Vivo में बरकरार पृष्ठीय रूट गैन्ग्लिया में प्राथमिक संवेदी न्यूरॉन्स के नेटवर्क में न्यूरोनल एन्सेंबल की कैल्शियम इमेजिंग

इस विधि का उपयोग करके निगरानी किए गए न्यूरॉन्स की संख्या न्यूरॉन नेटवर्क डेटा के संग्रह की अनुमति देती है जो पुराने या अन्य तरीकों का उपयोग करके असंभव होगा। इस तकनीक का मुख्य लाभ एक बार में लगभग 2,000 प्राथमिक संवेदी न्यूरॉन्स की निगरानी करने की क्षमता है, जो सीधे पिछले पंजे पर लागू उत्तेजनाओं का जवाब देते हैं। यह प्रक्रिया परिधीय एलोडोनिया और दर्द अतिसंवेदनशीलता के लिए चिकित्सीय हस्तक्षेप का अध्ययन करने के लिए विशेष रूप से उपयुक्त है।

इस विधि को ट्राइजेमिनल या जेनिकुलेट गैन्ग्लिया का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है या वोल्टेज या सेल सिग्नलिंग अणुओं, जैसे चक्रीय एएमपी के लिए आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड सेंसर के साथ उपयोग किया जा सकता है। इस सर्जरी को करने के लिए अभ्यास की आवश्यकता होती है। आप एक ही जानवर पर छह पृष्ठीय रूट गैन्ग्लिया पर अभ्यास कर सकते हैं।

जॉन शैननहाउस और श्री रूबेन गोमेज़ की सहायता के साथ प्रक्रिया का प्रदर्शन मैं करूंगा। शुरू करने के लिए, शरीर के तापमान को 37 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखने के लिए माउस को गर्म पैड पर रखें। माउस की श्रोणि हड्डी को महसूस करके काठ के विस्तार का पता लगाएं।

फिर, काठ वृद्धि के क्षेत्र के ऊपर माउस के पीछे शेव करें। कैंची का उपयोग करके, काठ के विस्तार के ऊपर तीन तरफा आयताकार चीरा लगाएं, और त्वचा को बल के साथ दूर मोड़ें। रीढ़ की दाहिनी ओर तीन से चार मिलीमीटर चीरे लगाने के लिए 13 मिलीमीटर स्प्रिंग विच्छेदन कैंची का उपयोग करें।

रीढ़ की हड्डी को उजागर करने के लिए त्वचा और मांसपेशियों को किनारों पर वापस काटने के लिए कैंची का उपयोग करें। फिर, आठ मिलीमीटर कैंची का उपयोग करके, दाईं ओर एल 5 डीआरजी की अनुप्रस्थ प्रक्रिया को साफ करने के लिए मांसपेशियों और संयोजी ऊतक को काट दें। रक्त को अवशोषित करने के लिए कपास या गेलफोम का उपयोग करके रक्तस्राव को कम करने की कोशिश करें।

फ्रीडमैन-पियरसन रोंगेर्स या मजबूत फाइन फोर्सेस का उपयोग करके दाईं ओर एल 5 अनुप्रस्थ प्रक्रिया को खोलें, डीआरजी को छूने से सावधान रहें। इसके बाद, माउस और हीटिंग पैड को कस्टम स्टेज पर ले जाएं। जगह में जानवर और हीटिंग पैड को सुरक्षित करने के लिए स्टेज टेप का उपयोग करें।

निरंतर आइसोफ्लुरेन एनेस्थीसिया के लिए नाक शंकु में जानवर की नाक रखें। उत्तेजनाओं के आसान अनुप्रयोग के लिए मंच से बाहर एक स्थिति से चिपके दाहिने पिछले पंजे को सुरक्षित करें। रीढ़ की हड्डी को रीढ़ की हड्डी पर त्वचा पर या पेल्विक हड्डी पर एल 5 डीआरजी के लिए सिर्फ रोस्ट्रल और पुच्छल के साथ सुरक्षित करें।

डीआरजी की सतह को यथासंभव स्तर बनाने के लिए क्लैंप और चरण को समायोजित करें। फिर, माइक्रोस्कोप के नीचे चरण रखें ताकि कम होने पर उद्देश्य सीधे डीआरजी से आठ मिलीमीटर ऊपर हो। रेक्टल थर्मामीटर डालें।

