Summary
干细胞分化为胰岛细胞为传统的糖尿病治疗和疾病建模提供了另一种解决方案。我们描述了一种详细的干细胞培养方案，该方案将商业分化试剂盒与先前验证的方法相结合，以帮助在培养皿中产生分泌胰岛素的干细胞衍生胰岛。
Abstract
人类多能干细胞 （hPSC） 分化为分泌胰岛素的 β 细胞为研究 β 细胞功能和糖尿病治疗提供了材料。然而，在获得充分模拟天然人类β细胞的干细胞衍生的β细胞方面仍然存在挑战。在先前研究的基础上，已经生成了 hPSC 衍生的胰岛细胞，以创建具有改进的分化结果和一致性的方案。这里描述的方案在第 1-4 阶段使用胰腺祖细胞试剂盒，然后在第 5-7 阶段使用根据 2014 年发表的论文修改的方案（以下简称“R 协议”）。包括使用胰祖细胞试剂盒和 400 μm 直径微孔板生成胰祖细胞簇的详细程序、用于 96 孔静态悬浮形式内分泌分化的 R 方案，以及 hPSC 衍生胰岛的 体外 表征和功能评估。完整的方案需要 1 周进行初始 hPSC 扩增，然后需要 ~5 周才能获得产生胰岛素的 hPSC 胰岛。具有基本干细胞培养技术和生物测定培训的人员可以重现该协议。
Introduction
胰腺β细胞分泌胰岛素，对血糖水平的升高做出反应。由于 1 型糖尿病 （T1D）1 中 β 细胞的自身免疫性破坏或 2 型糖尿病 （T2D）2 中 β 细胞功能障碍而缺乏足够胰岛素分泌的患者通常使用外源性胰岛素进行治疗。尽管这种疗法可以挽救生命，但它无法精确地与真正的β细胞动态分泌胰岛素所实现的血糖精确控制相媲美。因此，患者经常遭受危及生命的低血糖发作和慢性高血糖波动引起的其他并发症的后果。人类尸体胰岛的移植成功地恢复了 T1D 患者的严格血糖控制，但受到胰岛供体可用性和纯化健康胰岛进行移植的困难的限制 3,4。原则上，这一挑战可以通过使用hPSC作为替代起始材料来解决。
目前在体外从 hPSC 产生胰岛素分泌胰岛的策略通常旨在模拟体内胚胎胰腺发育的过程 5,6。这需要了解负责任的信号通路，并定时添加相应的可溶性因子，以模拟发育中的胚胎胰腺的关键阶段。胰腺程序从确定的内胚层开始，其标志是转录因子叉头盒 A2 （FOXA2） 和性别决定区 Y-box 17 （SOX17）7。最终内胚层的连续分化包括形成原始肠管，形成表达胰腺和十二指肠同源框 1 （PDX1）7,8,9 的后前肠，以及上皮扩张为共表达 PDX1 和 NK6 同源框 1 （NKX6.1）10,11 的胰腺祖细胞。
对内分泌胰岛细胞的进一步承诺伴随着促内分泌主调节因子神经原蛋白-3 （NGN3）12 的瞬时表达以及关键转录因子神经元分化 1 （NEUROD1） 和 NK2 同源框 2 （NKX2.2） 13 的稳定诱导。随后对主要的激素表达细胞进行编程，例如产生胰岛素的 β 细胞、产生胰高血糖素的 α 细胞、产生生长抑素的 delta 细胞和产生胰腺多肽的 PPY 细胞。凭借这些知识，以及广泛的高通量药物筛选研究的发现，最近的进展使 hPSC 胰岛能够产生类似于 β 细胞的细胞，能够分泌胰岛素 14,15,16,17,18,19。
已经报道了产生葡萄糖反应性 β 细胞的分步方案 6,14,18,19。基于这些研究，本方案涉及使用胰腺祖细胞试剂盒在平面培养物中产生 PDX1+/NKX6.1+ 胰腺祖细胞，然后将微孔板聚集成大小均匀的簇，并在静态 3D 悬浮培养物中使用 R 方案进一步分化为分泌胰岛素的 hPSC 胰岛。进行质量控制分析，包括流式细胞术、免疫染色和功能评估，以严格表征分化细胞。本文详细介绍了定向分化的每个步骤，并概述了体外表征方法。
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Protocol
该协议基于在无饲养层条件下使用 hPSC 系，包括 H1、HUES4 PDXeG 和 Mel1 INSGFP/W。本节详细介绍了分步过程，并在代表性结果部分提供了来自Mel1 INSGFP/W 区分的支持数据。我们建议在使用此处未说明的其他 hPSC 细胞系时需要进一步优化。有关本方案中使用的所有试剂和溶液的详细信息，请参阅 材料表 。
1. 分化培养基及溶液的制备
注：有关要制备的所有溶液，请参见表 1 ，有关分化培养基，请参见 表2 。
- 在无菌生物安全柜中制备用于细胞培养的所有培养基和试剂。使用前，将细胞培养相关溶液和基础培养基在浴中短暂加热至37°C。
注意：如下所述，每天通过添加补充剂来制作新鲜的分化培养基，并在同一天使用。或者，胰腺祖细胞试剂盒提供了提前制备更大体积的选项，可以按照制造商的方案在几天内使用。事实证明，这两种培养基制备方法都行之有效。请注意，不建议将培养基长时间留在水浴中。每天准备新鲜培养基时，建议等分补充剂以避免反复冻融循环。
2. hPSCs分化为胰腺祖细胞
- 在mTeSR1完全培养基中维持基质胶包被血管上的未分化hPSC，并每天进行培养基更换。在维持培养期间，当细胞达到 ~70% 汇合度时，每 3-4 天传代一次 hPSC，使用遵循制造商方案的细胞解离试剂。为了开始分化，将细胞解离成单细胞，并将它们接种到6孔或12孔组织培养处理的板上（每孔的培养基体积分别为2 mL或1 mL）。
注意：有关内胚层基础培养基及其等分试样的储存相关说明，请参见 表 1 。 - 用符合hESC标准的基质胶（按照制造商的方案在冰冷的DMEM / F12中稀释）预包被培养孔，并将板置于潮湿的37°C，5%CO2 培养箱中30分钟。
- 将基质胶包被的板移至室温（在3小时内使用）。
- 从 hPSC 培养物中吸出用过的培养基，并用 DPBS 冲洗一次。在37°C下用细胞解离酶将hPSC培养物解离到单细胞中3-5分钟。加入温热的 DMEM/F12 培养基冲洗细胞，转移到 15 mL 或 50 mL 锥形管中，并以 300 × g 旋转 5 分钟。
