Summary
מאמר זה מציג שיטה חדשה לסינתזה של הידרוג'לים חוץ-תאיים של מטריצה חוץ-תאית של סחוס דה-צלולרי (DC-ECM). להידרוג'ל DC-ECM יש תאימות ביולוגית מצוינת והם מספקים מיקרו-סביבה מעולה לצמיחת תאים. לכן, הם יכולים להיות פיגומים תאים אידיאליים ומערכות העברה ביולוגיות.
Abstract
הידרוג'לים של מטריצה חוץ-תאית לסחוס דה-תאי (DC-ECM) הם ביו-חומרים מבטיחים להנדסת רקמות ולרפואה רגנרטיבית בשל התאימות הביולוגית שלהם ויכולתם לחקות תכונות רקמות טבעיות. פרוטוקול זה נועד לייצר הידרוג'לים DC-ECM המחקים באופן הדוק את ה- ECM המקורי של רקמת הסחוס. הפרוטוקול כולל שילוב של שיבוש פיזיקלי וכימי ועיכול אנזימטי לסילוק החומר התאי תוך שמירה על המבנה וההרכב של ה-ECM. DC-ECM מקושר באמצעות חומר כימי ליצירת הידרוג'ל יציב ופעיל ביולוגית. להידרוג'ל DC-ECM פעילות ביולוגית מצוינת, מבנה מרחבי ופונקציית אינדוקציה ביולוגית, כמו גם אימונוגניות נמוכה. מאפיינים אלה מועילים בקידום הידבקות תאים, התרבות, התמיינות ונדידה וליצירת מיקרו-סביבה מעולה לצמיחת תאים. פרוטוקול זה מספק משאב רב ערך לחוקרים וקלינאים בתחום הנדסת הרקמות. הידרוג'לים ביומימטיים יכולים לשפר את הפיתוח של אסטרטגיות יעילות להנדסת רקמות לתיקון והתחדשות סחוס.
Introduction
הנדסת רקמת סחוס היא תחום המתפתח במהירות המבקש לחדש רקמת סחוס פגועה או חולה1. אחד האתגרים המרכזיים בתחום זה הוא פיתוח פיגומים ביומימטיים שיכולים לתמוך בגדילה ובהתמיינות של כונדרוציטים, התאים האחראים לייצור סחוס2. ECM של רקמת הסחוס משחק תפקיד קריטי בוויסות ההתנהגות של chondrocytes. DC-ECM הוא פיגום יעיל ליישומי הנדסת רקמות3.
מספר טכניקות פותחו לייצור DC-ECM מרקמת סחוס, כולל שיטות כימיות, אנזימטיות ופיזיקליות. עם זאת, שיטות אלה גורמות לעתים קרובות לייצור הידרוג'לים ECM שאינם ביומימטיים מספיק, מה שמגביל את הפוטנציאל שלהם לשימוש ביישומי הנדסת רקמות 4,5. לכן, יש צורך בשיטה יעילה יותר לייצור הידרוג'לים DC-ECM.
הפיתוח של טכניקה זו חשוב מכיוון שהיא יכולה לקדם את תחום הנדסת הרקמות על ידי מתן גישה חדשה ליצירת פיגומים ביומימטיים שיכולים לתמוך בהתחדשות רקמות ותיקונן. יתר על כן, טכניקה זו יכולה להיות מותאמת בקלות לייצור הידרוג'ל ECM מרקמות אחרות, ובכך להרחיב את היישומים הפוטנציאליים שלה.
בגוף הספרות הרחב יותר, יש עניין גובר בשימוש ב- DC-ECM כפיגום ליישומי הנדסת רקמות6. מחקרים רבים הוכיחו את יעילותם של הידרוג'לים DC-ECM בקידום גדילת תאים והתמיינותם ברקמות שונות, כולל סחוס 7,8. לכן, פיתוח פרוטוקול לייצור הידרוג'ל DC-ECM המחקה באופן הדוק את ה-ECM הטבעי של רקמת הסחוס הוא תרומה משמעותית לתחום.