बिजली लाइनों को हीटिंग पैड और रेक्टल थर्मामीटर से कनेक्ट करें। नाक शंकु को आइसोफ्लुरेन गैस लाइनों से कनेक्ट करें। 10x 0.4 डीआईसी उद्देश्य और इमेजिंग के लिए संबंधित सॉफ़्टवेयर के साथ एक सीधा कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करें।

495 नैनोमीटर पर उत्तेजना, 519 नैनोमीटर पर उत्सर्जन, और 500 से 580 नैनोमीटर के बीच पहचान तरंग दैर्ध्य की हरी एफआईटीसी फिल्टर सेटिंग्स का उपयोग करें। माइक्रोस्कोप के तहत, डीआरजी की सतह का पता लगाएं। मंच पर क्लैंप को समायोजित करें ताकि डीआरजी सतह यथासंभव स्तर पर हो और फोकल प्लेन में अधिकतम सतह क्षेत्र की कल्पना की जाए।

ओवरडोज के बिना आइसोफ्लुरेन एनेस्थीसिया बनाए रखने के लिए पूरी प्रक्रिया में जानवर की निगरानी करें। माइक्रोस्कोप रैपिड स्कैनिंग प्रोटोकॉल लोड करने के लिए, वोक्सेल आकार 2.496 बाय 2.496 बाय 16 माइक्रोन, 512 बाय 512 पिक्सल, 10 ऑप्टिकल स्लाइस जेड-स्टैक, 32 माइक्रोमीटर के लिए एक एयरी यूनिट, 488 नैनोमीटर और पांच मिलीवॉट की 1% लेजर पावर, पिक्सल टाइम 1.52 माइक्रोसेकंड, लाइन टाइम 0.91 मिलीसेकंड, फ्रेम टाइम 465 मिलीसेकंड, एलएसएम स्कैन स्पीड की विशिष्ट सेटिंग्स का उपयोग करें। द्विदिश स्कैनिंग, पीएमटी डिटेक्टर 650 वोल्ट प्राप्त करता है, और एक का डिजिटल लाभ। अधिग्रहण टैब के तहत स्टार्ट एक्सपेरिमेंट पर क्लिक करके डीआरजी का एक छोटा, आठ-चक्र स्कैन लें।

समय के साथ प्रति फ्रेम एक स्कैन पर स्कैन का ऑर्थोगोनल प्रोजेक्शन बनाकर एक फिल्म बनाएं। मैन्युअल रूप से छवि स्पष्टता और इमेजिंग कलाकृतियों की जांच करें, जैसे कि डीआरजी को पार करने वाली चमक की तरंगें। क्लैंप स्थिति और ऑप्टिकल सेक्शन मोटाई समायोजित करें, और इस चरण को तब तक दोहराएं जब तक कि एक स्पष्ट, उच्च गुणवत्ता वाली फिल्म प्राप्त न हो जाए।

फिर, Voxel आकार 1.248 से 1.248 बाय 14 माइक्रोन, 1024 द्वारा 1024 पिक्सेल, छह ऑप्टिकल स्लाइस Z-stack, 1.2 एयरी यूनिट या 39 माइक्रोमीटर, 488 नैनोमीटर और 25 मिलीवाट की 5% लेजर शक्ति, पिक्सेल समय 2.06 माइक्रोसेकंड, लाइन समय 4.95 मिलीसेकंड, फ्रेम समय 5.06 सेकंड, फ्रेम समय 5.06 सेकंड, LSM स्कैन गति की विशिष्ट सेटिंग्स का उपयोग करके माइक्रोस्कोप उच्च-रिज़ॉल्यूशन स्कैनिंग प्रोटोकॉल लोड करें। द्विदिश स्कैनिंग, पीएमटी डिटेक्टर 650 वोल्ट पर लाभ, और एक का डिजिटल लाभ। DRG की उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवि बनाने के लिए अधिग्रहण टैब के तहत प्रयोग प्रारंभ करें बटन पर क्लिक करें। माइक्रोस्कोप रैपिड स्कैनिंग प्रोटोकॉल लोड करें, और 80 चक्रों के लिए डीआरजी में सहज गतिविधि रिकॉर्ड करें।