- 用干细胞完全培养基加10μM Y-27632重悬细胞沉淀，并用血细胞计数器或自动细胞计数仪进行活细胞（台盼蓝阴性）计数。吸出稀释的基质胶，并立即在基质凝胶包被的孔上以1.60-1.80×105 /cm 2的密度接种活细胞，并在潮湿的37°C，5%CO2 培养箱中孵育24小时。进入第 1 阶段。
注意：这将导致 ~95% 的起始汇合以启动分化。根据制造商的协议，建议接种密度为 2.6 × 105/cm2 。建议测试各种接种密度，以确定细胞系的最佳值并检查细胞活力。如果存活率低于 80%，则不要进行分化。细胞活力低可能是由于收获过程中过度消化或过度研磨，或在接种前将细胞长时间留在 DMEM/F12 培养基中。 - 在第 1 阶段第 1 天，在浴中短暂加热内胚层基础培养基至 37°C 并解冻补充 MR 和 CJ。通过向内胚层基础培养基中加入补充 MR 和 CJ 来制备 1A 期培养基。搅拌均匀，立即使用。
- 从孔中吸出用过的培养基，加入Stage 1A培养基，并在加湿的37°C，5%CO2 培养箱中孵育24小时。
注意： 洗涤步骤是不必要的。在培养基更换前轻轻摇晃培养板，从培养物中去除任何未附着的细胞。在培养基去除过程中，不要将移液器吸头接触孔底，并通过温和的培养基添加，避免破坏单层。 - 在第 1 阶段第 2 天，在 37 °C 浴中短暂加热内胚层基础培养基并解冻补充剂 CJ。通过向内胚层基础培养基中加入补充CJ来制备1B期培养基。搅拌均匀，立即使用。
- 从孔中吸出用过的培养基，加入Stage 1B培养基，并在加湿的37°C，5%CO2 培养箱中孵育24小时。
- 在第 1 阶段第 3 天，重复步骤 2.8-2.9。进入 第 2 阶段。
- 在第 2 阶段第 1 天，在 37 °C 浴中加热胰腺 2-4 期基础培养基并解冻补充剂 2A 和 2B。 通过将补充剂 2A 和 2B 添加到胰腺 2-4 期基础培养基中来制备 2A 期培养基。搅拌均匀，立即使用。
- 从孔中吸出用过的培养基，加入Stage 2A培养基，并在加湿的37°C，5%CO2 培养箱中孵育24小时。
- 在第 2 阶段第 2 天，在 37 °C 浴中加热胰腺 2-4 期基础培养基并解冻补充剂 2B。 通过将补充剂 2B 添加到胰腺 2-4 期基础培养基中来制备 2B 期培养基。搅拌均匀，立即使用。
- 从孔中吸出用过的培养基，加入Stage 2B培养基，并在加湿的37°C，5%CO2 培养箱中孵育24小时。
- 在第 2 阶段第 3 天，重复步骤 2.13-2.14。进入 第 3 阶段。
- 在第 3 阶段第 1 天，在 37 °C 浴中加热胰腺阶段 2-4 基础培养基并解冻补充剂 3。通过将补充剂 3 添加到胰腺 2-4 期基础培养基中来制备第 3 阶段培养基。搅拌均匀，立即使用。
- 从孔中吸出用过的培养基，加入Stage 3培养基，并在潮湿的37°C，5%CO2 培养箱中孵育24小时。
- 在第 3 阶段第 2 天和第 3 天，重复步骤 2.16-2.17。进入 第 4 阶段。
- 在第 4 阶段第 1 天，在 37 °C 浴中加热胰腺 2-4 阶段基础培养基并解冻补充剂 4。通过将补充剂 4 添加到胰腺 2-4 期基础培养基中来制备第 4 阶段培养基。搅拌均匀，立即使用。
- 从孔中吸出用过的培养基，加入Stage 4培养基，并在加湿的37°C，5%CO2 培养箱中孵育24小时。
- 在第 4 阶段第 2 天到第 4 天，重复步骤 2.19-2.20。继续执行聚合步骤。
3. 使用直径为 400 μm 的微孔板聚集成胰腺祖细胞簇
- 在第 4 阶段第 5 天，每孔用 500 μL 抗粘附冲洗溶液预处理微孔（例如，24 孔板形式）。
- 制备平衡板并将微孔板以1,300× g 离心5分钟。
注意：在显微镜下检查板，以确保微孔中没有气泡。如果气泡仍被困在任何微孔中，则再次离心5分钟。 - 从孔中吸出抗粘附冲洗液，并用 1 mL DPBS 冲洗一次。从孔中吸出 DPBS，并向每个孔中加入 1 mL 聚集培养基。
- 从胰腺祖细胞培养物中取出用过的培养基，并用DPBS洗涤一次。用解离试剂在37°C下将培养物解离成单细胞10-12分钟。用温热的DMEM / F12冲洗细胞，将它们转移到管中，并以300× g 旋转5分钟。
- 将细胞沉淀重悬于聚集培养基中并进行活细胞计数。接种每孔 2.4-360 万个细胞（即每微孔 2,000-3,000 个细胞），并向每个孔中加入聚集培养基，以达到每孔 2 mL 的最终体积。
- 用P1000移液器吸头轻轻地上下移液细胞数次，以确保细胞在整个孔中均匀分布。不要将气泡引入微孔中。将微孔板以300× g 离心5分钟，以捕获微孔中的细胞。将微孔板在加湿的37°C，5%CO2 培养箱中孵育24小时，并进行第5-7阶段分化。
注意： 注意不要在聚集期间打扰板。可能需要长达 48 小时的孵育时间才能实现最佳聚集体形成。
4. 试剂盒衍生的胰腺祖细胞簇分化为hPSC胰岛
- 在第5阶段第1天，在37°C浴中加热第 5-7阶段的基础培养基并解冻补充剂（见表 1 和 表2）。通过向 5-7 期基础培养基中添加添加剂（至最终工作浓度）来制备第 5 阶段培养基。搅拌均匀，立即使用。
- 聚集体形成后，用P1000移液器吸头轻轻地上下移液聚集体数次，以浮动任何未聚集的细胞。让聚集体在重力作用下沉降（等待~1分钟）。尽可能轻轻地从孔中取出用过的培养基（含有漂浮的非聚集细胞），同时避免吸出聚集体。
- 将新鲜的 Stage 5 培养基用力分配到微孔板的表面上，以从微孔中去除聚集体。将聚集体转移到超低附着 （ULA） 6 孔中。用Stage 5培养基冲洗一次，以从微孔中完全回收聚集体。