הפרוטוקול המוצג במאמר זה עונה על צורך זה על ידי מתן שיטה חדשנית לייצור הידרוג'לים DC-ECM המחקים באופן הדוק את ה- ECM הטבעי של רקמת הסחוס. הפרוטוקול כולל דה-צלולריזציה של רקמת הסחוס, בידוד ה-ECM המתקבל ויצירת הידרוג'ל על ידי קישור צולב של ה-ECM עם פולימר תואם ביולוגית. ההידרוג'ל שהתקבל הראה תוצאות מבטיחות בתמיכה בצמיחה ובהתמיינות של כונדרוציטים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
מחקר זה אושר על ידי ועדת האתיקה של בית החולים טונגדה במחוז ג'ג'יאנג.
1. הכנת הידרוג'ל DC-ECM
הערה: במחקר זה, הסחוס התקבל מפרקי הברכיים של חזירי באמה מיניאטוריים בני 12 חודשים, תוך הימנעות מאיסוף רקמת עצם.
- קח את הסחוס שנאסף, לחסום ולקצוץ אותו לתוך 1-2 מ"מ3 חתיכות עם אזמל.
- מניחים 20 גרם של הסחוס הטחון בצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל, ומוסיפים 20 מ"ל של חיץ Tris-HCl היפוטוני (10 mM Tris-HCl, pH 8.0) כדי לטבול את הרקמה לחלוטין. מכניסים את צינור הצנטריפוגה למקפיא של -80°C למשך 3 שעות ולאחר מכן לתנור של 37°C למשך 3 שעות. חזרו על שלב ההקפאה והחימום שש פעמים. בשלב זה, מאגר Tris-HCl היפוטוני אינו זקוק להחלפה.
- נערו את צינור הצנטריפוגה למשך 30 שניות באמצעות מערבל מערבולות במהירות של 1,000 סל"ד. הניחו מסננת נירוסטה (גודל נקבוביות: ~ 250 מיקרומטר) על צינור צנטריפוגה חדש של 50 מ"ל.
- מרוקנים באיטיות את הסחוס נטול התאים לתוך מסננת הנירוסטה, שוטפים את הרקמה שלוש פעמים עם PBS סטרילי, ואוספים את הסחוס.
- הוסף 10 מ"ל של תמיסת טריפסין (0.25% טריפסין ב- PBS), והנח את הצינור על שייקר ב 37 ° C למשך 24 שעות. במהלך תקופה זו, להחליף את טריפסין כל 4 שעות. מסננים את המתלה באמצעות מסננת הנירוסטה, ושומרים על הרקמה. טריפסין ניתן לטפל בן לילה במהלך אחד מתהליכי העיכול, וזה לא ישפיע על העיכול הסופי.
- לשטוף את הרקמה טריפסינית עם חיץ hypertonic (1.5 M NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7.6).
- הוסף 10 מ"ל של תמיסת נוקלאז (50 U/mL deoxyribonuclease ו-1 U/mL ribonuclease ב-10 mM Tris-HCl, pH 7.5), והנח את הצינור על שייקר ב-37°C למשך 4 שעות.
- הסר את תמיסת הנוקלאז, שטוף את הסחוס שלוש פעמים עם PBS סטרילי, והוסף תמיסת Tris-HCl היפוטונית. הניחו את צינור הצנטריפוגה על שייקר, ושטפו במשך 20 שעות בטמפרטורת החדר (RT).
- הסר את תמיסת Tris-HCl ההיפוטונית, שטוף את הסחוס שלוש פעמים עם PBS סטרילי, והוסף תמיסת טריטון X-100 1% כדי לטבול את הרקמה למשך 24 שעות.
- הסר את תמיסת Triton X-100, ושטוף ביסודיות את הסחוס decellularized עם מים מזוקקים במשך 3 ימים, החלפת המים המזוקקים כל 12 שעות.
