continuación, cubra el espécimen completamente seco con una fina capa de oro-paladio mediante un recubrimiento de pulverización catódica y obtenga una imagen con SEM. El recubrimiento por pulverización catódica se realizó a una potencia de 120 W durante 5 min. El experimento se llevó a cabo bajo las siguientes condiciones: una tensión de trabajo de 15 kV y un grado de vacío inferior a 5 x 10−5 Pa.
- Para el análisis TEM, colocar la muestra en una mezcla de acetona anhidra y resina (1:1) durante 1 h, seguida de una mezcla de acetona anhidra y resina (1:3) durante 3 h. A continuación, coloca la muestra en resina durante la noche.
- Colocar la muestra en cápsulas de relleno medio y calentar a 70 °C durante 9 h.
- Después de la incrustación, corte la muestra en rodajas finas de 70 nm con un micrótomo ultrafino y colóquela en una malla de cobre.
- Pipetear 20 μL de solución de tinción de acetato de uranilo sobre la malla de cobre y teñir durante 15 min a RT. Retire la solución de tinción lavando suavemente la malla dos veces con agua destilada.
- A continuación, pipetear 20 μL de solución de tinción de citrato de plomo sobre la malla de cobre y teñir durante 15 min a RT. Lavar la malla tres veces con agua destilada.
- Coloque la malla de cobre en una placa de Petri limpia forrada con papel de filtro. Después del secado al aire, fotografíe las secciones con TEM. La sonda se aplicó con una fuerza descendente de 500 nN, se barrió a una velocidad de 1 Hz y tuvo una constante elástica (valor k) de 40 Nm-1. Se midió que el radio de la punta de la sonda era de 8 nm.
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Representative Results
Para preparar un mejor hidrogel cartilaginoso DC-ECM, estudiamos y revisamos la literatura previa y comparamos los diversos protocolos de descelularización en términos de relación de descelularización, inmunogenicidad y funcionalidad mecánica9.
Sobre esta base, preparamos el hidrogel de cartílago DC-ECM y exploramos el efecto de una biotinta de exosoma de matriz extractiva/células madre mesenquimales orientada radialmente en el tratamiento de defectos osteocondrales. Los resultados mostraron que el hidrogel de cartílago DC-ECM tenía baja inmunogenicidad y podía mejorar la migración celular y promover la reparación del cartílago10.
En los últimos años, hemos optimizado la preparación del cartílago DC-ECM. Preparamos el cartílago descelularizado siguiendo los pasos experimentales anteriores. Los resultados mostraron que el contenido de ADN se eliminó en el cartílago descelularizado en comparación con el cartílago nativo (p < 0,001, Figura 1A). La prueba de hidroxiprolina indicó que el contenido de colágeno fue similar entre los cartílagos nativos y descelularizados (p = 0,48, Figura 1B). El ensayo DMMB mostró que el glicosaminoglicano estaba bien retenido en el cartílago descelularizado en comparación con el cartílago nativo (p = 0,68, Figura 1C). Además, se utilizaron SEM y TEM para observar la ultraestructura de la DC-ECM (Figura 1D).
Para preparar un hidrogel DC-ECM, la solución DC-ECM liofilizada se solubilizó para obtener una concentración final del 2% en peso. Además, la solución DC-ECM se mezcló con VB2, seguida de reticulación inducida por UVA (370 nm) (Figura 2A). Colocamos la solución DC-ECM y el hidrogel DC-ECM en tubos de microcentrífuga (Figura 2B). Cuando los tubos se invirtieron, el hidrogel de los tubos no fluyó hacia el fondo, lo que era un signo de gelificación. El tiempo de gelificación de la solución DC-ECM basada en el autoensamblaje de colágeno a 37 °C sin agente de reticulación fue de aproximadamente 15 min (Figura 2C). Se probó la viscosidad y el módulo dinámico de la solución DC-ECM y el hidrogel. Encontramos que la viscosidad de la solución del hidrogel DC-ECM era mayor que la de la solución DC-ECM, y las tasas de cizallamiento más altas se asociaron con una viscosidad de solución más baja (Figura 2D). Además, el módulo de almacenamiento tanto de la solución DC-ECM como del hidrogel fue mucho mayor que el módulo de pérdida, lo que indica que ambos tenían propiedades de un gel en lugar de un líquido (Figura 2E). En particular, después de la reticulación y la liofilización, los tamaños de poro de la solución DC-ECM y el hidrogel DC-ECM, medidos con SEM, disminuyeron de 137,672 μm a 37,936 μm (p < 0,00195, Figura 2F, G).