- 收集 ULA 6 孔中的所有聚集体，将聚集体重悬于 Stage 5 培养基中，并将密度调整为每 100 μL 20 个簇（例如，预计从每个孔中回收 ~1,200 个簇。将 1,200 个簇重悬于 6 mL 第 5 阶段培养基中）。使用多通道移液器将 50 μL 第 5 阶段培养基分配到 ULA 平底 96 孔板的每个孔中。用 200 μL DPBS 填充角孔和边缘孔。
注意：避免使用边缘孔培养聚集体，因为它们容易蒸发更多;否则，使用设计用于最大限度地减少沿边缘蒸发的 96 孔板（例如，带有内置护城河的 96 孔板）或将培养板置于高湿度微气候细胞培养箱中。 - 将 100 μL 簇重悬液加入 ULA 平底 96 孔板的每个孔中，得到总共 150 μL 培养基，平均每孔含有 20 个簇。
注意：在分配到 96 孔中之前，每次轻轻混合簇重悬液。 - 将培养板放在湿润的37°C，5%CO2 培养箱中的水平表面上24小时。
- 在第 5 阶段第 2 天，按照步骤 4.1 制备第 5 阶段培养基。
- 使用多通道移液器从每个孔中取出~90 μL用过的培养基，并用100 μL Stage 5培养基刷新。
- 在第 5 阶段第 3 天，重复步骤 4.7-4.8。进入 第 6 阶段。
- 在第 6阶段第1天，在37°C浴中加热第5-7阶段的基础培养基并解冻补充剂（见表 1 和 表2）。通过向 5-7 期基础培养基中添加添加剂（至最终工作浓度）来制备第 6 阶段培养基。搅拌均匀，立即使用。
- 使用多通道移液器取出 ~90 μL 用过的培养基，每孔用 100 μL 第 6 阶段培养基刷新。
- 在第 6 阶段第 2 天到第 8 天，重复步骤 4.10-4.11。进入 第 7 阶段。
- 在第7阶段第1天，在37°C浴中加热第 5-7阶段的基础培养基并解冻补充剂（见表 1 和 表2）。通过向第 5-7 阶段基础培养基中添加添加剂（至最终工作浓度）来制备第 7 阶段培养基。搅拌均匀，立即使用。
- 使用多通道移液器除去 ~90 μL 用过的培养基，每孔用 100 μL Stage 7 培养基刷新。
- 在第 7 阶段第 2 天到第 12 天，重复步骤 4.13-4.14。继续进行 体外 表征。
5. 流式细胞术分析
- 取出培养基并用DPBS洗涤一次。通过在37°C下孵育10-12分钟，将培养物（平面祖细胞或分化簇）解离为单细胞。用FACS缓冲液冲洗并以300× g 旋转5分钟。
- 将细胞沉淀重悬于FACS缓冲液中并进行细胞计数。以 300 × g 旋转细胞 5 分钟。在室温下将单个细胞重悬于 500 μL 固定/Perm 缓冲液中 10 分钟。
注意：使用前将 Fix/Perm 缓冲液置于室温。Fix/Perm 缓冲液含有多聚甲醛 （PFA）。小心地在通风橱中处理 PFA，并按照机构指南进行处理。 - 以 500 × g 旋转 3 分钟，用 500 μL 1x Perm/Wash 缓冲液洗涤两次，然后重悬于 300 μL 1x Perm/Wash 缓冲液中。将 100 μL 单细胞重悬液（每个含有 2.5-3 × 105 个细胞）转移到三个微量离心管中，用于未染色对照、同种型对照和抗体染色（样品抗体和稀释信息参见 材料表 ）。在室温下孵育45分钟，并用箔覆盖。
- 以 500 × g 旋转 3 分钟。用 500 μL 1x Perm/Wash 缓冲液洗涤两次。将样品重悬于100μL的FACS缓冲液中，并用流式细胞仪和软件（例如FlowJo）分析染色的细胞（参见特定阶段标记物细胞内染色 的材料表 ）。
注意：如果未立即测定样品，请将其储存在避光的 4°C 下。对于门控策略，首先通过散射特性（FSC-A 和 SSC-A）对流动数据进行门控，以去除小的细胞碎片，然后通过 FSC-A 和 FSC 宽度特性来识别单线态。阳性和阴性门控由干细胞对照和/或未染色的同型对照确定。
6. 全挂片免疫染色
- 将簇收集在微量离心管中。通过重力沉降集群。吸出用过的培养基，并用 1 mL PBS（含钙和镁）冲洗一次。用 1 mL 4% PFA 在 4°C 下固定簇过夜。
- 用PBST冲洗一次，并在环境温度下在微量离心管中用500μL0.3%TritonX-100在倾斜振荡器上透化20-30簇至少6小时。
注意：大型簇需要更长的透化时间（长达 24 小时）。 - 将簇在环境温度下在100μL封闭缓冲液中在倾斜振荡器上孵育1小时。取出封闭缓冲液，并将簇与在室温下在抗体稀释缓冲液中稀释的 100 μL 一抗在倾斜振荡器上孵育过夜。
注意：如果成像过程中背景很强，请与一抗在4°C下孵育。 - 在倾斜振荡器上用 500 μL PBST 彻底洗涤 3 x 30 分钟（倾斜角度设置为 8，速度设置为 20）。
- 将簇与100μL二抗在抗体稀释缓冲液中在室温下在倾斜振荡器上孵育过夜。用箔纸盖住管子。
注意：如果成像过程中背景很强，请在4°C下与二抗一起孵育。 - 用 500 μL PBST 冲洗一次。加入 100 μL 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚 （DAPI） 溶液（10 μg/mL 的 PBST 溶液），并在室温下染色 10-15 分钟。用箔纸盖住并避光。
- 在倾斜摇床上用 500 μL PBST 彻底洗涤 3 x 30 分钟。在洗涤步骤中用箔纸盖住管子。
- 根据制造商的方案和公布的方案20,21，将簇连接到预涂有组织粘合剂的成像室载玻片（参见材料表）上。
- 用组织透明培养基（PBS溶液中的80%甘油）安装，并用玻璃盖玻片盖住。在共聚焦成像之前避光。
注意：如果样品未立即成像，请将其储存在避光的4°C下。
7. 静态GSIS测定
- 在37°C浴中加热低葡萄糖Kreb's Ringer碳酸氢盐（3.3G KRB）缓冲液，高葡萄糖（16.7G）KRB缓冲液和30mM KCl KRB缓冲液。