- השרו את הסחוס בתמיסת חומצה פראצטית (0.1% PAA ב-4% אתנול) למשך 4 שעות. מוציאים את תמיסת החומצה הפרצטית ושוטפים את הסחוס שלוש פעמים במים מזוקקים סטריליים.
- הניחו את מסננת הנירוסטה (גודל נקבוביות: ~ 250 מיקרומטר) על צינור צנטריפוגה של 50 מ"ל. מרוקנים לאט לאט את הסחוס הדה-צלולרי לתוך מסננת הנירוסטה, ואוספים את הסחוס. בדוק את מידת הדה-צלולריזציה ואת שימור המטריצה של הסחוס על ידי הערכת תכולת ה- DNA, הקולגן והגליקוזאמינוגליקן (GAG).
- הכניסו את הסחוס נטול התאים לקערת שחיקה, הוסיפו חנקן נוזלי וטחנו את הסחוס נטול התאים ליצירת אבקה. קח 2 גרם של אבקת סחוס decellularized, להוסיף 80 מ"ל של 0.5 M חומצה אצטית ו 20 מ"ג של pepsin, ולעכל במשך 24 שעות. צנטריפוגה ב 400 x גרם במשך 10 דקות; השליכו את המשקעים, ואספו את תמיסת הסופרנאטנט (תמיסת DC-ECM).
- דקנט 1 מ"ל של פתרון DC-ECM לכל באר לתוך לוחות 6 באר. מניחים את צלחות 6 באר בליופיליזר. הקפיא את פתרון DC-ECM. ברגע שהטמפרטורה במייבש ההקפאה יורדת ל -40 מעלות צלזיוס, הפעל את משאבת הוואקום, ושמור על מידת הוואקום ב -10 Pa למשך 22 שעות.
- הוציאו את תמיסת DC-ECM המיובשת בהקפאה, הניחו אותה בצינורות צנטריפוגות ואחסנו בטמפרטורה של -20°C. תקופת האחסון המינימלית של פתרון DC-ECM מיובש בהקפאה עולה על חצי שנה.
- הוסף 1 מ"ל של מים מזוקקים סטריליים כדי להמיס 20 מ"ג של תמיסת DC-ECM מיובשת בהקפאה בצינור הצנטריפוגה. נערו במשך דקה אחת באמצעות מערבול מערבולת במהירות של 1,000 סל"ד ב-RT. הוסיפו 1 מ"ג ויטמין B2 (0.1% w/v) לתמיסת DC-ECM, דגרו ב-37°C למשך 60 דקות, והקרינו באור UV (370 ננומטר, 3.5 mW/cm2) למשך 3 דקות ליצירת הידרוג'ל (DC-ECM hydrogel).
2. איתור סחוס דה-צלולרי
- זיהוי תכולת DNA של סחוס דה-סלולרי
הערה: חלץ את הדנ"א באמצעות ערכת הדם והרקמות של DNEasy.- ראשית, יש ליטול 20 מ"ג סחוס DC-ECM בצינור צנטריפוגה. הוסף 180 μL של Buffer GTL ו 20 μL של Proteinase K על ידי תנודת מערבולת, ודגר על הסחוס ב 56 ° C במשך 4 שעות עד שהוא מומס לחלוטין.
- נערו את צינור הצנטריפוגה למשך 15 שניות באמצעות מערבל מערבולות במהירות של 1,000 סל"ד ב-RT. לאחר מכן, להוסיף 200 μL של Buffer GL ואתנול נטול מים, ולערבב היטב על ידי רטט מערבולת. צנטריפוגה את הדגימות במשך דקה אחת במהירות של 6,000 x גרם ב 4 ° C.