एक ऑर्थोगोनल प्रोजेक्शन मूवी उत्पन्न करें, और सत्यापित करें कि छवि विश्लेषण के लिए पर्याप्त गुणवत्ता की है। उत्तेजनाओं को लागू करने के लिए, माइक्रोस्कोप को 15 से 20 स्कैन करने के लिए सेट करें। बेसलाइन का उत्पादन करने के लिए स्कैन पूरा करने के लिए एक से पांच तक प्रतीक्षा करें।

स्कैन छह से 10 के दौरान उत्तेजना लागू करें। डिसेन्सिटाइजेशन को रोकने के लिए अगले एक को लागू करने से पहले प्रत्येक उत्तेजना के बाद कम से कम पांच मिनट प्रतीक्षा करें। एक यांत्रिक प्रेस के लिए, पंजे को छुए बिना पैडल के बीच पंजे के साथ एल्गोमीटर के पिंचर को पकड़ें।

स्कैन पांच के अंत के तुरंत बाद पंजे को पिंच करें और स्कैन 10 के तुरंत बाद रोक दें। एक एल्गोमीटर के साथ प्रेस बल की निगरानी करें, और सुनिश्चित करें कि यह वांछित बल पर 10 ग्राम से अधिक नहीं है। थर्मल उत्तेजनाओं के लिए, वांछित तापमान के ठीक ऊपर पानी के एक बीकर को गर्म करें।

जब पानी सही तापमान पर हो, तो पंजे को पानी में डुबोकर स्कैन पांच के तुरंत बाद उत्तेजना लागू करें। स्कैन 10 के तुरंत बाद बीकर को दूर खींचें। सर्जिकल एल 5 डीआरजी एक्सपोजर के बाद कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी ने पीआरटी-जीसीएएमपी 3 चूहों का उपयोग करके एक बार में 1,800 न्यूरॉन्स को चित्रित करने की अनुमति दी।

प्राथमिक संवेदी न्यूरॉन्स को उत्तेजनाओं की अनुपस्थिति में और उनके सामान्य शारीरिक संदर्भ में उत्तेजनाओं के जवाब में सहज कैल्शियम क्षणिकों के लिए जनसंख्या स्तर पर एक पहनावा में देखा गया था। मजबूत उत्तेजना या हानिकारक गर्मी ने कैल्शियम प्रतिक्रियाओं में वृद्धि की। 100 ग्राम के साथ दबाने की तुलना में, 300 ग्राम के साथ दबाने से कैल्शियम ट्रांसिएंट्स का उत्पादन करने वाले न्यूरॉन्स की संख्या में वृद्धि हुई और वक्र के नीचे एफ 0 क्षेत्र द्वारा डेल्टा एफ।

21 और 45 डिग्री सेल्सियस की गैर-हानिकारक तापमान सीमा में गर्म गर्मी ने कैल्शियम ट्रांसिएंट्स का उत्पादन करने वाले न्यूरॉन्स की संख्या में वृद्धि की और वक्र के नीचे एफ 0 क्षेत्र से डेल्टा एफ। गैर-हानिकारक तापमान ने 57 डिग्री सेल्सियस पर हानिकारक गर्मी उत्तेजना की तुलना में क्षणिक पैदा करने वाले न्यूरॉन्स की एक छोटी संख्या को सक्रिय किया। इसके अलावा, छोटे और मध्यम व्यास के न्यूरॉन्स ने सहज रूप से और सभी उत्तेजनाओं के तहत कैल्शियम क्षणिक का उत्पादन किया, लेकिन बड़े व्यास वाले न्यूरॉन्स ने केवल 300 ग्राम प्रेस उत्तेजना के जवाब में कैल्शियम क्षणिक का उत्पादन किया।

डीआरजी स्तर और इष्टतम ऑप्टिकल स्लाइस मोटाई होना चाहिए। यह ऐसा होना चाहिए कि आप अधिकतम संख्या में कोशिकाओं का पता लगा सकें और फिल्म में कोई नमी न हो। इस तकनीक का उपयोग सोमाटोसेंसेशन और स्वाद के लिए जनसंख्या स्तर पर संवेदी तौर-तरीकों का विश्लेषण करने और पुराने और न्यूरोपैथिक दर्द में योगदान देने वाले जोड़े या सिंक्रनाइज़ समूहों में सक्रिय आसन्न न्यूरॉन्स का अध्ययन करने के लिए किया गया है।