- 手工挑选大小匹配的簇，并用 2 mL 温热的 3.3G KRB 缓冲液冲洗。将簇转移到非组织培养处理的6孔板中，并在2mL或温热的3.3G KRB缓冲液中在潮湿的37°C，5%CO2 培养箱中平衡1小时。
- 平衡后，用 100 μL 温热的 3.3G KRB 缓冲液填充测定室（参见 材料表）。手动挑选五个簇并将它们转移到测定室的中心。在加湿的37°C，5%CO2 培养箱中孵育30分钟。
注意：使用 10 μL 移液器吸头以最小的培养基体积转移簇。 - 小心地收集~100μL上清液并将其储存在-30°C，直到测量基础胰岛素分泌（参见步骤7.9）。在此步骤中，不要干燥或丢失任何簇。立即将100μL温热的16.7G KRB缓冲液加入测定室中，并在潮湿的37°C，5%CO2 培养箱中孵育相同的簇30分钟。
- 小心地收集~100μL上清液并将其储存在-30°C，直到测量葡萄糖刺激的胰岛素分泌（参见步骤7.9）。立即将100μL温热的30mM KCl KRB缓冲液加入测定室中，并在潮湿的37°C，5%CO2 培养箱中孵育相同的簇30分钟。
- 小心地收集~100μL上清液并储存在-30°C，直到测量KCl刺激的胰岛素分泌（参见步骤7.9）。立即向测定室中加入 100 μL RIPA 裂解缓冲液，并将含有所有五个簇的裂解缓冲液转移到微量离心管中。
- 可选）用P200移液器吸头通过剧烈研磨手动打破簇。涡旋 30 秒，在冰上孵育 30 分钟，然后再涡旋 30 秒。
注意：通过涡旋和足够的冰孵育时间确保完全裂解。 - 以 8,000 × g 旋转 1 分钟。收集上清液并储存在-30°C直至测量总胰岛素含量（参见步骤7.9）。
- 根据制造商的方案和公布的方案20,22，使用人胰岛素ELISA试剂盒测量上清液样品中的人胰岛素。
注意：避免上清液样品反复冻融。不应测定超过三个冻融循环的样品。
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Representative Results
我们开发了一种混合策略，通过七个步骤将干细胞分化为分泌胰岛素的 hPSC 胰岛，该策略在平面培养的前四个阶段使用胰腺祖细胞试剂盒，然后在最后三个阶段的静态悬浮培养中以先前报道的方法6 为基础（图 1).使用该方案，确保在细胞接种后 24 小时（第 0 阶段）进行接近汇合 （90%-100%） 的培养对于启动大多数 hPSC 系的有效分化至关重要（图 2A）。强烈建议测试不同的接种密度，以确定特定细胞系的最佳条件。在第 1 阶段培养期间，培养基可能会因漂浮的死细胞而出现浑浊，这在此阶段很常见。只要附着的细胞完全覆盖容器表面，这不会影响试剂盒的分化效率。在第 2-4 阶段，随着细胞增殖和细胞死亡减少，单层变得更加压实，用过的培养基不像第 1 阶段那样浑浊（图 2A）。正如胰岛素报告基因 Mel1 INSGFP/W hESC 所证明的那样，第 1 阶段结束时至少 95% 的 FOXA2+/SOX17+ 确定性内胚层细胞和第 4 阶段结束时的 80% PDX1+/NKX6.1+ 胰腺祖细胞可以常规实现（图 2B-E）。胰腺祖细胞从平面培养到悬浮培养的转变已被证明可以促进随后的内分泌细胞诱导23,24。在这个更新的方案中，我们使用微孔板并允许24小时的细胞聚集。这一次产生数千个大小和形态均匀的胰腺祖细胞簇（图3A，B），平均聚集效率（通过计算掺入聚集体的细胞百分比）为74.1%±4.4%（图3C）。重要的是，PDX1 和 NKX6.1 的表达在聚集后这些簇中的表达保持在高水平（图 3D，E），这表明使用分化试剂盒和微孔板在体外有效生产胰腺祖细胞。
接下来，我们使用 R 方案（一种从 Rezania 等人 6 修改的方法）在静态悬浮培养系统中使用 ULA 平底 96 孔板进行最后 3 阶段分化，以进一步将这些试剂盒衍生的胰腺祖细胞分化为 hPSC 胰岛（图 1）。胰岛素表达细胞在内分泌簇中逐渐诱导，如活培养物中随时间增加的INS-GFP信号所示（图4A，B）。簇大小的量化表明，第 5 阶段团簇的平均直径为 150 μm，到第 7 阶段，平均直径增加到 220 μm（图 4C）。这些簇在第 5 阶段和第 7 阶段之间生长时主要保持其光滑的球形外观，这表明与基于轨道振荡器的悬浮培养物（通常产生一些超大的簇）相比，静态培养方法限制了簇丛结（通常产生一些超大的簇）25。维持具有光滑球形形态的致密簇是分化细胞良好活力的指标，这对于最终成功分化为功能性 hPSC 胰岛非常重要。
细胞组成的表征表明，混合方案产生的 7 期 hPSC 胰岛主要是内分泌的，由四种主要的胰岛细胞类型组成，包括胰岛素阳性 β 细胞、胰高血糖素阳性 α 细胞、生长抑素阳性 δ 细胞和胰腺多肽阳性 PPY 细胞，同时也存在肠嗜铬细胞（来源于脱靶谱系26）（图 5A-C）).值得注意的是，这种混合方案主要产生单激素胰岛细胞（~50% CPEP+/GCG-/SST-细胞、~17% GCG+/CPEP-细胞和~12%SST+/CPEP-细胞）和少数双激素细胞（CPEP+/GCG+或CPEP+/SST+）在第 7 阶段培养物中（图 5B-D）。对 7 期 hPSC 胰岛中几个关键转录因子和成熟 β 细胞标志物的检查表明，分化 β 细胞表达 PDX1、NKX6.1、NEUROD1、MAFA 和葡萄糖转运蛋白 GLUT1（图 6A）。此外，在 7 期培养物中诱导 ~60% INS+/PDX1+ 细胞（图 6B）和 50% CPEP+/NKX6.1+ 细胞（图 6C），这表明使用此处介绍的杂交策略可有效生成功能性 β 细胞。事实上，体外静态葡萄糖刺激的胰岛素分泌 （GSIS） 测定表明，第 7 阶段 hPSC 胰岛可以分泌高水平的胰岛素，对高血糖和直接去极化都有反应（图 6D）。虽然这一功能令人鼓舞，但就胰岛素分泌量而言，hPSC-胰岛的体外葡萄糖反应性仍然不等同于尸体胰岛（图6D），hPSC-胰岛的总胰岛素含量约为尸体胰岛的一半（图6E）。需要持续优化才能获得具有更成熟 β 细胞表型的 hPSC 胰岛。