- הוסף 500 μL של Buffer GW1 לעמודת הספיחה, וצנטריפוגה את הדגימות למשך דקה אחת במהירות של 12,000 x גרם ב 4 ° C. הוסף 500 μL של Buffer GW2 לעמודת הספיחה, וצנטריפוגה ב- 20,000 x g ב- 4 ° C למשך דקה אחת. לבסוף, הוסף 50 μL של מים מעוקרים לעמודת הספיחה, וצנטריפוגה למשך דקה אחת במהירות של 6,000 x גרם ב 4 ° C כדי לאסוף את תמיסת ה- DNA. קבע את תכולת ה- DNA באמצעות ספקטרופוטומטר.
- זיהוי תכולת קולגן בסחוס נטול תאים
- כדי לזהות את תכולת הקולגן בסחוס נטול תאים, השתמשו בהידרוקסיפרולין כסמן חומצת אמינו של קולגן. להחמיץ, 5 מ"ג של סחוס decellularized עם 5 מ"ל של 6 M חומצה הידרוכלורית ב 100 ° C במשך 20 דקות, ולאחר מכן לנטרל אותו עם 5 מ"ל של 6 M תמיסת נתרן הידרוקסיד.
- חשב את התוכן של hydroxyproline על ידי מדידת ספיגת המדגם ב 570 ננומטר עם ספקטרופוטומטר. קבל רגרסיה ליניארית של ספיגת ריכוז באמצעות דגימת הידרוקסיפרולין סטנדרטית.
- זיהוי תוכן GAG בסחוס הדה-תאי
הערה: תוכן ה- GAG בסחוס DC-ECM זוהה באמצעות ערכת זיהוי כמותי קולורימטרי של GAG רקמות. כל הריאגנטים להלן זמינים בערכה.- קח 200 מ"ג של אבקת סחוס DC-ECM, ולהוסיף 500 μL של מגיב A על ידי תנודת מערבולת. לדגור את הדגימה ב 4 ° C במשך 16 שעות, ולאחר מכן צנטריפוגה ב 14,000 x גרם במשך 10 דקות.
- קח 50 מ"ל של תמיסת דגימה, והוסף 50 μL של תמיסת מלח גבוהה (מגיב B) ו 50 μL של תמיסת חומצה (מגיב C) על ידי תנודת מערבולת. לדגור על הדגימה במשך 10 דקות.
- הוסף 750 μL של תמיסת צבע (מגיב D) על ידי תנודת מערבולת, ודגר על הדגימה במשך 30 דקות בתנאים חשוכים. צנטריפוגה את הדגימה ב 14,000 x גרם במשך 10 דקות, ולאחר מכן להשליך את supernatant.
- מוסיפים 1 μL של תמיסת ניקוי (מגיב E), ומערבבים היטב. צנטריפוגו את הדגימה במהירות של 14,000 x גרם למשך 10 דקות, והשליכו את הסופרנטנט.
- מוסיפים 1 μL של תמיסת דיסוציאציה (מגיב F) לדגימה, ומערבבים היטב. יש לדגור על הדגימה במשך 30 דקות בתנאי חושך. לבסוף, לקבוע את תוכן GAG באמצעות ספקטרופוטומטר ב 600 ננומטר.
- ניתוח מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) ומיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת (TEM) של הסחוס הדה-תאי
- השווה בין הסחוס הדה-צלולרי לבין רקמת הסחוס הרגילה. יש להניח את הדגימה בתמיסת גלוטראלדהיד 2.5%, לדגור בטמפרטורה של 4°C למשך הלילה ולאחר מכן לשטוף עם PBS שלוש פעמים.
- תקן את הדגימה ב- 1% OsO4 למשך שעה ולאחר מכן שטוף שלוש פעמים עם PBS.
- יש לייבש את הדגימה על ידי טבילה רציפה באתנול 50%, 70%, 90% ו-100%, כמו גם 100% אצטון למשך 15 דקות כל אחד. הניחו את הדגימה בתמיסה מעורבת של הקסמתילדיסילאזאן ואתנול (1:1) למשך 15 דקות, ולאחר מכן טבלו בהקסמתילדיסילאזאן טהור למשך 15 דקות.