Figura 1: Preparación y caracterización del cartílago descelularizado. El cartílago descelularizado se comparó con el cartílago nativo. (A-C) Cuantificación del contenido de ADN, colágeno y glicosaminoglicanos (GAG). n = 5, ***p < 0,001 (prueba t de Student). Todos los experimentos se realizaron al menos tres veces. (D) Estructuras microscópicas del cartílago nativo y cartílago descelularizado fotografiadas con SEM y TEM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Preparación y caracterización del hidrogel DC-ECM. Bajo luz ultravioleta, la solución DC-ECM y VB2 se reticularon y formaron un hidrogel DC-ECM. (A) Estructuras moleculares y síntesis del hidrogel DC-ECM. Se compararon la apariencia, la caracterización y las propiedades mecánicas entre la solución DC-ECM y el hidrogel DC-ECM. (B) Las imágenes de la solución DC-ECM y el hidrogel DC-ECM en tubos de microcentrífuga. (C) El tiempo de gelificación del hidrogel DC-ECM y el hidrogel DC-ECM/VB2. n = 3, ***p < 0,001 (prueba t de Student). (D) La viscosidad y (E) el módulo dinámico de la solución DC-ECM y el hidrogel DC-ECM. (F) Estructuras microscópicas de la solución DC-ECM y del hidrogel (bajo y alto aumento). Barras de escala = 100 μm. (G) Tamaño de los poros de la solución DC-ECM y del hidrogel. n = 5, ***p < 0,001 (prueba t de Student). Todos los experimentos se realizaron al menos tres veces. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Este protocolo proporciona un enfoque sistemático para la preparación de hidrogeles de matriz extracelular de cartílago descelularizado que imitan de cerca la MEC nativa del tejido cartilaginoso. El protocolo implica una combinación de disrupción física, química y enzimática para eliminar el material celular mientras se preserva la estructura y composición de la MEC. Los pasos críticos del protocolo incluyen ajustar el tiempo y los métodos de descelularización y garantizar una descelularización completa.
En comparación con otros métodos existentes para la ingeniería de tejidos y la medicina regenerativa, este protocolo ofrece varias ventajas. Los hidrogeles DC-ECM tienen una excelente actividad biológica, estructura espacial y función de inducción biológica, así como baja inmunogenicidad, y estas características son beneficiosas para promover la adhesión, proliferación, diferenciación y migración celular11. Los hidrogeles DC-ECM también se pueden utilizar para la administración de fármacos y el tratamiento de defectos del cartílago12.
Una modificación que se puede hacer a este protocolo es el uso de diferentes agentes de reticulación para mejorar las propiedades mecánicas del hidrogel. Por ejemplo, los materiales nanometálicos se pueden utilizar para mejorar las propiedades mecánicas del hidrogel13. Además, la concentración de riboflavina y los tiempos de exposición a la luz UV se pueden optimizar para controlar las resistencias a la compresión y a la tracción del hidrogel.
A pesar de sus muchas ventajas, esta técnica tiene algunas limitaciones que deben tenerse en cuenta. Una limitación es que el proceso de descelularización puede causar algún daño a la MEC, lo que lleva a cambios en sus propiedades mecánicas14. Otra limitación es que el proceso de descelularización puede no eliminar completamente todo el material antigénico, lo que conduce a una posible respuesta inmune15. Además, es importante tener en cuenta que el protocolo descrito en este trabajo es específico para el tejido cartilaginoso, y otros tipos de tejido pueden requerir ajustes en el método de descelularización.
En términos de aplicaciones futuras, este protocolo se puede optimizar aún más para desarrollar hidrogeles DC-ECM con diferentes resistencias a la compresión y a la tracción. Además, esta técnica se puede aplicar a otros tejidos para desarrollar hidrogeles biomiméticos para aplicaciones de ingeniería de tejidos y medicina regenerativa. En general, el protocolo presentado en este documento proporciona un recurso valioso para investigadores y médicos en el campo de la ingeniería de tejidos y tiene el potencial de mejorar el desarrollo de estrategias efectivas de ingeniería de tejidos para la reparación y regeneración del cartílago.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue patrocinado por el Plan de Medicina y Tecnología Sanitaria de la Provincia de Zhejiang (2019KY050), el Plan de Ciencia y Tecnología de Medicina Tradicional China de la Provincia de Zhejiang (2019ZA026), el Plan Clave de Investigación y Desarrollo en la Provincia de Zhejiang (Subvención No.2020C03043), el Plan de Ciencia y Tecnología de Medicina Tradicional China de la Provincia de Zhejiang (2021ZQ021) y la Fundación Provincial de Ciencias Naturales de Zhejiang de China (LQ22H060007).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M Tris-HCl, pH7.6 | Beyotime | ST776-100 mL | |
| 1 M Tris-HCl, pH8.0 | Beyotime | ST780-500 mL | |
| -80 °C Freezer | Eppendorf | F440340034 | |
| Deoxyribonuclease | Aladdin | D128600-80KU | |
| DNEasy Blood &Tissue Kit | Qiagen | No. 69506 | |
| GAG colorimetric quantitative detection kit | Shanghai Haling | HL19236.2 | |
| HCP-2 dryer | Hitachi | N/A | |
| Nanodrop8000 | Thermo Fisher | N/A | Spectrophotometer |
| PBS (10x) | Gibco | 70011044 | |
| Ribonuclease | Aladdin | R341325-100 mg | |
| Sigma500 | ZIESS | N/A | Scanning electron microscope |
| Spectra S | Thermo Fisher | N/A | Transmission electron microscope |
| Stainless steel sieve | SHXB-Z-1 | Shanghai Xinbu | |
| Triton X-100 | Beyotime | P0096-500 mL | |
| Trypsin | Gibco | 15050065 | |
| Ultraviolet lamp | Omnicure 2000 | N/A | |
| Vitamin B2 | Gibco | R4500-5G | |
| Vortex mixer | Shanghai Qiasen | 78HW-1 |
References
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