图1： 体外产生功能性hPSC胰岛的分化方案概述。 工作流程图概述了使用胰祖细胞试剂盒在平面培养中将 hPSC 分化为胰腺祖细胞、使用微孔板聚集到胰腺祖细胞簇以及在静态悬浮培养中向 hPSC 胰岛过渡所涉及的七步程序。在整个研究中，使用胰岛素报告基因 hESC 系 Mel1 INSGFP/W 作为示例来证明这种混合方法的功效。缩写：hPSCs=人类多能干细胞;GSIS = 葡萄糖刺激的胰岛素分泌。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 2：使用胰腺祖细胞试剂盒将 hPSC 定向分化为胰腺祖细胞。 （A） 具有代表性的相差图像，显示指定阶段的细胞形态。比例尺 = 750 μm。 （B、C） （B） 1 期确定性内胚层细胞 （FOXA2+/SOX17+） 和 （C） 4 期胰腺祖细胞 （PDX1+/NKX6.1+） 关键标志物的代表性流式细胞术图。（D） PDX1（红色）和 NKX6.1（绿色）胰腺祖细胞的代表性免疫染色图像。细胞核用DAPI（蓝色）染色。比例尺 = 200 μm。 （E） 第 4 阶段第 4 天胰腺祖细胞中 PDX1+/NKX6.1+ 细胞的流式细胞术定量（n = 5 个生物学重复）。缩写：hPSCs=人类多能干细胞;DAPI = 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3：使用直径为 400 μm 的微孔板聚集成大小均匀的胰腺祖细胞簇。 （A） 第 4 阶段结束时的代表性相差图像，显示了微孔中和从微孔中取出后的簇形态。比例尺 = 300 μm。 （B） 第 4 阶段结束时簇直径的量化（n = 来自 3 个生物学重复的 60 个簇）。（C） 第 4 阶段结束时的聚集效率量化（n = 5 次生物学重复）。（D） PDX1（红色）和 NKX6.1（绿色）胰腺祖细胞簇的代表性免疫染色图像。细胞核用DAPI（蓝色）染色。比例尺 = 100 μm。 （E） 第 4 阶段第 5 天胰腺祖细胞聚集体中 PDX1+/NKX6.1+ 细胞的流式细胞术定量（n = 4 个生物学重复）。简称：DAPI=4'，6-二脒基-2-苯基吲哚。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4：在静态悬浮培养系统中胰腺祖细胞分化为 hPSC 胰岛 。 （A） 代表性相差图像（上图）和荧光图像（下图），显示指定阶段的簇形态和胰岛素表达模式。比例尺 = 300 μm。 （B） 在指定阶段（n = 来自两个生物学重复的 30 个簇）每个簇的平均 INS-GFP 荧光强度的定量。（C） 在指定阶段对簇直径进行定量（n = 60 个簇，来自三个生物学重复）。缩写：hPSC = 人多能干细胞;INS = 胰岛素;GFP = 绿色荧光蛋白。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 5：第 7 阶段 hPSC 胰岛细胞组成的表征。 （A） 第 7 阶段 hPSC 胰岛的代表性免疫染色图像，显示不同的细胞类型（SYN，泛内分泌标志物;CK19，导管标志物;INS-GFP，胰岛素由报告基因GFP信号指示;GCG;海温;PPY;ENC被SLC18A1抗体）染色）。细胞核用DAPI（蓝色）染色。比例尺 = 100 μm。 （B，C） 7 期 hPSC 胰岛中 （B） CPEP+ 和 GCG+ 细胞百分比的代表性流式细胞术图，以及 （C） 7 期 hPSC 胰岛中 CPEP+ 和 SST+ 细胞百分比的代表性流式细胞术图。（D） 流式细胞术定量第 7 阶段 hPSC 胰岛中指示的细胞标志物（n = 4 个生物学重复）。缩写：hPSC = 人多能干细胞;INS=胰岛素;GFP = 绿色荧光蛋白;SYN = 突触素;GCG = 胰高血糖素;SST = 生长抑素;PPY = 胰腺多肽;ENC = 肠嗜铬素;CPEP = C肽;DAPI = 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚。请点击这里查看此图的较大版本.
图 6：第 7 阶段 hPSC 胰岛的体外表征和功能评估。 （A） 第 7 阶段 hPSC 胰岛的代表性免疫染色图像，显示胰岛素（由报告基因 INS-GFP 信号指示）与几个关键 β 细胞标志物（如 NKX6.1、MAFA、NEUROD1、PDX1 和葡萄糖转运蛋白 GLUT1）共表达。细胞核用DAPI（蓝色）染色。比例尺 = 100 μm。 （B，C） INS+/PDX1+ 细胞的 （B） 百分比和 CPEP+/NKX6.1+ 细胞的 （C） 百分比的代表性流式细胞术图。（D） 静态 GSIS 测定显示 7 期 hPSC 胰岛（n = 6，包括 3 个生物学和 2 个技术重复）和人胰岛（n = 6，包括 3 个生物学和 2 个技术重复）对高葡萄糖（16.7 G、16.7 mM 葡萄糖）和 30 mM KCl 去极化的反应。数据以 SEM ±平均值表示。使用未配对的双尾 t 检验 （**p < 0.01） 比较两个指示组。（E） 第 7 阶段 hPSC 胰岛（n = 6，包括 3 个生物学和 2 个技术重复）和人胰岛（n = 6，包括 3 个生物学和 2 个技术重复）的总胰岛素含量。采用未配对双尾t检验（*p < 0.05）比较两组。缩写：hPSC = 人多能干细胞;INS = 胰岛素;GFP = 绿色荧光蛋白;DAPI = 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚。请点击这里查看此图的较大版本.