- הניחו את הדגימה במייבש HCP-2, ולאחר מכן יבשו באמצעות חנקן נוזלי. לאחר מכן, צפו את הדגימה המיובשת במלואה בשכבה דקה של פלדיום זהב באמצעות ציפוי מרזב, וצפו באמצעות SEM. ציפוי המרזב בוצע בהספק של 120 W למשך 5 דקות. הניסוי בוצע בתנאים הבאים: מתח עבודה של 15 קילו וולט, ודרגת ואקום נמוכה מ-5 x 10-5 Pa.
- עבור ניתוח TEM, מקם את הדגימה בתערובת של אצטון נטול מים ושרף (1: 1) במשך 1 שעות, ואחריו תערובת של אצטון נטול מים ושרף (1: 3) במשך 3 שעות. לאחר מכן, הניחו את הדגימה בשרף למשך הלילה.
- מניחים את הדגימה בכמוסות מלאות בינוניות, ומחממים ב-70°C למשך 9 שעות.
- לאחר ההטבעה, חותכים את הדגימה לפרוסות דקות של 70 ננומטר באמצעות מיקרוטום דק במיוחד, ומניחים על רשת נחושת.
- יש למרוח 20 μL של תמיסת צביעת אורניל אצטט על רשת הנחושת, ולהכתים למשך 15 דקות ב-RT. הסירו את תמיסת הכתמים על ידי שטיפה עדינה של הרשת פעמיים במים מזוקקים.
- לאחר מכן, שפכו 20 μL של תמיסת צביעת עופרת ציטראט על רשת הנחושת, והכתימו למשך 15 דקות ב- RT. שטפו את הרשת שלוש פעמים במים מזוקקים.
- הניחו את רשת הנחושת על צלחת פטרי נקייה מרופדת בנייר פילטר. לאחר הייבוש באוויר, צלמו את המקטעים באמצעות TEM. הגשושית הופעלה בכוח יורד של 500 nN, נסרק בקצב של 1 הרץ, והיה לה קבוע אלסטי (ערך k) של 40 Nm-1. רדיוס קצה הגשושית נמדד כ-8 ננומטר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כדי להכין הידרוג'ל סחוס DC-ECM טוב יותר, למדנו וסקרנו את הספרות הקודמת והשווינו את פרוטוקולי הדה-צלולריזציה השונים במונחים של יחס דה-צלולריזציה, אימונוגניות ופונקציונליות מכנית9.
על בסיס זה, הכנו את הידרוג'ל הסחוס DC-ECM וחקרנו את ההשפעה של ביו-דיו אקסוזום אקסוזום של מטריצת מיצוי רדיאלית/תאי גזע מזנכימליים בטיפול במומים אוסטאוכונדרליים. התוצאות הראו כי הידרוג'ל הסחוס DC-ECM היה בעל אימונוגניות נמוכה ויכול לשפר את נדידת התאים ולקדם תיקון סחוס10.
בשנים האחרונות ביצענו אופטימיזציה של הכנת הסחוס DC-ECM. הכנו את הסחוס הדה-תאי באמצעות שלבי הניסוי לעיל. התוצאות הראו שתכולת הדנ"א סולקה בסחוס הדה-תאי בהשוואה לזו שבסחוס הטבעי (p < 0.001, איור 1A). בדיקת הידרוקסיפרולין הצביעה על כך שתכולת הקולגן הייתה דומה בין הסחוס המקומי לסחוס הדה-תאי (p = 0.48, איור 1B). בדיקת DMMB הראתה שגליקוזאמינוגליקן נשמר היטב בסחוס נטול התאים בהשוואה לסחוס המקומי (p = 0.68, איור 1C). יתר על כן, SEM ו-TEM שימשו כדי לצפות באולטרה-מבנה של DC-ECM (איור 1D).