表1：本协议中使用的所有溶液和培养基的配方。请按此下载此表格。
表 2：第 1-7 阶段分化培养基的配方。 该表提供了制备阶段 1-7 分化培养基的配方。 请按此下载此表格。
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Discussion
本文描述了一种七阶段混合方案，该方案允许在体外培养后 40 天内产生能够在葡萄糖激发时分泌胰岛素的 hPSC 胰岛。在这些多个步骤中，有效诱导最终内胚层被认为为最终分化结果设定了重要的起点 18,27,28。在制造商的方案中，建议接种密度为2.6×105 / cm 2以启动分化，并将细胞暴露于第1阶段培养基中2天。为确保细胞在第 1 天达到接近汇合 （90%-100%），我们强烈建议在使用新的 hPSC 细胞系时测试接种密度，因为最佳接种密度可能会有所不同。例如，在我们手中测试的所有三个 hPSC 系中，发现 1.6-1.80 × 10 5/cm 2，而不是 2.60 ×10 5/cm2，是最佳接种密度。将第 1 阶段的培养时间从 2 天延长到 3 天，在 1B 期培养基中增加一天，可将 FOXA2+/SOX17+ 细胞的纯度从 80% 提高到 > 93%（数据未显示）。如果 FOXA2+/SOX17+ 细胞的比例在第 1 阶段结束时低于 70%，则 PDX1+ 细胞和 PDX1+/NKX6.1+ 细胞的诱导可能会受到影响。
需要注意的是，在整个 1 期培养过程中可能会观察到一些细胞死亡，而附着的细胞需要覆盖 100% 的表面积。在第 2-4 阶段，细胞死亡的减少与细胞增殖同时导致细胞致密和多层，据报道，这对于有效诱导胰腺祖细胞标志物 PDX1 和 NKX6.1 及其核定位至关重要29,30。在第 4 阶段的最后一天，使用 AggreWell 直径 400 μm 的微孔板将细胞解离并聚集成簇。与悬浮聚集、手动聚集或使用 U 底 96 孔板等其他方法相比，AggreWell 聚集可生成数千个大小均匀的球形簇，说明了该方法的稳健性。
对于静态 3D 培养中第 5-7 阶段的内分泌诱导，我们将平均数量的 ~20 个试剂盒衍生的胰腺祖细胞簇转移到 ULA 平底 96 孔板的每个孔中。这种方法大大减少了超大簇的形成并提高了细胞活力，可能是通过限制簇融合和/或降低轨道振荡器培养过程中剪切应力介导的细胞损失。为了去除用过的培养基中的漂浮死细胞，同时降低培养基更换过程中丢失簇的风险，我们建议刷新培养基总体积的三分之二左右。我们注意到，这种部分培养基变化不会妨碍内分泌分化，相反，当在不同阶段之间切换时，可能会提供温和的过渡。然而，当从平面培养过渡到静态悬浮培养时，在5期和6期早期，这种混合方案仍可能观察到一些细胞死亡。报告基因 hPSC 系（例如，Mel1 INSGFP/W hESC）可用于监测活体培养物的晚期分化。运行流式细胞术将有助于在第 5 阶段结束时检查 NKX6.1+/NEUROD1+，在第 6 阶段结束时检查 INS+/NKX6.1+，在第 7 阶段结束时检查 CPEP+/NKX6.1+。有效诱导与 NKX6.1 共表达的 CPEP+ 群体对于实现 β 细胞中的葡萄糖反应性至关重要31,32。在这方面，该方案在生成的 7 期 hPSC 胰岛中始终产生 >50% CPEP+/NKX6.1+ 细胞，这些细胞可以分泌胰岛素以响应体外高葡萄糖挑战。
尽管目前的方案已经证明了产生胰岛素的hPSC胰岛的有效生成，但这种方法存在局限性。在第 4 阶段结束时，使用这种胰腺祖细胞组合与各种 hPSC 细胞系（尤其是 iPSC）的分化效率仍可能有所不同（数据未显示）。优化应根据具体情况进行。该方法用于最后三个分化阶段，依赖于在 96 孔板中使用静态悬浮培养，这是劳动密集型且不可扩展的，因此将其用途限制为仅用于研究。虽然获得胰岛素分泌能力是令人鼓舞的，但hPSC胰岛的 体外 葡萄糖反应性和胰岛素含量明显低于尸体胰岛。未来仍需继续努力进行方案优化。尽管存在这些局限性，但我们认为这里介绍的方案提供了适用于筛选分化诱导因子和胰岛激素分泌调节因子以及模拟胰岛细胞功能障碍的 hPSC 衍生材料。
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Disclosures
Timothy J. Kieffer 在准备这份手稿时是 ViaCyte 的一名员工。其他作者声明没有竞争利益。
Acknowledgments
我们非常感谢 STEMCELL Technologies、Michael Smith Health Research BC、Stem Cell Network、JDRF 和加拿大卫生研究院的支持。Jia Zhao 和 Shenghui Liang 是 Michael Smith Health Research BC 实习生奖的获得者。Mitchell J.S. Braam 是 Mitacs Accelerate Fellowship 的获得者。Diepiriye G. Iworima 是 Alexander Graham Bell 加拿大研究生奖学金和 CFUW 1989 年巴黎综合理工学院纪念奖的获得者。我们衷心感谢来自MCRI和莫纳什大学的Edouard G. Stanley博士分享Mel1 INS GFP / W 系和阿尔伯塔省糖尿病研究所胰岛核心分离和分布人类胰岛。我们还要感谢不列颠哥伦比亚大学生命科学研究所成像和流式细胞术设施的支持。 图 1 是使用 BioRender.com 创建的。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3,3’,5-Triiodo-L-thyronine (T3) | Sigma | T6397 | Thyroid hormone |
| 4% PFA solution | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | Should be handled in fume hood |
| 96-Well, Ultralow Attachment, flat bottom | Corning Costar (VWR) | CLS3474 | Flat bottom; for static suspension culture in the last three stages |
| Accutase | STEMCELL Technologies | 07920 | Dissociation reagent for Stage 4 cells |
| Aggrewell400 plates | STEMCELL Technologies | 34415 | 400 µm diameter microwell plates |
| Aggrewell800 plates | STEMCELL Technologies | 34815 | 800 µm diameter microwell plates |
| Alexa Fluor 488 Goat anti-Human FOXA2 (goat IgG) | R&D Systems | IC2400G | 1:100 in flow cytometry; used for assaying Stage 1 cells |
| Alexa Fluor 488 Goat IgG Isotype Control | R&D Systems | IC108G | 1:100 in flow cytometry |
| Alexa Fluor 488 Mouse anti-Human SST (mouse IgG2B) | BD Sciences | 566032 | 1:250 in flow cytometry; used for assaying Stage 7 cells |
| Alexa Fluor 488 Mouse IgG2B Isotype Control | R&D Systems | IC0041G | 1:500 in flow cytometry |
| Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human C-peptide (mouse IgG1κ) | BD Pharmingen | 565831 | 1:2,000 in flow cytometry; used for assaying Stage 7 cells |
| Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human INS (mouse IgG1κ) | BD Sciences | 565689 | 1:2,000 in flow cytometry |
| Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human NKX6.1 (mouse IgG1κ) | BD Sciences | 563338 | 1:33 in flow cytometry; used for assaying Stage 4 cells |
| Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human SOX17 (mouse IgG1κ) | BD Sciences | 562594 | 1:50 in flow cytometry; used for assaying Stage 1 cells |
| Alexa Fluor 647 Mouse IgG1κ Isotype Control | BD Sciences | 557714 | 1:50 in flow cytometry |
| ALK5i II | Cayman Chemicals | 14794 | TGF-beta signaling inhibitor |
| Anti-Adherence Rinsing Solution | STEMCELL Technologies | 7010 | Microwell Rinsing Solution |
| Assay chamber | Cellvis | D35-10-1-N | For static GSIS and confocal imaging purposes |
| Bovine serum albumin (BSA) | Thermo Fisher Scientific | BP1600-100 | For immunostaining procedure |
| CK19 antibody | DAKO | M0888 | 1:50 in whole mount immunofluorescence |
| D-glucose | Sigma | G8769 | Medium supplement |
| DAPI | Sigma | D9542 | For nuclear counterstaining |
| DMEM/F12, HEPES | Thermo Fisher Scientific | 11330032 | Matrix diluting solution |
| Donkey anti-goat Alexa Fluor 555 | Life technologies | A21432 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-goat Alexa Fluor 647 | Life technologies | A21447 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-mouse Alexa Fluor 555 | Life technologies | A31570 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-mouse Alexa Fluor 647 | Life technologies | A31571 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 555 | Life technologies | A31572 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 647 | Life technologies | A31573 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-sheep Alexa Fluor 647 | Life technologies | A21448 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| DPBS | Sigma | D8537 | Without Ca2+ and Mg2+ |
| ELISA, insulin, human | Alpco | 80-INSHU-E01.1 | For human insulin measurement |
| Fatty acid-free BSA | Proliant | 68700 | Medium supplement |
| Fixation and Permeabilization Solution Kit | BD Sciences | 554714 | Fix/Perm and 10x Perm/Wash solutions included |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | STEMCELL Technologies | 7174 | For clump passaging hPSCs during maintenance culture |
| Glucagon antibody | Sigma | G2654 | 1:400 in whole mount immunofluorescence |
| GLUT1 antibody | Thermo Fisher Scientific | PA1-37782 | 1:200 in whole mount immunofluorescence |
| GlutaMAX-I (100x) | Gibco | 35050061 | L-glutamine supplement |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific | G33-4 | For tissue clearing and mounting |
| GSi XX | Sigma Millipore | 565789 | Notch inhibitor |
| Heparin | Sigma | H3149 | Medium supplement |
| ITS-X (100x) | Thermo Fisher Scientific | 51500056 | Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine; medium supplement |
| LDN193189 | STEMCELL Technologies | 72147 | BMP antagonist |
| MAFA antibody | Abcam | ab26405 | 1:200 in whole mount immunofluorescence |
| Matrigel, hESC-qualified | Thermo Fisher Scientific | 08-774-552 | Extracellular matrix for vessel surface coating |
| MCDB131 medium | Life technologies | 10372019 | Base medium |
| mTeSR1 Complete Kit | STEMCELL Technologies | 85850 | stem cell medium and 5x supplement included |
| N-Cys (N-acetyl cysteine) | Sigma | A9165 | Antioxidant |
| NaHCO3 | Sigma | S6297 | Medium supplement |
| NEUROD1 antibody | R&D Systems | AF2746 | 1:20 in whole mount immunofluorescence |
| NKX6.1 antibody | DSHB | F55A12-c | 1:50 in whole mount immunofluorescence |
| Pancreatic polypeptide antibody | R&D Systems | AF6297 | 1:200 in whole mount immunofluorescence |
| PBS | Sigma | D8662 | With Ca2+ and Mg2+ |
| PDX1 antibody | Abcam | ab47267 | 1:200 in whole mount immunofluorescence |
| PE Mouse anti-Human GCG (mouse IgG1κ) | BD Sciences | 565860 | 1:2,000 in flow cytometry; used for assaying Stage 7 cells |
| PE Mouse anti-Human NKX6.1 (mouse IgG1k) | BD Sciences | 563023 | 1:250 in flow cytometry |
| PE Mouse anti-Human PDX1 (mouse IgG1k) | BD Sciences | 562161 | 1:200 in flow cytometry; used for assaying Stage 4 cells |
| PE Mouse IgG1κ Isotype Control | BD Sciences | 554680 | 1:2,000 in flow cytometry |
| PE Mouse-Human Chromogranin A (CHGA, mouse IgG1k) | BD Sciences | 564563 | 1:200 in flow cytometry |
| R428 | Cayman Chemicals | 21523 | AXL tyrosine kinase inhibitor |
| Retinoid acid, all-trans | Sigma | R2625 | Light-sensitive |
| RIPA lysis buffer, 10x | Sigma | 20-188 | For hormone extraction |
| SANT-1 | Sigma | S4572 | SHH inhibitor |
| SLC18A1 antibody | Sigma | HPA063797 | 1:200 in whole mount immunofluorescence |
| Somatostatin antibody | Sigma | HPA019472 | 1:100 in whole mount immunofluorescence |
| STEMdiff Pancreatic Progenitor Kit | STEMCELL Technologies | 05120 | Basal media and supplements included |
| Synaptophysin antibody | Novus | NB120-16659 | 1:25 in whole mount immunofluorescence |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | For permeabilization |
| Trolox | Sigma Millipore | 648471 | Vitamin E analog |
| TrypLE Enzyme Express | Life technologies | 12604-021 | cell dissociation enzyme reagent for single cell passaging hPSCs |
| Trypsin1/2/3 antibody | R&D Systems | AF3586 | 1:25 in whole mount immunofluorescence |
| Y-27632 | STEMCELL Technologies | 72304 | ROCK inhibitor |
| Zinc sulfate | Sigma | Z0251 | Medium supplement |
References
- Atkinson, M. A., Eisenbarth, G. S., Michels, A. W.