כדי להכין הידרוג'ל DC-ECM, תמיסת DC-ECM המיובשת בהקפאה הייתה מסיסה, לריכוז סופי של 2 wt%. יתר על כן, פתרון DC-ECM עורבב עם VB2, ואחריו UVA (370 ננומטר) המושרה על ידי קישור צולב (איור 2A). מיקמנו את תמיסת DC-ECM ואת הידרוג'ל DC-ECM בתוך צינורות מיקרו-צנטריפוגות (איור 2B). כאשר הצינורות היו הפוכים, ההידרוג'ל בצינורות לא זרם לתחתית, וזה היה סימן לג'לציה. זמן הג'לציה של תמיסת DC-ECM המבוססת על הרכבה עצמית של קולגן ב-37°C ללא חומר קישור צולב היה בערך 15 דקות (איור 2C). נבדקו הצמיגות והמודולוס הדינמי של תמיסת DC-ECM וההידרוג'ל. מצאנו שצמיגות התמיסה של הידרוג'ל DC-ECM הייתה גבוהה יותר מזו של תמיסת DC-ECM, וקצבי גזירה גבוהים יותר היו קשורים לצמיגות נמוכה יותר של התמיסה (איור 2D). נוסף על כך, מודולוס האחסון של תמיסת DC-ECM והידרוג'ל היה גבוה בהרבה ממודולוס ההפסד, מה שמצביע על כך שלשניהם היו תכונות של ג'ל ולא של נוזל (איור 2E). יש לציין כי לאחר קישור צולב וייבוש בהקפאה, גדלי הנקבוביות של תמיסת DC-ECM והידרוג'ל DC-ECM, שנמדדו באמצעות SEM, ירדו מ-137.672 מיקרומטר ל-37.936 מיקרומטר (p < 0.00195, איור 2F,G).
איור 1: הכנה ואפיון של הסחוס הדה-צלולרי. הסחוס הדה-צלולרי הושווה לסחוס הטבעי. (א-ג) כימות תכולת הדנ"א, הקולגן והגליקוזאמינוגליקן (GAG). n = 5, ***p < 0.001 (מבחן t של סטודנט). כל הניסויים בוצעו לפחות שלוש פעמים. (D) מבנים מיקרוסקופיים של הסחוס המקומי והסחוס הדה-תאי שצולמו עם SEM ו-TEM. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: הכנה ואפיון של הידרוג'ל DC-ECM. תחת אור אולטרה סגול, פתרון DC-ECM ו- VB2 צולבים ויצרו הידרוג'ל DC-ECM. (A) מבני מולקולות וסינתזה של הידרוג'ל DC-ECM. המראה, האפיון והתכונות המכניות הושוו בין פתרון DC-ECM לבין הידרוג'ל DC-ECM. (B) התמונות של תמיסת DC-ECM והידרוג'ל DC-ECM בצינורות מיקרוצנטריפוגות. (C) זמן הג'לציה של הידרוג'ל DC-ECM והידרוג'ל DC-ECM/VB2. n = 3, ***p < 0.001 (מבחן t של סטודנט). (D) הצמיגות והמודולוס הדינמי (E) של תמיסת DC-ECM והידרוג'ל DC-ECM. (F) מבנים מיקרוסקופיים של תמיסת DC-ECM והידרוג'ל (הגדלה נמוכה וגבוהה). פסי קנה מידה = 100 מיקרומטר. (G) גדלי נקבוביות של תמיסת DC-ECM והידרוג'ל. n = 5, ***p < 0.001 (מבחן t של סטודנט). כל הניסויים בוצעו לפחות שלוש פעמים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה מספק גישה שיטתית להכנת הידרוג'לים מטריקס חוץ-תאיים של סחוס דה-צלולרי המחקים באופן הדוק את ה-ECM המקורי של רקמת הסחוס. הפרוטוקול כולל שילוב של הפרעה פיזיקלית, כימית ואנזימטית לסילוק חומר תאי תוך שמירה על המבנה וההרכב של ECM. השלבים הקריטיים של הפרוטוקול כוללים התאמת זמן ושיטות הדה-צלולריזציה והבטחת דה-צלולריזציה מלאה.
בהשוואה לשיטות קיימות אחרות להנדסת רקמות ורפואה רגנרטיבית, פרוטוקול זה מציע מספר יתרונות. להידרוג'ל DC-ECM פעילות ביולוגית מצוינת, מבנה מרחבי ופונקציית אינדוקציה ביולוגית, כמו גם אימונוגניות נמוכה, ומאפיינים אלה מועילים בקידום הידבקות תאים, התפשטות, התמיינות ונדידה11. הידרוג'ל DC-ECM יכול לשמש גם להעברת תרופות וטיפול בפגם סחוס12.
שינוי אחד שניתן לבצע בפרוטוקול זה הוא השימוש בחומרים צולבים שונים כדי לשפר את התכונות המכניות של ההידרוג'ל. לדוגמה, ניתן להשתמש בחומרים ננו-מתכתיים כדי לשפר את התכונות המכניות של הידרוג'ל13. בנוסף, ניתן לייעל את ריכוז הריבופלבין ואת זמני החשיפה לאור UV כדי לשלוט בעוצמות הדחיסה והמתיחה של ההידרוג'ל.
למרות יתרונותיה הרבים, לטכניקה זו יש כמה מגבלות שיש לקחת בחשבון. מגבלה אחת היא שתהליך הדה-צלולריזציה עלול לגרום נזק מסוים ל-ECM, מה שיוביל לשינויים בתכונותיו המכניות14. מגבלה נוספת היא שתהליך הדה-צלולריזציה עלול שלא להסיר לחלוטין את כל החומר האנטיגני, מה שמוביל לתגובה חיסונית פוטנציאלית15. יתר על כן, חשוב לציין כי הפרוטוקול המתואר במאמר זה הוא ספציפי לרקמת הסחוס, וסוגים אחרים של רקמות עשויים לדרוש התאמות לשיטת הדה-צלולריזציה.
במונחים של יישומים עתידיים, פרוטוקול זה יכול להיות מותאם עוד יותר לפיתוח הידרוג'ל DC-ECM עם עוצמות דחיסה ומתיחה שונות. בנוסף, טכניקה זו יכולה להיות מיושמת על רקמות אחרות כדי לפתח הידרוג'לים ביומימטיים עבור הנדסת רקמות ויישומי רפואה רגנרטיבית. בסך הכל, הפרוטוקול המוצג במאמר זה מספק משאב רב ערך לחוקרים ולקלינאים בתחום הנדסת הרקמות, ויש לו פוטנציאל לשפר את הפיתוח של אסטרטגיות יעילות להנדסת רקמות לתיקון והתחדשות סחוס.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו מומנה על ידי תוכנית הרפואה וטכנולוגיית הבריאות של מחוז ג'ג'יאנג (2019KY050), תוכנית המדע והטכנולוגיה של הרפואה הסינית המסורתית של מחוז ג'ג'יאנג (2019ZA026), תוכנית המחקר והפיתוח המרכזית במחוז ג'ג'יאנג (מענק מס '2020C03043), תוכנית המדע והטכנולוגיה של הרפואה הסינית המסורתית של מחוז ג'ג'יאנג (2021ZQ021), והקרן למדעי הטבע של מחוז ג'ג'יאנג של סין (LQ22H060007).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M Tris-HCl, pH7.6 | Beyotime | ST776-100 mL | |
| 1 M Tris-HCl, pH8.0 | Beyotime | ST780-500 mL | |
| -80 °C Freezer | Eppendorf | F440340034 | |
| Deoxyribonuclease | Aladdin | D128600-80KU | |
| DNEasy Blood &Tissue Kit | Qiagen | No. 69506 | |
| GAG colorimetric quantitative detection kit | Shanghai Haling | HL19236.2 | |
| HCP-2 dryer | Hitachi | N/A | |
| Nanodrop8000 | Thermo Fisher | N/A | Spectrophotometer |
| PBS (10x) | Gibco | 70011044 | |
| Ribonuclease | Aladdin | R341325-100 mg | |
| Sigma500 | ZIESS | N/A | Scanning electron microscope |
| Spectra S | Thermo Fisher | N/A | Transmission electron microscope |
| Stainless steel sieve | SHXB-Z-1 | Shanghai Xinbu | |
| Triton X-100 | Beyotime | P0096-500 mL | |
| Trypsin | Gibco | 15050065 | |
| Ultraviolet lamp | Omnicure 2000 | N/A | |
| Vitamin B2 | Gibco | R4500-5G | |
| Vortex mixer | Shanghai Qiasen | 78HW-1 |
References
- Vega, S. L., Kwon, M. Y., Burdick, J. A. Recent advances in hydrogels for cartilage tissue engineering. European Cells & Materials. 33, 59-75 (2017).