- Petersen, M. C., Shulman, G. I.
- Shapiro, A. M., et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. The New England Journal of Medicine. 343 (4), 230-238 (2000).
- Gamble, A., Pepper, A. R., Bruni, A., Shapiro, A. M. J. The journey of islet cell transplantation and future development. Islets. 10 (2), 80-94 (2018).
- Pagliuca, F. W., et al. Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro. Cell. 159 (2), 428-439 (2014).
- Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (11), 1121-1133 (2014).
- Jennings, R. E., et al. Development of the human pancreas from foregut to endocrine commitment. Diabetes. 62 (10), 3514-3522 (2013).
- Jorgensen, M. C., et al. An illustrated review of early pancreas development in the mouse. Endocrine Reviews. 28 (6), 685-705 (2007).
- Jensen, J. Gene regulatory factors in pancreatic development. Developmental Dynamics. 229 (1), 176-200 (2004).
- Hald, J., et al. Generation and characterization of Ptf1a antiserum and localization of Ptf1a in relation to Nkx6.1 and Pdx1 during the earliest stages of mouse pancreas development. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (6), 587-595 (2008).
- Villasenor, A., Chong, D. C., Henkemeyer, M., Cleaver, O. Epithelial dynamics of pancreatic branching morphogenesis. Development. 137 (24), 4295-4305 (2010).
- Rukstalis, J. M., Habener, J. F. Neurogenin3: a master regulator of pancreatic islet differentiation and regeneration. Islets. 1 (3), 177-184 (2009).
- Mastracci, T. L., Anderson, K. R., Papizan, J. B., Sussel, L. Regulation of Neurod1 contributes to the lineage potential of Neurogenin3+ endocrine precursor cells in the pancreas. PLoS Genetics. 9 (2), e1003278 (2013).
- Balboa, D., et al. Functional, metabolic and transcriptional maturation of human pancreatic islets derived from stem cells. Nature Biotechnology. 40 (7), 1042-1055 (2022).
- Du, Y., et al. Human pluripotent stem-cell-derived islets ameliorate diabetes in non-human primates. Nature Medicine. 28 (2), 272-282 (2022).
- Hogrebe, N. J., Augsornworawat, P., Maxwell, K. G., Velazco-Cruz, L., Millman, J. R. Targeting the cytoskeleton to direct pancreatic differentiation of human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 38 (4), 460-470 (2020).
- Yoshihara, E., et al. Immune-evasive human islet-like organoids ameliorate diabetes. Nature. 586 (7830), 606-611 (2020).
- Mahaddalkar, P. U., et al. Generation of pancreatic beta cells from CD177(+) anterior definitive endoderm. Nature Biotechnology. 38 (9), 1061-1072 (2020).
- Liang, S., et al. Differentiation of stem cell-derived pancreatic progenitors into insulin-secreting islet clusters in a multiwell-based static 3D culture system. Cell Reports Methods. 3, 10046 (2023).
- Zhao, J., et al. In vivo imaging of beta-cell function reveals glucose-mediated heterogeneity of beta-cell functional development. Elife. 8, e41540 (2019).
- Zhao, J., et al. In vivo imaging of calcium activities from pancreatic beta-cells in zebrafish embryos using spinning-disc confocal and two-photon light-sheet microscopy. Bio-protocol. 11 (23), e4245 (2021).
- Liang, S., et al. Carbon monoxide enhances calcium transients and glucose-stimulated insulin secretion from pancreatic beta-cells by activating phospholipase C signal pathway in diabetic mice. Biochemical and Biophysical Research Communications. 582, 1-7 (2021).
- Bruin, J. E., et al. Maturation and function of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors in macroencapsulation devices following transplant into mice. Diabetologia. 56 (9), 1987-1998 (2013).
- Toyoda, T., et al. Cell aggregation optimizes the differentiation of human ESCs and iPSCs into pancreatic bud-like progenitor cells. Stem Cell Research. 14 (2), 185-197 (2015).
- Russ, H. A., et al. Controlled induction of human pancreatic progenitors produces functional beta-like cells in vitro. EMBO Journal. 34 (13), 1759-1772 (2015).
- Veres, A., et al. Charting cellular identity during human in vitro beta-cell differentiation. Nature. 569 (7756), 368-373 (2019).
- D'Amour, K. A., et al. Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm. Nature Biotechnology. 23 (12), 1534-1541 (2005).
- Jiang, Y., et al. Generation of pancreatic progenitors from human pluripotent stem cells by small molecules. Stem Cell Reports. 16 (9), 2395-2409 (2021).
- Tran, R., Moraes, C., Hoesli, C. A. Controlled clustering enhances PDX1 and NKX6.1 expression in pancreatic endoderm cells derived from pluripotent stem cells. Scientific Reports. 10 (1), 1190 (2020).
- Mamidi, A., et al. Mechanosignalling via integrins directs fate decisions of pancreatic progenitors. Nature. 564 (7734), 114-118 (2018).
- Rezania, A., et al. Enrichment of human embryonic stem cell-derived NKX6.1-expressing pancreatic progenitor cells accelerates the maturation of insulin-secreting cells in vivo. Stem Cells. 31 (11), 2432-2442 (2013).
- Sander, M., et al. Homeobox gene Nkx6.1 lies downstream of Nkx2.2 in the major pathway of beta-cell formation in the pancreas. Development. 127 (24), 5533-5540 (2000).