- Yang, J., Zhang, Y. S., Yue, K., Khademhosseini, A. Cell-laden hydrogels for osteochondral and cartilage tissue engineering. Acta Biomaterialia. 57, 1-25 (2017).
- Bejleri, D., Davis, M. E. Decellularized extracellular matrix materials for cardiac repair and regeneration. Advanced Healthcare Materials. 8 (5), e1801217 (2019).
- Brown, M., Li, J., Moraes, C., Tabrizian, M., Li-Jessen, N. Y. K. Decellularized extracellular matrix: New promising and challenging biomaterials for regenerative medicine. Biomaterials. 289, 121786 (2022).
- Barbulescu, G. I., et al. Decellularized extracellular matrix scaffolds for cardiovascular tissue engineering: Current techniques and challenges. International Journal of Molecular Sciences. 23 (21), 13040 (2022).
- Zhang, W., Du, A., Liu, S., Lv, M., Chen, S. Research progress in decellularized extracellular matrix-derived hydrogels. Regenerative Therapy. 18, 88-96 (2021).
- Zhu, W., et al. Cell-derived decellularized extracellular matrix scaffolds for articular cartilage repair. International Journal of Artificial Organs. 44 (4), 269-281 (2021).
- Li, T., Javed, R., Ao, Q. Xenogeneic decellularized extracellular matrix-based biomaterials for peripheral nerve repair and regeneration. Current Neuropharmacology. 19 (12), 2152-2163 (2021).
- Xia, C., et al. Decellularized cartilage as a prospective scaffold for cartilage repair. Materials Science & Engineering C-Materials for Biological Applications. 101, 588-595 (2019).
- Chen, P., et al. Desktop-stereolithography 3D printing of a radially oriented extracellular matrix/mesenchymal stem cell exosome bioink for osteochondral defect regeneration. Theranostics. 9 (9), 2439-2459 (2019).
- Saldin, L. T., Cramer, M. C., Velankar, S. S., White, L. J., Badylak, S. F. Extracellular matrix hydrogels from decellularized tissues: Structure and function. Acta Biomaterialia. 49, 1-15 (2017).
- Yuan, X., et al. Stem cell delivery in tissue-specific hydrogel enabled meniscal repair in an orthotopic rat model. Biomaterials. 132, 59-71 (2017).
- Zheng, L., et al. Intensified stiffness and photodynamic provocation in a collagen-based composite hydrogel drive chondrogenesis. Advanced Science. 6 (16), 1900099 (2019).
- Young, J. L., Holle, A. W., Spatz, J. P.Nanoscale and mechanical properties of the physiological cell-ECM microenvironment. Experimental Cell Research. 343 (1), 3-6 (2016).
- Abdolghafoorian, H., et al. Effect of heart valve decellularization on xenograft rejection. Experimental and Clinical Transplantation. 15 (3), 329-336 (2017).
